CN103059142B - 猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的重组蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医学领域，特别涉及动物重组蛋白疫苗，重组蛋白含有所述猪圆环病毒的抗原的表位和所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的表位，通过乳化后支撑疫苗；所述重组蛋白通过合成如SEQ ID NO：6所示的目标片段，并和PGEX-4T-1载体组成重组载体，将重组质粒转化至宿主菌诱导表达，并提取重组蛋白而得；用于猪体免疫的重组蛋白含量是宿主菌诱导表达4小时后的产物，采用包涵体回收、溶解、浓缩等过程后提纯浓度达80％以上的重组蛋白质；本发明制备的重组蛋白质性质稳定、不具传播病毒等特点，在研制防制PRRSV和PCV2疫苗具有极大的优势或不可替代的作用。

Description

猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的重组蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及动物重组疫苗。

背景技术

免疫抑制性疾病除了本身的直接危害之外，更为重要的是造成免疫抑制，可使低致病性的病原体引起多种疾病综合征发生，甚至达到难以控制的程度，还造成对疫苗接种反应增强、副作用加大，或使免疫失败和对治疗无应答。免疫抑制性病的危害对畜禽健康的威胁日益增加。当前最常发生并危害严重的猪免疫抑制性疾病主要有猪繁殖与呼吸综合征和圆环病毒II型感染。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起，主要特点为怀孕母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊化等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪出现呼吸道症状。该病1987年首发于美国，迅速散播遍及全球，并于1995年在我国暴发，给我国乃至世界养猪业造成严重的经济损失。PRRSV感染猪的巨噬细胞系统，易感细胞主要是位于扁桃体、肺、淋巴结和脾脏的单核/巨噬细胞系统等免疫器官。从很多临床和实验观察，PRRSV能引起感染猪的免疫抑制，导致对继发细菌感染的易感性。中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室的研究结果表明，经PRRSV感染的SPF猪，猪体对猪瘟弱毒疫苗会产生一定程度的不应答。肺脏是PRRSV的原发性靶器官，肺泡巨噬细胞是其感染的靶细胞。试验证明，PRRSV在巨噬细胞中复制，可直接或间接引起这些细胞的形态和功能改变甚至死亡，从而导致机体免疫力下降，引起免疫抑制。PRRSV引起机体的细胞免疫功能低下，而体内高水平的病毒特异性抗体又不足以清除病毒，造成病毒在猪体内的持续性感染。

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是至今发现最小的一种重要的动物病原微生物。PCV2具有致病性，主要引起猪断奶后多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，育肥猪的皮炎与肾病综合征(Porcine dermatetitis and nephropathy syndrome，PDNS)，母猪的繁殖障碍，新生仔猪的先天性震颤、腹泻、增生性坏死性肺炎，是一种新的传染病。1991年加拿大首次暴发该病，随后10几年内，有20多个国家和地区都有该病的报道。按照血清学的观点，PCV2分布全世界。由PCV2感染急性发病猪群死亡率为10％，种猪淘汰率5～10％，哺乳仔猪死淘率低于5％，若细菌等发生继发感染，病死率可上升为25％。猪圆环病毒2型(PCV2)是新近确认的猪重要病原体。该病主要进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，同时导致淋巴系统损伤和免疫缺陷，造成感染该病的猪群对其它病原的易感性增高。研究表明，PCV2具有免疫抑制特性，PCV2感染猪的淋巴细胞，循环B细胞和T细胞的数量下降，淋巴器官中的T、B淋巴细胞数量减少，因此PCV2感染猪群由于免疫功能下降，使猪群对其它病原体的抵抗力大大降低。PCV2感染可以引起继发性免疫缺陷，发病或感染猪至少存在短暂的不能激发有效的免疫应答现象。迄今，PCV2感染和引起的疾病已呈全球分布。由PCV2感染引起的PMWS(断奶后多系统衰竭综合征)于2002年在我国各地呈暴发流行，给国内养猪业造成了巨大经济损失，已成为我国规模化猪场危害养猪生产的重要免疫抑制性疫病之一。因此，加强对PCV2感染的控制具有十分重要的实践意义。

在实际生产中，因这两个病的感染导致其他疫苗免疫效果不理想、保护率较低、应激反应等造成的直接经济损失每年高达数千万元人民币，间接损失上亿元人民币。随着生物技术的不断进步与发展，生物工程产品在农业领域应用越来越多。生物工程技术在兽用生物制品的应用主要体现在基因工程疫苗的开发与研究。以某些病毒或细菌的免疫原性基因为基础，利用分子生物技术进行基因克隆和蛋白表达，将表达蛋白作为免疫原，是疫苗研究的新途径，为克服一些常规疫苗的缺陷带来希望。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种重组蛋白及其制剂，该重组蛋白及其制剂是基于两组截断片段涉及制备的，具有免疫原性。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

重组蛋白，含有所述猪圆环病毒的抗原的表位和所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的表位。

进一步，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

由所述的重组蛋白制备的疫苗，将重组蛋白进行乳化后，得疫苗；优选为浓度为80μg/mL的重组蛋白与乳化剂按体积比1∶1的比例混合后乳化。

本发明的目的之二在于提供一种上述重组蛋白的制备方法，该方法操作简单，蛋白产量高。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

所述的重组蛋白的制备方法：具体包括以下步骤：

A目的片段的合成

将如SEQ ID NO：1所示的猪圆环病毒的抗原的表位对应的核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的表位对应的核苷酸序列通过如SEQ ID NO：4所示的柔性的Linker相连，得如SEQ ID NO：5所示的目标片段；

B修饰与优化

将如SEQ ID NO：5所示的目标片段作适应宿主菌修饰，并添加酶切位点，得如SEQ ID NO：6所示的目标片段；

C重组载体

分别将如SEQ ID NO：6所示的目标片段和PGEX-4T-1载体分别进行Bamh I和Not I双酶切后进行连接，得重组载体，并制备转化子和提取重组质粒；

D诱导表达与提取

将重组质粒转化至宿主菌诱导表达，并提取重组蛋白。

进一步所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于：将包涵体回收，溶解后进行SDS-PAGE电泳，切下目标条带，回收浓缩后可得到80mg/mL的目的蛋白。

本发明的目的之三在于提供一种重组载体，其转化到宿主细胞中，能诱导宿主细胞产生重组蛋白。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

重组载体，所述重组载体为将如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列和PGEX-4T-1载体分别进行Bamh I和Not I双酶切后进行连接而得的重组载体。

本发明的目的之四在于提供重组蛋白的应用，该应用为降低猪患断奶后多系统衰竭综合征或育肥猪的皮炎与肾病综合征或猪繁殖与呼吸综合征的风险。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的重组蛋白在制备疫苗中的应用。

本发明的目的之五在于提供两种抗原的联合运用，该运用起协同作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原联合在制备抗呼吸综合征病毒、抗猪圆环病毒的疫苗中的应用。

进一步，编码所述猪圆环病毒的抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示

本发明的有益效果：用于猪体免疫的重组蛋白含量是宿主菌诱导表达4小时后的产物，采用包涵体回收、溶解、浓缩等过程后可得到浓度达80％以上的重组蛋白质。由于本发明制备的重组蛋白质性质稳定、不具传播病毒等特点，在研制防制PRRSV和PCV2疫苗具有极大的优势或不可替代的作用。更多有益效果，详见实施例。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

图1为PGEX-4T-1载体的结构示意图。

图2为重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白质分子量标准，1为未经诱导的对照菌体超声波裂解液，2为诱导时间为1小时的菌体超声波裂解液，3为诱导时间为2小时的菌体超声波裂解液，4为诱导时间为3小时的菌体超声波裂解液，5为诱导时间为4小时的菌体超声波裂解液。

具体实施方式

就分子生物学领域中，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明通过一个柔性的Linker(如SEQ ID NO：4所示)将一个PCV2截断片段(如SEQ ID NO：1所示)和一个PRRSV截断片段(SEQ ID NO：2所示)串连起来，然后克隆到PGEX-4T-1表达载体上，转化进入BL21(DE3)宿主菌进行表达，表达量为：0.2mg/mL，目标蛋白为包涵体，通过回收、溶解、浓缩等过程后，得到80mg/mL目的蛋白，加入弗氏佐剂乳化后免疫仔猪，通过ELISA检测，有良好的免疫效果。

以下将结合附图对本发明进行详细说明，

实施例1

1.核酸序列的修饰与合成

通过GeneBank公布的PCV2与PRRSV的核苷酸序列选定两个截断片段，通过一条柔性的Linker将两个抗原连接在一起。目标核苷酸序列如下：

PCV2核苷酸序列片段，如SEQ ID NO：1所示：

GGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTGACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCGAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTGAACCCT

PRRSV核苷酸序列片段，如SEQ ID NO：2所示：

AACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGAATGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGTAG

Linker核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

CCACCGCCACCTTCGCCGCCACCGCCTTCGCCGCCACCGCCGTCG

PCV2-Linker-PRRSV核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：

GGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTGACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCGAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTGAACCCTCCACCGCCACCTTCGCCGCCACCGCCTTCGCCGCCACCGCCGTCGAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGAATGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGTAG

为了适合在DE3宿主菌中表达，对目标片段的核苷酸序列进行碱基的优化，并在序列的两端添加相应的酶切位点Bamh I和Not I，合成全序列，将所得序列连接到T载体，转化进入DH5α，进行序列测定；优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示：

GGATTCGGCATCTTCAACACACGCCTGAGTCGCACCTTTGGCTACACCATCAAGCGCACCACCGTTAAGACCCCGAGTTGGGCCGTGGACATGATGCGCTTCAACATCAACGACTTCCTGCCTCCGGGCGGTGGTAGTAATCCGCGTAGCGTGCCGTTCGAGTACTACCGCATCCGCAAGGTTAAGGTGGAGTTCTGGCCGTGCAGCCCGATTACACAGGGTGACCGCGGTGTGGGTAGCAGTGCCGTGATCCTGGACGACAACTTCGTGACCAAGGCCACCGCACTGACCTACGACCCGTACGTGAATTACAGCAGCCGCCACACCATTACCCAGCCGTTCAGCTACCACAGCCGCTACTTTACCCCGAAGCCTGTGCTGGACAGCACCATCGACTACTTCCAGCCGAACAACAAGCGCAACCAGCTGTGGCTGCGCCTGCAAACAGCCGGCAATGTGGACCACGTGGGCCTGGGTACCGCCTTCGAAAACAGCATCTATGACCAGGAGTACAATATCCGCGTGACCATGTACGTGCAGTTCCGCGAGTTCAATCTGAAAGATCCTCCGCTGAATCCGCCTCCTCCGCCTAGTCCGCCGCCGCCTAGCCCGCCGCCTCCTAGCAACAACAACAGCAGCCACATCCAGCTGATCTACAACCTGACCCTGTGCGAGCTGAACGGCACCGAATGGCTGGCCCAAAAGTTTGACTGGGCAGTGGAGG CGGCCGC

2.表达载体的载体构建

将测序正确的序列片段(如SEQ ID NO：6所示)和PGEX-4T-1载体(载体图谱见图1)，在37℃水浴分别进行Bamh I和Not I双酶切，采用DNA回收试剂盒回收目的片段，用T4连接酶在4℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞；采用PCR方法筛选阳性转化子，将阳性转化子进行扩大培养，采用常规方法进行重组质粒提取(参照《分子克隆实验指南》第三版)，命名为PGEX-pp，-20℃保存；

3.诱导表达

将重组质粒PGEX-pp转化BL21(DE3)宿主菌，37℃摇床培养，培养至菌液OD600值达到0.6-0.8后，加入IPTG(终浓度0.5mM)诱导培养4小时，收获菌体，裂解后进行SDS-PAGE电泳(见图2)，目的蛋白为53.76KDa，通过Eppendprf 6131Biophotometer的Traycell超微量核酸蛋白检测模块测定表达产物的含量为0.2mg/mL；重组蛋白为包涵体，通过回收、溶解、浓缩等过程后，得到80mg/mL目的蛋白；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2

采用弗氏佐剂与纯化后重组蛋白进行乳化，具体为浓度为80μg/mL的重组蛋白与乳化剂按体积比为1∶1的比例混合后乳化。将乳化后的产物免疫接种PRRSV和PCV2抗原、抗体检测为阴性21日龄仔猪，接种剂量为80mg/头；间隔1周行二免，免疫剂量为80mg/头；同时，用市售的PRRSV疫苗作为对照免疫仔猪；在免疫后1周、2周、3周和4周分别对仔猪进行静脉采血，分离血清；采用市售的ELISA试剂盒检测血清中PRRSV和PCV2的抗体OD值(见表1、表2)，发现免疫两周后PCV2与PRRSV抗体都呈阳性，且PCV2抗体呈强阳性。

表1 仔猪免疫重组蛋白后PCV2抗体检测

编号1-4为试验动物组；编号5-6为空白对照

表2 仔猪免疫重组蛋白后PRRSV抗体检测

编号1-4为试验动物组；编号5-6为空白对照

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.重组蛋白，其特征在于：含有猪圆环病毒的抗原的表位和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的表位，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

A目的片段的合成

将如SEQ ID NO：1所示的猪圆环病毒的抗原的截断片段对应的核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的截断片段对应的核苷酸序列通过如SEQ ID NO：4所示的柔性的Linker相连，得如SEQ ID NO：5所示的目标片段；

B修饰与优化

将如SEQ ID NO：5所示的目标片段作适应宿主菌修饰，并添加酶切位点，得如SEQ ID NO：6所示的目标片段；

C重组载体

分别将如SEQ ID NO：6所示的目标片段和PGEX-4T-1载体分别进行Bamh I和Not I双酶切后进行连接，得重组载体，并制备转化子和提取重组质粒；

D诱导表达与提取

将重组质粒转化至宿主菌诱导表达，并提取重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于：包涵体回收，溶解后进行SDS-PAGE电泳，切下目标条带，回收浓缩后可得到80mg/mL的目的蛋白。

4.重组载体，其特征在于：所述重组载体为将如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列和PGEX-4T-1载体分别进行Bamh I和Not I双酶切后进行连接而得的重组载体。

5.由权利要求1所述的重组蛋白制备的免疫原，其特征在于：将重组蛋白用弗氏佐剂进行乳化后，得免疫原。

6.权利要求1所述的重组蛋白在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒、抗猪圆环病毒的免疫原中的应用。

7.猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原联合在制备呼吸综合征病毒、抗猪圆环病毒的免疫原中应用，编码所述猪圆环病毒的抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。