CN1974758A

CN1974758A - 一种高产5－氨基乙酰丙酸的工程菌

Info

Publication number: CN1974758A
Application number: CN 200610136870
Authority: CN
Inventors: 张德咏; 刘勇; 成飞雪; 谭新球; 罗源华; 何明远; 张战泓; 戴建平; 朱春晖
Original assignee: HUANAN PROV INST OF PLANT PROTECTION; HUANAN PROV INST OF PLANT PROT
Current assignee: Changsha Etam in bio fertilizer technology development Co Ltd
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2026-12-15
Also published as: CN1974758B

Abstract

本发明涉及一种生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌。工程菌为含有光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)PSB－1菌株5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的大肠杆菌；工程菌在以蛋白胨、酵母膏和无机盐为组分的培养基中加入甘氨酸、琥珀酸与乙酰丙酸，培养2～4小时后，再加入诱导剂，5～14小时后，5－氨基乙酰丙酸的产量达到最大值；本发明不仅ALA产量高，而且工艺简单，对环境友好，满足工业化生产的要求。

Description

一种高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌

技术领域

本发明涉及基因工程，具体涉及一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，以下简称ALA)，是卟啉、(亚铁)血红素和维生素B12的等四吡咯类化合物的共同前体，是一种广泛存在于细菌、真菌、动物及植物等生物机体活细胞中的非蛋白氨基酸。ALA作为一种光动力学剂(photodynamic agent)，在农用化学及医学领域都具有广泛的用途。在农业领域中，ALA对植物无毒副作用，易降解无残留，成为极具发展前途的绿色无公害的壮苗剂、增产剂、抗逆剂、除草剂、杀虫剂、增色剂、绿化剂和落叶剂等；在医学领域，ALA可以作为抗癌药物，能选择性的杀死癌细胞，被称为第二代光动力学药物(photodynamic medicine)，具有对正常细胞毒害小，病人避光时间短，疗效显著，无残留等特点。但在自然条件下ALA细胞外分泌量非常低，很难用于实际生产。因此，ALA的合成研究引起了广泛重视。

由于化学法合成ALA过程复杂，产量低，费用高，从而也限制了它的广泛应用。利用生物合成方法生产ALA毫无疑问是最佳选择。生物合成ALA有2种方法，一是生物诱变法。Sasaki等(Biosynthesis，biotechnological production and applications of5-aminolevulinic acid.Appl Microbiol Biotechnol，2002，58：23-29)优化类球红细菌的突变株(Rhodobacter sphaeroides)的培养条件，将ALA的产量提高到1.3g/L；在国内2002年刘秀艳等(光合细菌产生ALA的研究浙江大学学报(理学版)，2002，29：336-340)对红假单胞菌进行诱变，筛选ALA高产量菌株，并优化发酵条件，使ALA产量达到22.15mg/L。但生物诱变法培养条件复杂、周期长、成本较高。而另一种方法就是基因工程方法，Mariet等(5-aminolevulinate production by E.coli containing the Rhodobacter sphaeroides hemAGene.Applied and Environmental Microbiology，1990，62：3560-3566)和Choi等(Optimizationof extracallular δ-aminolevulinic acid production from Escherichia coli transformed with ALAsynthase gene of Bradyhizobium japonicum.Biotechnology Letters，1999，：551-554)分别构建了含有类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的ALA合成酶基因(hemA)的工程菌，获得了高产量的ALA，其产量分别达到3.21g/L和2.94g/L。由于重组工程菌产量高、发酵时间短，成本相对较低，其将是今后ALA大规模生产的一项很有前景的生物技术。

要应用构建的工程菌将ALA产量提高到工业化生产条件，仍是需要进一步研究的课题。

发明内容

本发明旨在利用大肠杆菌工程菌大量生产ALA，为工业化生产ALA提供一种高产的工程菌。

解决上述发明目的的技术方案是：构建的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌为含有光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)菌株PSB-1(CCTCC M 206124)5-氨基乙酰丙酸合成酶基因全长序列的大肠杆菌。

工程菌的培养条件为在以蛋白胨、酵母膏和无机盐为组分的培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂乙酰丙酸，培养2～4小时后，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(0.2～1.2mM)或乳糖(2～10mM)，5～14小时后，5-氨基乙酰丙酸的产量达到最大值。

培养工程菌的蛋白胨、酵母膏培养基的各组分及含量范围如下：

蛋白胨8～30g/L，酵母膏3～30g/L，葡萄糖0～10g/L，NaCl 2～10g/L，Mg₂SO₄·7H₂00.5～1.5g/L，KH₂PO₄ 2～5g/L，K₂HPO₄或(NH₄)₂HPO₄ 3～5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 0～7g/L，NH₄Cl 0～1.5g/L，微量元素溶液1～1.5ml/L，及60～100mM的甘氨酸、20～60mM的琥珀酸和20～60mM的乙酰丙酸；微量元素溶液成分为(1L)：CoCl₂·6H₂O 5g，MnSO₄·5H₂O 1g，Na₂MoO₄·2H₂O 2g，H₃BO₃ 0.5g，ZnCl₂ 2g，CuSO₄·5H₂O 1g，FeSO₄·7H₂O20g，CaCl₂·2H₂O 20g。诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.2～1.2mM或乳糖2～10mM。

下面结合附图进一步详述本发明。

附图说明

图1重组质粒pQE30-R.A-hemA的构建过程。

图2重组诱导表达蛋白15％SDS-PAGE胶电泳图，泳道1～4分别为重组菌经诱导0小时、2小时、4小时、6小时后蛋白抽提物检测结果，M为蛋白标准。

图3纯化蛋白SDS-PAGE胶电泳图，泳道1为诱导表达蛋白纯化前对照，2为washbuffer洗出液，3～6为Elution buffer第1、2、3、4次洗脱液，7为未经IPTG诱导的细菌培养液，M为蛋白标准。

图4为计算ALA浓度标准曲线图。

本发明的光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)PSB-1菌株已提交中国典型培养物中心保藏，保藏号为：CCTCC M 206124，保藏日期为2006年11月16日。

本发明的核心技术包括生产ALA工程菌的构建和该菌的特定培养条件。该工程菌含有光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，在特定的培养基中可生产浓度大于5g/L的ALA。

上述ALA合成酶基因序列见Genbank登陆号：DQ288861(www.ncbi.nlm.nih.gov)。

上述培养基的三种组成见下表。

表1培养基组成

培养基1(g/L)	培养基2(g/L)	培养基3(g/L)
培养基1(g/L)	培养基2(g/L)	培养基3(g/L)	蛋白胨 10g酵母膏 5g葡萄糖 5gNaCl 10gMg₂SO₄·7H₂O 0.5gKH₂PO₄ 2gK₂HPO₄ 4gNa₂HPO₄·12H₂O 7gNH₄Cl 1g微量元素溶液 1ml	蛋白胨 20g酵母膏 30g葡萄糖 5gNaCl 3gMg₂SO₄·7H₂O 1g(NH₄)₂HPO₄ 3.5gKH₂PO₄ 5g微量元素溶液 1ml	蛋白胨 10g酵母膏 5gNaCl 10gMg₂SO₄·7H₂O 0.5gKH₂PO₄ 2gK₂HPO₄ 4gNa₂HPO₄·12H₂O 7gNH₄Cl 1g微量元素溶液 1ml

微量元素溶液(1L)：CoCl₂·6H₂O 5g，MnSO₄·5H₂O 1g，Na₂MoO₄·2H₂O 2g，H₃BO₃ 0.5g，ZnCl₂ 2g，CuSO₄·5H₂O 1g，FeSO₄·7H₂O 20g，CaCl₂·2H₂O 20g。

加入60～100mM的甘氨酸、20～60mM的琥珀酸和20～60mM的乙酰丙酸。

本发明基因工程菌的构建及培养，包括以下步骤：

1).将嗜酸柏拉红菌ALA合成酶基因(DQ288861)的全长序列与表达载体连接，转化大肠杆菌，获得含有ALA合成酶基因的工程菌；

2).将该工程菌在含甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸的特定培养基中培养2-4h后，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，0.2～1.2mM)或乳糖(2～10mM)，诱导ALA合成酶基因的表达，5-14h后ALA的产量达到最大值。

用本发明构建的工程菌生产ALA，不仅产量高达5g/L，而且工艺简单，对环境友好，满足工业化生产的要求。

具体实施方式

实施例1

生产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌BL21(DE3)工程菌的构建与培养：

1.嗜酸柏拉红菌基因组DNA的抽提

液体培养的嗜酸柏拉红菌经离心收集后采用CTAB法进行DNA抽提，琼脂糖检测DNA的浓度与完整性。具体操作如下：

1).取嗜酸柏拉红菌PSB-1菌株(CCTCC M 206124)接种液体培养基(接种量1％，培养基充满培养瓶后密封)后进行光照培养(30℃，光照强度2000Lx，7d)。该液体培养基成分为：乙酸钠1640mg/L，MgSO₄·7H₂O 200mg/L，K₂HPO₄ 900mg/L，KH₂PO₄ 600mg/L，CaCl₂·2H₂O 75mg/L，EDTA 20mg/L，(NH₄)₂SO₄ 1320mg/L，FeSO₄·7H₂O 11.8mg/L，微量元素溶液1mL/L，pH 6.8(用NaOH调)，微量元素溶液：H₃BO₃ 2800mg/L，MnSO₄·4H₂O2100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 750mg/L，ZnSO₄·7H₂O 240mg/L，Cu(NO₃)₂·3H₂O 40g/mL；

2).将对数生长期的嗜酸柏拉红菌菌液10ml 10000rpm离心2min收集菌体；

3).用500μl TE缓冲液溶解后，加30μl 10％SDS，3μlPKase，混匀，37℃，1小时；

4).加100μl 5M的NaCl，混匀后加入80μl的10％的CTAB/NaCl溶液，混匀；

5).等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000rpm离心5min；

6).取上清液加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，12000rpm离心5min；

7).上清加入2-3倍体积无水乙醇或3/5体积的异丙醇沉淀DNA，10000rpm离心10min；

8).70％乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，加TE溶解；

9).37℃RNase消化1小时，即得到基因组DNA。

2.ALA合成酶基因的克隆

1).根据序列信息设计嗜酸柏拉红菌ALAS基因特异PCR扩增引物，引物两端引入酶切位点。引物序列如下：

F：5’-TAGGGAGCTCATGGATTACACCAAG-3’

R：5’-ACAGTAAGCTTAACTTATTCCGCAGC-3’

斜体部分为引入的酶切位点。

2).利用上述引物对嗜酸柏拉红菌基因组DNA进行PCR扩增，得到完整的ALAS基因扩增产物。扩增程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，61℃复性30秒，72℃延伸60秒，35个循环，最后延伸10分钟。PCR产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，显示在1200bp有单一条带，与预期序列大小一致。

3.ALAS基因原核表达载体的构建

如图1所示，重组质粒的构建按以下步骤进行：

1).将PCR扩增片段利用限制性内切酶Sac I和Hind III双酶切，并同时酶切pQE30表达载体(Qiagen)，酶切PCR产物和载体经琼脂糖电泳后分别回收。T4DNA连接酶16℃连接过夜，使PCR片段定向连接到表达载体pQE30的Sac I和Hind III两个酶切位点上，并热激转化([美]J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002)感受态细胞BL21(DE3)。转化产物涂布于含100μg/L的氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。

2).挑取阳性单菌落，提取质粒后，利用PCR以及Sac I和Hind III双酶切鉴定出有正确插入的克隆(即重组子)，进一步测序确证。将这种表达载体命名为pQE30-R.A1-hemA，而含有这种表达载体的工程菌命名为BL21(DE3)-pQE30-R.A1-hemA，即为本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌。

4.ALA合成酶的诱导表达及蛋白的纯化与检测

1).含有pQE30-R.A-hemA重组子的工程菌BL21(DE3)-pQE30-R.A1-hemA在含有100μg/ml氨苄青霉素培养基1中37℃培养过夜，加入的甘氨酸100mM，琥珀酸50mM和乙酰丙酸40mM，然后以1∶100浓度接种于20ml的LB培养基放大培养至OD₆₀₀为0.6～0.7时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，诱导前取1ml菌作为对照，37℃继续培养6小时，每隔2小时取1ml菌液，离心收集菌体。

2).加入400μl裂解液(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM imidazol，PH8.0、10μg/ml溶菌酶)，冰上30分钟，12000rpm离心，分别收集上清。

3).上清用15％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳条件为100V，25mA电泳5小时，考马斯亮蓝染液(考马斯亮兰0.1％，45％甲醇，l0％冰醋酸)染色15分钟，脱色液(10％甲醇，10％冰醋酸)脱色15分钟后观察电泳结果。

4).根据电泳结果在约44KDa处有占蛋白总量20.3％的可溶蛋白表达(图2)，此大小与序列中氨基酸序列大小基本一致，初步认为此蛋白为5-氨基乙酰丙酸合成酶。

5).表达的ALA合成酶蛋白含有组氨酸(6×His)标记，便于纯化，可溶形式的诱导表达蛋白纯化利用Qiagen公司的Ni-NTA树脂亲和层析试剂盒(QIA expressionist，Version 3.0，03/2001)进行，纯化蛋白利用15％SDS-PAGE凝胶电泳检测，在44KDa处可见单一条带的表达蛋白(图3)，证明此蛋白为5-氨基乙酰丙酸合成酶。

5.ALA合成酶比活力测定

1).菌抽提液500μl等体积反应试剂(含50mMTris-HCl(PH 7.5)，20mM氯化镁，0.1M琥珀酸二钠，0.1M的甘氨酸，0.1mM的磷酸吡哆醛，15mM ATP，0.2mM的辅酶A)于离心管中混合，于37℃分别反应10分钟、20分钟和30分钟后。

2).加入500μl 10％的三氯乙酸于离心管中终止反应，13000rpm离心5分钟。

3).ALA含量测定采用分光光度法。取上清加入1ml 2M的醋酸钠(PH 4.6)，混匀后加入300μl乙酰丙酮，混匀后沸水浴15分钟，冷却至室温。加入2.5ml Ehrlich’s试剂(60％的冰醋酸(V/V)，2％对二甲氨基苯甲醛(m/V)，11.2％的高氯酸(V/V))。室温反应15分钟，待显色完全后于556nm测其吸光值，计算ALA合成量。ALA浓度参照标准曲线(图4)计算。

标准曲线制作方法如下：

精确配制浓度为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L和5mg/L的标准ALA溶液一组(ALA标准试剂购自Sigma公司，纯度大于98％，货号A3785)，各取1ml分别加入1ml 2M的醋酸钠(PH 4.6)，混匀后加入300μl乙酰丙酮，混匀后沸水浴15分钟，冷却至室温。加入2.5ml Ehrlich’s试剂(60％的冰醋酸(V/V)，2％对二甲氨基苯甲醛(m/V)，11.2％的高氯酸(V/V))。室温反应15分钟后利用分光光度计在556nm测吸光度，得到标准曲线为y(ALA浓度，mg/L)＝-0.121233+14.2588X(OD值)，相关系数R＝0.9980。

4).总蛋白含量采用Bradford法测定。测出含有hemA基因的重组菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力为333U/min·mg of protein，1个酶活力单位定义为37℃1分钟内合成1μmol ALA所需酶量；酶比活力为每毫克总蛋白所含的酶单位。而不含重组子的大肠杆菌BL21(DE3)则检测不到5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性。

5).重组菌胞外ALA产量测定。利用培养基1优化培养重组菌，测发酵液中胞外ALA的含量。测定方法同上。经分光光度法测定发酵液中ALA产量一般为2-3g/L，最高可达到5.379g/L。

实施例2

生产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌M15[PREP4]工程菌的构建与培养：

基本方法同上，所不同的是：

1).ALA合成酶基因的克隆中所用引物如下：

F：5’-ATTTGAGCTCGGTGCCGTTCTAC-3’

R：5’-ACAGTAAGCTTAACTTATTCCGCAGC-3’

扩增程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃复性60秒，72℃延伸60秒，35个循环，最后延伸10分钟。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，显示在1700bp处有单一条带。

2).ALAS基因原核表达载体的构建中将这种表达载体命名为pQE30-R.A2-hemA。所用宿主菌为M15[PREP4]，转化产物涂布于含100μg/L氨苄青霉素和50μg/L的卡纳霉素的LB平板上培养。含有这种表达载体的工程菌命名为M15-pQE30-R.A2-hemA，即为本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌。

3).工程菌利用培养基3进行优化培养，培养基的其它组分同实施例1。ALAS表达诱导剂为乳糖，加入量至终浓度5mM。发酵液中胞外ALA含量最高可达5.379g/L。

实施例3

生产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌M15[PREP4]工程菌的构建与培养：

基本方法同上，所不同的是：

1).ALA合成酶基因的克隆中所用引物如下：

F：5’-ATTTGAGCTCGGTGCCGTTCTAC-3’

R：5’-AGAATAAGCTTGCAGCGAGGACG-3’

扩增程序为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃复性2分钟，72℃延伸2分钟，30个循环，最后延伸10分钟。PCR产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，显示在2550bp处有单一条带。

2).ALAS基因原核表达载体的构建中将这种表达载体命名为pQE30-R.A3-hemA。所用宿主菌为M15[PREP4]。转化产物涂布于含100μg/L氨苄青霉素和50μg/L的卡纳霉素的LB平板上培养。含有这种表达载体的工程菌命名为M15-pQE30-R.A3-hemA，即为本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌。

3).工程菌利用培养基2进行优化培养，培养基的其它组分与诱导剂同实施例1。发酵液中胞外ALA含量最高可达5.379g/L。

<110>湖南省植物保护研究所

<120>一种高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌

<160>6

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>用于PCR扩增嗜酸柏拉红菌ALAS基因的第一对引物

<220>

<400>1

tagggagctc atggattaca ccaag 25

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>用于PCR扩增嗜酸柏拉红菌ALAS基因的第一对引物

<220>

<400>1

acagtaagct taacttattc cgcagc 26

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>用于PCR扩增嗜酸柏拉红菌ALAS基因的第二对引物

<220>

<400>1

atttgagctc ggtgccgttc tac 23

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>用于PCR扩增嗜酸柏拉红菌ALAS基因的第二对引物

<220>

<400>1

acagtaagct taacttattc cgcagc 26

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>用于PCR扩增嗜酸柏拉红菌ALAS基因的第三对引物

<220>

<400>1

atttgagctc ggtgccgttc tac 23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>用于PCR扩增嗜酸柏拉红菌ALAS基因的第三对引物

<220>

<400>1

agaataagct tgcagcgagg acg 23

Claims

1.一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌为含有光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastusacidophilus)菌株PSB-1(CCTCC NO：M 206124)5-氨基乙酰丙酸合成酶基因全长序列的大肠杆菌。

2.一种如权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的培养方法，其特征在于工程菌的培养条件为在以蛋白胨、酵母膏和无机盐为组分的培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂—乙酰丙酸，培养2～4小时后，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖，5～14小时后，5-氨基乙酰丙酸的产量达到最大值。

3.根据权利要求2所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的培养方法，其特征在于培养工程菌的蛋白胨、酵母膏培养基的各组分及含量范围如下：

蛋白胨 8～30g/L

酵母膏 3～30g/L

葡萄糖 0～10g/L

NaCl 2～10g/L

Mg₂SO₄·7H₂O 0.5～1.5g/L

KH₂PO₄ 2～5g/L

K₂HPO₄或(NH₄)₂HPO₄ 3～5g/L

Na₂HPO₄·12H₂O 0～7g/L

NH₄Cl 0～1.5g/L

微量元素溶液 1～1.5ml/L，

微量元素溶液成分为(1L)：CoCl₂·6H₂O 5g，MnSO₄·5H₂O 1g，Na₂MoO₄·2H₂O 2g，H₃BO₃ 0.5g，ZnCl₂ 2g，CuSO₄·5H₂O 1g，FeSO₄·7H₂O 20g，CaCl₂·2H₂O 20g。

4.根据权利要求2所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的培养方法，其特征在于培养工程菌的蛋白胨、酵母膏培养基中加入的其他组分及诱导剂的终浓度范围如下：

甘氨酸 60～100mM

琥珀酸 20～60mM

乙酰丙酸 20～60mM

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.2～1.2mM或乳糖2～10mM。