CN111534528A - 一种提高植物耐低温胁迫能力的方法及其植物表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高水稻耐低温胁迫能力的方法及其植物表达载体，其特征在于通过在植物中导入表达5‑氨基乙酰丙酸合成酶基因，以获得转基因植物的耐低温胁迫能力得到提高。本发明还提供一种制备耐低温胁迫能力提高的转基因水稻的方法，其是通过含有5‑氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体转化植物，筛选获得耐低温胁迫能力提高的转基因植物。本发明的实验结果表明，转5‑ALAS基因水稻各株系的耐低温胁迫的能力得到较大的增强，因此在培育耐低温胁迫如耐寒品种中具有推广应用价值。

Description

一种提高植物耐低温胁迫能力的方法及其植物表达载体

技术领域

本发明属于生物技术领域和植物育种领域，具体涉及一种提高植物尤其是水稻的耐低温胁迫能力的方法及其植物表达载体。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)就是一种有多种效应的植物生理活性物质，是一种绿色可生物降解的杀虫剂。但是由于5-ALA纯品化学合成过程复杂且不适用于工业化生产要求；而生物合成取得了进展，并且在产量上提高，但是距离工业化生产要求相差甚远。加上市场上5-ALA价格昂贵，自然状态下稳定性差，无法在生产上大面积使用。据报道(Meller&Gassman，Biosynthesis of-amino-levulinic acid:Two pathways inhigher plants.Plant Science Letters,1982，26(1):23-29)植物体内5-ALA存在C4和C5两条合成途径，但以C5合成途径为主，由于生化反馈调节抑制使得5-ALA并没有在细胞中累积，给植物源的5-ALA研究和应用带来一定的困难。因此从其他途径寻找高效高活性的5-ALA合成酶基因，利用植物本身的底物，改变植物体内5-ALA的合成途径，是实现5-ALA稳定高效利用的关键，而光合细菌是一类能够大量生产5-ALA并分泌到细胞外的微生物，且以C4途径合成，因工艺简单、产率高、具有工业化的生产潜力，备受国内外研究者的关注。为此从嗜酸柏拉红细菌(Rhodoblastus acidophilus)成功地克隆了编码5-ALA的5-ALAS合成酶基因，原核表达表明具有较高活性(张德咏等，光合细菌嗜酸柏拉红菌5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆与原核表达，微生物学报，2007，47(4):639-644)。

根据植物生理学分析，卟啉化合物在植物的代谢中起关键作用，参与植物的光合作用与呼吸作用。而5-ALA是所有卟啉化合物的共同前体，在自然界生物中广泛存在。在植物生化三羧酸循环(TCA)、乙醛酸循环和氨基酸分解途径过程中(《生物化学》，沈同等，2001)，均产生微生物5-ALAS合成5-ALA所需的底物，琥珀酰氨辅酶A和甘氨酸，为植物体内利用C4途径生产5-ALA提供可能。嗜酸柏拉红细菌(Rhodoblastus acidophilus)中的5-ALAS基因(基因编号：DQ288861，全长1239bp，编码413氨基酸)，在大肠杆菌中原核表达研究表明表达蛋白大小为45KD，其5-ALA的产量达到5.3克/升，已经达到同类研究5-ALA最高生产水平，表明该5-ALAS具有较高的酶活性，属于C4合成途径。根据Murray等(Advancedmethods in plant breeding and biotechnology,CAB International,Wallingford,Oxon,UK.1991.ISBN 0-85198-706-0)的研究结果，目的基因与植物基因组内含子过多的A+T含量通常妨碍目的基因的表达，而5-ALAS G+C的含量为47％，适合在植物体内进行高效表达。目前为止，国际上仅仅一例关于转5-ALAS基因水稻的研究，Sunyo等(Expression ofBradyrhizobium japonicum 5-aminolevulinic acid synthase induces severephotodynamic damage in transgenic rice，Plant sicence,2004，167(4):789-795)将来自于Bradyrhizobium japonicum的5-ALAS导入水稻，研究表明外源的5-ALAS在转基因水稻中能有效的合成并大幅度增加ALA的含量，同时转基因水稻中卟啉IX和叶绿素的含量也增加。有趣的是在强光照下，转基因植株产生光动力伤害而被漂白，其光合作用并没有增加反而受到抑制，但是在普通光照下，其光合作用稍有增加。这种结果归功于目标基因过量表达、多拷贝或水稻品种本身对光敏感、或整合位置特殊，使得外源的ALA在补偿植株本身所需后，5-ALA在细胞中累积的浓度超过促进植物生长发育所需要的基准。并且关于转基因的水稻种子的抗性和生理生化特性未见后续报道。

耐低温胁迫性育种是应对作物耐低温胁迫性治理中最为有效、安全和经济的措施之一。尽管研究者们试图从不同途径寻找抗性资源，挖掘相关基因，进行有效利用但是目前仅仅在抗旱、抗盐碱等方面取得成功，找到一些抗性相关基因和抗性品种，但是因为抗性水平不理想或抗性基因复杂的互作等因素限制了它们的实际应用，目前真正能够大面积应用于生产实际的非常有限。自然，研究者们希望从其他途径寻找具有耐低温胁迫性相关基因(包括微生物源和植物源等)，通过利用进行抗性种质资源的创制，在一定程度上将补充耐低温的耐低温胁迫性资源，促进农业可持续发展。

发明内容

针对现在技术存在的不足，本发明人进行了深入研究和分析，最终完成本发明。

本发明人前期研究表明：水稻苗期根系用1ppm的5-ALA处理，放在10℃低温中5天，幼苗存活率提高了40％；在水稻初穗期喷施10ppm的5-ALA，可使水稻产量提高3.0％-4.5％，显示了5-ALA在水稻上的应用前景，证实了低浓度ALA可以提高植物抵抗低温强光胁迫的能力。与Hotta等(Improvement of Cold Resistance in Rice Seedlings by 5-Aminolevulinic Acid，J.Pesticide Sci.，1998，(23)：29-33。)将三叶龄水稻幼苗根系浸泡处理(1mg/L 5-ALA)溶液和Xu等(2000)250mg/L 5-ALA喷施处理水稻幼苗均有相同的效果。以上研究结果暗示ALA在提高水稻的耐低温胁迫耐低温胁迫方面中可能有用。但是，5-ALA在自然界极不稳定，容易发生聚合形成二聚体或者多聚体，导致5-ALA失去生物活性，使得5-ALA的大面积使用变得困难；另外5-ALA通过化学合成繁琐而不适用于工业化的生产要求，且市场价格昂贵，是其大面积应用的重要障碍；其次，植物体内天然生产5-ALA含量极底且以C5合成途径为主，由于生化反馈调节抑制使得5-ALA并没有在细胞中累积，给植物源的5-ALA研究和应用带来一定的困难。因而它的生理活性并没有充分发挥。但利用基因工程的方式，还没有人成功尝试的报道。本发明人在研究转基因植物体内表达5-氨基乙酰丙酸合成酶基因用以提高其抗虫能力的研究过程，无意中发现转基因植株对低温耐性有所增强，结合前面的初步研究，将使用植物专一性启动子或弱启动子适量表达外源的5-ALAS，以平衡植物体内的卟啉化合物和叶绿素的产出与利用，达到提高植物的光合效率并增加产量；与此同时选用光温不十分敏感、光合效率较低的优良水稻品种，例如粳稻品种、籼粳杂交品种具有这种的特性品种，更具体的例如粳稻台北309、粳稻4008S，作为受体材料，并且选择整合拷贝数低的植株(一般为一至二个拷贝)，可以有效保证克服相关缺点，实现水稻耐低温胁迫耐低温胁迫的重大突破。因此，通过进一步研究通过基因工程在植物体现有效表达5-氨基乙酰丙酸合成酶基因而提高转基因植物耐低温性，完成本发明。

本发明提供一种提高水稻耐低温胁迫能力的方法，通过在植物中表达5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(即5-aminolevulinic acid synthase,5-ALAS基因)来实现。其中可以采用组型启动子来介导表达，如Ubiquitin启动子，35S启动子，更优选地两个35S启动子串联作为启动子。更优选地，选用光温不十分敏感、光合效率低的优良水稻品种，例如粳稻品种、籼粳杂交品种具有这种的特性品种，更具体的例如粳稻台北309、粳稻4008S，作为受体材料。

在一个具体实施方式中，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)。更具体地，所述的来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)具有SEQ ID No.1所示的序列。

相应的，本发明提供一种制备耐低温胁迫能力提高的转基因植物的方法，其是通过含有5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体转化植物，筛选获得耐低温胁迫能力提高的转基因植物。

其中优选地，所述转基因植物中选择整合拷贝数低(如2个或1个拷贝)的植株，优选为一个拷贝。

其中所述表达载体的出发载体为pCAMBIA1300(购自Cambia institute fromAustralia)。

可以采用组型启动子来介导表达，如Ubiquitin启动子，35S启动子。但更优选地的采用两个35S启动子串联等。

在一个具体实施方式中，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)。更具体地，所述的来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)具有SEQ ID No.1所示的序列。

对于终止子可以采用任何合适的终止子，如Ubiquitin终止子。

本发明还提供上述方法中用至的植物表达载体，其是具有韧皮部特异性启动子和5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体。

在一个具体实施方式中，所述载体中，用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA1300。在一个具体实施例中，构建的本发明的植物表达载体为pCAMBIA1300：Ubiquitin启动子：ALAS：Ubiquitin终止子。

相应地，本发明提供5-氨基乙酰丙酸合成酶基因有提高水稻耐低温胁迫能力中的应用，尤其是选用光温不十分敏感、光合效率相对较低的优良水稻品种，例如粳稻品种、籼粳杂交品种具有这种的特性品种，更具体的例如粳稻台北309、粳稻4008S，作为受体材料。

本发明的技术效果如下：实验结果表明转5-ALAS基因的水稻植株，其5-ALAS酶活性是供体水稻(未转5-ALAS基因的水稻)的1.6-1.9倍，转基因水稻植株体内的5-氨基乙酰丙酸含量是野生型水稻的2.6-3.8倍。本发明实验结果还表明，转5-ALAS基因水稻各品系以4℃/5d为低温处理，结果表明转基因水稻的芽期耐低温明显强于对照，对转基因植株进行苗期耐低温胁迫试验，证明5-ALAS基因在水稻中的表达显著提高了水稻苗期的耐低温能力。

附图说明

图1：5-ALAS的PCR结果。其中，M为λDNA/PstI marker,CK为阴性对照。泳道1-10为5-ALAS基因扩增结果。

图2：植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)的构建策略流程。

图3：植物表达载体pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitinterminater的构建策略流程。

图4：pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)重组质粒HindIII酶切鉴定。

图5：pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater重组质粒HindIII和EcoRI双酶切鉴定。

图6T3代转5-ALAS基因植株芽期低温胁迫芽期耐冷性评价标准为：1级：所有苗全部成活，叶色青绿；3级：死苗在30％以下；5级：死苗在30％～50％之间；7级死苗达50％以上；9级：苗全部死亡。

图7转基因植株苗期耐低温胁迫1-3：3、6、9号转基因株系；ck：对照。

图8部分转基因309-Ubiquitin-ALAS T₁代植株基因组Southern杂交；1：λDNA/HindⅢDNA marker；2-10：待检测植株基因组DNA HindⅢ单酶切；11：非转基因植株基因组DNA HindⅢ单酶切；12：含有5-ALAS基因的质粒HindⅢ单酶切；13：D15000 DNA marker。

图9粳稻台北309转5-ALAS基因的实验过程。

图10转基因09-Ubiquitin-ALAS、4008S-Ubiquitin-ALAS和D1-Ubiquitin-ALAS阳性植株报告基因筛选(潮霉素50μg/ml处理)(上图为转基因阳性植株；下图为共分离植株和对照)。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1、5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆

1)根据NCBI中序列登录信息，设计5-ALAS基因特异的PCR扩增引物，并引入酶切位点，引物序列如下：

5'引物：5’-CCATGGATGGATTACACCAAGTTCTTC-3’斜体部分为NcoI酶切位点(用于pCAMBIA1300：2×35S promoter:ALAS:poly(A)植物表达载体的构建)

3'引物：5’-GGATCCTTATTCCGCAGCGAGCGGCTT-3’斜体部分为BamHI酶切位点(用于pCAMBIA1300：2×35S promoter:ALAS:poly(A)植物表达载体的构建)

5'引物：5’-CCCGGGATGGATTACACCAAGTTCTTC-3’斜体部分为SmaI酶切位点(用于pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater植物表达载体的构建)

3'引物：5’-GAGCTCTTATTCCGCAGCGAGCGGCTT-3’斜体部分为SacI酶切位点(用于pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater植物表达载体的构建)

2)光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)PSB-8基因组的制备

取光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-8菌株，以1:100比例接种液体培养基，30℃，2500LX光照培养7天。取10ml菌液，室温12000rpm离心5min收集菌体。用500μl TE缓冲液溶解后，加30μl 10％SDS和3μl蛋白酶K,混匀，37℃温浴1小时。加100μl 5M的NaCl,混匀后加入80μl10％CTAB/NaCl溶液，混匀，37℃温浴1小时。加等体积酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀，室温12000rpm离心5分钟。取上清液加入等体积氯仿/异戊醇,混匀，室温12000rpm离心5分钟。吸取上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温12000rpm离心10分钟。用70％乙醇洗涤沉淀两次，室温干燥后加TE溶解，37℃5μl RNase(10mg/ml)消化1小时，即得到基因组总DNA。

3)以2)的总DNA(50ng/μl)为模板，以1)所合成的引物进行PCR扩增，获得完整的5-ALAS基因扩增产物。反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性30秒，72℃延伸60秒，30个循环，最后延伸10分钟。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小为1230bp，与预期序列大小一致(图1)。

4)电泳割胶回收得到的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因片段与克隆载体pGEM-T-Easy按照1:3进行连接，转化并通过菌落PCR筛选得到重组质粒pGEM-T-Easy-ALAS，进一步测序验证，结果如核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。

实施例2、具有组成型表达启动子2×35S promoter或Ubiquitin promoter和5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(即5-ALAS基因)植物表达载体的构建

其中，植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)的构建策略流程如图2所示。植物表达载体pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater的构建策略流程如图3所示。

1)中间载体pBsK:2×35S:ALAS:poly(A)的构建

用限制性内切酶NcoI和BamHI分别双酶切pGEM-T-Easy:ALAS重组质粒和pBsK质粒。电泳割胶回收pGEM-T-Easy:ALAS重组质粒上切下的5-ALAS片段以及pBsK双酶切后的大片段。将回收片段按照1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶并转化，通过菌落PCR筛选得到中间载体pBsK:2×35S:ALAS:poly(A)。

2)中间载体pUB:Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater的构建

用限制性内切酶SmaI和SacI分别双酶切pGEM-T-Easy:ALAS重组质粒和pUB质粒。电泳割胶回收pGEM-T-Easy:ALAS重组质粒上切下的5-ALAS片段以及pUB双酶切后的大片段。将回收片段按照1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶并转化，通过菌落PCR筛选得到中间载体pUB:Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater。

3)5-ALAS基因植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)的构建

用限制性内切酶HindIII分别酶切pCAMBIA1300(购自Cambia institute fromAustralia)：质粒和pBsK:2×35S:ALAS:poly(A)重组质粒，电泳割胶回收pCAMBIA1300质粒大片段以及pBsK:2×35S:ALAS:poly(A)重组质粒2×35S:ALAS:poly(A)片段，将回收片段按1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶连接，通过遗传转化，得到重组质粒pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)，即植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)。

4)5-ALAS基因植物表达载体pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitinterminater的构建

用限制性内切酶HindIII和EcoRI分别双酶切pCAMBIA1300(购自Cambiainstitute from Australia)：质粒和pUB:Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitinterminator重组质粒，电泳割胶回收pCAMBIA1300质粒大片段以及pUB:Ubiquitinpromoter:ALAS:Ubiquitin terminater重组质粒Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitinterminater片段，将回收片段按1:3(摩尔比)比例用T4 DNA连接酶连接，通过遗传转化，得到重组质粒pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater，即植物表达载体pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater。

pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)重组质粒HindIII酶切鉴定如图4所示。pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater重组质粒HindIII和EcoRI双酶切鉴定如图5所示。

实施例3：植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)和pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater导入农杆菌

制备农杆菌EHA105的感受态细胞，用热击转化法将上述构建好的植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)和pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater导入农杆菌EHA105中，在加有利福平以及卡那霉素的培养基平板上筛选转化子。从-70℃取出的农杆菌感受态细胞置于冰上约5min，待其解冻后，加入1μl质粒与农杆菌感受态细胞混匀，在-20℃冰水上放置30min，迅速转入37℃水浴热击30min，加入800μl液体SOC培养基，28℃，200rpm恢复3-5hrs，取200μl涂含50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平的YEP平板上，28℃黑暗培养48hrs,获得单菌落并进行菌落PCR筛选，获得含有pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)和pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater质粒的阳性转化子。

实施例4：植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)和pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater的重组农杆菌转化水稻

1)取阳性农杆菌转化子(含有植物表达载体pCAMBIA1300：2×35S:ALAS:poly(A)和pCAMBIA1300：Ubiquitin promoter:ALAS:Ubiquitin terminater)单菌落，接种于YEP培养基中(含利福平50μg/ml，卡那霉素50μg/ml)，28℃，200rpm震荡摇培2天。

2)取600-1000μl的菌液加入到50ml含有相应抗生素、100μmol/L AS的LB培养基中，培养至菌液处于变色的临界状态(OD₆₀₀＝0.3-0.4)。

3)4℃4000rpm离心10min收集菌体，弃上清液，加入MS液体养基(含100μmol/L AS)重悬后，4℃4000rpm再离心10min收集菌体，弃上清液，加入MS液体养基(含100μmol/L AS)重悬，将菌液稀释至浓度OD₆₀₀＝0.3-0.4。

4)向无菌三角瓶中的愈伤组织加入农杆菌菌液，侵染30min,侵染过程中不断摇动三角瓶。

5)将侵染后的愈伤组织取出置于灭菌滤纸上，吸去多余菌液，置于共培养培养基上(培养基表面放置一层灭菌滤纸)26±1℃暗培养2天。

6)将共培养后的水稻愈伤组织取出，用无菌水冲洗5-6遍，吸去多余水分，转接到有灭菌滤纸的平皿中，在超净工作台上无菌风干水分。之后再将愈伤组织转移到含有500mg/L头孢霉素，50mg/L潮霉素的NB筛选培养基上进行筛选。

7)2周后继代筛选一次，将筛选2次后的愈伤组织转移到分化培养基上，光照条件下26±1℃培养分化。

8)2-4周后从愈伤组织将再生小苗切离转至1/2MS培养基上，进行生根培养。待小苗长到15cm左右时炼苗2-3天，移栽入土。

在本实施例中选用的水稻品系是为粳稻台北309、粳稻4008S和籼稻D1。共获得转基因粳稻台北309为84株、粳稻4008S为14株和籼稻D1为68，同时取转基因309-Ubiquitin-ALAS、4008S-Ubiquitin-ALAS、D1-Ubiquitin-ALAS和309-2X35S-ALAS、4008S-2X35S-ALAS和D1-2X35S-ALAS的叶片进行潮霉素(50μg/ml处理)耐受性筛选分析，阳性植株明显表现为耐受，而对照表现为不耐受和坏死。图9显示粳稻台北309转基因的实验过程，其中显示了愈伤组织的分化、再生苗在1/2MS培养基上生根以及再生植株生长情况的照片；图10转基因材料潮霉素耐受性分析。

实施例5：转基因水稻品系中5-ALAS基因的整合及转录检测

确认通过潮霉素筛选的转基因水稻株系是否含有目的基因片段，用PCR方法对转基因水稻品系进行初筛鉴定。

首先采用CTAB法提取植物基因组：(1)取0.3-0.5g新鲜的转基因水稻叶片，用液氮充分研磨成粉末状。(2)将粉末状叶片转入1.5ml无菌微量离心管中，加入600μl预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴30min。(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24∶1)，混匀，室温12000rpm离心10min。(4)取上清液，移入新的无菌微量离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置15min至数小时。(5)室温12000rpm离心10min，收集沉淀。(6)沉淀用1ml 75％乙醇漂洗，室温12000rpm离心3min，弃去上清液，重复3次。(7)倾去洗液，干燥沉淀，溶于500μl TE(pH8.0)，加入终浓度为10μg/ml的RNaseA，37℃水浴30min，所获得的基因组DNA样品凝胶电泳检测。

以植物基因组DNA为模板，用5-ALAS基因的上下游引物和潮霉素基因的上下游引物进行PCR检测，电泳检测分别显示5-ALAS片段长度为1.2kb；潮霉素基因片段长度为0.9kb,表明目的基因已经成功整合到转基因植株基因组中。

转基因植株目的基因转录情况检测，抽取转基因水稻总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析。取0.3g植物嫩叶材料，加入液氮后充分研磨成粉末，转入1.5ml Eppendorf管；加入600μl水饱和酚仿和600μl TRIzoLRNA提取缓冲液剧烈振荡混匀，冰浴5-10min；4℃，12,000rpm离心10min；取上清，等体积水饱和酚仿再抽提一次，4℃，12,000rpm离心10min；取上清加入等体积的4mol/L LiCl，混匀后置于4℃放置过夜或-20℃2h沉淀RNA；4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；70％乙醇洗涤沉淀两次，沉淀干燥后溶于适量DEPC处理过的ddH₂O中，用DNase处理37℃30min,然后用等体积水饱和酚仿再抽提一次，4℃，12,000rpm离心10min；取上清加入等体积的4mol/L LiCl，混匀后置于4℃放置过夜或-20℃2h沉淀RNA；4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；70％乙醇洗涤沉淀两次，沉淀干燥后溶于适量DEPC处理过的ddH₂O中，于-20℃或-70℃保存备用。取植物总RNA约0.1-0.5μg，oligo(dT)50ng,10mMdNTP mix1μl,用DEPC处理水补足至10μl,混匀之后短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl,将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min,加入1μl反转录酶，将上述混合物混匀之后，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min,合成cDNA。以cDNA为模板，用5-ALAS基因的上下游引物进行PCR反应，以actin引物作为对照引物。获得的目的片段，通过割胶回收、连接转化、重组子测序证实目的基因已经成功整合到转基因水稻植株基因组中。

以目标基因和选择标记基因潮霉素为目标，利用PCR对粳稻台北309-Ubiquitin-ALAS、4008S-Ubiquitin-ALAS和D1-Ubiquitin-ALAS的转基因植株T0代进行筛选，阳性率分别为53.84％、46.97％和38.64％，如下表1所示为进一步验证目的基因在转基因水稻植株整合情况，以转基因309-Ubiquitin-ALAS为对象，参照上述方法抽提阳性转基因植物基因组DNA，并利用HindIII酶消化DNA过夜(37℃)，参考分子克隆第三版，结合地高辛标记试剂盒说明，以目标基因5-ALAS为探针进行southern杂交，杂交结果显示目的基因为单拷贝和多拷贝整合到植物基因组中，具体为1-3个拷贝不等(具体见图8)。选择单拷贝的转基因植株开展进一步的研究。

表1部分转5-ALAS基因T0代PCR检测结果

实施例6：转基因水稻植株5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力测定与5-氨基乙酰丙酸含量测定

ALA合成酶活性测定参照Burnham(1970)方法稍加改动。首先用凯基植物总蛋白提取试剂盒，提取转基因水稻植株的总蛋白，将蛋白抽提液500μL与等体积反应试剂(含50mmol/L Tris—HC1，pH 7.5，20mmol/L氯化镁，0.1mol/L琥珀酸二钠，0.1mol/L的甘氨酸，0.1mmol/L的磷酸吡哆醛，15mmol/L ATP，0.2mmol/L的辅酶A)混合，分别反应10min、20min和30min后，加入500μl 10％的三氯乙酸终止反应，13000r/min离心5min。取上清加入1mL2mol的醋酸钠(pH 4.6)，混匀后加入300μL乙酰丙酮，混匀后沸水浴15min，冷却至室温。加入2.5mL Ehrlich’s试剂(60％的冰醋酸(V/V)，2％对二甲氨基苯甲醛(m/V)，11.2％的高氯酸(V/V))。室温反应15min，待显色完全后于556nm测其吸光度，计算ALA合成量。总蛋白含量采用Bradford法测定。酶活力单位定义为37℃1min内合成IμmolALA所需酶量。

3个转基因品系的5-氨基乙酰丙酸合成酶活性测定结果表明表2所示(品系中最后的数值是转基因品系的编号)。

表2不同转5-氨基乙酰丙酸合成酶基因水稻品系酶活性和5-氨基乙酰丙酸含量的比较

由此可见，5-ALAS拷贝为单拷贝的3个转基因品系309-Ubiquitin-ALAS、4008S-Ubiquitin-ALAS和D1-Ubiquitin-ALAS 5-氨基乙酰丙酸合成酶活性测定结果表明：转基因水稻中的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力是供体品系植株的1.6-1.9倍，5-氨基乙酰丙酸含量是供体品系植株的2.6-3.8倍。可见转基因309-Ubiquitin-ALAS、4008S-Ubiquitin-ALAS和D1-Ubiquitin-ALAS，尤其是309-Ubiquitin-ALAS、4008S-Ubiquitin-ALAS水稻中5-氨基乙酰丙酸合成酶基因活性明显高于对照，而且提高了5-氨基乙酰丙酸的含量。

实施例7转5-ALAS基因水稻苗期耐低温胁迫能力的鉴定

苗期低温鉴定的水稻种子按常规浸种24h，35℃催芽48h，1周后播种在白瓷盘中，均匀播下50粒发芽一致(胚根1cm，胚芽0.5cm)的稻种，每盘播1个品种，在28℃L/24℃D的光照培养室中长至三叶期，8℃处理2d，以未处理的植株为对照组,转基因植株和对照在苗期进行耐低温胁迫后，5、6、9、11号株系(转基因台北309)的根长明显比对照长，3、5、11号株系(转基因台北309)的根数明显多于对照，3号株系的平均鲜重明显比对照重(具体见表3，以及图6、图7)。其中，图6显示T3代转5-ALAS基因植株芽期低温胁迫芽期耐冷性结果图示，图7显示转基因植株苗期耐低温胁迫1-3：3、6、9号转基因株系(转基因台北309)。(根据表4，与对照比较，可以看出转基因水稻各品系芽期和苗期进行低温处理后，4℃时植株的存活率提高了约35％-50％，8℃时植株的死亡率降低来哦60％-70％，孕穗期结实率提高20％-38％，表明所有转基因水稻对低温胁迫的耐受性明显提高，而且粳稻309-Ubiquitin-ALAS和4008S-Ubiquitin-ALAS比籼稻D1-Ubiquitin-ALAS的耐受性更好。

表3转基因植株苗期耐低温胁迫分析

注：小写字母不同表示多重比较的差异达5％显著水平，大写字母不同表示多重比较的差异达1％显著水平。

下同

表4转基因水稻各品系与对照芽期、苗期和孕穗期耐低温鉴定

注：芽期耐低温按9级标准评级。1级：全部存活；3级：80％-90％存活；5级：50％-79％存活；7级：1％-49％存活；9级：全部死亡。三叶期秧苗的耐低温评价：1级：幼苗枯死率0-20％；2级：幼苗枯死率21％-30％；3级：幼苗枯死率31％-40％；4级：幼苗枯死率为41％-50％；5级：幼苗枯死率51％-60％；6级：幼苗枯死率61％-70％；7级：幼苗枯死率71％-80％；8级：幼苗枯死率81％-90％；9级：幼苗枯死率91％-100％。孕穗期耐低温的评价标准为：1级：80％-100％结实；2级：70％-79％结实；3级：60％-69％结实：4级：50％-59％结实；5级：1％-49％结实；6级：不结实。

实施例8转5-ALAS基因水稻苗期耐低温胁迫能力的机理

根据水稻最早感受低温的部位是叶片，植物质膜的流动性与其膜上的脂肪酸的成分有关，通过其不同的脂肪酸成分来影响膜的流动性和膜蛋白功能。为此测定了在低温条件下不同转基因水稻品系与对照的膜脂脂肪酸含量变化。由表5的数据可知，与转基因籼稻D1-Ubi-ALAS和非转基因籼稻D1相比，耐冷性更好的转基因粳稻台北309-Ubi-ALAS在正常条件下含不饱和脂肪酸较多，不饱和度脂肪指数较高。转基因粳稻台北309-Ubi-ALAS经低温处理后，与未处理的成分相比，脂肪饱和度下降21.80％，不饱和脂肪指数增加4.70％。而耐低温系数较低的非转基因籼稻D1，其脂肪饱和度增加11.60％，不饱和脂肪指数下降8.70％。转基因籼稻D1-Ubi-ALAS则处于中间，其脂肪饱和度下降5.1％，不饱和脂肪指数增加1.9％。转5-ALAS基因籼稻品种与非转基因籼稻相比，低温处理后其脂肪饱和度显著下降，不饱和脂肪指数显著增加。推测5-氨基乙酰丙酸可能参与调控了这种膜的脂肪酸组分变化过程。

表5不同水稻品种剑叶脂肪酸含量的变化

注：不饱和脂肪指数＝18:1mol％+18:2mol％x 2+18:3mol％x 3；脂肪饱和度＝16:0mol％+18:0mol％。

序列表

<110>湖南省植物保护研究所

<120>一种提高植物耐低温胁迫能力的方法及其植物表达载体

<160>5

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>1230

<212>DNA

<213> Rhodoblastus acidophilus

<400> 1

atggattaca ccaagttctt cgcagacgcg cttgaccgtt tgcatgctga gcgccgctat 60

cgcgtttttg ccgatctgga acgcgtcgcg ggccggttcc cccacgccac ctggcactcc 120

ccgagcggcg aacgcgacgt cgtgatctgg tgctcgaatg attatctcgg catgggccag 180

cacccgaagg tggtcggcgc aatggtcgag accgcgacgc ggctcggcac tggtgccggt 240

ggcacccgca acatcgccgg cacgcaccat ccgctggtga tgcttgagag ggaactggca 300

gatctgcacg gcaaggaagc cgcgctgctg ttcacctcgg gctacgtctc gaaccagacc 360

ggcatttcga cgctcgccaa gctgatcccg aactgcctga tcctgtcgga cgcgctcaac 420

cacaattcga tgatcgaagg catccgccag tcgggttgcg agcgcattgt ctggcgccac 480

aacgacaccg cgcatctcga agagttgctg cgcgccgttg agccgggccg cccggtgctg 540

atcgcgttcg aaagcctgta ttcgatggac ggcgacgtcg cgccgatggc gaagatctgc 600

gatctcgccg aaaaatatgg cgccatgacc tattgcgacg aagtccatgc ggtcgacatg 660

tacggcgccc gcggcgccgg cgttgccgag cgggatggtg tgatgcaccg catcgacatc 720

atcgaagcga cgctggccaa ggcgttcggc tgcctcggcg gctacatctc cggcaagaag 780

gacgtgatcg acgccgtgcg ctcctatgcg ccgggcttca tcttcacgac cgcgctgccg 840

ccgccgatct gcgccgctgc gaccgccgcg atccgccacc tcaagacctc gacctgggag 900

cgtgaacgtc accaggatcg tgccgcgcgc ctcaaggccg tgctcaacac cgccggcctg 960

ccggtgatgc cgaccgacac ccacatcgtt ccggtgttcg tgggcgatgc cgagcgctgc 1020

aagaaggcca gcgatctcct gctggaaaag cacggcatct acatccagcc gatcaactat 1080

ccgaccgttg ccaagggcaa ggagcggctg cgcatcaccc cgtcgccgta tcatgacgac 1140

gatctgatgg atcggctggc cgaagcgctg gtcgacgtct gggagacgct ggaactgccg 1200

ctcggcgcca agccgctcgc tgcggaataa 1230

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatggatgg attacaccaa gttcttc 27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 3

ggatccttat tccgcagcga gcggctt 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 4

cccgggatgg attacaccaa gttcttc

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gagctcttat tccgcagcga gcggctt 27

Claims (10)

1.一种提高水稻耐低温胁迫能力的方法，其特征在于通过在植物中导入表达5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，以获得转基因植物的耐低温胁迫能力，其中所述水稻为光温不敏感、光合效率较低的优良水稻品种。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)，优选地，所述的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达是通过组型启动子，优选为Ubiquitin启动子，35S启动子，更优选为两个35S启动子串联；优选地，所述转基因植物中选择整合所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因拷贝数为1至2个拷贝。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻品种、籼粳杂交品种，更优选为粳稻台北309、粳稻4008S。

5.一种制备耐低温胁迫能力提高的转基因水稻的方法，其特征在于，其是通过含有5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的植物表达载体转化植物，筛选获得耐低温胁迫能力提高的转基因水稻，其中所述水稻为光温不敏感、光合效率较低的优良水稻品种。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述表达载体的出发载体为pCAMBIA1300。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的表达是通过组型启动子，如Ubiquitin启动子，35S启动子，更优选两个35S启动子串联。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的来源于光合细菌嗜酸柏拉红菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(5-ALAS)具有SEQ ID No.1所示的序列。

10.5-氨基乙酰丙酸合成酶基因有提高植物耐低温胁迫能力中的应用，所述水稻是粳稻品种、籼粳杂交品种，更优选为粳稻台北309、粳稻4008S。

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