CN1412323A - 一种筛选转基因植物的方法及其所用的双价植物表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型的筛选植物转化体的方法及其所用的植物双价表达载体。该方法用草甘膦抗性基因取代以往所用的抗生素抗性基因，作为筛选转基因植物品系的标记基因。方法中所用的植物双价表达载体含有草甘膦抗性基因和所要筛选的植物性状基因。本发明不仅能够高效筛选植物转化体，而且用作筛选标记基因的草甘膦抗性基因具有双重功效，一方面作为抗除草剂基因，另一方面作为一种植物筛选标记基因，并与其它的重要目的性状基因连锁起来转化植物，将大大方便转化植物的筛选以及纯系育种品种的筛选。用本发明方法筛选的转基因植物，不仅具有良好的目的转化基因的性状，而且具有良好的抗草甘瞵性状。

Description

一种筛选转基因植物的方法及其所用的双价植物表达载体

                                  技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种以草甘膦抗性基因作为标记基因筛选转基因植物的方法，及其所用的双价植物表达载体。

                                  背景技术

如何筛选植物转化体是成功获得转基因植物的一个关键技术。选择标记按照其基因产物的性质主要有几大类型：抗生素类、生化类、荧光素类及抗除草剂类。目前，大多采用抗生素抗性基因作为筛选植物转化的标记基因，最常用的有新霉素磷酸转移酶基因(Npt II)和潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)。前者基因编码酶对卡那霉素(km)和新霉素(neo)具有抗性，后者基因编码酶对潮霉素(hyg)产生抗性。虽然这些抗生素抗性基因作为标记基因具有转化率较高且方便筛选的优点，但人们担心这些抗性基因一旦由转基因植株转移到病原菌中，将会使病原菌对抗生素产生抗性。用荧光素类基因仅作为报告基因，无选择(筛选)作用。生化类基因标记，如二氢叶酸还原酶基因标记，由于价格昂贵，不宜推广。上述三大类型选择标记仅仅作为筛选标记，不能够作为目的性状基因。目前常用的抗除草剂基因有抗草丁膦的bar(Basta乙酰CoA转移酶)基因和抗溴苯氰的bxn(腈水解酶)基因，但这两种筛选剂都逐渐被淘汰，因为草丁膦价格太昂贵而溴苯氰能被皮肤吸收影响啮齿动物的发育。

草甘膦对动物毒性低(大白鼠LD 50，口服11343mg/kg，皮下注射7500mg/kg)，在环境中可被多种微生物分解，也可通过理化途径降解，所以基本上没有对环境污染的问题。利用莽草酸羟基乙烯转移酶基因(aroA)作为标记基因对人的食物链更为安全，因此是一种理想的植物标记基因。

草甘膦是一种内吸光谱性除草剂，它可无选择地抑制所有植物的莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)的活性，阻断芳香族氨基酸的合成，从而阻断植物的生长。EPSPS在芳香族氨基酸合成途径中催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成，形成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)。国外应用基因工程培育耐除草剂作物的研究已有15年以上，已开发出多种抗除草剂的转基因作物，因此，抗草甘膦基因本身又是目的性状基因。过去，抗草甘膦基因工程的主要策略是利用定点突变来改良草甘膦作用的靶蛋白EPSPS，但由于酶的三维结构和氨基酸作用部位并不完全清楚，所以定点突变的效果十分有限。遇到的问题是，突变后酶虽然降低了对草甘膦的亲和力，但同时对酶原低物的亲和力也下降，因而影响了酶的催化活性。CN1358858专利申请公开了一种采用基因优化技术所获得的抗草甘膦抗性基因aroAM12其特征是在EPSPS氨基酸位置由脯氨酸35→丙氨酸；丙氨酸40→缬氨酸；苏氨酸42→蛋氨酸；精氨酸83→组氨酸；赖氨酸185→谷氨酸；异亮氨酸201→丝氨酸；精氨酸330→苏氨酸。研究表明，由于EPSP合成酶中多个氨基酸位点的改变，使该酶对底物PEP亲和性增加，而同草甘膦亲和性下降，从而提高对草甘膦的抗性。

                                  发明内容

为了克服现有的筛选转基因植物的方法中筛选标记的单一作用或者安全性的不足，本发明提供一种新型筛选方法及其所用的植物双价表达载体。该方法不仅能够高效筛选植物转化体，而且方法中的筛选标记基因本身又是很好的目的性状基因。

本发明的筛选转基因植物的方法是：用草甘膦抗性基因取代以往所用的抗生素抗性基因，作为筛选转基因植物品系的标记基因。

本发明方法的具体步骤可以是：首先在植物表达载体中插入草甘膦抗性基因(最好是通过基因优化技术获得的草甘膦抗性基因，例如aroAM12)以及所要筛选的植物性状基因，构成植物双价表达载体；用该植物双价表达载体转化农杆菌，获得含有该表达载体的工程菌；再用此工程菌感染植物外植体；由于草甘膦对植物有毒性，所以感染后的外植体在分化培养基中分化一周后，待草甘膦抗性基因充分表达后再加入选择剂(草甘膦)进行筛选。

用于上述本发明方法的植物双价表达载体，其结构特征是：该载体含有草甘膦抗性基因和所要筛选的植物性状基因。

该植物双价表达载体可以采用植物表达载体pCAMBIA1300为基本载体，在pCAMBIA1300的多克隆位点MCS处插入草甘膦抗性基因和所要筛选的植物性状基因而构成。植物表达载体pCAMBIA1300中含有Ti质粒中T-DNA的左右边界序列(LB和RB)，在该段DNA中含有多克隆位点(MCS)，在两边界序列之外含有卡那霉素抗性基因km(r)。

上述植物双价表达载体所用的草甘膦抗性基因最好是通过基因优化技术获得的，例如aroAM12。

本发明利用草甘膦抗性基因的双重功效，即一方面作为抗除草剂基因，另一方面作为一种植物筛选标记基因，并与其它的重要目的性状基因连锁起来转化植物，将大大方便转化植物的筛选以及纯系育种品种的筛选。

试验证明，用本发明方法筛选的转基因植物，不仅具有良好的目的转化基因的性状，而且具有良好的抗草甘瞵性状。

以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。

                               附图说明

图1是含有BtS1m基因的pBtPCR2.1质粒的构建示意图。

图2是pGAT1300质粒的构建示意图。

图3是含有aroAM12基因和BtS1m基因的pCM12-BtS1m植物双价基因表达载体示意图。

图4是aroAM122和BtS1m基因的特异性检测引物进行PCR检测扩增的结果示意图。

图5是烟草叶片对草甘膦的抗性实验示意图。

图6是烟草生根抗性实验示意图。

图7是烟草植株对草甘膦的抗性示意图。

图8是双价转基因烟草表现出的抗虫效果示意图。

                              具体实施方式实施例1.抗虫、抗草甘膦植物双价表达载体的构建

按照表1.1所示的Hind III+Sal I双酶切反应及电泳体系，用Hind III+Sal I切割含有BtS1m基因片段的质粒pBtS1m(01129519.8号专利申请公开)，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A^GelExtraction kit(Omega，下同)回收2.7kb左右大小处的条带，得到2E-35sp+BtS1m片段。用HindIII+Xho I切割aroAM12PCR2.1质粒(含aroAM12基因的PCR2.1质粒，见图1)，回收4100bp处的条带，得到含有Nos终止序列的片段，然后用T4DNA连接酶将回收的2.7kb和4100bp的两部分DNA片段连接起来(连接反应体系见表1.2)，得到含有BtS1m基因的pBtPCR2.1质粒(见图1)。用EcoRI+Xho I切割含aroAM12基因片段的pCAMBIA1300-M12(由aroAM12基因片段插入pCAMBIA1300质粒构成，见图2)，回收2300bp处的条带，得到含有CaMV+TSP+aroAM12的片段；用EcoR I+Xho I切割pCAMBIA1300载体，回收6800bp处的条带，得到去除抗潮霉素基因的pCAMBIA1300空表达载体；然后用T4DNA连接酶将2300bp和6800bp两部分DNA片段连接起来，得到含aroAM12的去除抗潮霉素抗生素基因的pGAT1300质粒(见图2)。用Hind III+Xba I切割pGAT1300质粒，得到带有缺口的pGAT1300质粒。用Hind III+Xba I切割pBtPCR2.1质粒，回收3.0kb处的条带，得到2E-35spBt+Nos片段，然后用T4DNA Ligase连接带有缺口的pGAT1300质粒和3.0kb两部分DNA片段，即得到双价质粒载体pCM12-s1m(见图3)。该植物双价表达载体pCM12-s1m上含有抗草甘膦基因(aroAM12)和抗虫基因(BtS1m)，但不含可在植物中表达的抗生素抗性基因。其中，抗草甘膦基因(aroAM12)所在表达框的构成是：从5′到3′端方向(I)转录调控区的启动子CaMV35s，(II)转导肽序列(TSP)，以便将合成的产物转移到其作用靶位点叶绿体中，(III)抗草甘膦基因M12编码序列和(IV)3′端的非翻译区PolyA片段。抗虫基因BtS1m所在表达框的构成是：从5′到3′端方向(I)转录调控区，包含有2个增强子的35s启动子，即2E-35sp，(II)TMVRNA的Ω片段(翻译增强子)，(III)带分泌信号肽的嵌合Bt杀虫蛋白编码序列BtS1m，(IV)Nos，3′端的转录终止序列。

表1.1  Hind III+Sal I双酶切反应及电泳体系

    质粒载体DNA                   20.0μl

    Hind III(10U/μl)             3.0μl

    Sal I(10U/μl)                3.0μl

    10x反应缓冲液                 8.0μl

    ddH₂O                        46.0μl

在37℃条件下保温3小时，然后用1XTAE(0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA)电泳缓冲液配制1.0％的琼脂糖凝胶，在琼脂糖凝胶里加入EB(溴化乙锭)至终浓度为0.5μg/ml，在3-5V/cm的电压降下电泳。

表1.2  连接反应体系

     DNA片段1                  5.0μl

     DNA片段2                  5.0μl

     ddH₂O                    8.0μl

     T4 Ligase(5weiss U/ul)    0.5μl

     T4 Ligase缓冲液(10x)      2.0μl

     在16℃条件下连接反应过夜。实施例2.大肠杆菌转化子的获得

E.coli XL-1-blue感受态细胞的制备：①将XL1-blue的单菌落接入5mL不含抗生素的LB液体培养基(见表2.1)中，37℃、震荡过夜；②按1％(v/v)的量转入新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD₆₀₀＝0.3；③将50-100mL的LB液体培养基(LB配制见表2.1)加入两个无菌离心管中，在冰上放置30分钟；④在4℃、4000rpm(转/分)离心10分钟，去上清液，在每个离心管中加入10mL预冷的0.1％CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。⑤在4℃、4000rpm离心10分钟，去上清液，将菌体悬浮于2mL预冷的0.1％的CaCl₂溶液中，再加入300μL的无菌甘油，混匀，在每个无菌的离心管中加入100uL XLl-blue感受态细胞，于-70℃保存。

取实施例1中的连接产物(植物双价表达载体pCM12-slm)10μl，加入到刚好融化的大肠杆菌XL-1-blue感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；42℃水浴热激90秒钟，然后冰浴1-2分钟。加LB培养基1ml于Eppendorf管中，37℃水浴培养1小时，13000rpm离心5秒钟，去上清，加入100μl LB培养基，混匀，涂在LB+Km(kanamycine，卡那霉素)平板上。37℃培养24小时左右时，挑取单菌落，摇菌过夜，采用E.Z.N.A^Plasmid miniprep Kit回收质粒，经PCR和酶切检测后，挑选出阳性质粒，保存相应的菌落，即转化子。该转化子可用于扩增和提取植物双价表达载体pCM12-s1m。

  表2.1  LB液体培养基成分

      细菌培养用胰化蛋白胨        10g；

      细菌培养用酵母提取物        5g；

      NaCl                        10g；

      去离子水                    950mL

      (若配制固体培养基则再按18-20g/L的量加入琼脂。)

  完全溶解后用5mol/LNaOH调pH7.2，再加入去离子水至总体积为1L，然后高压灭菌即可。实施例3.根癌土壤杆菌的转化

  根癌土壤杆菌LBA4404感受态细胞的制备：①从含有链霉素(str)和利福平(Rif)的YEB固体培养基(见表3.1)平板上挑取LBA4404菌落，接种到5ml含有相应抗生素的YEB液体培养基(按表3.1，不加琼脂)中，28℃，200rpm震荡过夜。②用YEB液体培养基稀释至50ml，然后28℃、200rpm培养6-12小时，至OD₆₀₀值为0.6左右。③置于冰上5分钟，然后于4℃、2000rpm离心7分钟。④取1ml浓度为20mmol/L冰冷的CaCl₂溶液重悬沉淀，混匀。⑤分装成10份，每份100μl，-70℃冰箱中保存备用。

向-70℃冰箱中保存的杆菌LBA4404感受态细胞100μl中加入实施例2中所提取的质粒5μl，37℃水浴5分钟，之后加入1ml YEB液体培养基，室温下放置3小时。6000rpm离心30秒，倒掉上清，加入100μl YEB，混匀，涂布在YEB+Str+Rif+Km平板上。48小时左右时，挑取单菌落(经酶切和PCR检测，确认为含有双价基因质粒载体)，摇菌过夜，培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6时用于感染。

表3.1  YEB固体培养基成分

    细菌培养用胰化蛋白胨    5g/L

    细菌培养用酵母提取物    5g/L

    蔗糖                    5g/L

    硫酸镁                  2mmol/L

调pH值至7.2，按18g/L的量加入琼脂。实施例4.含有双价载体的工程菌对烟草的转化及抗性植株的获得

将实施例3得到的工程菌感染烟草外植体(叶片，剪成0.5×0.5cm大小)5分钟，用经过高压灭菌的滤纸吸干，移入到MS+6-BA(6-benzyladenine，6-苄基嘌呤)1mg/L+NAA(naphthalene acetic acid，萘乙酸)0.1mg/L+3％蔗糖+0.7％琼脂的培养基中暗处共培养48小时。用无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干，然后移入到含有头孢霉素(400mg/L)的MS+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)分化培养基中，28±2℃，漫射光条件培养，诱导分化。培养1周，再转移到含有选择剂草甘膦的分化培养基上[MS+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+草甘膦(30μmol/L)]。继续培养一段时间(3周)，当芽长至2-3cm时，将产生的抗性芽切下移入到不含草甘膦的MS+NAA(0.1mg/L)生根培养基中，诱导根的形成。一周后不定根出现。在过两周后打开瓶盖炼苗2-3天，将苗取出，用自来水冲去根部培养基，移到盆中，保湿1周后即可成活。实施例5.转基因植株的分子生物学鉴定

取待测烟草植株(实施例4筛选得到的抗性植株)幼嫩叶片，采用CTAB(十六烷基二甲基乙基溴化铵)法微量提取DNA：取约1-2cm²的新鲜幼嫩叶片，在一装有400ul冰冷的CTAB(-)缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.7mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA pH8.0)的管中用玻璃棒磨碎，然后加入500μl于65℃预热的CTAB(+)缓冲液{CTAB(-)，2％CTAB.使用前加入1％的2-巯基乙醇}，混匀，65℃保温90分钟，期间不时颠倒混匀，后取出，待冷至室温后加入450ul氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，颠倒混匀至溶液呈乳浊状，离心10分钟。将上层液相转移至一干净的Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，室温放置20分钟，然后离心5分钟，收集沉淀。用70％乙醇洗涤DNA沉淀，于空气中干燥后，加入20μl双蒸水溶解。

分别用aroAM12和BtS1m基因的特异性检测引物(按照表5.1和表5.2体系)进行PCR检测。aroAM12引物序列为：引物1：5’-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3’

               引物2：5’-CGCGGATCCTTAGCAGGCTACTCATTC-3’Bts1m引物序列为：引物1′：5′TATCCCATTGTTCGCAGTCC 3′

             引物2′：5′CATCACGACTCAAGTTGTTA 3′

表5.1  PCR反应液

2×TaqDNA聚合酶缓冲液，4种dNTP各200μM，根据各模板设计的特异引物各3pM(BIOASIA)，各源模板DNA约10²-10⁴拷贝，TaqDNA聚合酶(上海生工)约.0.5-5U。具体为：

    dNTPs                         2μl

    模板DNA                       1μl

    TaqDNA聚合酶                  0.5μl

    引物1                         0.5μl

    引物2                         0.5μl

    ddH₂O                        16.5μl

表5.2  PCR反应程序

    预变性：94℃，5分钟

    循环：94℃60秒，58℃60秒，72℃60秒

          共进行30次。

    72℃延伸10分钟。

反应结束后，电泳检测PCR扩增结果。电极缓冲液为1xTAB，1.0％的琼脂糖凝胶，在3-5V/cm的电压降下电泳1小时。

检测结果如图4所示。其中M为DNA ladder，ck为空白对照，上图a，b，c，d为加入BtS1m特异引物后的检测结果，下图a，b，c，d为加入aroAM12特异引物后的检测结果。从中可以看出，两组引物分别在1.3kb(aroAM12片段)和0.98kb(BtS1m部分片段)处出现了扩增条带。从图4中可以看出用草甘膦抗性基因作为标记基因筛选出的4株转化苗的DNA扩增结果表明，该双价基因已经整合到植物基因组DNA中。实施例6.植株对草甘膦的抗性检测

取实施例4所获得转化烟草苗幼叶，剪成0.5×0.5cm大小，放在含有10到100μmol/L草甘膦的MS+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+3％蔗糖+0.7％琼脂的分化培养基中，在28℃恒温，每天16小时光照条件下培养。以未经转化的烟草叶片作为对照，检验转化所获得的烟草对草甘膦的抗性，实验结果如图5所示：上面一行A为转基因烟草叶片，从左到右培养基中草甘膦的浓度依次为0、0.05、0.4、0.8、1.2mmol/L；下面一行B为野生对照烟草叶片，从左到右培养基中草甘膦的浓度依次为0、0.05、0.4、0.8、1.2mmol/L。从图中可以看出转基因植株的叶片在1.2mmol/L草甘膦的培养基上仍能分化出芽，而对照在0.05mmol/L草甘膦的培养基上时就没有芽分化出来，表明所获得的转化植株具有很好的草甘膦抗性。

将诱导出的抗性芽和空白对照分化出的芽转移到MS+NAA(0.1mg/L)+3％蔗糖+0.7％琼脂+30μmol/L草甘膦的生根培养基中，在28℃恒温，每天16小时光照条件下培养20天，观察生根的情况。结果如图6所示：其中a为双价转基因烟草，CK为空白对照烟草；转基因植株能够在30μmol/L草甘膦的生根培养基中正常生根，而对照则不生根或很少生根。

将移栽到大棚的草甘膦抗性烟草苗，直接用孟山都公司的Roundup(活性成分为稀释至1.55g/L草甘膦)喷洒。结果如图7所示：其中a1为空白对照烟草苗喷洒草甘膦(1.55g/L)前的生长状况，a2为喷洒后15天的生长状况；b1为双价转基因苗喷洒草甘膦(1.55g/L)前的生长状况，b2为喷洒后15天的生长状况。喷洒一周后，转基因获得的烟草，没有受损的现象；第二次喷药后，在少数叶片上出现了一些黄色的斑点，但不影响整棵烟草的生长和长出新叶，而对照则在10天后死亡。

综合图5、图6、图7结果表明：转基因植株表现出了良好的抗性。实施例7.转基因烟草对棉铃虫的杀虫活性测定

试验设计转基因植株aroAM12，aroAM12+BtS1m和常规烟草(CK)三个处理。用于处理1，2龄幼虫的烟叶放入铺有浸湿滤纸的培养皿中，叶柄基部用湿润的脱脂棉球包裹，以防叶片迅速萎焉。试验组和对照组各接入1龄棉铃虫8头和2龄棉铃虫3头，接虫前称重。接虫后置于28±2℃，光照∶黑暗＝16∶8hrs的温室中，3天后观察幼虫的生存和发育的情况。结果如图8和表7.1所示。从图和表中可以看出，双价转基因烟草表现出良好的抗虫效果。

                 表7.1  转基因烟草对棉铃虫幼虫生存和发育的影响材料    死亡率(％)      存活幼虫体重      PCR结果        对草甘膦代号    3d       6d      (mg)3d       BtS1m   aroAM12    的抗性o       12.5     12.5    5.0±0.3      -        +          +a       88.5     100     0.6±0.3      +        +          +b       80.0     90      0.7±0.2      +        +          +c       85.0     100     0.6±0.35     +        +          +d       80.0     100     0.5±0.28     +        +          +CK      10.0     10.0    5.5±0.4      -        -          -

表中，o为含有aroAM12单价基因植株，a、b、c、d为含有aroAM12+BtS1m双价转基因植株，CK为空白对照。

Claims (8)

1.一种用标记基因筛选转基因植物的方法，其特征是：用草甘膦抗性基因取代抗生素抗性基因，作为筛选转基因植物品系的标记基因。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是：首先在植物表达载体中插入草甘膦抗性基因以及所要筛选的植物性状基因，构成植物双价表达载体；用该表达载体转化农杆菌，获得含有该表达载体的工程菌；再用此工程菌感染植物外植体；感染后的外植体在分化培养基中分化一周至草甘膦抗性基因充分表达后再加入选择剂草甘膦进行筛选。

3.用于权利要求1或2所述方法的植物双价表达载体，其特征是：该载体含有草甘膦抗性基因和所要筛选的植物性状基因。

4.按照权利要求3所述的植物双价表达载体，其特征是，该载体是在基本载体pCAMBIA1300的多克隆位点MCS处插入草甘膦抗性基因和所要筛选的植物性状基因而构成的。

5.按照权利要求3或4所述的植物双价表达载体，其特征是其所含的草甘膦抗性基因是通过基因优化技术获得的。

6.按照权利要求5所述的植物双价表达载体，其特征是其所含的草甘膦抗性基因是aroAM12。

7.按照权利要求6所述的植物双价表达载体，其特征是其所含的要筛选的植物性状基因是抗虫基因BtS1m。

8.按照权利要求7所述的植物双价表达载体，其特征是该载体是pCM12-s1m，其中，抗草甘膦基因aroAM12所在表达框的构成是：从5′到3′端方向(I)转录调控区的启动子CaMV35s，(II)转导肽序列TSP，(III)抗草甘膦基因aroAM12编码序列和(IV)3′端的非翻译区PolyA片段；抗虫基因BtS1m所在表达框的构成是：从5′到3′端方向(I)转录调控区，包含有2个增强子的35s启动子，即2E-35sp，(II)TMVRNA的Ω片段翻译增强子，(III)带分泌信号肽的嵌合Bt杀虫蛋白编码序列BtS1m，(IV)Nos，3′端的转录终止序列。

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