CN102584961A - 一种抗虫蛋白Cry1A.401、其表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗虫蛋白Cry1A.401，其特征在于，其具有：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟有显著的杀虫效果，本发明的抗虫基因Cry1A.401能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。

Description

一种抗虫蛋白Cry1A.401、其表达载体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体地说，涉及一种抗虫蛋白Cry1A.401、其表达载体及应用。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringHansis)。它在芽孢形成过程中产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。一般认为，晶体蛋白的杀虫作用分为5个步骤：包括溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成，每个步骤都能够影响晶体蛋白的杀虫效果(Moonsom等，2007)。伴胞晶体进入昆虫机体后，在中肠的碱性条件下二硫键被打开，溶解为前毒素，然后在胰蛋白酶的作用下激活成有活性的毒素蛋白。然后毒素蛋白与中肠上皮细胞膜受体结合，有毒性的α-螺旋穿透细胞质膜形成孔或灶，破坏细胞膜表面的膜电势，细胞渗透性平衡失调，胀破裂解，中肠坏死，围食膜和中肠上皮受损，中肠内的碱性物质进入血腔，导致昆虫麻痹死亡(Soberón等，2009)。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。

1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1987年，比利时Vaeck等人首次获得转Bt杀虫蛋白的抗虫烟草，但只能检测到微弱的抗虫性，其表达蛋白几乎检测不到，只占可溶性蛋白的0.001％。同年又有两次获得Bt转基因植株的报道(Barton等，1987；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。到1990年，至少有7个研究小组获得Bt转基因植物并应用于大田试验(Estruch J等，1996)。1993年，Michael等人对Cry1Ab基因进行改造，获得Bt转基因植株，对玉米螟有很好的抗性。KozHal(1993)等人工合成了一个G+C含量达到65％的结构基因(与野生型CryIA(b)基因的同源性为65％)，利用基因枪技术把该合成基因导入玉米品种，培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达Cry1A(b)抗虫基因。1996年，Joachim W等人将Cry1Ab进行截短修饰，转化水稻，获得转Bt水稻，靶标害虫死亡率达100％。1998年，Cheng等人根据植物所偏爱的密码子，改造了Cry1Ab和Cry1Ac基因用农杆菌转化法转化水稻获得转基因植株，R2代虫试，5天内有100％致死率。Bohotova等(2001)人工改造合成Cry1B基因，转化热带玉米得到转基因玉米能有效防治玉米螟。

我国对Bt杀虫蛋白基因的研究主要是：1992年，郭三堆等人采用植物优化密码子方法首先在国内人工合成全长1824bp的GFMCry1A杀虫基因，获得了中国第一代单价抗虫棉。丁群星等(1993)和王国英等(1995)分别用子房注射法和基因枪法将pB48.415质粒转入玉米愈伤组织中获得转基因植株，抗虫性测定表明其具有一定抗虫性。李慧芬等(2002)用基因枪转化技术将Cry1Ac3-cpti融合基因导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，获得可育的转基因植株，且部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性。朱常香(2003)通过共转化法将含有Cry1Ab基因和bar基因的两个质粒导入玉米自交系，2个基因共整合的频率为70％，且呈连锁遗传和表达，大部分转化植株具有较高的抗虫性。张红伟等(2004)利用基因枪法将Bt基因GFMCry1A导入玉米杂交种‘京玉7号’(501/京24)的亲本之一—自交系501的幼胚和愈伤组织中，从转基因高世代材料中筛选出高抗玉米螟的转基因株系T123，并配制出高抗玉米螟杂交新组合。共转化法能够实现多基因在同一受体植株中转化，被引入应用到转Bt毒蛋白基因玉米的研究中，取得了一定的成果。张艳贞等(2004)采用农杆菌介导法将Bt基因导入玉米自交系340、4112中，经PCR、PCR-Southern和Southern blotting检测，证明外源基因Bt已稳定整合到玉米基因组中，平均转化率为2.35％。李余良等(2007)利用基因枪法将Bt和GNA基因共转化超甜玉米自交系S1幼胚，获得含Bt基因11株，其中有5株能扩增出GNA基因。对9株转基因T1代植株叶片室内接虫抗性鉴定，有5株转基因植株表现较强的抗性。袁英等(2007)采用基因枪法将杀虫毒蛋白基因(Cry1A)导入东北春玉米自交系铁7922中，通过对后代植株的PPT筛选、分子鉴定和ELISA法检测，证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传，且筛选出一批抗玉米螟自交系。近年来，研究表明从分子水平上对Bt基因序列进行改造和对相关调控元件进行优化能够提高基因的表达量，得到了越来越多研究者的关注。Wang等(2008)将一个由ubi启动驱动的Cry1Ah基因转入玉米幼胚，结果表明阳性转化植株对亚洲玉米螟具有较高抗性，并且通过对比试验证明ubi启动子能够有效提高Bt毒蛋白的表达量。我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系。

转基因作物中应用最多的是第一大类中的Cry1Ab，其次是Cry1Ac和Cry1F。Cry1Ab蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒杀作用的伴胞晶体，其在生物防治领域具有重要的应用前景。苏云金杆菌δ-内毒素基因Cry1Ab来源于微生物，但其转基因植物存在表达量低、表达产物不稳定、抗虫性效果差等问题。通过改造碱基序列提高GC含量能提高其在转基因植物中的表达量，达到杀虫目的(Koziel，1993)。Cry1Ac杀虫晶体蛋白，一般由1100-1200个氨基酸组成，分子量在130-140kD之间。就交互抗性而言，研究表明：能够在表达Cry1F蛋白的转基因玉米TC1507上完成幼虫发育的Cry1F抗性欧洲玉米螟品系，与Cry1Ab和Cry9C没有交互抗性，仅对Cry1Ac有低水平的交互抗性(Pereira E J G，2008)。一般认为结构域I参与孔道的形成，结构域II决定毒素与受体的特异性结合，结构域III主要调节毒素的活性。

玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，当前玉米虫害(以玉米螟为主)严重，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。由于缺乏合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂；但是化学杀虫剂同时杀死害虫及其天敌，造成生态不平衡和环境污染。通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。因此，应用新的抗虫基因、提高杀虫蛋白的表达量以及培育新型抗虫转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种抗虫蛋白Cry1A.401。

本发明的另一个目的是提供编码上述蛋白的基因。

本发明的另一个目的是提供含有上述基因的载体。

本发明的另一个目的是提供上述载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供上述蛋白在提高转基因植物抗虫性中的应用。

本发明的进一步目的是提供上述蛋白在制备杀虫剂中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种抗虫蛋白Cry1A.401，其具有：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的还提供了编码上述蛋白的基因Cry1A.401，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的抗虫基因Cry1A.401是通过将密码子优化后的Cry1Ab的第一、第二功能结构域1392bp和Cry1F的第三功能结构域444bp和Cry1Ac一个长1698bp的片段拼接在一起，形成新的Cry1A.401核苷酸序列，

本发明还提供了含有抗虫基因Cry1A.401的载体，优选双价载体CPB，该载体含有一个筛选基因bar基因，一方面，有利于转化体的筛选，减小后期检测工作量；另一方面，在转化体时，可以通过检测bar基因来进一步说明目的基因已转入受体植株。

进一步地，本发明还提供了含有上述载体的宿主细胞，优选LBA4404。

本发明还提供了含有抗虫基因Cry1A.401的转化植物细胞。

更进一步地，本发明还提供了抗虫基因Cry1A.401在提高转基因植物抗虫性中的应用。所述植物优选为农作物、果树或蔬菜，如玉米、水稻、马铃薯、棉花等。

将本发明基因Cry1A.401与原核表达载体可操作地连接，能够快速初步检测本发明合成的Bt基因表达产物对玉米螟的毒性。将本发明基因Cry1A.401与植物表达载体可操作地连接，并将表达载体导入相应的农杆菌中，进而通过农杆菌介导法进行遗传转化，培育抗虫转基因玉米。也可以对其它农作物或者果树等进行遗传转化，使其具备抗虫活性。

本领域技术人员还可以将本发明基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产Bt蛋白，并将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明人工合成的抗虫基因Cry1A.401序列与原始Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ac序列相比，大大增强了其在植物中的表达，扩大了抗虫谱。改造后的Cry1A.401基因与原始Cry1Ab的DNA序列同源性为39.52％，与原始Cry1F的DNA序列同源性为34.03％，与原始Cry1Ac的DNA序列同源性为79.86％。编码的氨基酸序列的比对分析显示，改造后的Cry1A.401编码蛋白与原始Cry1Ab编码蛋白的同源性为46.26％，与原始Cry1Ac编码蛋白的同源性为91.72％，与原始Cry1F编码蛋白的同源性为32.37％。本发明的抗虫基因Cry1A.401可在植物细胞中高效稳定的表达。

将抗虫基因Cry1A.401导入玉米后，可以得到稳定遗传的Cry1A.401转化体。此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明CPB(pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar)质粒图谱；

图2为本发明采用农杆菌介导法获得的转Cry1A.401基因玉米；其中，发芽(左)、共培养(中)以及转基因植株移栽到温室(右)；

图3为本发明T₀代转化体中目的基因Cry1A.401的PCR检测结果，其中，M为D2000；CK1为阳性质粒对照；CK2为未转基因阴性对照；空白为双蒸水对照；1-5是401-1到401-5；

图4为本发明T₀代转化体选择标记基因Bar的PCR检测结果，其中，M为D2000；CK1为阳性质粒对照；CK2为未转基因阴性对照；空白为双蒸水对照；1-5是401-1到401-5；

图5为本发明T₀代转化体目的蛋白Cry1A的免疫学检测，其中CK1为未转基因苗阴性对照；1-5为401-1到401-5。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1 Cry1A.401基因的合成

通过密码子优化，合成Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ac(合成工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。)，再通过SOE法(1992，蔡宇旸)，将Cry1Ab的第一、第二功能结构域、Cry1F的第三功能结构域和Cry1Ac的片段(1837bp至3531bp)拼接在一起，形成新的Cry1A.401 DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一般认为：Bt蛋白由三个结构域构成，结构域I包括活性杀虫蛋白N末端的250-300个氨基酸，由7个α-螺旋组成，其中一个α-螺旋疏水性较强，位于结构域I的中心，其余6个α-螺旋围在周围。现已证明其与杀虫蛋白的毒性有关，疏水性的α-螺旋具有插入敏感昆虫的中肠道细胞膜，并形成孔道；结构域II由三个反相平行的β折叠形成一个三棱形状的结构，每个折叠通过一个小环结构相连。其中有两个β折叠高度同源，各由四条反相平行的具有β构象的肽链构成。另一个β折叠有三条β构象的肽链及一个小的α-螺旋构成。这一结构域由中间的约200个氨基酸构成。结构域II主要参于对目标昆虫消化道表皮靶细胞的识别与结合，是决定杀虫蛋白特异性的主要因素。结构域III由两个反相平行的具有β构象的肽链高度缠绕而形成一个β-三夹板结构，其主要功能是维持蛋白结构稳定，使其不受昆虫蛋白酶的降解(Li et al.，1991；Grochulski et al.，1995)。此外，该结构域也可能起到保证毒蛋白与受体稳定结合的作用。与原始Bt基因Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ac基因编码序列进行比对分析，同源性分别为39.52％、34.03％和79.86％。编码Cry1A.401的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2 Cry1A.401基因在原核系统中的表达和产物的毒性检测

为了检测改造的Cry1A.401基因体外表达及对玉米螟的毒性情况，我们构建了Bt原核表达载体。根据克隆Bt基因需要，在引物序列的5’端添加NdeI内切酶识别位点序列AAGGAGATATACATA，3’端添加XhoI内切酶识别位点序列GGTGGTGGTGCTCGAG。设计引物序列列为：F：AAGGAGATATACATATGGACAACAACCCGAAC；R：GGTGGTGGTGCTCGAGTTCCTCCATAAGGAGTAA。以拼接好的DNA为模板，用添加了接头的引物，扩增Cry1A.401基因，凝胶回收试剂盒回收纯化Cry1A.401基因片段。用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切pET30a，回收纯化。两个片段进行连接反应，构建所得原核表达质粒命名为pET30a-Cry1A.401。经PCR检测，测序，表明载体构建正确。用pET30a-Cry1A.401转化BL21(DE3)感受态细胞。

用含有pET30a-Cry 1A.401的大肠杆菌BL21菌液经IPTG诱导后，提取Bt蛋白，以清水和含空载体pET30a大肠杆菌BL21菌液为对照，用玉米螟进行虫试。具体步骤如下：

①接种大肠杆菌BL21单菌落于5ml LB(含卡那霉素)液体培养基中，37℃过夜培养。

②将菌液接种到500ml LB(含卡那霉素)液体培养基中，培养至OD≈0.5。

③加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时。

④4000rpm离心10min，收集菌体。

⑤加入20ml裂解缓冲液(2mM Tris-HCl；0.2mM CaCl₂；PH＝8.0)，重新悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min。

⑥超声波破碎菌体(破碎参数：工作3s，间隔3s，80次，冰浴破碎)，4000rpm离心10min，收集上清。

⑦将收集的上清加入到饲养玉米螟的饲料中。以含空载体pET30a大肠杆菌BL21菌液为阴性对照。

⑧在24孔板上放入一条饲料，每个放有饲料的孔接1头2-3龄玉米螟，各接100个孔，重复三次。放入温度26～28度，相对湿度70％左右的环境中培养，7天后进行毒性鉴定：结果表明，分泌表达的Cry1A.401基因编码的Bt蛋白有较好的杀虫效果，玉米螟的死亡率达到100％，而且对玉米螟的生长有明显的抑制作用(表1)。

表1 Cry1A-401基因原核表达产物的毒性检测结果

处理(重复三次)	试虫数(只)	平均死亡率(％)
			H2O(阴性对照)	300	0

pET30a(阴性对照)	300	0
			阳性对照	300	100
Cry1A.401	300	100

实施例3 Cry1A.401基因在转基因植物中的表达和表达产物的毒性检测

在引物序列的5’和3’端分别添加SmaI内切酶识别位点序列CTCTAGAGGATCCCC和TCGAGCTCGGTACCC，设计引物为：F：5’CTCTAGAGGATCCCCATGGACAACAACCCGAAC3’；R：5’TCGAGCTCGGTACCCCTACTCGAGTGTGGCAGTAAC 3’，以合成的Cry1A.401核苷酸序列为模板，用带接头的引物扩增，并用凝胶回收纯化试剂盒回收目的片段。同时用SmaⅠ酶切植物表达载体CPB，回收纯化酶切后的CPB片段。两个片段进行连接反应(In-Fusion HDcloning kit，Clontech)，构建得到真核表达质粒CPB-Cry1A.401(全文统一)(启动子为CaMV35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar)。经PCR检测，测序，表明载体构建正确。

其中，CPB(pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar，图1)质粒是在pCAMBIA1300质粒基础上构建的质粒，含有一个目的基因插入盒(35S-多克隆酶切位点-T-nos)和一个来自吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。该基因序列位于花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV)和3’尾部(TCaMV)之间。

质粒pCAMBIA1300购自澳大利亚CAMBIA(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriculture)，参考网址http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。该载体可用于玉米受体材料的遗传转化。

采用农杆菌介导转化方法(菌种LBA4404)将插入序列导入受体植株的茎尖组织，经除草剂双丙氨膦筛选后获得转基因植株(图2)。移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。图3显示了T₀代转化体目的基因Cry1A.401的PCR检测结果，其中M：D2000(分子量分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中最亮的条带为：750bp，天根生化科技有限公司)；CK1：阳性质粒对照；CK2：未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-5：Cry1A.401-1到Cry1A.401-5。

引物序列：

Cry1A.401-F：5′-ATGGACAACAACCCGAAC-3′

Cry1A.401-R：5′-GTTGTTGAATTCCGCCGA-3′

目的片段大小：1396bp，退火温度55℃，35个循环。

图4显示了T₀代转化体选择标记基因Bar的PCR检测结果，其中M：D2000；CK1：阳性质粒对照；CK2：未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-5：Cry1A.401-1到Cry1A.401-5。

引物序列：

F-Bar：5′-CCATCGTCAACCACTACATCG-3′

R-Bar：5′-AGCTGCCAGAAACCCACGT-3′

目的片段大小：497bp，退火温度59.7℃，35个循环。

目的蛋白Cry1A.401的检测(Bt-Cry1Ab/1Ac免疫学检测)：

1、取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf管中。然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。

2、取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-1ml SEB4样品提取缓冲液。

3、取出检测条(上海佑隆生物科技有限公司；货号：STX06200/0050)，手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管或提取袋中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。

4、3-5分钟内出现质控线，最长反应时间为30分钟，此时检测条可取出。质控线是用来确保试验结果的准确性。如果质控线没有出现，检测无效。由于样品的流动性不同，产生信号的时间也不同。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。如果想长期保存检测结果，可剪掉样品垫，用纸巾吸干，这将阻止残存的液体干扰结果。检测线的深浅反应了被检测蛋白的含量(图5)。

图5为T₀代转化体目的蛋白Cry1A.401的免疫学检测，其中CK为未转基因苗阴性对照；转基因阳性苗为1到5。上条带为质控线，下条带为检测线指示被检测蛋白。该结果表明，抗虫基因Cry1A.401表达的目的蛋白在转基因玉米中高效表达。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种抗虫蛋白Cry1A.401，其特征在于，其具有：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因Cry1A.401。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.如权利要求3所述的载体，其为双价载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其为LBA4404。

7.含有权利要求2所述基因的转化植物细胞。

8.权利要求1所述的蛋白在提高转基因植物抗虫性中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，所述植物为农作物、果树或蔬菜。

10.权利要求1所述的蛋白在制备杀虫剂中的应用。

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