CN101130762B - 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8H基因、蛋白及其应用 - Google Patents
对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8H基因、蛋白及其应用 Download PDFInfo
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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-
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Abstract
本发明涉及“对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8H基因、蛋白及其应用”属于生物防治技术领域。本发明对鞘翅目害虫高毒力的cry8H基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO1所示，人工设计合成的可以在植物中表达的cry8H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。该人工设计的cry8H基因转化植物，获得的转基因植物都具有抗华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)性能。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，本发明涉及对鞘翅目害虫高毒力的cry8H基因的核苷酸序列，涉及对鞘翅目害虫高毒力的蛋白质的氨基酸序列，涉及，人工设计合成的可以在植物中表达的cry8H基因的核苷酸序列，涉及该人工设计的cry8H基因的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列，涉及含有cry8H基因的重组菌株，涉及使用该基因构建表达载体，还涉及利用上述基因序列进行植物转化的方法。
背景技术
金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeidae)，其幼虫(俗称蛴螬，本发明以下也简称为“蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫，可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中的危害居首位，其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主，占总地下害虫量的70-80％以上。据统计每年全国蛴螬发生面积约1亿亩，严重年份曾达3亿2千万亩，产量损失高达20％以上，有些地块甚至绝产。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区，主要危害粮食、油料等作物；其它地区的危害情况也很严重，如危害甘蔗的蛴螬，在广东、广西、云南、四川、福建等地普遍发生；在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区，蛴螬的发生也很严重(魏鸿钧等，《中国地下害虫》，上海：上海科学技术出版社，1989，1-41；王永祥等，“冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”，《河北师范大学学报》(自然科学版)，1998，22(2)：268-270)。以在我国油料作物中种植面积仅次于油菜居第二位的花生为例。我国的花生产量占世界花生总产量的35％左右，居世界首位，年出口收入达207亿美元，2001年全国花生面积(500万公顷)和总产(1450万吨)均达到历史最高水平。但蛴螬对花生的危害十分严重。为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学、物理等综合防治策略，这虽有一定成效，却难以达到持续控制的效果。因此，寻找新的有效防治方法，已成为当务之急。
在获得对蛴螬高毒力Bt基因的基础上，培育杀蛴螬的转基因植物是一条值得探索的新的防治途径。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.AndMolecular Biology Review，1998，62：3775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
目前人们已经克隆了近400种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属157种模式基因。近年国际上cry8类基因的研究动向引人瞩目。研究表明，这类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(0hba，M.etal.，A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a highlarvicidal activity specific for scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，1992.14：54-57)，1994年Sato等从中克隆出一种新的杀虫基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein genefrom Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeidinsects，Curr.Microbiol.1994.28：15-19.4)。目前已发现11种cry8类基因，编码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。详细的信息见表1(Asano，S.，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein having insecticidal activity，DNA encoding theprotein，and controlling agent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A and JP 2002045186-A/2))。其中美国Mycogen公司分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性(Tracy E.Mi chaels，et al.，Bacillusthuringiensis toxins active against scarab pests，1994，USP5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对西方玉米根叶甲(Western cornrootworm)具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，Andre，R.，DuckNicholas，B.，Feng，Xiang，Flannagan Ronald，D.，Kahn，Theodore，W.，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against coleopterans，2002，W002/34774A2)。在我国，河北省农业科学院植物保护研究所和河北农业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100％(冯书亮等，“一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株”，《中国生物防治》，2000，16(2)：74-78)。
表1苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白
发明内容
本发明提供一种对大黑鳃金龟等鞘翅目重要害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌cry8H模式基因序列，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
苏云金芽孢杆菌菌株BT-SU4，其保藏号为CGMCC2071。
对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ha1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
一种工程菌菌株BioT8H，其特征在于含有cry8Ha1基因。
对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ha1蛋白，由上述cry8Ha1基因所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
cry8Ha1蛋白在制备杀害鞘翅目害虫药剂中的应用。
一种蛋白，具有上述蛋白相同的功能，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示.
一种人工改造合成的mcry8Ha1基因，其编码上述的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
一种植物表达载体p3300U8H，其特征是该植物表达载体由mcry8Ha1基因序列、组成型表达启动子或根特异性启动子、终止子和一种能在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体所构建。
mcry8Ha1基因在植物抗鞘翅目害虫中的应用。
所述应用为将含有mcry8Ha1基因的植物表达载体p3300U8H转化植物或微生物，使之产生抗鞘翅目害虫的毒性。
所述植物是草坪草。
所述应用为将mcry8Ha1基因表达的蛋白制备成药剂，用于杀灭鞘翅目害虫。
本发明从河北土壤分离得到菌株BT-SU4，其保藏编号为CGMCC2071，其生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时产生有毒杀作用的伴胞晶体。
根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物：
SN5un85`-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3`
SN3un85`-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3`
PCR扩增鉴定BT-SU4菌株，扩增结果(见附图1)，其显示条带与已知cry8类基因(见表3)均不同，表明菌株BT-SU4中可能含有新的cry8杀虫基因。
设计一对全长基因引物cry8H5/cry8H3用来扩增全长基因。并且引入BamHI/SalI用于克隆与表达，引物对cry8H5/cry8H3的序列如下：
cry8H5：gg aat tcg atg agt ccg aat aat cag aat
cry8H3：cgc gtc gac tta cat ttc ttc tac aat caa ttc
以菌株BT-SU4的总DNA为模板，用pfuDNA聚合酶，进行PCR扩增，结果(见附图2)显示扩增出约3.5Kb的条带，与载体pET21b连接转化大肠杆菌JM110，得到重组质粒pSASSU4(附图2)。对插入片断进行测序分析，得到序列SEQ ID NO 1为pSASSU4中BamHI/SalI双酶切片段，序列全长3672bps，分析表明其含有开放阅读框，ORF1的位置是1-3672，GC含量为38.％，编码1223个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性，表4为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ha1。
引物cry8H5/cry8H3分别引入BamHI和SalI位点，以菌株BT-SU4质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSTK中得到重组质粒pSK08H(见附图3)，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中(该突变株来源于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可以向公众提供，见李海涛等，农业生物技术学报2005Vol.13No.6 P.787-791)，得到工程菌BioT8H。
将上述工程菌BioT8H于30℃于牛肉膏培养基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌)中培养，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳分析(方法参见Sambrook，J.et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)，结果(见附图4)。结果表明工程菌BioT8H中的cry8Ha1基因获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。
Cry8Ha1蛋白的活性测定表明，表达的Cry8Ha1具有杀华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫的活性。
根据微生物和植物对密码子偏好的不同，对cry8Ha1基因的1-2010bp的序列进行了优化。本发明按照cry8Ha1基因的人工改造序列进行了全基因合成，新基因见SEQID NO 3所示的核苷酸序列，对应蛋白序列见SEQ ID NO 4。cry8Ha1基因与mcry8Ha1(modified cry8Ha1)基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ha1的37.6％提高为50.1％。调整了Cry8Ha1蛋白的氨基酸密码子使用频率，使mCry8Ha1蛋白的氨基酸密码子使用频率与植物中的使用频率接近，将cry8Ha基因的人工改造序列两端引入BamHI和SacI位点(见SEQ IDNO 3)，连至pUC57载体(该载体为常用载体，GenBank登录号为Y14837)，重组质粒命名为pUC57-mcry8H。
用BamHI和SacI酶切质粒pUC57-mcry8H(中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存)回收2.0kb片段，用同样的内切酶酶切质粒pCAMBIA3300(该载体为常用载体，中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存，见张晓国等武汉植物学研究，2000Vol.18No.1P.15-20)，回收10kb片段，将两个片段连接，转化大肠杆菌DH5α，得到阳性转化子，把此新构建质粒命名为p3300U8H。该质粒含有组成型表达的启动子Ubiquitin(即一段DNA序列，可以驱动所连接的基因片段进行转录，进而翻译成蛋白质，组成型表达的启动子可以调控基因在生长发育的任何阶段和任何组织都有表达)、mcry8Ha基因和NOS终止子(一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)。质粒构建图见附图5，该质粒可以转化植物，获得转基因植物。。
将人工合成改造的基因mcry8Ha1农杆菌转化，制备得到阳性克隆，再转化草坪草，转基因草坪草的生物活性检测表明，转基因植株表现出了良好的抗华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)性能。转基因草坪草的抗华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)性能是因为在植物体中有启动子启动人工改造的mcry8Ha1基因的转录，表达了Cry8H蛋白，双元载体中的表达盒——组成型启动子、人工改造的mcry8Ha1和终止子只有整合到草坪草的基因组中才能表达外源基因，所以可以用此双元载体转化任何已建立农杆菌转化方法的植物，获得的转基因植物都具有抗华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)性能。
生物保藏信息：
微生物名称(属、种的学名)：芽孢杆菌属苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏日期：2007年6月1日
保藏编号：CGMCC 2071
附图说明
图1：菌株BT-SU4的PCR-RFLP图谱。其中：
M.DNA分子量标准
1.PCR产物
2.PCR产物酶切
图2：重组质粒pSASSU4酶切图谱。其中：
M.DNA分子量标准
1.PCR产物BamHI/SalI酶切
2.载体pET21b BamHI/SalI酶切
3.重组质粒pSASSU4BamHI/SalI酶切图谱
图3：重组质粒pSK08H酶切图谱。其中：
M.DNA分子量标准
1.PCR产物BamHI/SalI酶切
2.重组质粒pSK08H BamHI/SalI酶切图谱
3.载体pSTK BamHI/SalI酶切
图4：cry8Ha1基因在Bt无晶体突变株中的表达。其中：
M.蛋白质分子量标准
1.HD-73-
2.BioT8H
3.BT-SU4
图5：p3300U8H质粒构建图
图6：转化草坪草的分子检测，其中：
M.DNA分子量标准
1至5.为部分阳性转基因植株检测结果
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
1.1菌株BT-SU4中cry基因鉴定
根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物
SN5un8 5`-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3`
SN3un8 5`-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3`
表2是这些基因与引物的同源序列，表3是用这对引物预测的cry8基因扩增产物酶切片段大小，通过这种PCR-RFLP方法可以分别鉴定出将这些基因。
表2引物与cry8各基因的保守区配对情况及配对区在基因上的位置
表3cry8的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性
用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185：
10×PCR buffer 5μL
MgCl2(20mM) 6μL
dNTP(10mM) 1μL
引物对(10mM) 1μL/个
模板 1uL
Taq聚合酶(5U/μL) 0.5μL
超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。
扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。
对PCR产物利用KpnI和DraI酶切分析，结果(附图1)显示条带是2058bp，106bp，与已知cry8类基因的图谱(表3)不同，表明菌株BT-SU4中可能含有新的cry8杀虫基因.1.2菌株BT-SU4中cry8H基因的克隆
设计了一对全长基因引物cry8H5/cry8H3用来扩增全长基因。并且引入BamHI/SalI用于克隆与表达，引物对cry8H5/cry8H3的序列如下：
cry8H5：gg aat tcg atg agt ccg aat aat cag aat
cry8H3：cgc gtc gac tta cat ttc ttc tac aat caa ttc
以菌株BT-SU4的总DNA为模板，用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。
| 10×PCR buffer | 5μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| 引物对(10mM) | 1μL/个 |
| 模板 | 1uL |
| 10×PCR buffer | 5μL |
| pfuDNA聚合酶(5U/μL) | 0.5μL |
超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。
扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。结果(见附图2)显示扩增出3.5Kb的条带，与载体pET21b连接转化大肠杆菌JM110，得到阳性转化子pSASSU4。对插入片断进行测序分析，得到序列SEQ ID NO 1为pSASSU4中BamHI/SalI双酶切片段，序列全长3472bps，分析表明其含有开放阅读框，ORF1的位置是1-3472，GC含量为38.％，编码1157个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性，表4为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ha1。
表4Cry8Ha1与Cry8蛋白同源比较数据
本发明进一步分析了Cry8Ha1蛋白的氨基酸组成(见表6)，得知其分子量为131.56kDa，等电点为pH4.735(见表5)，分析了蛋白的生化指标(见表5)
表5Cry8Ha1蛋白的生化特性
表6Crv8Ha1蛋白的氨基酸组成
1.3cry8H基因的表达
引物cry8H5/cry8H3分别引入BamHI和SalI位点，以含全长cry8Ha1的菌株BT-SU4质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSTK(见附图3)中，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8H。
分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基中培养30小时，取500μL菌液至Eppendorf管中，超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5N NaOH，25℃作用5分钟；加入65μL 3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μLβ-巯基乙醇)，100℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果。结果(附图4)表明，工程菌BioT8H中的cry8Ha1基因均获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。
1.4Cry8H蛋白的活性测定
将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将野生菌株HD-73-接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下，2倍梯度浓度稀释，将40ml菌悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在18％-20％。接入金龟子龄幼虫20头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲养，14天检查死虫数，计算死亡率。结果(见表7)表明工程菌株对华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)具有极高的毒杀活性。其表达的Cry8H蛋白具有杀华北大黑鳃金龟、铜绿丽金龟和暗黑鳃金龟虫的活性。
表7Bt工程菌和BT-SU4菌株对华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)幼虫杀虫活性测定
注：在结果的浓度单位中，浓度是X毫克蛋白每克土。
实施例2
2.1人工设计合成的可以在植物中表达的cry8H基因的核苷酸序列
根据微生物和植物对密码子偏好的不同，对cry8Ha1基因的1-2010bp的序列进行了优化。本发明按照cry8Ha1基因的人工改造序列进行了全基因合成，新基因见SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。cry8Ha1基因与mcry8Ha1(modified cry8Ha1)基因的核苷酸序列同源性只有87.08％，G+C含量也由原来cry8Ha1的37.6％提高为50.1％(表8)。调整了Cry8Ha1蛋白的氨基酸密码子使用频率，使mCry8Ha1蛋白的氨基酸密码子使用频率与植物中的使用频率接近(表9)。将cry8Ha基因的人工改造序列两端引入BamHI和KpnI位点，连至pUC57载体，重组质粒命名为pUC57-mcry8H。
表8cry8Ha1基因与mcry8Ha1G+C含量比较与聚腺苷酸化的信号序列情况
表9植物、Cry8Ha1及mCry8Ha1中蛋白的氨基酸密码子使用频率
2.2植物表达载体的构建
用BamHI和SacI酶切质粒pUC57-mcry8H(中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存)回收2.0kb片段，用同样的内切酶酶切质粒pCAMBIA3300(该载体为常用载体，中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存，见张晓国等武汉植物学研究，2000Vol.18 No.1P.15-20)，回收10kb片段，将两个片段连接，转化DH5α，得到阳性转化子，把此新构建质粒命名为p3300U8H。该质粒含有组成型表达的启动子Ubiquitin(即一段DNA序列，可以驱动所连接的基因片段进行转录，进而翻译成蛋白质，组成型表达的启动子可以调控基因在生长发育的任何阶段和任何组织都有表达)、mcry8Ha基因和NOS终止子(一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)。质粒构建图见附图5，该质粒可以在植物中表达外源基因。
2.3农杆菌转化
取一管200μl农杆菌LBA4404的感受态细胞，加入1μg p3300U8H质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃恢复培养5分钟，加入1ml LB液体培养基，28℃慢速振荡(＜100rpm)6小时，4,000rpm离心5分种，弃上清，加入100μlLB液体培养基重悬细胞，涂布于含有卡那霉素100μg/ml、利福平100μg/ml和链霉素100μg/ml的LB培养基的平板上，28℃培养48小时。将LB抗性培养基平板上的克隆，摇菌，提取质粒，应用PCR方法检测阳性克隆。
2.4草坪草转化
将含有p3300U8H质粒的农杆菌克隆接种于含有卡那霉素100μg/ml、利福平100μg/ml和链霉素100μg/ml的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，1/100接种于含有卡那霉素100μg/ml、利福平100μg/ml和链霉素100μg/ml的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，；将草坪草愈伤浸于菌液中，农杆菌侵染15分钟；取出草坪草愈伤，用灭菌滤纸吸干菌液，放置到共培养培养基(MS培养基+100μmol/ml乙酰丁香酮+3mg/l 2，4-D)中，28℃暗培养2天，2天后将草坪草愈伤转移至MS筛选分化培养基(MS培养基+150μg/l草丁磷+500μg/ml羧苄霉素+3mg/l 2，4-D)，28℃，光/暗＝16小时/8小时，2周后，愈伤点分化成小植株，将小植株切下移至生根培养基(MS培养基+700μg/ml草丁磷+500μg/ml羧苄霉素)生根，根部发育健壮后，移至花盆在土中继续生长(普通土∶营养土∶蛭石＝2∶1∶1)。
2.5转化草坪草的分子检测
提取转化草坪草的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下：
8HF 1：5′-TGGACACCAAGGGCATTAAGAG
8HR 1：5′-AGTAGCCTGAGTGGCGTAAAGA
PCR扩增的反应条件为：94℃，10分钟，1个循环；94℃，1分钟，54℃，1分钟，72℃，1分钟，30个循环。把产物电泳。如图6所示，阳性转化株扩增出大小为600bp的片段。
2.6转基因草坪草的生物活性检测
从田间采集华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)3种在我国北方危害比较严重的金龟子成虫群体，带回室内，分别放入40×40×50cm的饲养盒中，盒底放5-8cm厚的潮湿过筛细土，饲喂新鲜榆树叶片，26-28℃饲养。待其产卵后，将卵挑出，放在潮湿土中使孵化。将刚孵化的幼虫挑出，每个小饲养盒(Φ8cm，H5cm)放幼虫5头，饲喂土豆块和新鲜的玉米嫩根，待幼虫长到一定龄期后供生测用。
采用群体种植和群体接虫的方法，进行生物测定。在大田土中采用分别种植及混合种植转基因植株和未转化植株的种植方法，每个处理12株。
按照建立的危害程度分级标准，暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数统计如下，见表10。
表10.转基因植株与非转基因株的危害统计。
从表10统计结果看，转p3300U8H植株的危害率为62.5％，危害指数为22.9；非转基因植株危害率100％，危害指数为72.9。转p3300U8H植株表现出了良好的抗暗黑鳃金龟(Holo trichia parallela)的特性。
华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)幼虫对供试转基因植物的危害程度统计如下。转p3300U8H植株危害率为75％，危害指数为28.4，低于非转基因植株危害率为100％，未转化植株危害指数75.0。可见转p3300U8H植株表现出了良好的抗华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita)特性。
铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)幼虫对供试转基因植物的危害程度统计如下。转p3300U8H植株危害率为45％，危害指数为16.5，低于非转基因植株危害率为100％，未转化植株危害指数75.0。可见转p3300U8H植株表现出了良好的抗铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)的特性。
根据以上信息，利用可以在根部特异转录基因的启动子，可以使该基因在植物根部得到表达，从而只在植物根部获得对目标害虫华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)的抗性。
附：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列
SEQ ID NO 1(cry8Ha1基因的核苷酸序列)
1
ATAAGAA AGGGAGGAAG AAAAATGGCT AGCATGACTG GTGGACAGCA AATGGGTCGG
61 GATCCGAATT CGATGAGTCC GAATAATCAG AATGAATATG AAATTATAGA TACACCATCT
121 CGTACGTCTG TATCCAATGA TTCTGTCAGA TATCCTTTCG CAAGCGATCC AACAACTGAT
181 TTAAACAATA TGAATTATAA AGATTTCCTT AAAACAGTAA ATGGTTACAA TACTGGAGAT
241 CTTTCTGGAT CTGAGGCATT TATCAGTCAA ACTGCAATTA ATACTGCAGG TAAAGCTGTA
301 GGTACAGTAC TCGGTTTATT GGGTGTTCCA TTAGCCGGAG CAGTTGGCCC CTTAATATCC
361 TTCTATGGTG CCGTTGCCCT ATTATTTTGG GGGCCGGGAG ATCCATGGCA AGCTTTTATG
421 ACCCAAGTAG AGGCATTAGT TAACCAAAAA ATAGCAGATT ATGCAAGAAA TAAAGCAATT
481 GCAGAATTAC AAGGGTTAAG GAATATTCTT GATTTATATC GTTTAGCACT TATAGAATGG
541 GAAGAGAACC CAACAAGAAC AAGATCACTA ACAAATATCC GTCTTAAATT TGAAGATGTT
601 AATCAGTTTT TCGAATATCA AATGCCATCT TTTGCAGTAG GAGGTTATGA GGTTCCATTA
661 TTAGCAGTAT ATGCACAGGC AGCAAATCTT CATTTGTCAG TATTAAGAGA TGCCGCGATA
721 TTCGGAGAAC AGTGGGGAAT GTCTCAAACT GCTATTAATA ACATATATGA CCTTCAGCAG
781 AGAAGAACTG CTGAGTATAT TAATCATTGT GTGAAATGGT ATAATAATGG TTTAGATAAA
841 TTAAGAGGTT CGAATGCTGG GCAATGGGTT AATTTTAATC GCTACCGTAG AGAGATGACA
901 CTAATGGTAT TGGATATTGT AGCGATATTT CCAAACTATG ATACACGTAC GTATCCAAGT
961 GGAATTGGAA CTAGTGTCCA ACTTACAAGA GAAGTATATA CGGATCCTAT TGGTGCGACA
1021 TCAACACAAG GTGGCGTTTC TTGGTATGAC GACGCACCTT CTTTTACAGC TATTGAAAGT
1081 TCCGTGGTTC GACCACTTCA CTTATTTGAT TTACTAACAG GGGTTACAGT CTATGCCGCT
1141 AGTAGTTCTT GGGATTCAAG TCATTATTTT AGATTTTGGA ATGGGCATAA AGTAGACACA
1201 AAGGGAATTA AGAGTTCTGT TCAATATAGT AATGTATATG GTTCTACTAG TAATGCGGTT
1261 AGTACAACTA TTATACCATT TTCGGGTTTT GACGTTTATA GAGTCTTTTC GCTAGCTGGT
1321 GTACTATTTG CTTGGACAAC AAGATACTTT GGAGCCCCTG AAGTTTATTT TCAAAGAGTA
1381 GACCATAATT CTGGGATTGA TGTTGGATAC GATATAGCGT TTAGCGAAAG GTATGCAGGG
1441 ATTGGAGAAC AACAAAAGGA TTCACTTGAT GAATTACCTT TACAAACAGA AGGGCCGGCA
1501 TATAGATCTT ATAGTCATAG ATTGAATCAT ATTTCAATGG TTCCACAAAC TGTACGAACA
1561 CGGAATGTAC CTGTATTTTC TTGGTCGCAT CGGAGTGCGG ATATTGACAA TAGAATTTTT
1621 CAGGATAGAA TTAATCAAAT TCCGGTAGTA AAGGGACATA CATTAGGTCC AGGTGCTTCT
1681 GTTATGGCAG GTCCTGGATT TACAGGAGGA AATATAGTGA CTAGAACAAG TCCAGGTGTA
1741 GTAGTTTTTT CTGGAGTTAC TATAAAGAAT GCATTATCAC AACGATATCG TGTGAGAATA
1801 CGGTATGCTT CTACTACTGA CTTCCGATTT TTCTCTACAC TTTCAGGAAC TCGTCTTTAT
1861 GCCACTCAGG CTACTAAAAC TATGAATAAA GGACAACAAT TAACATATGA ATCATTTCAG
1921 TATGCAACAA TTGGTTCTAC ATTTACATTT GAGAATGTAA ATGATAGTTT GACAATAGGT
1981 GCAGATCAAT TTCTAAGTGG TGAGCAAGTA TATGTAGATA GATATGAAGT AATCCCAGTG
2041 GATGCAACGT TTGAAGCGGA GAACGATTTA GAGGTGGCAA AGAAAGCAGT AAATAATTTG
2101 TTTACGAATG CAAAAGATGC CTTACAGACG GATGTTACAG ATTATCAAGT AAATCAAGCA
2161 GCTAATTTAG TAGAATGCCT ATCAAGTGAG TTATATCCAA ATGAAAAACG TTTGTTATTT
2221 GATGCGGTGA AAGAGGCAAA ACGACTGGAT CAAGCACGTA ACTTACTTCA AGATACACAG
2281 TTTAATGAGA TGAATGGAGA AAACGGATGG AATGGGAGCA CAGGTGTTGA GATTGTTGAA
2341 GATGATGTCT TCTTTAAGGA CCGCTCAATT CGATTATCTA GCGCGCGAGA AGCGGGGACA
2401 GAAAACTCCC CAACGTATCT GTACCAAAAA ATAGATGAAT CTCGCTTAAA ACCATACACT
2461 AGATATAGTC TGAGAGGGTT TGTAAGAAGT AGTCAAAATT TAGAGATATA TGTCACTCGT
2521 TACCAAACAC AGCGAGTGGT CAAAAATATA GTAGACAATT TCTTACCAGA TATGTATGCT
2581 GTTAACGCCT GCGGAGGAAT TGATAGATGC GGAGAACAAA AGCATGTGAA TACTATGTTA
2641 GGATTAGAAA ATAATGTACC AAATGGAAAT ACAGTGTCTG ACTCTCATGA GTTTTCAATT
2701 CCTGTAGATA CAGGGGAGCT GAATTATAAT GAGGATACGG GTATTTGGGT TGTATTTAAA
2761 ATCACAACCA CGGATGGATA CGCAACACTT GGAAATCTTG AATTGGTAGA AGAGGGACCG
2821 TTATCTGGAG AAACATTAGA ACGTGTGAAA AATCAAGGAA AGCAGTGGCA GGACCAAATG
2881 GCAAGAAGAC GTGCGGAAAC AGATACAAGA TACGGGACAG CAAAACAAGC CATTGATCGT
2941 TTATTTGTAG ACTATCAGGA TCAACAATTA TCTCCTAGTA TAGAAATATC AGATTTGACT
3001 GCGGCACAAA ATCTGGTACA GTCCATCCCT TACGTATATA ATGATACGTT ACCAGAAATA
3061 CCGGGGATGA ACTATACAAG TGTTACAGAG TTAACAAACA GACTCCAACA AGCATGGAAT
3121 TTGTATGACT TGAGAAATAG CATACAAAAT GGTGATTTCC GAAATGATGT AAGTAATTGG
3181 AATGTTACAC CTGGAGTCAA TATTCAACAA ATGAATCATA CGTCTGTTCT TGTGATTCCA
3241 AATTGGGATT CACAAGCGTC ACAACAAATT ACCGTTCAAC CAAATCGAAG ATATGTGTTA
3301 CGTGTTACCG CAAGAAAAGA AGGAAGCGGA GATGGATACG TAACCATCCG TGATGGAGCA
3361 AAATATACAG AAACGCTGAC ATTTAATACA TGTGATTATA ATGGAAGTAG TGTATATCAG
3421 GAGCAAGCAT TGTATACAAA TGATGTATAC AATACGCAAT CCGTTAACAT ACAGGGTTCG
3481 AATAGTGCGT ATCATACACA AGCAACCAAT ACCGATAGAT ATAATATGAA TGGTATGTAT
3541 AATGATCAAA CTAGCTATGT TACAAAAACA GTAGAATTTA TTCCGTATAC GGAGCAAGTC
3601 TGGATTGAGA TGAGCGAAAC CGAGGGCGTA TTCTATATAG AGAGTGTAGA ATTGATTGTA
3661 GAAGAAATGT AA
SEQ ID N02(Cry8Ha1蛋白的氨基酸序列)：
1 MIRKGGRKMA SMTGGQQMGR DPNSMSPNNQ NEYEIIDTPS RTSVSNDSVR YPFASDPTTD
61 LNNMNYKDFL KTVNGYNTGD LSGSEAFISQ TAINTAGKAV GTVLGLLGVP LAGAVGPLIS
121 FYGAVALLFW GPGDPWQAFM TQVEALVNQK IADYARNKAI AELQGLRNIL DLYRLALIEW
181 EENPTRTRSL TNIRLKFEDV NQFFEYQMPS FAVGGYEVPL LAVYAQAANL HLSVLRDAAI
241 FGEQWGMSQT AINNIYDLQQ RRTAEYINHC VKWYNNGLDK LRGSNAGQWV NFNRYRREMT
301 LMVLDIVAIF PNYDTRTYPS GIGTSVQLTR EVYTDPIGAT STQGGVSWYD DAPSFTAIES
361 SVVRPLHLFD LLTGVTVYAA SSSWDSSHYF RFWNGHKVDT KGIKSSVQYS NVYGSTSNAV
421 STTIIPFSGF DVYRVFSLAG VLFAWTTRYF GAPEVYFQRV DHNSGIDVGY DIAFSERYAG
481 IGEQQKDSLD ELPLQTEGPA YRSYSHRLNH ISMVPQTVRT RNVPVFSWSH RSADIDNRIF
541 QDRINQIPVV KGHTLGPGAS VMAGPGFTGG NIVTRTSPGV VVFSGVTIKN ALSQRYRVRI
601 RYASTTDFRF FSTLSGTRLY ATQATKTMNK GQQLTYESFQ YATIGSTFTF ENVNDSLTIG
661 ADQFLSGEQV YVDRYEVIPV DATFEAENDL EVAKKAVNNL FTNAKDALQT DVTDYQVNQA
721 ANLVECLSSE LYPNEKRLLF DAVKEAKRLD QARNLLQDTQ FNEMNGENGW NGSTGVEIVE
781 DDVFFKDRSI RLSSAREAGT ENSPTYLYQK IDESRLKPYT RYSLRGFVRS SQNLEIYVTR
841 YQTQRVVKNI VDNFLPDMYA VNACGGIDRC GEQKHVNTML GLENNVPNGN TVSDSHEFSI
901 PVDTGELNYN EDTGIWVVFK ITTTDGYATL GNLELVEEGP LSGETLERVK NQGKQWQDQM
961 ARRRAETDTR YGTAKQAIDR LFVDYQDQQL SPSIEISDLT AAQNLVQSIP YVYNDTLPEI
1021 PGMNYTSVTE LTNRLQQAWN LYDLRNSIQN GDFRNDVSNW NVTPGVNIQQ MNHTSVLVIP
1081 NWDSQASQQI TVQPNRRYVL RVTARKEGSG DGYVTIRDGA KYTETLTFNT CDYNGSSVYQ
1141 EQALYTNDVY NTQSVNIQGS NSAYHTQATN TDRYNMNGMY NDQTSYVTKT VEFIPYTEQV
1201 WIEMSETEGV FYIESVELIV EEM*
SEQ ID N03(人工设计基因的核苷酸序列)
1 GGATCCATGA TCAGAAAGGG CGGCAGGAAG ATGGCCAGCA TGACTGGTGG ACAGCAGATG
61 GGTCGTGATC CCAACTCCAT GAGCCCCAAC AACCAGAATG AGTACGAAAT CATCGACACC
121 CCATCTCGTA CCTCTGTGTC CAACGACTCT GTCAGATACC CTTTCGCCAG CGATCCAACC
181 ACTGACTTGA ACAACATGAA CTACAAGGAT TTCCTTAAGA CCGTTAACGG TTACAACACT
241 GGAGACCTTT CTGGATCTGA GGCATTCATC AGCCAAACTG CCATTAACAC TGCAGGTAAG
301 GCTGTCGGGA CCGTTCTCGG TTTGTTGGGT GTTCCATTGG CCGGCGCCGT TGGCCCCCTG
361 ATCTCCTTCT ACGGTGCCGT TGCCCTCTTG TTCTGGGGCC CCGGAGATCC CTGGCAGGCC
421 TTCATGACCC AAGTGGAGGC ACTGGTTAAC CAGAAAATCG CCGACTACGC AAGGAACAAG
481 GCCATTGCAG AGTTACAAGG GTTGAGGAAC ATACTGGATT TGTACCGTCT GGCCCTTATC
541 GAATGGGAAG AGAACCCAAC CAGAACCAGG TCACTCACCA ACATCCGTCT TAAATTCGAG
601 GACGTTAACC AGTTTTTCGA ATACCAAATG CCATCTTTCG CAGTCGGAGG TTACGAGGTT
661 CCACTGTTAG CCGTTTACGC ACAGGCCGCA AACCTTCACT TGTCAGTGTT GAGAGATGCC
721 GCTATCTTCG GCGAACAGTG GGGAATGTCC CAAACTGCTA TTAACAACAT CTACGACCTT
781 CAGCAGAGGA GAACTGCTGA GTACATCAAC CACTGCGTGA AGTGGTACAA CAACGGTCTG
841 GACAAGTTAA GGGGTTCCAA TGCTGGCCAA TGGGTTAACT TCAATCGCTA CCGTAGAGAG
901 ATGACCCTCA TGGTGTTGGA TATTGTGGCT ATCTTCCCAA ACTACGACAC CCGTACCTAC
961 CCAAGCGGAA TTGGCACTAG TGTCCAACTT ACCAGGGAAG TTTACACCGA TCCTATAGGC
1021 GCTACCTCAA CCCAAGGTGG CGTTTCTTGG TACGACGACG CCCCTTCTTT TACCGCTATT
1081 GAGTCCTCCG TGGTTCGCCC ACTTCACTTG TTCGACCTGC TCACCGGGGT TACCGTCTAC
1141 GCCGCTAGTA GCTCCTGGGA TTCAAGTCAC TACTTTAGAT TCTGGAATGG GCACAAGGTG
1201 GACACCAAGG GCATTAAGAG TTCTGTTCAG TACAGTAATG TGTACGGCTC TACTAGCAAT
1261 GCTGTTAGTA CCACTATTAT CCCATTTTCC GGTTTCGACG TTTACAGGGT CTTTTCCCTC
1321 GCTGGTGTGC TCTTCGCTTG GACCACCAGA TACTTTGGAG CCCCTGAAGT TTACTTCCAA
1381 AGGGTGGACC ACAATTCCGG GATTGACGTT GGATACGACA TCGCTTTTAG CGAAAGGTAC
1441 GCAGGGATTG GAGAACAACA AAAGGACTCA CTTGATGAAT TACCTTTGCA AACCGAGGGG
1501 CCCGCCTACA GGTCTTACAG CCACAGGTTG AATCACATTT CAATGGTTCC ACAAACTGTT
1561 CGCACCCGTA ATGTCCCTGT GTTCTCTTGG TCCCACCGTA GTGCTGACAT AGACAATAGA
1621 ATTTTTCAGG ATAGGATTAA CCAGATTCCC GTGGTCAAGG GCCACACCCT GGGTCCAGGT
1681 GCTTCCGTTA TGGCAGGTCC TGGATTCACC GGAGGCAATA TCGTGACTAG AACCAGCCCA
1741 GGTGTGGTCG TTTTTTCTGG AGTTACTATC AAGAATGCCT TATCACAACG CTACCGTGTG
1801 AGGATTCGTT ACGCTTCTAC TACTGACTTC CGCTTCTTCT CCACCCTTTC AGGAACTCGT
1861 CTTTACGCCA CTCAGGCTAC TAAAACTATG AATAAGGGAC AACAATTGAC CTACGAATCA
1921 TTTCAGTACG CAACCATCGG TTCCACCTTC ACCTTTGAGA ATGTGAATGA CAGTTTGACC
1981 ATCGGTGCCG ATCAATTCCT CAGCGGTGAG CAAGTGTACG TCGACAGATA CGAAGTGATC
2041 CCAGTGGATG CAACCTTTGA AGCTGAGAAC GACCTGGAGG TGGCCAAGAA AGCAGTCAAT
2101 AACTTGGAGC TC
SEQ ID NO 4(人工设计基因mCry8Ha1蛋白的氨基酸序列)
1 MIRKGGRKMA SMTGGQQMGR DPNSMSPNNQ NEYEIIDTPS RTSVSNDSVR YPFASDPTTD
61 LNNMNYKDFL KTVNGYNTGD LSGSEAFISQ TAINTAGKAV GTVLGLLGVP LAGAVGPLIS
121 FYGAVALLFW GPGDPWQAFM TQVEALVNQK IADYARNKAI AELQGLRNIL DLYRLALIEW
181 EENPTRTRSL TNIRLKFEDV NQFFEYQMPS FAVGGYEVPL LAVYAQAANL HLSVLRDAAI
241 FGEQWGMSQT AINNIYDLQQ RRTAEYINHC VKWYNNGLDK LRGSNAGQWV NFNRYRREMT
301 LMVLDIVAIF PNYDTRTYPS GIGTSVQLTR EVYTDPIGAT STQGGVSWYD DAPSFTAIES
361 SVVRPLHLFD LLTGVTVYAA SSSWDSSHYF RFWNGHKVDT KGIKSSVQYS NVYGSTSNAV
421 STTIIPFSGF DVYRVFSLAG VLFAWTTRYF GAPEVYFQRV DHNSGIDVGY DIAFSERYAG
481 IGEQQKDSLD ELPLQTEGPA YRSYSHRLNH ISMVPQTVRT RNVPVFSWSH RSADIDNRIF
541 QDRINQIPVV KGHTLGPGAS VMAGPGFTGG NIVTRTSPGV VVFSGVTIKN ALSQRYRVRI
601 RYASTTDFRF FSTLSGTRLY ATQATKTMNK GQQLTYESFQ YATIGSTFTF ENVNDSLTIG
661 ADQFLSGEQV YVDRYEVIPV DATFEAENDL EVAKKAVNNL
Claims (11)
1.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株BT-SU4，其保藏号为CGMCC2071。
2.对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Hal基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.一种工程菌菌株BioT8H，其特征在于含有权利要求2所述的cry8Hal基因。
4.对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Hal蛋白，由权利要求2所述的cry8Hal基因所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
5.权利要求4所述的cry8Hal蛋白在制备杀害鞘翅目害虫药剂中的应用，所述鞘翅目害虫指华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)。
6.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示.
7.一种人工改造合成的mcry8Hal基因，其编码权利要求6所述的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
8.一种植物表达载体p3300U8H，指用BamHI和SacI酶切质粒pUC57-mcry8H，回收2.0kb片段；用同样的内切酶酶切质粒pCAMBIA3300，回收10kb片段，将两个片段连接，转化大肠杆菌DH5α，得到阳性转化子；所述表达载体含有组成型表达的启动子Ubiquitin、mcry8Ha基因和NOS终止子。
9.权利要求7所述的mcry8Hal基因在植物抗鞘翅目害虫中的应用，所述植物指草坪草，所述鞘翅目害虫指华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)。
10.权利要求9所述的应用，其特征是将含有权利要求7所述的mcry8Hal基因的植物表达载体p3300U8H转化草坪草，使草坪草产生抗所述鞘翅目害虫的毒性。
11.权利要求9所述的应用，其特征是将权利要求7所述的mcry8Hal基因表达的蛋白制备成药剂，用于杀灭所述鞘翅目害虫。
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2007
- 2007-08-07 CN CN2007101200202A patent/CN101130762B/zh active Active
-
2008
- 2008-07-01 WO PCT/CN2008/071513 patent/WO2009018739A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
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| 李海涛等.苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性.农业生物技术学报13 6.2005,13(6),第787-791页. |
| 李海涛等.苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性.农业生物技术学报13 6.2005,13(6),第787-791页. * |
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| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd. Assignor: Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences Contract record no.: 2012990000114 Denomination of invention: Efficient bacillus thuringiensis cry8H gene, protein for vaginata destructive insect and uses of the same Granted publication date: 20100825 License type: Common License Open date: 20080227 Record date: 20120320 |