CN1609220A - 一种人工合成的对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry8基因序列 - Google Patents

Abstract

本发明为“一种人工合成的对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry8基因序列”，属生物防治技术领域。本发明涉及对鞘翅目地下害虫高毒力的Bt cry8Ca基因的人工改造核苷酸序列、核苷酸突变序列和缺失片段，涉及可提高Bt cry8Ca基因抗虫活性的氨基酸突变序列，涉及该氨基酸序列包含的编码蛋白质的活性区序列、表达盒；本发明进一步涉及利用人工改造的cry8Ca基因序列和基因片段构建的表达载体，和使用该载体和人工改造的cry8Ca基因构建工程菌和转化植物。本发明可使转基因植物对鞘翅目地下害虫产生抗性，可用于植物地下虫害的防治。

Description

一种人工合成的对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry8基因序列

本发明的技术领域

本发明属于生物防治技术领域。

本发明的背景技术

虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年因此损失粮食总产量的9％，直接经济损失达57亿美元(James C，ISAAA Briefs，2003，vii)。金龟子类幼虫(俗称蛴螬，本发明以下也简称为“蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫，可危害粮食、棉花、油料、蔬菜、糖料、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学和物理等综合防治策略，但这些防治虽有一定成效，却难以达到持续控制的效果。因此，克隆对蛴螬高毒力的基因，培育杀蛴螬的转基因植物就是一条值得探索的新的生物技术防治途径。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.et al.，1998，Microbiol.And Molecular BiologyReview，62(3)：775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了广泛应用。

目前人们已经克隆了300多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属135种模式基因。其中，有12种克隆的cry8类基因，它们对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年，Ohba等人在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba M et al.，1992，Letters inApplied Microbiology，14：54-57)；1994年，Sato等从中克隆了一种新的杀虫基因cry8Ca1(Sato R et al.，1994，Curr Microbiol，28：15-19)。由于cry8类基因具有很大的潜在应用价值，大多数基因都已经申请专利，如杜邦公司克隆的对西方玉米根叶甲(Western cornrootworm)具有显著杀虫效果的cry8Bb1、cry8Bc1基因已申请专利(专利号为WO0234774-A3和WO 0234774-A2)并已用于转基因抗虫玉米的开发；日本Asano等克隆的cry8Da1、cry8Da2和cry8Da3也已在日本申请专利(专利号为JP 2002045186-A 1/2)。我国河北省农业科学院植物保护研究所和河北农业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株(冯书亮等，2000，《中国生物防治》，16(2)：74-77；王容燕等，2003，《植物保护学报》，30(2)：223-225)，其中包括HBF-1菌株。该菌株对黄褐丽金龟幼虫具有特异高杀虫活性，对铜绿丽金龟也表现出较高的杀虫活性。本发明克隆的cry8Ca2基因即来自HBF-1菌株。

1987年，Vaeck等人首次将Bt杀虫晶体蛋白基因转入烟草，开创了人类利用转基因技术防治害虫的先河(Vaeck，et al，1987，Nature，328：33-37)。但是在转基因研究中人们发现将

来源于Bt的杀虫蛋白基因直接转入植物，存在着表达产物不稳定、表达量少的缺陷(vanAarssen，et al，1995，Plant Mol Biol，28：513-524)。一般地，对Bt基因进行改造，应用植物偏好的密码子，可以提高Bt基因在转基因植物中的表达量。本发明即克隆了对鞘翅目害虫高毒力的cry8基因，对该基因进行了密码子优化，这样一方面可以解决国内转基因抗虫植物中杀虫基因种类单一的不足，拓宽转基因抗虫植物的杀虫谱，另一方面通过将改造的基因转化植物，可以提高基因表达量，增强杀虫效果。

本发明的内容

本发明的目的：

本发明的目的是提供一种对鞘翅目地下害虫具有极高毒力的新型Bt基因，并对克隆的cry8Ca基因进行人工改造，以利用植物偏好的密码子序列，提高cry8Ca基因在转基因植物中的表达量；并通过突变Cry8Ca蛋白的两个氨基酸位点，提高cry8Ca基因对金龟科害虫的毒性。进一步，本发明利用组成型表达的启动子和组织特异性启动子构建一种新的植物表达载体，尤其是根特异性启动子构建植物表达载体，以使毒蛋白在根部特异表达，以毒杀地下害虫和减少转基因安全性问题。

本发明的技术方案：

1.在HBF-1菌株中进行cry8Ca2基因的克隆

冯书亮等从河北省土壤中分离获得一株苏云金芽孢杆菌新分离株HBF-1，通过对该菌株的杀虫活性研究发现，该菌株对黄褐丽金龟幼虫和铜绿丽金龟幼虫具有特异的杀虫活性(冯书亮等，2000，《中国生物防治》，16(2)：74-77)。人们通过利用cry基因的CAPS鉴定体系，可以鉴定Bt菌株中所包含的基因类型(Kuo，W.S.& Chak，K.F.，Appl.Envir.Micro.1996，62：1369-1377；宋福平等，《中国农业科学》，1998，31(3)：13-18)。本发明对HBF-1菌株进行cry8类基因的鉴定，方法为：利用cry8类基因的通用引物

S5un8：5′-CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3′

S3un8：5′-CTGACTGATTTCCACCATCACG-3′

进行PCR扩增，可以扩增出1212bp的阳性条带，用EcoO109I和DraI双酶切的PCR产物有四条带，分别是613bp、310bp、197bp和92bp；回收PCR产物构建至T-载体(T-vector)，测序结果与已知cry8Ca1基因的同源性非常高，证明在HBF-1菌株中含有cry8Ca基因。根据GenBank上公布的cry8Ca1基因序列设计出全长引物对s8ca5/s8c3，用于载体pET21b的克隆与表达。引物对s8ca5/s8c3的序列如下：

              BamHI

S8Ca5：5′-CGC GGATCCGAAATGAGTCCGAATAATCAG-3′

              SalI

S8C3：5′-ACGC GTCGACCTCTTCTTCTAACACGAGTT-3′

以菌株HBF-1的总DNA为模板，用pfuDNA聚合酶，PCR扩增出3.5Kb条带，与载体pET21b连接转化大肠杆菌JM110，得到阳性转化子pSAS001、pSAS002。对阳性克隆做限制性内切酶分析及PCR检测，结果如附图3所示。pSAS001由北京六合通经贸有限公司(中国北京市)测序，得到全长基因序列(GenBank登录号为AY518201)，该基因编码区为3483bps，编码1160个氨基酸，分子量为130KD。将克隆的新基因在GenBank通过blastn比较，结果表明该基因与上述日本亚种BuiBui的cry8Ca1基因有一个碱基(第2315个碱基)发生变化，对应的氨基酸(第772个氨基酸)S也由N取代，可知新基因与已知基因的同源性超过99％。该基因被Bt命名委员会命名为cry8Ca2基因。

2.在Bt无晶体突变株中表达Cry8Ca蛋白

本实验室保存有Bt-E.coli穿梭表达载体pSXY^km(该载体来源于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，该实验室可以向公众提供该质粒)，该载体具有cry3A的启动子和pET21b的多克隆位点，使得外源基因特别是Bt中的基因可以稳定大量表达，选用的卡那霉素抗性基因可以使目标菌株得到环境安全释放。本实验室保存的无晶体突变株HD73^-(该突变株来源于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可以向公众提供)可以使外源晶体杀虫蛋白通过镜检检出。

用SalI/BamHI消化pSAS001，回收3.4Kb的基因片段，用SalI/BamHI消化载体过夜，以便消化完全，回收载体。连接载体与目的片段，转化JM110，得到穿梭表达载体pSK001的转化子。

提取质粒，纯化，电击转化(转化方法见美国Bio-Rad公司电穿孔仪说明书)SCS110进行修饰，提取质粒，纯化，电击转化HD73^-，得到的转化子可表达cry8Ca2基因。1/2LB培养基30℃培养36小时，镜检可以看到球型晶体，SDS-PAGE分析可以检测到130KD的蛋白。

3.在Bt中表达的Cry8C蛋白的生物活性检测

Bt菌株在LB培养基上培养3天后，刮下并悬浮于无菌水中，采用乳糖悬浮丙酮沉淀的方法，制成粉剂备用。将上述粉剂按照2倍等比级差梯度浓度稀释，加入到均匀粗细土豆丝的灭菌细土中混匀，以20天龄铜绿丽金龟幼虫作为供试虫主，每个处理接虫20头，重复3次，以加入清水的处理作为空白对照，感染饲养7天、14天检查死虫数，计算校正死亡率和体重增长率。

4.cry8Ca2基因的随机突变研究

利用普通Taq酶在PCR扩增中易产生突变。本发明对cry8Ca2基因进行了随机突变研究。以质粒pSAS001为模板，用引物对s8ca5/s8c3进行PCR反应，将PCR产物构建至Bt-E.coli穿梭表达载体pSXY^km，得到一系列不同的克隆，提取质粒，纯化，电击转化SCS110进行修饰，提取质粒，纯化，电击转化HD73^-，得到的转化子可以表达cry8Ca2基因。对转不同转化子的HD-73^-菌的杀虫活性进行检测，发现其中有两个位点的突变可以提高Cry8Ca2蛋白的杀虫活性，分别是第439位的Q(Gln)突变为P(Pro)和第642位的E(Glu)突变为G(Gly)。

5.cry8Ca2基因的人工改造

根据微生物和植物对密码子偏好的不同，本发明对cry8Ca2基因的1-2040bp的序列进行人工优化改造。人工优化改造序列与cry8Ca2基因序列的比较见附图7。本发明按照cry8Ca2基因的人工改造序列进行了全基因合成，新基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。改造的cry8Ca2基因即mcry8Ca(modified cry8Ca)缺失了cry8Ca2基因3’端的1.5Kb的序列，与cry8Ca2基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca2的37％提高为46％(附图8)。本发明调整Cry8Ca蛋白的氨基酸密码子使用频率，使mCry8Ca蛋白的氨基酸密码子使用频率与植物中的使用频率接近。在人工改造的序列中，突变了原来Cry8Ca2蛋白的两个氨基酸位点，分别把第439位的Q(Gln)突变为P(Pro)和第642位的E(Glu)突变为G(Gly)，新氨基酸序列见SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。将mcry8Ca基因连接至pUC19载体，两端引入BamHI和KpnI位点，把得到的质粒命名为pUCmcry8。

6.植物表达载体的构建

本发明用BamHI和KpnI双酶切pUCmcry8，回收2.0Kb的基因片段，同样用BamHI和KpnI双酶切质粒pGEM-3Zf(+)(该质粒为常用质粒，GenBank登录号为X65304，可在美国Promega公司购买到)，连接，转化JM110，把得到的阳性转化子命名为p3Zmcry8；本发明用可在根癌农杆菌和大肠杆菌中穿梭的双元载体pBI121(该载体为常用载体，GenBank登录号为AF485783。见Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11：287-293)，用BamHI和SacI双酶切质粒pBI121，回收12Kb的片段，同样用BamHI和SacI双酶切质粒p3Zmcry8，回收2.0Kb的片段，将两个片段连接，转化JM110，得到阳性转化子，把此新构建质粒命名为pBSmCN。该质粒含有组成型表达的启动子CaMV35S(即一段DNA序列，可以驱动所连接的基因片段进行转录，进而翻译成蛋白质，组成型表达的启动子可以调控基因在生长发育的任何阶段和任何组织都有表达)、mcry8Ca基因和NOS终止子(一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)。对质粒进行酶切鉴定，结果如附图9所示；构建图谱见附图10。

根据文献报道克隆烟草根特异性启动子(只驱动基因在根中表达，在其它组织没有表达)TobRB7(Yamamoto Y，1991，The plant cell，3：371-382；南兰等，2002，《科学通报》，47(1)：49-53)。首先根据TobRB7已知序列设计一对引物：

                  XbaI

TobRB7-P1F：5′-AT TCTAGACACCCGAAAGGAAATGATTCGTTC

                  BamHI

TobRB7-P1R：5′-AT GGATCCGTTCTCACTAGAAAAATGCCCCAA

提取烟草的基因组DNA做模板，应用PCR方法克隆启动子序列，其反应条件为：94℃，1分钟；54℃，1分钟；72℃，1分钟；共30个循环。电泳检测可见一740bp的产物带，回收电泳条带，用XbaI和BamHI双酶切，载体同样用XbaI和BamHI双酶切，连接，转化JM110，把得到的阳性转化子进行酶切鉴定(见附图11)；构建图谱见附图12。把得到的质粒命名为p3Zpro。测序结果表明克隆的启动子序列与报道序列(Yamamoto Y，1991，The PlantCell，3：371-382)只有一个碱基差别，同源性在99％以上。

用SacI和EcoRI双酶切质粒pBI121，回收0.26Kb的小片段，同样双酶切质粒pGEM-3Zf(+)，连接，把得到的阳性转化子命名为p3Z-Nos；用XbaI和BamHI酶切p3Zpro，回收启动子740bp的片段，连接到进行过同样酶切的载体p3Z-Nos中，构建得到质粒p3ZPN；用SalI和EcoRI双酶切质粒p3ZPN，回收1Kb的小片段，并把农杆菌-大肠杆菌穿梭的双元载体pBin19(该载体为常用载体，中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室保存，该实验室可以向公众提供该载体)用SalI和EcoRI双酶切，与回收的1Kb小片段连接，把得到的转化子命名为pBPN；用BamHI和KpnI双酶切质粒pUCmcry8，回收2.0Kb的片段，把质粒pBPN同样用BamHI和KpnI双酶切，回收大片段，连接，转化JM110，把得到的重组质粒命名为pBTmCN。其酶切鉴定和构建图谱分别见附图13和附图14。

7.农杆菌转化

取两管200μl农杆菌LBA4404的感受态细胞，分别加入1μg pBTmCN或者pBSmCN质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃恢复培养5分钟，加入1ml YEB液体培养基，28℃慢速振荡(＜100rpm)4小时，1,000rpm离心30秒种，弃上清，加入100μl YEB液体培养基重悬细胞，涂布于含有卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的YEB培养基的平板上，28℃培养48小时。将YEB抗性培养基平板上的克隆，摇菌，提取质粒，应用PCR方法检测阳性克隆。

8.烟草转化

将含有pBTmCN和pBSmCN质粒的农杆菌克隆接种于含有卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，1/50接种于MS盐(pH7.0)中；将烟草无菌苗切成0.4×0.6cm²的小块，将烟草叶片浸入MS盐中，农杆菌侵染10分钟；取出烟草叶片，用灭菌滤纸吸干菌液，放置到铺有一层滤纸的MS培养基中，28℃暗培养3天，3天后将烟草叶片转移至MS筛选分化培养基(MS培养基+100μg/ml卡那霉素+500μg/ml羧苄霉素+3mg/ml 6-BA+0.2mg/mlNAA)，28℃，光/暗＝16小时/8小时，2周后，在叶片边缘有绿色愈伤点出现，1周后，愈伤点分化成小植株，将小植株切下移至生根培养基(MS培养基+100μg/ml卡那霉素+500μg/ml羧苄霉素)生根，根部发育健壮后，移至花盆在土中继续生长(普通土∶营养土∶蛭石＝2∶1∶1)。

9.转化烟草的分子检测

提取转化烟草的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下：

3059：5′-GCTAATTCTCGTATCGCTGTTGAGT

3060：5′-TTGCGACCCTGAGATTGATAACTTG

PCR扩增的反应条件为：94℃，5分钟，1个循环；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环。把产物电泳。

10.转基因烟草的生物活性检测

从田间采集铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)、黄褐丽金龟(A.exoleta)两种在我国北方危害比较严重的金龟子成虫群体，带回室内，分别放入40×40×50cm的饲养盒中，盒底放5-8cm厚的潮湿过筛细土，饲喂新鲜榆树叶片，26-28℃饲养。待其产卵后，将卵挑出，放在潮湿土中使孵化。将刚孵化的幼虫挑出，每个小饲养盒(Φ8cm，H5cm)放幼虫5头，饲喂土豆块和新鲜的玉米嫩根，待幼虫长到一定龄期后供生物检测用。

采用群体种植和群体接虫的方法，进行生物测定。在大田土中分别种植转pBSmCN和转pBI121载体的烟草植株以及混合种植转pBSmCN、pBI121、pBTmCN、pBTGN(TobRB7启动子+GUS基因)载体的转基因植株和未转化植株，每种处理12株。

将转基因烟草12株分别种植在48×33×13cm的塑料盒子中，土壤深度12cm。每个植株接20天龄的黄褐丽金龟幼虫5头或15天龄的铜绿丽金龟幼虫5头。

金龟子类幼虫对烟苗危害程度的分级标准为：

0级：植株生长健壮，根系发达；

1级：无明显危害情况，主根、须根危害的程度占整个植株的20％以下；

2级：危害明显，根系不发达，主根、须根危害的程度占整个植株的20％-50％；

3级：植株危害严重，须根少，主根、须根危害的程度占整个植株的50％-70％；

4级：植株萎蔫，甚至死亡，主根、须根危害的程度占整个植株的70％以上

在接虫15天时，按照上述分级标准，对各种烟草植株进行统一分级，并计算危害率和危害指数。

按照建立的危害程度分级标准，黄褐丽金龟幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数见附图17、18。转pBSmCN植株的危害率为62.5％，危害指数为21.9；转pBTmCN植株危害率为80％，危害指数为35；转pBI121植株危害率100％，危害指数为76，与未转化植株的危害指数61.4相当。转pBSmCN植株和转pBTmCN植株表现出了良好的抗黄褐丽金龟幼虫的特性。

铜绿丽金龟幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数见附图19、20。转pBSmCN植株危害率为70％，危害指数为25.0；转pBTmCN植株危害率为50％，危害指数为12.5，低于转pBSmCN植株；转pBI121植株危害率为100％，危害指数为62.8，与未转化植株危害指数75.0相当。从附图21可见转pBTmCN植株和转pBI121植株相比表现出了良好的抗铜绿丽金龟幼虫的特性。

本发明的有益效果：

本发明涉及对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry8Ca基因。通过对cry8Ca基因的人工改造，使该基因更适于在植物中表达，并且将两个氨基酸位点突变后，显著提高了Cry8Ca蛋白的杀虫活性；将该基因构建植物表达载体，转化各种农作物、草坪草和花卉，可以提高植物抗地下害虫的能力，解决地下害虫不易防治的难题。如果将cry8Ca基因与cry1Ab、cry1Ba等基因构建双抗载体，将扩大对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱，并且可以克服或延缓昆虫对转基因植物抗药性的产生。

此外，将根特异性启动子与mcry8Ca基因相连构建植物表达载体，使基因在根组织特异表达，而在地上部分没有表达，这样可以避免更多的转基因生物安全性问题，有广阔的应用前景。本发明提供的cry8Ca基因序列，可以广泛应用于烟草、花生、马铃薯、玉米、草坪草等双子叶植物和单子叶植物的转基因研究和生产，提高转基因植物对地下有关害虫的毒性。

附图说明：

图1为HBF-1菌株PCR产物电泳结果。其中，

道1为菌株HBF-1；

道2为标准Marker：依次为1440，961，736，585，481，341，258，159，105bp。

图2为HBF-1菌株PCR产物EcoO109I/DraI双酶切电泳图。其中，

道1菌株HBF-1；道2为标准Marker。

图3为pSAS001的限制酶切检测与PCR鉴定。其中，

道1为pSAS001的PCR产物；

道2为pSAS001的BamHI与SalI的酶切产物；

道3为pSAS001的BamHI的酶切产物；

道4为pSAS002的PCR产物；

道5为pSAS002的BamHI与SaLI的酶切产物；

道6为pSAS002的BamHI的酶切产物；

道M为Lamda DNA/Eco1301 Marker，依次为19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925，421，71bp。

图4为pSK001表达载体的酶切分析。其中，

道1为M1：λDNA-Eco130I；

道2为pSK001BamHI/SalI酶切；

道3为pSAS001 BamHI/SalI酶切。

图5为HD73^-和pSK001营养体、芽孢形态和晶体形态。其中，

左为HD73^-无晶体突变株营养体和芽孢形态；

右为pSK001转入表达载体pSK001后有晶体产生时的形态。

图6为表达载体在BT中表达蛋白的SDS-PAGE分析。其中，

道1为大分子量蛋白Marker；

道2为载体pSK001；

道3为CK HD73^-。

图7为cry8Ca2基因与mcry8Ca基因的序列比较。

图8为cry8Ca基因与mcry8Ca基因GC含量比较。

图9为pBSmCN质粒的酶切鉴定。其中，

道1为λ/Eco130I；

道2为p3Z-mCry8 plasmid；

道3为pBSmCN/HindIII+EcoRI；

道4为pBSmCN/BamHI+EcoRI。

图10为pBSmCN质粒的构建图谱。

图11为p3Zpro质粒的酶切鉴定。其中，

道1为λ/Ecol30I；

道2为TobRB7启动子PCR扩增；

道3为3Z/XbaI+BamHI；

道4为p3z-pro/XbaI+BamHI；

道5为质粒p3z-pro。

图12p3Zpro质粒的构建图谱。

图13为pBTmCN质粒的酶切鉴定。其中，

道1为λ/Eco130I；

道2为p3Z-Nos/EcoRI+SacI；

道3为pp3Z-PN/XbaI+BamHI；

道4为p3Z-PN/SalI+EcoRI；

道5为pBPN/SalI+EcoRI；

道6为pBPN/HindIII+EcoRI；

道7为pBTmCN/HindIII+EcoRI；

道8为pBTmCN/SalI+EcoRI。

图14为pBTmCN质粒的构建图谱。

图15为农杆菌转化鉴定。其中，

道1为λ/Eco130I；

道2-道9为提取农杆菌质粒的PCR鉴定；

道10为CK-。

图16为转化烟草植株的PCR检测结果。其中，

道1-道3为转化烟草的PCR检测；

道4为λ/Eco130I；

道5为CK-；

道6-道10为转化烟草的PCR检测；

道11为CK+。

图17为黄褐丽金龟幼虫对转mcry8Ca基因烟草各级危害程度比较。

图18为黄褐丽金龟幼虫对转mcry8Ca基因烟草危害指数比较。

图19为铜绿丽金龟幼虫对转mcry8Ca基因烟草各级危害程度比较。

图20为铜绿丽金龟幼虫对转mcry8Ca基因烟草危害程度比较。

图21为铜绿丽金龟对转基因烟草的危害程度比较。其中，

A.转pBI121载体的烟草；

B.转pBTmCN载体的烟草。

具体实施方案

以下叙述本发明的实施例。应该说明，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

实施例1、cry8Ca2基因的鉴定与克隆

本发明通过利用cry基因的CAPS鉴定体系，鉴定了Bt菌株HBF-1中包含cry8类基因。利用cry8类基因的通用引物进行PCR扩增，可以扩增出1212bp的阳性条带(见附图1)；用EcoO109I和DraI双酶切PCR产物有四条带，分别为613bp、310bp、197bp和92bp(见附图2)，该带型与已知的cry8Ca1基因的带型一致，证明在菌株HBF-1中含有cry8C基因。

提取菌株HBF-1的总DNA，以总DNA为模板，以cry8Ca1基因序列的5’端和3’端序列设计全长引物，用pfuDNA聚合酶PCR扩增，得到3.5Kb的片段，连接载体pET21b，得到质粒pSAS001，测序结果表明，新克隆片段与cry8Ca1基因在2315位由G变为A，相应的氨基酸由S变为N，氨基酸的同源性为99.91％(见表1)。

表1基因cry8Ca1和基因cry8Ca2的比较结果

基因     GenBank中的  GenBank中的   第2314-2316 第772个氨  核苷酸同    蛋白质同

          核苷酸编号  蛋白质编号    核苷酸      基酸       源性        源性

cry8Ca1    U04366     AAA21119      AGT         S(Ser)     99.97％     99.91％

cry8Ca2    AY518201   AAR98783      AAT         N(Asn)

实施例2、cry8Ca2基因在Bt中表达

为验证克隆的cry8Ca2基因是否具有杀虫活性，将cry8Ca2基因的全基因片段在大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pSXY^km中表达。用SalI/BamHI消化pSAS001，回收3.4kb的基因片段，用SalI/BamHI同样消化载体，回收载体。连接载体与目的片段，转化JM110，得到穿梭表达载体pSK001的转化子。表达载体限制性内切酶酶切分析见附图4。

提取质粒，纯化，电击转化SCS110进行修饰，提取质粒，纯化，电击转化HD73^-，得到的转化子可以表达cry8Ca基因。1/2LB培养基30℃培养36hrs，镜检可以看到球型晶体(见附图5)，SDS-PAGE分析可以检测到130KD的蛋白(见附图6)。

实施例3、cry8Ca2基因的生物活性检测

如下表2所示，Bt菌株HBF-1对铜绿丽金龟幼虫的杀虫毒力最高，14天调查结果是当浓度为80μg/g土时其死亡率为100％，转cry8Ca基因的HD-73^-菌的杀虫毒力低于HBF-1菌株，当浓度为160μg/g土时其14天校正死亡率达63.3％，但显著高于无晶体突变株HD-73^-，说明克隆的cry8Ca2基因对铜绿丽金龟幼虫具有杀虫活性。

表2 Cry8Ca蛋白对铜绿丽金龟幼虫的生物活性

菌株            浓度μg/g土    7天                14天

                             校正死亡率(％)    校正死亡率(％)

                  80            50.0              100

HBF-1             40            53.3              85.7

                  20            30.0              43.3

                  10            38.3              43.3

                  5             13.3              28.3

                  160           38.3              63.3

HD-73^-(cry8Ca)   80            25.0              51.7

               40             25.0             36.7

               20             13.3             28.3

               10             15.0             28.3

               160            8.3              13.3

HD-73^-(受体菌) 80            0                8.3

               40             0                5.0

               20             0                0

               10             0                0

空白对照(水)    -             -                -

实施例4、cry8Ca2基因的随机突变

以质粒pSAS001为模板，用引物对s8ca5/s8c3 PCR反应，将PCR产物构建至Bt-E.coli穿梭表达载体pSXY^km，得到一系列不同的克隆，提取质粒，纯化，电击转化SCS110进行修饰，提取质粒，纯化，电击转化HD73^-，得到的转化子可以表达cry8Ca基因。对转不同转化子的HD-73^-菌的杀虫活性进行检测，其中有两个位点的突变可以提高Cry8Ca蛋白的杀虫活性，分别是第439位的Q(Gln)突变为P(Pro)和第642位的E(Glu)突变为G(Gly)。

实施例5、cry8Ca2基因的人工改造

根据植物和微生物密码子偏好性不同、微生物核苷酸序列中有多个ATTTA多聚核苷酸加尾信号和不同密码子的使用频率的差异，根据本发明上述方法对cry8Ca2基因进行了人工改造，改造的cry8Ca2基因缺失了cry8Ca2基因3’端的1.5Kb的序列，核苷酸的同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca2的37％提高为46％(附图8)，密码子的使用频率得到了优化(表3)。

表3密码子在植物、苏云金芽孢杆菌和改造基因中的使用频率比较

氨基酸	密码子	密码子使用频率
					植物％	Cry8Ca基因％(氨基酸个数)	改造的cry8Ca基因％(氨基酸个数)
		Lys	AAA	36				18	38(9)
	AAG				64	6	63(15)
		Asn	AAC	72				24(12)	72(36)
	AAT				28	76(38)	28(14)
		Thr	ACA	21				36(18)	36(18)
	ACC				41	10(5)	34(17)
			ACG	7				24(12)	0
	ACT				31	30(15)	30(15)
		Arg	AGA	29				58(21)	28(10)
	AGG				23	17(6)	28(10)
			CGA	7				11(4)	0(0)
	CGC				11	3(1)	14(5)
			CGG	5				0(0)	0(0)
	CGT				25	11(4)	31(11)
		Ser	AGC	21				3(2)	19(13)

	AGT	15	31(2)1	15(10)
						TCA	14	19(13)	19(13)
	TCC	16	9(6)	22(15)
						TCG	3	4(3)	4(3)
	TCT	21	33(22)	19(13)
					Ile	ATA	12	31(16)	0(0)
	ATC	45	10(5)	41(21)
						ATT	43	59(30)	59(30)
Met	ATG	100	100(12)	100(12)
					Gln	CAA	64	92(24)	64(16)
	CAG	36	8(2)	36(9)
					His	CAT	35	60(3)	40(2)
	CAC	65	40(2)	60(3)
					Pro	CCA	45	46(12)	44(12)
	CCC	19	12(3)	15(4)
						CCG	9	4(1)	0(0)
	CCT	26	38(10)	41(11)
					Leu	CTA	8	15(8)	0(0)
	CTC	20	4(2)	42(22)
						CTG	10	11(6)	11(6)
	CTT	28	21(11)	21(11)
						TTA	5	38(20)	0(0)
	TTG	30	11(6)	26(14)
					Glu	GAA	52	80(28)	56(19)
	GAG	48	20(7)	44(15)
					Asp	GAC	52	10(3)	55(16)
	GAT	48	90(26)	45(13)
					Ala	GCA	23	45(22)	22(11)
	GCC	32	12(6)	35(17)
						GCG	3	12(6)	0(0)
	GCT	41	31(15)	43(21)
					Gly	GGA	32	38(18)	38(18)
	GGC	20	9(4)	17(8)
						GGG	11	15(7)	8(4)
	GGT	37	38(18)	38(18)
					Val	GTA	9	43(16)	0(0)
	GTC	20	8(3)	19(7)
						GTG	28	19(7)	27(10)
	GTT	43	30(11)	54(20)
					Tyr	TAC	68	27(12)	64(28)
	TAT	32	73(32)	36(16)
					Cys	TGC	78	100(1)	1o0(1)
	TGT	22	0(0)	0(0)
					Trp	TGG	100	100(11)	100(11)

Phe	TTC	56	30(8)	56(15)
						TTT	44	70(19)	44(12)

实施例6、植物表达载体的构建

本发明在人工改造的mcry8Ca基因两端引入了BamHI和KpnI位点，连在pUC19载体上。本发明构建了两个植物表达载体pBSmCN和pBTmCN，构建图谱见附图10、14，电泳检测结果见附图9、13。pBmCN的构建方法是：把组成型启动子CaMV35S、改造的mcry8Ca基因和NOS终止子构建到双元载体pBI121上，并由mcry8Ca基因替换原来载体上的GUS基因。

pBTmCN载体的构建过程是：首先根据本发明以上所述的文献报道的烟草根特异性启动子TobRB7序列设计引物，5’引物在基因的-669至-646位，3’引物在基因的+48至+71位，且为方便以后的构建工作，在引物的两端分别引入XbaI位点和BamHI位点，引物序列如下：

              XbaI

TobRB7-P1F：AT TCTAGACACCCGAAAGGAAATGATTCGTTC

              BamHI

TobRB7-P1R：AT GGATCCGTTCTCACTAGAAAAATGCCCCAA

以烟草基因组DNA为模板，PCR扩增得到740bp的条带，回收，用XbaI和BamHI酶切，构建至质粒pGEM 3Zf(+)，得到质粒p3Zpro。测序结果表明，克隆的TobRB7启动子与报道的TobRB7基因相比，在-340位少了一个A，-359位中的A被T代替。通过启动子-报告基因检测启动子活性，可以看到新克隆的TobRB7启动子可以驱动报告基因GUS在转基因烟草的根中特异表达，证明新克隆的TobRB7启动子具有驱动活性，并具有组织特异性。

用SacI和EcoRI双酶切质粒pBI121，回收0.26Kb的小片段，同样双酶切质粒pGEM-3Zf(+)，连接，把得到的阳性转化子命名为p3Z-Nos；用XbaI和BamHI酶切p3Zpro，回收启动子740bp的片段，连接到同样酶切的载体p3Z-Nos中，构建得到质粒p3Zpronos；用SalI和EcoRI双酶切质粒p3Zpronos，回收1Kb的小片段，农杆菌-大肠杆菌穿梭的双元载体pBin19用SalI和EcoRI双酶切，与回收的1Kb小片段连接，把得到的转化子命名为pBpronos；用BamHI和KpnI双酶切质粒pUCmcry8，回收2.0Kb的片段，质粒pBpronos同样用BamHI和KpnI双酶切，回收大片段，连接，转化JM110，把得到的重组质粒命名为pBTmCN。

实施例7、植物表达载体转化农杆菌

采用冻融直接转化法，将构建好的质粒pBTmCN、pBSmCN转入根癌农杆菌LBA4404。转化子在卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的双抗性YEB培养基的平板上筛选。随机选取转化得到的克隆，少量提取质粒DNA进行PCR扩增验证，证明两种质粒均已转入农杆菌(附图15)。

实施例8、植物表达载体转化烟草

烟草转化采用叶盘法(Horsch RB，1986，Proc Natl Acad SciU S A.83(8)：2571-5)，转化外植体取培养的烟草无菌苗顶部幼嫩叶片。共培养三天后，转至分化培养基(MS培养基+100μg/ml Kn+500μg/ml Cb+3mg/ml 6-BA+0.2mg/ml NAA)进行见光分化，2周后，在叶片边缘有绿色愈伤点出现，而大部分转化体则可以直接分化出抗性芽，抗性芽长到2-3cm时，移至生根培养基(MS培养基+100μg/ml Kn+500μg/ml Cb)生根，约2周后可生出细嫩小根，逐渐成苗。

实施例9、转化烟草的分子检测

提取转化烟草的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下：

3059：5′-GCTAATTCTCGTATCGCTGTTGAGT

3060：5′-TTGCGACCCTGAGATTGATAACTTG

PCR扩增的反应条件为：94℃，5分钟，1cycle；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环，电泳结果如附图16所示。

实施例10、转基因烟草的生物活性检测

将铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和黄褐丽金龟(A.exoleta)两种在我国北方危害比较严重的金龟子采用群体种植和群体接虫的方法，进行生物测定。在大田土中采用分别种植转pBSmCN和转pBI121载体的烟草植株以及混合种植转pBSmCN、pBI121、pBTmCN、pBTGN(TobRB7启动子+GUS基因)载体的转基因植株和未转化植株的种植方法，每个处理12株。

将转基因烟草12株分别种植在48×33×13cm的塑料盒子中，土壤深度12cm。每个植株接20天龄的黄褐丽幼虫5头或15天龄的铜绿丽金龟幼虫5头。

在接虫15天时，按照本发明上述的分级标准，对各种烟草植株进行统一分级，并计算危害率和危害指数。

按照建立的危害程度分级标准，黄褐丽金龟幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数见附图17、18。可见转pBSmCN植株的危害率为62.5％，危害指数为21.9；转pBTmCN植株危害率为80％，危害指数为35；转pBI121植株危害率100％，危害指数为76，与未转化植株的危害指数61.4相当。转pBSmCN植株和转pBTmCN植株表现出了良好的抗黄褐丽金龟幼虫的特性。

铜绿丽金龟幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数见附图19、20。转pBSmCN植株危害率为70％，危害指数为25.0；转pBTmCN植株危害率为50％，危害指数为12.5，低于转pBSmCN植株；转pBI121植株危害率为100％，危害指数为62.8，与未转化植株危害指数75.0相当。转pBTmCN植株和转pBSmCN植株表现出了良好的抗铜绿丽金龟幼虫的特性。附图21直观地显示了转pBTmCN植株和转pBI121植株相比表现出的良好的抗铜绿丽金龟幼虫特性。

附：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列

SEQ ID NO 1(mcry8Ca基因的核苷酸序列)：

atgagcccaa acaatcaaaa cgagtacgaa attatcgacg ctctctcacc cacttccgtt    60

tccgataact ctattcgtta tcctctcgcc aatgaccaaa ccaacacact ccagaatatg    120

aactacaaag attatctgaa gatgaccgaa tcaacaaacg ctgagttgtc tcgcaacccc    180

gggacattta ttagtgctca ggacgctgtt ggaactggaa ttgatattgt tagcactatc    240

atcagtggtc tcggcattcc agtgcttggg gaagtcttct caattctggg ttcactcatt    300

ggcctcttgt ggccctcaaa taacgaaaac gtttggcaaa tctttatgaa ccgcgtggag    360

gagttgattg accaaaaaat cctcgattcc gtccgttcaa gggccattgc agacctcgct    420

aattctcgta tcgctgttga gtactaccag aacgcccttg aagactggag gaagaaccca    480

cacagcacac gcagcgcagc ccttgtgaag gaaagattcg gaaacgcaga ggccattctc    540

cgtactaata tgggttcatt ttctcaaacc aactatgaga ctccactcct ccccacatac    600

gcccaggccg cctccctgca tttgcttgtt atgagggatg ttcaaattta cggcaaggaa    660

tggggatatc ctcagaacga cattgacttg ttttacaaag aacaagtctc ttataccgct    720

agatactccg atcactgcgt ccaatggtac aacgctggtc tcaataagct cagaggaacc    780

ggtgctaagc agtgggtgga ctataaccgt ttccgccgtg agatgaacgt gatggttttg    840

gatttggttg cactcttccc aaactacgac gctcgtatct acccactgga aacaaatgcc    900

gaacttacaa gagagatttt cacagatcct gttggaagtt acgtgactgg acaatcgagc    960

acccttatct cttggtacga catgattcca gcagctcttc cttcattttc aaccctcgag    1020

aacttgcttc gtaaacctga tttctttact ttgctgcaag aaattaggat gtatacaagt    1080

ttcagacaga acggcaccat tgaatactat aactactggg gaggacaaag gctcaccctt    1140

tcctatatct acggttcctc attcaataag tatagcgggg ttcttgccgg tgctgaggac    1200

attattcctg tgggtcaaaa cgatatttac agggttgttt ggacttacat cggaaggtac    1260

accaacagtc tgttgggagt caacccagtt actttttact tcagcaataa cacacctaaa    1320

acttattcga agccaaagca attcgctggt ggaatcaaaa caattgactc cggcgaggaa    1380

ctcacttacg aaaactacca atcttatagt cacagggtta gctacattac atcttttgag    1440

atcaagagta ccggtggtac agtgctcgga gttgttccta tcttcggttg gacccatagc    1500

agtgccagcc gcaacaattt tatttacgca acaaaaatct cacagatccc aatcaacaag    1560

gccagtagaa ctagcggtgg agctgtttgg aacttccaag aaggtttgta caacggagga    1620

cctgtcatga aactctccgg ctctggttcc caagttatca atctcagggt cgcaacagat    1680

gccaagggag caagccagcg ttatcgtatt agaatcagat acgcctctga ccgtgctggt    1740

aagtttacca tctcctccag atctccagag aaccctgcaa cctattcagc ttccattgct    1800

tacacaaaca ctatgtccac aaacgcttct ttgacctata gtactttcgc ctacgcagaa    1860

tctggcccta tcaatctcgg gatttcggga agctcaagga cttttgatat ctccattaca    1920

aaaggtgccg gtgctgctaa cctttatatt gacagaattg aatttattcc agttaacacc    1980

ctcttcgaag cagaggaaga cttggatgtg gccaagaagg ctgtgaatgg cttgttcacc    2040

taa                                                                  2043

SEQ IDNO 2(mcty8Ca基因的氨基酸序列)：

MSPNNQNEYE IIDALSPTSV SDNSIRYPLA NDQTNTLQNM NYKDYLKMTE STNAELSRNP    60

GTFISAQDAV GTGIDIVSTI ISGLGIPVLG EVFSILGSLI GLLWPSNNEN VWQIFMNRVE    120

ELIDQKILDS VRSRAIADLA NSRIAVEYYQ NALEDWRKNP HSTRSAALVK ERFGNAEAIL    180

RTNMGSFSQT NYETPLLPTY AQAASLHLLV MRDVQIYGKE WGYPQNDIDL FYKEQVSYTA    240

RYSDHCVQWY NAGLNKLRGT GAKQWVDYNR FRREMNVMVL DLVALFPNYD ARIYPLETNA    300

ELTREIFTDP VGSYVTGQSS TLISWYDMIP AALPSFSTLE NLLRKPDFFT LLQEIRMYTS    360

FRQNGTIEYY NYWGGQRLTL SYIYGSSFNK YSGVLAGAED IIPVGQNDIY RVVWTYIGRY    420

TNSLLGVNPV TFYFSNNTPK TYSKPKQFAG GIKTIDSGEE LTYENYQSYS HRVSYITSFE    480

IKSTGGTVLG VVPIFGWTHS SASRNNFIYA TKISQIPINK ASRTSGGAVW NFQEGLYNGG    540

PVMKLSGSGS QVINLRVATD AKGASQRYRI RIRYASDRAG KFTISSRSPE NPATYSASIA    600

YTNTMSTNAS LTYSTFAYAE SGPINLGISG SSRTFDISIT KGAGAANLYI DRIEFIPVNT    660

LFEAEEDLDV AKKAVNGLFT                                                680

Claims (6)

1.一种Bt基因cry8Ca的人工合成序列，其特征是该序列具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。

2.一种对昆虫具有活性的蛋白质，其特征是该蛋白质是由权利要求1的核苷酸序列所编码，且具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

3.一种植物表达载体，其特征是该植物表达载体含有权利要求1的基因序列和一种可在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体。

4.一种植物表达载体，其特征是该植物表达载体含有权利要求1的基因序列和一种可以在大肠杆菌中表达的载体。

5.一种转化植物使之表现出对昆虫毒性的方法，其特征是该方法应用权利要求3的植物表达载体。

6.一种转化植物使之表现出对昆虫毒性的方法，其特征是该方法应用权利要求4的植物表达载体。

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