CN1597969A

CN1597969A - 一种双t－dna载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用

Info

Publication number: CN1597969A
Application number: CN 200410064691
Authority: CN
Inventors: 刘巧泉; 辛世文; 于恒秀; 顾铭洪
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2004-09-20
Filing date: 2004-09-20
Publication date: 2005-03-23

Abstract

本发明提供一种含有双T－DNA结构区的简便农杆菌双元载体，以及利用此载体系统培育无抗性选择标记转基因水稻的方法。该系统借助于根瘤农杆菌介导的共转化原理，在一个双元载体上含有两个独立的T－DNA结构区段，其中的第一个T－DNA区含有抗生素抗性选择标记基因，而第二个T－DNA区含有一个通用的多克隆位点，可任意插入目的基因。该双T－DNA载体分子量小，易于克隆操作，在其含多克隆位点的T－DNA区上克隆入目的基因及其必要的调控系列后，实现对水稻的共转化；经自花授粉，在其自交后代中选育含有目的基因、而已剔除了选择标记基因的转基因个体，从而消除因为选择标记的存在而对转基因植物商业化生产等可能带来的负面影响。

Description

一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用

技术领域

本发明涉及一种无抗性选择标记转基因作物的培育方法，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。更具体地说，本发明涉及一种具有两个独立T-DNA结构域的双元载体，分别含有抗性选择标记基因和目的基因；涉及利用该双T-DNA双元载体系统产生同时含有选择标记基因与目的基因的共转化转基因植株后，在其后代群体中选育只含目的基因而无抗性选择标记基因的个体，从而消除因为选择标记的存在而对转基因作物商业化生产等可能带来的负面影响。

背景技术

自1994年首例转基因植物进入商品化生产以来，全球转基因作物的种植面积迅速扩大，2001年已达到5260万公顷，是1996年种植面积的近20倍。但随着转基因作物商品化生产的加快，也呈现出越来越多潜在的问题。其中，抗性选择标记基因(Resistant selectable maker gene)潜在的生态环境和食用安全性是考虑得较多的、也是争论最大的焦点问题之一。抗性选择标记目前广泛应于植物的遗传转化，在辅助筛选转目标基因植物的过程中起到了很大的作用。但当成功获得转基因植株后，选择标记基因的存在便又是多余的，而且有可能会影响目的基因的稳定性、加重受体植物细胞代谢的负担；更为重要的是，抗性选择标记一般都是一些抗生素抗性标记，含此类选择标记的转基因植物在进入商品化生产应用后，是否会对人畜产生潜在的危害，是否会被病原菌所摄取而造成更为严重的潜在后果等等？这些潜在的问题对转基因作物的进一步应用造成了一定的影响。因此，培育无抗生素选择标记的、更为安全的转基因作物已成为当前全球植物基因工程育种的重要目标之一。

解决转基因植物中抗性选择标记安全性问题的途径有两条：一是采用可剔除抗性选择标记或无标记转化技术，培育不含任何选择标记的转基因植株；二是发展非抗性的安全性标记基因。其中第一条途径中因培育的转基因植物中只含有目标基因而不含任何非目的基因，所以受到了广泛的重视；特别是最近几年来国外在这方面的研究与技术进步非常迅速。目前，已发展了多种培育无抗性选择标记转基因植物的技术，主要可分为两类，一类称为标记基因的剔除技术，另一类为无标记直接转化技术。其中又以标记基因的剔除技术最为成功，也是目前研究和应用最多的一项技术。

从转基因植物中剔除选择标记的技术可归纳为三种。(1)共转化(Co-transformation)和遗传分离系统。该系统是用得最多的、也是最为普遍的一种用于培育无标记转基因植物的技术。将目的基因和选择标记基因分别构建进不同的载体或同一载体的不同功能区段，共同转化入同一受体细胞中获得转基因共整合植株作为选育对象，在下一个自交分离世代中标记基因和目的基因可经遗传重组而被分离，即可筛选获得仅含目的基因而不含选择标记的理想转基因植株。该系统比较简单，适用于多种转化体系，但必须保证标记基因和目的基因共整合在受体基因组的不同位点。早前主要是运用基因枪介导的双载体共转化法获得共转化植株。随着农杆菌转化植物技术的成熟和普及，基于农杆菌的共转化技术已成为该系统的主流，发展的技术有双菌株双载体法、单菌株双载体法以及单载体双T-DNA(或双T-DNA边界)法等。其中以单载体双T-DNA法的效果最好，共整合频率在50％以上，获得无标记转基因植株的机率也很高，目前已相继在水稻、烟草、玉米和大豆等中获得应用。共转化系统中标记基因和目的基因的遗传分离必需经过有性世代才能实现，这不仅会增加育种时间，而且无法应用于无性繁殖的物种。(2)位点特异性重组(Site-specific recombination)或转座子(Transposon)介导切除系统。该技术是将选择标记基因构建在DNA专一性位点间或转座子内，筛选获得的转基因植株与含重组酶或转座酶基因的转基因植株杂交，经重组或转座从目的基因整合位点处切除选择标记基因。目前已应用的重组酶系统主要有两种，即噬菌体P1的Cre/loxP系统和质粒pSR1的R/Rs重组系统。该技术需要在受体细胞中额外表达重组酶或转座酶，但在转基因植株中发生重组或转座的机率往往不高；另外，在剔除标记基因后还必须经有性世代的遗传分离去除重组或转座酶基因，操作程序繁琐，应用受到很大限制。最近新发展的两类标记切除系统可明显地改进这些缺陷，一是结合了重组酶基因R与正选择标记基因ipt(Iropentennyl transferase，异戊烯基转移酶)的农杆菌MAT( Muti-auto transformation)载体系统，二是基于人雌激素受体和Cre/loxP重组系统的化学诱导标记基因剔除系统。前者最终可实现一步法获得无标记转基因植株，但必须依赖于ipt表型筛选；后者不仅可精确控制切除时间、提高标记基因切除频率，而且有利于高频再生无标记的单拷贝转基因植株。(3)染色体内同源重组(Introchromosomal homologousrecombination，ICR)诱导缺失系统。自然条件下植物细胞内的ICR频率极低。借助于噬菌体附着序列attP构建的农杆菌attP-ICR载体系统使转基因烟草中的ICR频率显著提高，并成功诱导了标记基因的切除。该系统为培育无标记转基因植株提供了又一条捷径，但其作用机制仍有待阐明，而且具体操作实效也有待提高。

上述各项技术虽然都已在无抗性选择标记转基因植物的培育中得到了一定的研究应用，但多数技术离实际的商业化应用，尤其对于大众化的育种应用仍有一定的距离。综合分析评价各项技术的实际要求，并结合转基因作物，尤其是重要的禾谷类作物的研究结果，可以看出真正能适用于培育无抗性选择标记转基因作物(重点是禾谷类作物)、并富有成效的主要还是共转化技术。因为：(1)以基于重组酶、转座子或染色体内重组等的标记基因剔除系统为例，这些系统虽然已在烟草和拟南芥等模式植物中获得了证明，但到目前为止极少见应用于水稻、玉米等重要粮食作物的报道；其次，在水稻等作物中发生同源重组或转座的机率往往不高，再加上这些系统仍需要与含重组酶或转座酶基因的转基因植株杂交以及随后世代的遗传分离，所以真正能筛选获得的无标记转基因植株的效果仍十分有限，而且选育周期也较长。(2)多数改良的标记基因剔除系统都要结合ipt基因等正选择标记作为辅助标记(如Endo等2002)，这些技术虽然已在个别植物品种中获得了应用，但对于受体材料的要求却极为严格，特别是对多数较难转化的玉米和水稻(尤其是籼稻类型)来讲，都不适宜于使用ipt基因作为正选择标记。因此，要在重要的禾谷类作物，特别是水稻和玉米等中普及此类技术仍有很大的难度。(3)与上述两点形成鲜明对比的是，基于共转化技术的标记基因剔除系统却已包括水稻、玉米和大豆等重要作物在内的大多数作物中获得了非常普遍的应用，而且效果良好。尤其是经农杆菌介导的双T-DNA载体系统，不仅共转化率高(50％以上)，而且通过遗传分离后获得无选择标记转基因植株的几率也很高(超过60％)。该技术不仅在水稻中获得了很好的效果，而且已被证明在玉米、烟草和大豆等中也同样有效。但这些双T-DNA载体的分子量往往较大，而且不具通用性。因此，发展一种适用性广的、极易进行体外遗传操作的T-DNA载体系统是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于高效培育无抗性选择标记转基因植物的简便双T-DNA双元载体系统。该系统借助于根瘤农杆菌介导的共转化原理，在一个双元载体上含有两个独立的T-DNA结构区段，其中的第一个T-DNA区含有抗生素抗性选择标记基因，而第二个T-DNA区含有一个通用的多克隆位点，可任意插入目的基因。该双T-DNA载体分子量小，易于克隆操作；利用该载体系统转化植物，尤其是单子叶作物如水稻等的共转化效率高，而且适用性广。

本发明的另一个目的是提供一种无选择标记转基因水稻的高效培育方法。该方法是借助于所构建的简便双T-DNA双元载体系统，在其中一个T-DNA区克隆入目的基因及其必要的调控系列后，实现对水稻的共转化；经自花授粉，在其自交后代中选育含有目的基因、而已剔除了选择标记基因的转基因个体。

本发明的再一个目的是提供由上述载体系统和方法培育的转基因水稻植株及其后代，以及由这些材料为亲本经有性杂交转育而成的所有含有目的基因的转基因水稻。

本发明的技术方案包括：

(1)制备含有两个T-DNA结构域的农杆菌双元载体，称为双T-DNA双元载体，其中所述第一个T-DNA区上含有可用于筛选转化植物细胞的抗生素抗性选择标记基因，第二个T-DNA区上含有一个通用的多克隆位点，可方便地克隆入目的基因。

(2)在第二个T-DNA区克隆入用于改良作物的目的基因，再用该载体系统借助于根瘤农杆菌介导的共转化方法转化受体水稻。可期望借助于一个农杆菌将两个独立的T-DNA区导入同一个细胞中，并整合到不同染色体或同一染色体的不同位置上，从而可在分离后代中获得只含目的基因、无抗性选择标记基因的转基因植株。

其中所述的双T-DNA双元载体相对于常规的农杆菌双元载体，只多了一个T-DNA功能区，其它所含核酸序列及其功能同常规双元载体。该载体系统在转化植物的技术方法上与其它双元载体系统无明显差别，但却可方便地用于培育无抗性选择标记的转基因作物。

所述第一个T-DNA区上的抗生素抗性选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase，HPT)基因，第二个T-DNA区上的多克隆位点源自质粒pUC18的通用多克隆位点。

所述目的基因可以包括任何在生产上的有应用价值的基因，包括抗生物胁迫(抗虫、抗病)基因、抗非生物胁迫(抗除草剂、耐盐等)基因、品质改良基因、以及与其它转基因应用有关的目的基因及其上述不同基因的融合或多价基因。

所述受体水稻指所有栽培稻种，包括籼稻、粳稻、爪哇稻，常规稻，杂交稻的不育系、保持系或恢复系。

附图说明

图1(A)所示为含有双T-DNA结构区的植物通用双元载体pSB130；

图1(B)所示为含有双T-DNA结构区的植物通用双元载体pSB131；

图2所示为含有LRP基因的双T-DNA植物表达载体pSB130-LRP；

图3所示为T0代转pSB130-LRP水稻植株总DNA的Southern杂交分析；

图4所示为转双T-DNA载体pSB130-LRP水稻T1代植株总DNA的Southern杂交分析；

图5所示为含有Bt毒蛋白基因和GUS基因的双T-DNA植物表达载体pSB131-BT；

图6所示为Bt基因与HPT基因共转化的水稻植株T₀代总DNA的PCR分析；

图7所示为Bt基因与HPH基因共转化的水稻植株T1代总DNA的PCR分析；

附图1：本发明构建开发的通用双T-DNA双元载体pSB130和pSB131。双元载体pSB130上的第一个T-DNA结构区(RB1-LB1)上含有一个源自质粒pUC18的通用多克隆位点，而第二个T-DNA结构区(RB2-LB2)含有潮霉素磷酸转移酶基因作为抗性选择抗性标；pSB131为携带有GUS报告基因的双T-DNA通用双元载体，其中第一个T-DNA区(RB1-LB1)上除含有一个源自质粒pUC18的通用多克隆位点外，还含有一个GUS报告基因，第二个T-DNA区(RB2-LB2)含有潮霉素磷酸转移酶基因作为抗性选择抗性标。

附图2：携带有高赖氨酸含量LRP目的基因的双T-DNA双元载体pSB130-LRP。其中一个T-DNA区含有潮霉素磷酸转移酶基因作为抗性选择抗性标，另一个T-DNA区上含有来自四棱豆的高赖氨酸含量蛋白LRP基因。

附图3：T0代转pSB130-LRP水稻植株总DNA的Southern杂交分析。总DNA分别抽提自转基因水稻植株L(经含双T-DNA载体pSB130-LRP的农杆菌介导转化而来)或未转化植株(标记为W)的叶片。总DNA在电泳前都经HindIII(h)或PstI(p)酶切消化，杂交所用的探针分别为地高辛标记的反义HPT基因编码区序列(图3-A)或LRP cDNA(图3-B)，P表示pSB130-LRP质粒DNA，图左侧所示(M)为地高辛标记的分子量标准(GIBCOBRL公司)。

附图4：转pSB130-LRP水稻T1代不同植株总DNA的Southern杂交分析。总DNA分别抽提自转基因水稻L(经含双T-DNA载体pSB130-LRP的农杆菌介导转化而来)T1代植株或未转化植株(标记为W)的叶片。总DNA在电泳前都经EcoRI酶切消化，杂交所用的探针分别为地高辛标记的反义潮霉素抗性基因编码区序列(图4-A)或LRP cDNA(图4-B)，图左侧所示(M)为地高辛标记的分子量标准(GIBCOBRL公司)。

附图5：携带有Bt毒蛋白目的基因的双T-DNA双元载体pSB131-BT。其中一个T-DNA区含有潮霉素磷酸转移酶基因作为抗性选择抗性标，另一个T-DNA区上含有来自苏云菌芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因和GUS报告基因。

附图6：Bt基因与HPT基因共转化的水稻植株T₀代总DNA的PCR分析。A.Bt基因的PCR分析结果；B.HPT基因的PCR分析结果。泳道M为DNA分子量标记，泳道P指质粒DNA；泳道W为未转化植株总DNA；泳道1-5分别为5个T₀代转基因植株总DNA。

附图7：Bt基因与HPT基因共转化的水稻植株T1代总DNA的PCR分析。A.Bt基因的PCR分析结果；B.HPT基因的PCR分析结果。泳道M为DNA分子量标记，泳道P指质粒DNA；泳道W为未转化植株总DNA；泳道1-9分别为来源于同一T₀代共转化植株的T1代9个转基因单株的总DNA。图中8号植株即可无抗性选择标记的转基因植株。

具体实施方式

以下结合四个最佳实施例进一步阐明本发明的具体实施方式。实施例所述内容不构成对本发明权利要求范围的限制。

实施例1：植物双T-DNA通用双元载体pSB130和pSB131的构建

1.1根据双元载体pCAMBIA1300(CAMBIA，Australia)的核苷酸序列，设计了两个引物LBP₁(5’-CAA GCGGCCGCGAGATCATCCGTGTTT-3’)和LBP₂(5’-GTA GAATTCGACCGGATCTGTCGATCGA-3’)，以便从该双元载体中扩增其T-DNA区的左边界序列。在这两个引物的5’端分别加接上了Not I和Eco RI(下划线)酶切位点，其中LBP₂位于左加界序列靠近T-DNA一侧。PCR反应的条件为95℃、5min；95℃、50sec，55℃、50sec，72℃、30sec，30个循环；72℃、7min。495bp长的PCR产物经Not I和Eco RI酶切后克隆进中间载体pBluescript SK^-中，经鉴定的阳性克隆称为pBSK/LB。

1.2用Hind III和Eco RI双酶切双元载体pCAMBIA1300，再用Klenow大片段补平并让其自连，以去除该双元载体中的多克隆位点，形成无多克隆位点的双元载体pC130。

1.3用SacII和NotI双酶切双元载体pC130，回收并纯化3.8kb的含T-DNA区的一个片段，将其克隆进第一步的载体pBSK/LB中，构建成载体pBSK/LB/T-DNA。

1.4用SphI和NotI双酶切载体pBSK/LB/T-DNA，再用Klenow大片段补平并让其自连，以去除该质粒中位于SphI和NotI之间的DNA序列，形成载体pBSK/LB/T-DNA(M)。

1.5用SacII和EcoRI双酶切载体pBSK/LB/T-DNA(M)，回收并纯化3.4kb长的含一个T-DNA区和一个左加界序列的片段，用这一片段取代原双元载体pCAMBIA1300或pCAMBIA1301中SacII和EcoRI之间的序列(含T-DNA区左边界和潮霉素抗性基因)，即构建成含两个T-DNA区的双元载体pSB130(附图1-A)和pSB131(附图1-B)。

构建的两个双T-DNA载体中，其中一个含有由CaMV 35S启动子控制的潮霉素磷酸转移酶基因，在导入植物细胞后可使其产生对潮霉素的抗性，用作抗性选择标记。在pSB130的另一个T-DNA结构区中，含有一个来源于质粒pUC18的多克隆位点，可方便地用于克隆入目的基因；在pSB131的另一个T-DNA结构区中，除也含有pUC18的多克隆位点外，还携带有一个来源于细菌的GUS(beta-glucuronidase，beta-葡萄糖甘酸酶)报告基因，可通过组织化学染色来筛选含有目的基因的转基因后代个体。

实施例2：利用双T-DNA载体培育无选择标记的高赖氨酸含量转基因优质水稻

2.1携带有高赖氨酸含量蛋白LRP基因的双T-DNA双元载体的构建

稻米中缺乏赖氨酸，被认为是水稻的第一限制必需氨基酸，利用转基因技术在水稻中表达异源的富含赖氨酸的蛋白质，可提供稻米中总的赖氨酸含量。克隆自四棱豆的高赖氨酸含量蛋白(Lysine-rich protein，LRP)基因，其编码的蛋白质中含有10.7％的赖氨酸(Sun等，USA patent，1998)，是一个理想的用于改良稻米营养品质的基因。为使其在转基因水稻种子胚乳中特异性高表达，将编码LRP的cDNA连接于水稻本身的谷蛋白基因Gt1启动子之后，再克隆入双T-DNA双元载体pSB130(图1-A)的多克隆位点中，构建了含1.8kb长Gt1启动子、LRP cDNA和NOS终止子序列的植物表达载体pSB130-LRP(图2)。将此植物表达载体经冻融法转化入农杆菌菌株EHA105中，并用于水稻的转化。

2.2转基因水稻植株的获得

按申请人已建立的农杆菌介导转化水稻的程序(刘巧泉等，植物生理学报，1998)将所构建的植物表达载体中所含的基因导入水稻中。取开花后12～15天的水稻未成熟种子经70％乙醇表面消毒2min后，于2％(活性氯含量)的NaClO溶液中消毒90min以上，并不时摇动，用无菌水冲洗4～5次，然后用解剖刀和镊子剥出幼胚并培养于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，经4-7天预培养后诱导出的初生愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。将在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/l卡那霉素(Kanamycin，Km)的YEB半固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/l Km的YEB液体培养基中，于28℃振摇培养过夜；第2天按1％接种量转接入40ml含50mg/l Km的AB液体培养基中，于28℃、250rpm继续培养6～8hr(培养至生长对数期)。将新鲜的培养液于6000rpm、4℃离心5min，收集菌体并重悬于10～15ml的AAM(含100～400μmol/l乙酰丁香酮)液体培养基中，立即用于与水稻受体材料的共培养转化。将各种适宜的水稻受体材料浸没在新鲜的AAM农杆菌菌液中15～30min，间或摇动几次。然后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N₆D₂C共培养培养基上，于26-28℃黑暗条件下共培养3天。3天后，切去胚芽并转入选择培养基上进行选择培养。10～14天后长出的新鲜愈伤组织再转移到新的选择培养基上继续筛选2代(10～14天/代)，然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小苗经生根壮苗后移入网室或人工气候室盆栽。共获得了41个独立的转化子，分别称为L1、L2和L41等；每个转化子含有2-6个转基因水稻植株。大多数转基因水稻植株移栽入大田后，绝大多数能正常生长、开花并结实。

2.3T0代转基因水稻植株的分子鉴定

取一定的水稻嫩绿叶片，按Murray和Thompson(1980)所述的CTAB法提取总DNA，总DNA溶解于含20mg/l RNAase A的ddH₂O中，37℃温浴1h，直接1μl总DNA用于PCR分析。在25μl反应液中混合1μl总DNA、1×反应缓冲液、1.5mmol/l MgCl₂、0.2mmol/l dNTPs、1μmol/l引物、1单位Taq DNA聚合酶(Promega)及适量ddH₂O，进行PCR扩增。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离并在凝胶成像仪上观察。Southern杂交时，取6-8μg总DNA，用适量的限制性内切酶消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，并按Sambrook等(1989)预处理凝胶，并将DNA转移到带正电荷的尼龙膜(Roche)上。按Roche推荐的条件，尼龙膜先在不含DNA探针的丘奇(Church)缓冲液(7％SDS，50％formaldehyde，5×SSC，2％blocking reagent，50mmol/l sodium phosphate，pH7.0，0.1％N-lauroylsarcosine)中于42℃预杂交2-4h，然后加入2.2.10.2中已经地高辛标记的反义DNA探针至终浓度为10ng/ml)杂交过夜。第二天分别用2×SSC、0.1％SDS(室温)和0.5×SSC、0.1％SDS(68℃)各洗2次，每次20min；然后按DIG Luminescent Detection Kit(Roche)推荐的程序进行检测。用已杂交的尼龙膜进行第二次杂交时，先将膜用ddH₂O清洗5min，再用0.2mol/l NaOH、0.1％SDS在37℃洗2次，每次20min，以去除与DNA结合的探针。然后将膜浸泡在2×SSC中5min，便可按上述程序用第二个DNA探针进行预杂交、杂交。

在由双T-DNA双元载体来源的所有转基因水稻植株中，首先用PCR筛选同时整合有两个T-DNA的共转化子。对由双T-DNA双元载体pSB130-LRP来源的41个的独立转化子中，从28个转基因株系中扩增出了与LRP和HPT基因特异的PCR产物，共转化频率达到68.3％。进一步以LRP或HPT基因特异的探针作Southern blot分析，在所分析的转基因水稻植株中都整合有HPT基因(图3-A)，但只在一部分转基因植株中检测到LRP嵌合基因的整合(图3-B)。PCR和Southern杂交分析的结果，都说明位于同一双元载体上的两个独立T-DNA区上的HPT基因与LRP嵌合基因可一起整合入转基因水稻植株的基因组中。另外，从部分转基因水稻植株只整合有HPT基因这一点分析，该超双元载体中含潮霉素抗性基因的T-DNA可单独整合入水稻基因组中。

2.4无抗性选择标记转LRP目的基因植株的获得

对27个同时含有HPT和LRP基因的共转化植株，分别收取T₁代成熟种子。随机选取部分种子去壳灭菌，接种在含50mg/l潮霉素的1/2MSH培养基上，统计潮霉素抗性分离情况；或直接将种子播种入人工气候室，待苗长大后，按刘巧泉等(2001)的方法检测各植株中的潮霉素抗性；同时选取部分T₁代植株按单株提取叶片总DNA，用于PCR或Southern杂交分析。结果显示，HPT和LRP基因在部分独立转化株的后代中发生遗传分析，其后代的部分植株只含有LRP目的基因，而不含有HPT基因，如L15、L16、L22和L26等(表1)，这些后代个体中HPT和LRP基因的整合情况进一步经Southern杂交获得了证实(图4)。也有部分后代中HPT和LRP基因未发生分离的，即两个基因仍紧密联锁在一起，如L1和13等(表1)。在所分析的总共27个独立转化系中，发现有12个可产生无抗性选择标记的转目的基因水稻后代个体，获得无选择标记转基因植株的频率为44％。

表1转双T-DNA载体pSB130-LRP共转化植株后代个体间HPT和LRP的分离比分析

T₀代植株整合拷贝数 T₁植株数

T₀代共

转化植株

HPT LRP HPT⁴/LRP⁺ HPT⁴/LRP^- HPT⁴/LRP⁺ HPT⁴/LRP^-

L1 1 1 24 0 0 7

L13 1 1 16 0 0 2

L15 1 1 27 4 5 2

L16 1 1 14 2 3 1

L17 2 2 35 0 0 5

L22 1 2 17 0 3 0

L26 2 3 12 3 3 0

L28 1 1 14 0 0 5

实施例3：利用双T-DNA载体培育无抗性选择标记的抗虫转Bt基因水稻

3.1携带有Bt毒蛋白基因的双T-DNA双元载体的构建

来源于苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因是目前应用最为广泛的抗虫基因，转Bt毒蛋白基因棉花、玉米等已获成功运用；该基因导入水稻后对稻螟虫具有很好的抗性。本实例采用根据植物偏爱密码子重新合成Bt毒蛋白基因，可使该基因在转基因植物中更高效并稳定地表达；另外在Bt毒蛋白的N-端加接上来自于植物的转运肽信号序列，可使表达产物定位于内质网中，使目的蛋白的表达更具高效性(彭日荷等，生物化学与生物物理学报，2001，33：219-224)。分别用SacI和EcoRI以及HindIII和BamHI双酶切将来自于农杆菌的胭脂碱合成酶基因的终止子(NOS)和来自于玉米的泛素Ubiquitin基因启动子克隆入双T-DNA载体pSB131(图1-B)的相应多克隆位点中，然后再用BamHI和SacI将化学合成并经修饰的Bt毒蛋白基因插入pSB131中Ubiquitin启动子和NOS终止子之间，即构建了含有Bt毒蛋白基因的双T-DNA植物表达载体pSB131-BT(图5)。此植物表达载体经冻融法转化入农杆菌菌株EHA105中，并用于水稻的转化。

3.2转基因水稻植株的获得

转基因水稻的培育方法同实施例2。经该双T-DNA植物表达载体系统转化，一共在一个粳稻品种武香粳9中获得了77个独立的转基因水稻株系，在另一个籼稻品种协青早中获得了3个独立的转基因株系。

3.3T0代转基因水稻植株的鉴定

对由双T-DNA双元载体来源的所有转Bt毒蛋白基因水稻植株，首先用PCR分析HPT基因的整合情况，结果表明所有转基因水稻植株都已整合有潮霉素抗性基因(图8)。因在该双元载体的其中一个T-DNA还含有GUS报告基因，我们可用GUS组织化学染色法进行检测目的基因的整合情况。经对所有转基因株系进行GUS染色，发现在总共81个株系中仅3个显示有GUS阳性。同时对所有转基因水稻植株又进行了针对目的基因(Bt基因)的PCR分析，结果显示在共81个转基因株系中有23个含有Bt基因(图6)，证明两个T-DNA区的共整合率为30％左右，对GUS基因的PCR分析进一步证实了这一结果。比较GUS组织化学染色及PCR分析的结果也可看出，大部分共转基因植株中虽然整合有GUS基因，但没有检测到其表达。

3.4无抗性选择标记转Bt基因植株的筛选

对部分同时含有HPT和Bt基因的共转化植株，分别收取T₁代成熟种子。随机选取部分种子去壳灭菌，接种在含50mg/l潮霉素的1/2MSH培养基上，统计潮霉素抗性分离情况；或直接将种子播种入人工气候室，待苗长大后，按刘巧泉等(2001)的方法检测各植株中的潮霉素抗性；同时选取部分T₁代植株按单株提取叶片总DNA，用于PCR分析。结果显示，HPT和Bt基因在部分独立转化株的后代中发生遗传分析，其后代的部分植株只含有Bt基因，而不含有HPT基因，如图7所示的一个T1代株系中第8号植株。这些后代个体中HPT和Bt基因的整合情况进一步经Southern杂交获得了证实。同时也发现有部分后代中HPT和Bt基因未发生分离的，即两个基因仍紧密联锁在一起。

Claims

1.一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用，其特征在于：

(1)制备含有两个T-DNA结构域的农杆菌双元载体，称为双T-DNA双元载体，其中第一个T-DNA区上含有可用于筛选转化植物细胞的抗生素抗性选择标记基因，第二个T-DNA区上含有一个通用的多克隆位点，可方便地克隆入目的基因。

(2)在第二个T-DNA区克隆入用于改良作物的目的基因，再用该载体系统借助于根瘤农杆菌介导的共转化方法转化受体水稻，可期望借助于一个农杆菌将两个独立的T-DNA区导入同一个水稻细胞中，并整合到不同染色体或同一染色体的不同位置上，从而可在分离后代中获得只含目的基因、无抗性选择标记基因的转基因水稻植株。

2.根据权利要求1所述的一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用，其特征在于所述的双T-DNA双元载体相对于常规的农杆菌双元载体，多了一个T-DNA功能区，所含核酸序列及其功能同常规双元载体，该载体系统在转化植物的技术方法上与其它双元载体系统无明显差别，但却可方便地用于培育无抗性选择标记的转基因作物。

3.根据权利要求1所述的一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用，其特征在于其中一个T-DNA区上的抗生素抗性选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphotransferase，HPT)基因，另一个T-DNA区上的多克隆位点源自质粒pUC18的通用多克隆位点。

4.根据权利要求1所述的一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用，其特征在于所述目的基因可以包括任何在生产上的有应用价值的基因：抗生物胁迫(抗虫、抗病)基因、抗非生物胁迫(抗除草剂、耐盐等)基因、品质改良基因、以及与其它转基因应用有关的目的基因及其上述不同基因的融合或多价基因。

5.根据权利要求1所述的一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用，其特征在于所述受体水稻指所有栽培稻种，包括籼稻、粳稻或爪哇稻；可以是常规稻，也可以是杂交稻的不育系、保持系或恢复系。

6.根据权利要求1所述的一种双T-DNA载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用，其特征在于所述的无抗性选择标记转基因水稻，包括所有通过上述载体系统和方法直接培育的无选择标记转基因水稻植株及其后代，以及由这些材料为亲本经有性杂交转育而成的所有含有目的基因的无选择标记转基因水稻。