CN103255166B

CN103255166B - 一种超双元载体、构建方法及其应用

Info

Publication number: CN103255166B
Application number: CN201310185723.9A
Authority: CN
Inventors: 李莉; 李羽; 王锡锋; 雷阳; 刘艳; 吴蓓蕾
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103255166A

Abstract

本发明涉及一种超双元载体、构建方法及其应用。本发明超双元载体，骨架载体为pCMBIA1301-hpt^-，将Xba I-RB-LB-Sal I插入在骨架载体的限制性酶切位点Xba I和Sal I间，这样，连同原有的左右边界序列，形成了2个T-DNA区；再通过限制性酶切位点将hpt II连入T-DNA2区中，获得了含有hpt II的超双元载体pDT1301。本发明pDT1301含有hpt II，便于转化过程中抗性愈伤和转基因再生植株的筛选；而hpt II与外源目的基因不在同一个T-DNA区内，又便于转基因后代自交分离，获得不含有选择性标记基因的安全转基因植株，为转基因植物的安全释放扫清障碍。

Description

一种超双元载体、构建方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种培育无选择标记转基因植物的超双元载体、构建方法及其应用，更具体涉及到无选择标记基因转基因兼抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒转基因水稻植株的获得。

背景技术

自从上世纪80年代转基因植物诞生以来，植物转基因工程作为提高作物品质、产量、抗胁迫能力等的有效手段之一，其发展势头始终不减，现已跃入大规模商业化生产阶段，并成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计，从1996年转基因生物商业化以来，由最初的6个国家种植170万公顷增加至2012年29个国家种植1.7亿公顷（增加了100倍之多），超过1700万农民从中获益，使得杀虫剂的使用量减少了一半，其中20个发展中国家种植面积达到52%，为保障粮食安全和进一步减少世界某些脆弱地区的贫困做出了贡献。在中国，共有720万小农户种植了400万公顷转基因植物，涉及的植物有棉花、木瓜、白杨树、西红柿及甜椒等(Clive James,中国生物工程杂志，2012,33（2）：1-8)。

目前用于将外源基因导入植物细胞中的方法有很多，常用方法有基因枪法和根瘤农杆菌介导法。基因枪法的优点是不受宿主细胞基因型的限制，缺点是该方法导入的外源基因拷贝数多，嵌合基因整合进宿主细胞染色体中的频率低，可同时将用于细菌筛选和再生植株筛选的标记基因同时导入。农杆菌介导法的缺点是受宿主细胞基因型限制，其优点是操作简单、转化效率较高、成本低，避免将用于细菌筛选的标记基因导入植物，只将位于同一T-DNA区内的外源目的基因和标记基因导入植物，并且紧密相连，目前主要应用于双子叶植物和少数单子叶植物的遗传转化。

在转基因植物的获得过程中，为了便于筛选到低频率的转化事件，常将外源目的基因与易于识别的选择标记基因串联，再通过标记基因筛选低频率的转化事件。选择标记基因多为抗生素或除草剂抗性基因，随着抗性愈伤和再生植株选择过程的结束，其变为多余的基因，而其随着外源目的基因传递给转基因后代，还可引发安全性问题。选择性标记基因的存在对环境的潜在危害主要表现在：1）标记基因有可能转移到土壤微生物和其它植物，继而引起其它生物产生抗性；2）在食品上有一定的安全风险和消费心理障碍，因此，很多国家和组织都制定了相关的条款和法规，使得多数转基因作物商品化生产难以实现，因此培育无选择标记基因的安全转基因植物已成为植物基因工程发展的趋势。

目前常用于获得无选择标记基因植物的方法主要有位点特异性重组、转座子系统和共转化法等。位点特异性重组系统能精确的引入外源基因，但需要进行二次转化或杂交，费时、费力。利用转座子系统虽然能完整的删除选择标记基因，但需要通过有性繁殖分离目的基因和标记基因，周期长、效率低，且不稳定，难以定向优化。共转化法具有操作简便，适用范围广，基因转化效率较高等优点，被广泛的应用于水稻、烟草、油菜、大豆、玉米等植物中。农杆菌介导的共转化法就是把目的片段和选择性择标记基因分别构建于不同载体或同一载体的不同T-DNA区，期望借助于农杆菌等转化方法将选择标记基因和目的基因同时导入同一受体细胞的不同染色体上。一方面利用选择标记基因编码的性状，筛选出同时含有目的基因的细胞或再生植株。另一方面，通过转基因植株后代自交，使目的基因和选择标记基因发生分离，从而获得不携带选择标记基因的转基因阳性植株。因此，农杆菌介导的共转化法不仅可以避免将用于细菌筛选的标记导入转基因植物，而且可以通过后代自交分离剔除用于再生植株筛选的标记基因，从而获得安全的转基因植物，为转基因植物的商业化生产排除障碍。

发明内容

基于上述目的，本发明提供了一种含有双T-DNA区的超双元载体，该载体含有两个T-DNA区，可以通过酶切位点Xho I方便、快捷的将外源目的基因或具有RNA干涉效果的发夹结构插入T-DNA1区，而选择标记基因（潮霉素抗性基因）则位于T-DNA2中。利用该载体可以直接将外源基因（结构）插入T-DNA1中，获得适合根瘤农杆菌转化单子叶植株的表达载体，既可节省人力物力财力，又提高了工作效率，重要的是可以通过T1代转基因植株自交分离获得无抗生素标记基因的转基因安全植物，为通过植物基因工程获得可安全释放的转基因新种质提供技术支撑。

本发明还提供超双元载体和RNA干涉载体的构建方法，为无选择标记基因植物的获得，以及抗病育种工程提供了一种新的策略和思路。

该载体可应用于根瘤农杆菌介导的水稻遗传转化，并能产生无选择标记基因的转基因水稻植株。应用该载体构建了含有水稻条纹病毒（RSV）和水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因部分核苷酸序列（RSV-RBSDV-HCP）发夹结构的RNA干涉（RANi）载体，并成功导入水稻，获得了无选择标记基因的转基因抗病植株。

超双元载体pDT1301，其骨架载体为去除潮霉素抗性基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-，具有一个T-DNA区，其特征在于：在该骨架载体T-DNA区的多克隆位点处插入序列片段，使原来T-DNA区从左边界到右边界依次被分成T-DNA1区和T-DNA2区，所述序列片段的5’端为右边界序列RB，3’端为左边界序列LB，中间相连的为无关序列；所述T-DNA2中通过限制性酶切位点插入含有潮霉素抗性基因hpt II的片段，所述RB序列如SEQ ID NO13所示，所述LB序列如SEQ ID NO14所示。

所述序列片段如SEQ ID NO1所示。

所述T-DNA2中插入的序列如SEQ ID NO6所示。

超双元载体pDT1301-DR，其特征在于：在上述超双元载体pDT1301的T-DNA1区中，通过限制性酶切位点插入有水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒(Riceblack streaked dwarf virus，RBSDV)外壳蛋白（Coat protein,CP）基因部分核苷酸序列（RSV-RBSDV-HCP）的发夹结构，发夹结构序列如SEQ ID NO15所示。

超双元载体pDT1301的构建方法，包括如下步骤：（1）将序列SEQ ID NO1插入在骨架载体pCMBIA1301-hpt^-的限制性酶切位点Xba I和Sal I间，形成两个T-DNA区，命名为T-DNA1和T-DNA2，得到不含有潮霉素抗性基因的中间载体I，命名为pCMBIA1301-hpt^--DT；（2）再通过限制性酶切位点Nco I将含潮霉素抗性基因hpt II的片段SEQ ID NO6所示的序列连入pCMBIA1301-hpt^--DT载体的T-DNA2中，获得了含有潮霉素的超双元载体，该载体命名为pDT1301。

所述步骤（2）的具体方法为：（A）以pCMBIA1301为模板，以序列SEQ ID NO.4和SEQID NO.5为引物对，经PCR扩增得到携带酶切位点Nco I的潮霉素抗性基因（hpt II），并连入pMD18-T载体，经测序验证的载体命名为pMD18-T-hpt；（B）将载体pMD18-T-hpt采用NcoI酶切，电泳、回收hpt II片段；再在T4连接酶作用下，与经去磷酸化的Nco I酶切pCAMBIA1301-hpt^--DT产物连接，经PCR鉴定插入正确的载体命名为pDT1301。

pDT1301-DR载体的构建方法，步骤如下：（1）以中间载体pMCG161+/-D为模板，以序列SEQ ID NO9和SEQ ID NO10为引物对，经PCR扩增得到含有RSV-RBSDV-HCP序列、水稻Intron和酶切位点Xho I的发夹结构；（2）将PCR产物经Xho I酶切、连入同样经过XhoI酶切的载体pDT1301的T-DNA1区内，获得兼抗RSV和RBSDV的RNA干涉（RNAi）载体pDT1301-DR。

上述超双元载体在遗传转化中的应用。

所述应用为将目的基因或发夹结构插入T-DNA1区中，采用农杆菌介导转化法转化禾本科植物，得到转基因植株，再通过T₁代自交分离得到无选择标记基因的转基因植株。

所述目的基因为水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒(Rice blackstreaked dwarf virus，RBSDV)外壳蛋白（Coat protein,CP）基因部分核苷酸序列（RSV-RBSDV-HCP）的发夹结构，其序列如SEQ ID NO15所示，所述禾本科植物为水稻。

本发明构建的超双元载体：骨架载体为去除潮霉素抗性基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-，T-DNA区右、左边界（Xba I-RB-LB-Sal I）插入在骨架载体的限制性酶切位点Xba I和Sal I间。SEQ.ID NO1的序列:如下，其中TCTAGA为Xba I酶切位点序列，为Sal I酶切位点序列，为右边界序列(RB)，为左边界序列(LB)。这样，连同pCMBIA1301-hpt^-原有的左右边界序列，即形成了2个T-DNA区，即T-DNA1和T-DNA2，中间载体I不含有潮霉素抗性基因，命名为pCMBIA1301-hpt^--DT。本领域技术人员可以按照pCMBIA1301-hpt^-上所带的不同的酶切位点来插入序列片段，但该序列片段一定必须带有右边界序列和左边界序列，才能形成两个T-DNA区。

再通过限制性酶切位点将潮霉素抗性基因（hpt II）连入pCMBIA1301-hpt^--DT载体的T-DNA2中，获得了含有潮霉素的超双元载体，该载体命名为pDT1301。插入的含潮霉素抗性基因序列根据T-DNA2区的酶切位点来确定。本发明通过限制性酶切位点Nco I将SEQ IDNO6所示的含基因hpt II的序列插入T-DNA2中。

本发明构建的载体（见图10），其中第一个T-DNA区（T-DNA1）包括：左边界-CaMV3’UTR-多酶切位点-CaMV35S promoter-部分LacZ alpha fragment-右边界”，其结构简单，可通过限制性内切酶Xho I将预期的外源基因或发夹结构连入，以便将来获得无选择标记基因的转基因植物尽可能少的携带载体成分；第二个T-DNA区（T-DNA2）则包含有潮霉素抗性基因和GUS A，利于在T₀代进行抗性愈伤和再生植株的筛选。

应用上述超双元载体pDT1301,将含有水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)外壳蛋白（Coat protein,CP）基因部分核苷酸序列（RSV-RBSDV-HCP）的发夹结构插入pDT1301的T-DNA1区中，即可获得了兼抗RSV和RBSDV两种病毒的RNA干涉（RNAi）载体，命名为pDT1301-DR。采用农杆菌介导法将载体pDT1301-DR遗传转化水稻成熟胚愈伤组织，成功获得了转基因再生植株，通过T1代自交分离，成功获得了无选择标记基因、兼抗RSV和RBSDV的转基因水稻，实现了利用RNA干扰原理获得兼抗RSV和RBSDV水稻新材料的预期目标。

pDT1301载体的构建方法，步骤如下：（1）人工合成SEQ ID NO1所述序列（XbaI-RB-LB-Sal I”）；（2）将SEQ ID NO1的合成产物和载体pCMBIA1301-hpt^-（本实验室保存，可向公众提供）分别用限制性内切酶Xba I和Sal I双酶切,并在T₄连接酶作用下连接，获得不含潮霉素抗性基因、但含有2对T-DNA左右边界的中间载体pCAMBIA1301-hpt^--DT。（3）以pCMBIA1301为模板，以序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物对，经PCR扩增携带酶切位点Nco I的潮霉素抗性基因（hpt II），并连入pMD18-T载体，经测序验证的载体命名为pMD18-T-hpt。（4）将载体pMD18-T-hpt采用Nco I酶切，电泳、回收hpt II片段；再在T₄连接酶作用下，与经去磷酸化的Nco I酶切pCAMBIA1301-hpt^--DT产物连接，经PCR鉴定插入正确的载体命名为pDT1301，其中hpt II位于载体的T-DNA2区内，其由CaMV35S启动子和Nos终止子控制。

本发明的超双元载体pDT1301适合禾本科植物遗传转化；其含有潮霉素抗性基因（hpt II）的，这样便于转化过程中抗性愈伤和转基因再生植株的筛选；而hpt II与外源目的基因不在同一个T-DNA区内，又便于转基因后代自交分离，获得不含有选择性标记基因的安全的转基因植株，为转基因植物的安全释放扫清障碍。

将本发明构建的RNA干涉载体pDT1301-DR转入受体植物中，将使RSV和RBSDV发生基因沉默而不表达，从而使该受体植物产生RSV和RBSDV的抗性。RNA干涉载体pDT1301-DR抗生素基因与目的基因不在同一个T-DNA区内，适合农杆菌介导的单子叶植物遗传转化，这样即可方便抗性愈伤组织的筛选，又可通过T₁代自交分离，方便获得无标记基因（潮霉素抗性基因）的且兼抗RSV和RBSDV的转基因后代，减少转基因植物带来的生物安全性隐患。

本发明以水稻模式品种爱知旭为受体，在农杆菌菌株EHA105介导下，获得了载体pDT1301-DR的转基因再生株系及后代。共获得T₀代再生株系125个，其中含有外源目的基因的阳性株系31个，阳性率为24.8%。

本发明将T₁代转基因栽植到RSV和RBSDV的重病区，通过自然发病进行了抗病性筛选,调查结果表明:在T₁代的1301株中，有494株未表现症状，807株表现水稻条纹病毒或水稻黑条矮缩病毒，发病率为62%。而受体爱知旭发病严重，发病率在100%。通过筛选获得了兼抗两种病毒病害的转基因植株。

对T₁代19个株系的494株未表现症状的植株通过PCR技术进行了潮霉素抗性基因和外源目的基因的检测，其中16个株系的71株是仅携带有外源目的基因，不携带潮霉素抗性基因的安全植株，占14.4%.

本发明为植物抗病基因工程提供了一种含有双T-DNA区载体的超双元载体，该载体可应用于农杆菌介导的水稻遗传转化，并能产生无选择标记基因的转基因水稻植株。超双元载体及其构建方法与应用，为转基因技术及选择无标记生物抗性育种提供了新的思路。将该载体用于水稻转化，成功获得了无抗生素标记基因的抗病毒植株，实现了利用RNA干扰原理获得含有最少量外源成分的抗RSV和RBSDV水稻新材料的预期目标，为RNA干扰介导的无选择标记基因植物抗性育种及基因工程提供了成功的实例。

附图说明

图1.中间载体I（pCMBIA1301-hpt^--DT）的PCR鉴定

泳道1.DL2000；2.空白对照；3.pCMBIA1301-hpt-；4-12.待检质粒

图2.中间载体II(pMD18-T)的PCR鉴定

泳道1.DL2000；2.空白对照；3-12.检测样品

图3.超双元载体pDT1301的PCR鉴定

泳道1.DL2000,2.空白对照，3.载体pCMBIA1301-hpt-，4-21.待检质粒

图4.质粒pDT1301-DR的Xho I酶切鉴定

泳道1.DL15000,2.空质粒pDT1301，3-4.酶切样品

图5.重组子E-DT-DR的PCR鉴定

泳道1.DL2000；2.空EHA105菌液（阴性对照）；3.阳性对照；4-9.重组子E-DT-DR

图6.水稻爱知旭品种的遗传转化

A．水稻成熟胚愈伤组织的诱导；B．水稻成熟胚愈伤组织的诱导；C．愈伤组织与农杆菌的共培养；D．抗性愈伤组织的筛选;E.分化小苗的壮苗;F.转基因再生植株。

图7转基因水稻T0代植株目的基因的PCR检测

泳道1.Marker DL2000;2.空白对照；3.阳性质粒对照；4.转基因植株(4.T1;5.T2;6.T3;7.T5;8.T8;9.T9);

图8.T1代转基因目的基因（538bp）和潮霉素抗性基因（1042bp）的PCR鉴定

图9转基因植株抗病情况

图10超双元载体pDT1301的图谱

A.转基因水稻；B淮稻5号；C.爱知旭

具体实施方式

实验中所用的pMD18-T购自大连宝生物公司（Takara公司），感受态细胞DH5α购自北京全式金公司。

RSV-RBSDV-HCP的RNAi载体pMCG161+/-D由中国农业科学院植物保护研究所水稻病害实验室构建并保存，其适用于禾本科植物转化通过基因枪转化的兼抗RSV和RBSDV的RNAi载体，其具有氯霉素抗性。RSV-RBADV-HCP的发夹结构含有来源于水稻的Rice waxy-aintron1，插入在载体pMCG161的Asc I和Spe I两个酶切位点间。

经本实验室改造的pCMBIA1301-hpt-也可向公众发放，其可在酶切位点BamH I和Hind III处将来自中间载体pMCG161+/-D上的目的基因的发夹结构通过酶切插入，获得无标记基因、且适合农杆菌介导的单子叶植物遗传的RNAi载体，该载体具有卡那霉素抗性。

实施例1、超双元载体pDT1301的构建

步骤1：设计、合成含有酶切位点的T-DNA右、左边界

根据已公布的pCMBIA1301载体的序列（GenBank:AF234297.1），设计包括限制性酶切位点Xba I和Sal I，以及T-DNA右、左边界序列的“Xba I-RB-LB-Sal I”结构，序列见SEQ IDNO1，由北京奥科公司合成，合成片段98bp。所述SEQ ID NO1序列如下：

GCTCTAGAgtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatactgttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaGTCGACGT。

步骤2：含两对T-DNA边界中间载体I的构建

将经过序列验证的SEQ ID NO1的合成产物45ng在37℃经Xba I和Sal I双酶切8h后，65℃热处理20min；在T₄连接酶作用下，与同样经过Xba I和Sal I双酶切的载体pCMBIA1301-hpt^-在16℃连接过夜，即可将SEQ ID NO1插入到载体pCMBIA1301-hpt^-，获得中间载体I。

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Transgen5α，筛选阳性克隆。并以SEQ ID NO2和SEQ ID NO3为引物对，对筛选到的阳性克隆进行PCR（退火温度为52℃），插入“XbaI-RB-LB-Sal I”结构的阳性质粒则会扩增出549bp的片段，否则扩增出467bp的片段（图1）。阳性质粒即为含有2对T-DNA边界，但在T-DNA区不含有潮霉素抗性基因的中间载体I，命名为pCAMBIA1301-hpt^--DT。所述引物序列如下：

SEQ ID NO2:AATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCC

SEQ ID NO.3:GACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTT

步骤3：含双T-DNA区超双元载体pDT1301的构建

1）潮霉素抗性基因（hpt II）的克隆：根据已公布的pCAMBIA1301载体序列（GenBank:AF234297.1）设计能够扩增潮霉素抗性基因（hpt II）的引物，且在引物中引入酶切位点Nco I序列。所述引物SEQ ID NO4和SEQ ID NO5序列如下，下划线部分为酶切位点序列：

SEQ ID NO4 CCCATGGGCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC

SEQ ID NO5 CCCATGGGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC

以pCAMBIA1301为模板，以SEQ ID NO4和SEQ ID NO5为引物PCR扩增潮霉素抗性基因hpt II，即SEQ ID NO6，目的片段约为1042bp（图2）。对扩增产物进行胶回收、连接pMD18-T，序列测定正确的阳性质粒命名pMD18-T-hpt。

2）潮霉素抗性基因（hpt II）的插入

将中间载体I(pCAMBIA1301-hpt^--DT)经Nco I单酶切后，用去磷酸化酶37℃去磷酸化15min，80℃灭活20min，冷却到室温，与同样经过Nco I质粒pMD18-T-hpt后的回收片段，在T₄连接酶作用下16℃连接过夜。以SEQ ID NO7为上游引物，以SEQ ID NO8为下游引物，进行PCR鉴定，若hpt II连入载体中，则扩增出1477bp的片段；若hpt II未连入载体，则会扩增出451bp的片段（图3）。所述引物序列如下：

SEQ ID NO.7 GCCATCGTTGAAGATGCCTCTGC

SEQ ID NO.8 CGGACGAGTCGTCGGTTCTGTAACT

由于采用的是单酶切，因而在连入时会出现hpt II正向或反向连入两种情况，需要经过测序验证。将测序合格的载体命名为pDT1301（图10），此即为含有两个T-DNA区、适合根瘤农杆菌共转化禾本科植物的超双元载体。外源目的基因或发夹结构可通过酶切位点Xho I插入在T-DNA1区中，而潮霉素抗性基因（hpt II）则位于T-DNA2区，这样既便于转化过程中抗性愈伤和转基因再生植株的筛选；而hpt II与外源目的基因不在同一个T-DNA区内，又便于转基因后代自交分离，获得不含有选择性标记基因的安全的转基因植株，为转基因植物的安全释放扫清障碍。

实施例2、兼抗水稻条纹病毒（RSV）和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的RNA干扰载体的构建及其遗传转化

步骤1：RNA干涉（RNAi）载体的构建

以含RSV-RBSDV-HCP发夹结构的中间载体pMCG161+/-D为模板，以序列SEQ ID NO9和SEQ ID NO10为引物对，采用高保真LATaq酶行PCR扩增，获得包括水稻Intron及其侧翼的RSV-RBSDV-HCP的正反义链和酶切位点Xho I的发夹结构，扩增产物约2309bp，阴性对照（pMCG161）仅扩增到1233bp的片段，说明其成功获得了RSV-RBSDV-HCP发夹结构。

将PCR产物经Xho I酶切、连入同样经过Xho I酶切的超双元载体pDT1301的T-DNA1区内，获得兼抗RSV和RBSDV的RNA干涉（RNAi）载体pDT1301-DR，经Xho I酶切鉴定，阳性质粒获得了2309bp的目的片段，阴性质粒（pDT1301）没有获得2309bp的目的片段（图4）。所述引物及序列如下：

SEQ ID NO9 CCTCGAGGATTGCTTTCCTGGACCCGTGCAGCTG

SEQ ID NO10 CCTCGAGGCAGGACTCTAGACCCACTAGTGGGCGCG

至此本发明得到了适合农杆菌介导法转化单子叶植物的超双元载体，能产生RNA干涉作用的发夹结构与选择标记基因（潮霉素抗性基因）分别位于超双元载体pDT1301-DR的T-DNA1区和T-DNA2区中，可通过T₁代自交分离和抗病性筛选获得无选择标记基因、兼抗水稻条纹病毒（RSV）和水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的转基因后代，减少了将来转基因植物存在生物安全性的隐患。

步骤2：RNA干涉载体电击转化根癌农杆菌EHA105

本发明采取电击转化的方法，将重组质粒pDT1301-DR导入根瘤农杆菌EHA105的感受态细胞，获得了含有RSV-BSDV-HCP基因发夹结构的重组农杆菌，经筛选鉴定为阳性的重组子命名为E-DT-DR。具体步骤如下：

1）将1μg质粒（pDT1301-DR）与150μl农杆菌EHA105感受态混匀，加入到灭菌后的电击杯中，在2.5KV电压下转化。

2）然后加800μl液体培养基冲洗电击杯并转入EP管，28℃，220rpm摇培2h。

3）再取100～200μl培养液涂YM（Kana：50μg/ml；利福平50μg/ml）平板，28℃培养约18h。

4）经挑取单菌落于5ml YM液体培养基（Kana：50μg/ml；利福平50μg/ml），28℃，220rpm，摇培16－24h即可。

5）重组农杆菌E-DT-DR的PCR鉴定:以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物对，菌落PCR鉴定结果（见图5）表明，阳性转化子和重组质粒为模板扩增到约538bp的条带;以未转化的EHA105菌液为模板的阴性对照未得到目的片段。

所述引物序列如下：

SEQ ID NO11:5’-AGACTAGTGGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’

SEQ ID NO12:5’-AGGAGCTCCCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’

测序正确的重组农杆菌即可用于水稻的遗传转化。

步骤3：水稻成熟胚愈伤组织的遗传转化

应用上述含有RSV-RBSDV-HCP发夹结构的重组农杆菌转化水稻品种爱知旭，获得转基因再生植株(图6)。

本发明经过潮霉素筛选，已获得以水稻品种爱知旭为受体的T₀代再生植株125株。

步骤4:转基因植株的PCR检测和无选择标记基因、抗病植株的获得

本发明以SEQ ID NO11/SEQ ID NO12为引物对，对以爱知旭为受体的转RSV-RBSDV-HCP干涉载体的再生水稻植株T₀代125株进行PCR检测，结果表明37株扩增到目的条带RSV-RBSDV-HCP，约538bp（图7），阳性率为29.6%，初步说明目的基因整合进了水稻的基因组。

对T₀代PCR检测为阳性的37个株系的T1代植株，在RSV和RBSDV的重病区进行了抗病筛选，获得了19个株系的494株不表现病害症状的抗病植株（图9）。

继而，采用PCR技术，对不表现病害症状的19个株系494株进行了潮霉素抗性基因和外源目的基因（RSV-RBSDV-HCP）的检测，结果表明：19个株系的261株目的基因和潮霉素抗性基因未分离，同时携带有外源目的基因和潮霉素抗性基因；但仍然有16个株系的71株是仅携带有外源目的基因（图8），不携带潮霉素抗性基因的安全植株。此结果说明本发明构建的超双元载体可超过用于构建RNA干扰载体，并获得无标记基因的安全植株。

Claims

1.超双元载体pDT1301，其骨架载体为去除潮霉素抗性基因的pCAMBIA1301载体，即pCAMBIA1301-hpt^-，具有一个T-DNA区，其特征在于：在该骨架载体T-DNA区的多克隆位点处插入序列片段，使原来T-DNA区从左边界到右边界依次被分成T-DNA1区和T-DNA2区，所述序列片段的5’端为右边界序列RB，3’端为左边界序列LB，中间相连的为无关序列；所述T-DNA2中通过限制性酶切位点插入含有潮霉素抗性基因hpt II的片段，所述RB序列如SEQ ID NO：13所示，所述LB序列如SEQ ID NO：14所示，所述序列片段如SEQ ID NO：1所示，所述T-DNA2区中插入的片段如SEQ ID NO：6所示。

2.RNA干扰载体，命名为pDT1301-DR，其特征在于：在权利要求1所述的超双元载体的T-DNA1区插入有水稻条纹病毒RSV和水稻黑条矮缩病毒RBSDV外壳蛋白CP基因部分核苷酸序列RSV-RBSDV-HCP的发夹结构，该发夹结构的序列如SEQ ID NO：15所示。

3.权利要求1所述的超双元载体的构建方法，包括如下步骤：(1)将序列SEQ ID NO：1插入在骨架载体pCAMBIA1301-hpt^-的限制性酶切位点Xba I和Sal I间，形成两个T-DNA区，分别命名为T-DNA1和T-DNA2区，得到不含有潮霉素抗性基因的中间载体I，命名为pCAMBIA1301-hpt^--DT；(2)再通过限制性酶切位点Nco I将含潮霉素抗性基因hpt II的基因片段SEQ ID NO：6所示的连入pCAMBIA1301-hpt^--DT载体的T-DNA2中，获得了含有潮霉素的超双元载体，该载体命名为pDT1301。

4.根据权利要求3所述的构建方法，所述步骤(2)的具体方法为：(A)以pCAMBIA1301为模板，以序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物对，经PCR扩增得到携带酶切位点Nco I的潮霉素抗性基因hpt II，并连入pMD18-T载体，经测序验证的载体命名为pMD18-T-hpt；(B)将载体pMD18-T-hpt采用Nco I酶切，电泳、回收hpt II片段；再在T4连接酶作用下，与经去磷酸化的Nco I酶切pCAMBIA1301-hpt^--DT产物连接，经PCR鉴定插入正确的载体命名为pDT1301。

5.权利要求2所述的RNA干扰载体pDT1301-DR的构建方法，步骤如下：(1)以中间载体pMCG161+/-D为模板，以序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为引物对，经PCR扩增得到含有RSV-RBSDV-HCP序列、水稻Intron和酶切位点Xho I的发夹结构；(2)将PCR产物经Xho I酶切、连入同样经过Xho I酶切的载体pDT1301的T-DNA1区内，获得兼抗RSV和RBSDV的RNA干涉载体pDT1301-DR。

6.权利要求1所述的超双元载体在水稻遗传转化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，为将目的基因或发夹结构插入T-DNA1区中，采用农杆菌介导转化法转化水稻，得到转基因植株，再通过T1代自交分离得到无选择标记基因的转基因植株。

8.根据权利要求7所述的应用，所述目的基因为水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因部分核苷酸序列RSV-RBSDV-HCP的发夹结构，该发夹结构的序列如SEQ ID NO：15所示。