CN107475286A - 一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法，构建基于水稻茎叶特异性表达外源基因与胚乳特异性表达调控位点特异性重组酶系统的水稻遗传表达载体，转化水稻愈伤组织，经检测与筛选获得绿色安全无标记的转基因水稻株系。本发明方法所获得的转基因水稻其外源目的基因如抗虫或抗除草剂基因只在水稻的茎叶等绿色组织中表达，达到预期的抗虫或抗除草剂的目的；同时外源基因表达产物及其基因DNA均不存在于水稻的胚乳即精米中，从而有效解决其食用安全性问题。

Description

一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法。

背景技术

目前，全球转基因水稻研究进展迅速，已有数百例转基因水稻获准田间试验，涉及抗虫、抗病、抗除草剂、品质和农艺性状改良等多方面内容。美国于2001年和2006年分别批准药用型转基因水稻和抗除草剂转基因水稻的商业化种植；第三世界国家伊朗于2004年批准Bt抗虫转基因水稻的商业化种植，面积从开始的2 000hm²现已增加数倍。我国转基因水稻研发与世界同步，其中抗虫转基因水稻处于世界领先水平。2009年，以华中农业大学为主的研究团队研制的高抗鳞翅目害虫转基因水稻“华恢一号”和“Bt汕优63”品系还曾获得了中华人民共和国农业部颁发的生产应用安全证书。

水稻作为最主要的粮食作物，转基因技术的应用与商业化推广是其历史发展的必然。转基因水稻经过近30年的发展，已经取得了巨大的进步，打下了坚实的基础，为世界粮食的安全保障展示了无限美好的应用前景。与其他转基因植物技术相类似，生物安全问题尤其是食品安全问题成为了转基因水稻技术继续发展的当前最主要障碍，使得围绕转基因水稻的应用陷入了无休止的剧烈争论之中。

如何利用科学的生物技术等手段，消除或减轻公众对转基因植物（包括转基因水稻）安全性的担忧，成了科学家们当前迫切需要解决的重大问题。为了解决这个问题，研究者们经过长期的探索，采用了几种不同的技术策略来保障转基因植物的安全。如叶绿体转化技术、雄性不育技术、种子不育技术、安全标记基因技术和无选择标记技术等都已成功应用于转基因植物安全性的控制。但是，迄今为止所报道的这些技术都存在一些缺点，现有的安全技术均不能满足对转基因水稻食品安全性控制的需要。

基于位点特异性重组系统发展起来的外源基因删除技术被广泛应用于转基因植物中的标记基因删除，改进的该技术在转基因烟草中结合组织特异性启动子技术获得了最高100%的删除效率，这为我们解决转基因水稻的食品安全性问题提供了新的思路与选择。本实验室通过利用水稻胚乳特异性启动子调控技术结合高效特异性的位点特异重组系统，已经成功建立了一种高效特异的水稻胚乳特异删除系统，获得了最高100%的删除频率和最高80%的删除效率。为了降低或减少公众对转基因水稻安全性的担忧与疑虑，尤其是食品安全的问题，从而达到可以促进转基因水稻（包括抗虫转基因水稻）的商业化生产与推广应用，并通过减少病虫害损失达到增加粮食产量的目的，同时通过减少化学农药的使用达到降低生产成本的目的，还能有助于环境保护，因此本领域迫切需要开发一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法。

发明内容

本发明提供了一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法，构建基于水稻茎叶特异性表达外源基因与胚乳特异性表达调控位点特异性重组酶系统的水稻遗传表达载体，转化水稻愈伤组织，经检测与筛选获得绿色安全无标记的转基因水稻株系。

构建基于水稻茎叶特异性表达外源基因与胚乳特异性表达调控位点特异性重组酶系统的水稻遗传表达载体；所述的水稻遗传表达载体，同时包含以下元件：双T-DNA分子；同向的双重组酶识别序列；水稻茎叶特异性表达启动子调控的外源基因表达盒；胚乳特异性表达启动子调控的重组酶基因表达盒以及用于水稻遗传转化筛选的抗生素基因表达盒。其中一条T-DNA分子上包含同向双重组酶识别序列，且在双识别序列之间同时含有外源基因表达盒和重组酶基因表达盒；另一条-DNA分子上包含抗生素基因表达盒。

所述的重组酶识别序列是指能被重组酶特异识别并剪切的序列，包括loxp、frt、融合改造的loxp-frt，优选为loxp-frt。根据Luo等（Luo, et al. 'GM-gene-deletor'_fused loxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency ofFLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobaccoplants. Plant Biotechnol J, 2007, 5(2): 263-27）在文献中已公开的loxp-frt序列人工合成，碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的水稻茎叶特异性表达启动子是指PsbR，所述的PsbR（GenBank AccessionNO： AP014964.1 5808458-5810458）碱基序列如SEQ ID NO：1所示。根据GenBank的序列设计引物从日本晴水稻基因组扩增获得，并测序验证。

所述的重组酶基因为cre、frt，cre基因为人工合成序列，碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述的frt基因为人工合成序列，碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

所述的抗生素基因包括潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因，优选为潮霉素抗性基因。

所述的胚乳特异性表达启动子为Gt1或Gluc，所述的Gt1（GenBank Accession NO：EU441217.1）碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述的Gluc（GenBank Accession NO：EU264107.1）碱基序列如SEQ ID NO：2所示。均由曲乐庆研究员（中国科学院植物研究所，北京）提供。

所述的外源基因指抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、品质改良基因、抗逆基因中的单价或多价基因，优选为抗虫基因、抗除草剂基因的至少一种。

所述水稻愈伤组织来自籼稻或粳稻。

本发明的显著优点：

本发明方法所获得的转基因水稻其外源目的基因如抗虫或抗除草剂基因只在水稻的茎叶等绿色组织中表达，达到预期的抗虫或抗除草剂的目的；同时外源基因表达产物及其基因DNA均不存在于水稻的胚乳即精米中，从而有效解决其食用安全性问题。与此同时，由于水稻的胚中仍然保留的所有的外源基因结构，因此转基因水稻的优良特性能够稳定地遗传给其后代。

附图说明

图1 为载体pBlue2KS-PAb的结构示意图；其中PsbR表示水稻茎叶特异表达启动子，cryIAb表示抗虫目的基因，Tnos表示胭脂碱合成酶的终止序列。

图2为载体pMD18T-LF-GLCMS的结构示意图；其中Gluc表示水稻胚乳特异表达启动子，CreM表示经过密码子优化的重组酶基因cre，Tnos表示胭脂碱合成酶的终止序列，LF-L表示左边的loxpFRT识别位点，LF-R表示右边的loxpFRT识别位点。

图3为载体pDTM3的结构示意图；其中“正向”表示水稻来源的MAR（核基质结合序列），T-border（left）表示T-DNA左边界，T-border（right）表示T-DNA右边界，CaMV35Spromoter表示花椰菜花叶病毒35S启动子，hygromycin（R）表示潮霉素磷酸转移酶基因，CaMV35S polyA表示花椰菜花叶病毒的多聚腺苷酸终止序列。

图4a 为植物表达载体pDMG-PAb-LF的结构示意图；其中PsbR表示水稻茎叶特异表达启动子，cryIAb表示抗虫目的基因，Tnos表示胭脂碱合成酶的终止序列，Gluc表示水稻胚乳特异表达启动子，CreM表示经过密码子优化的重组酶基因cre，LF-L表示左边的loxpFRT识别位点，LF-R表示右边的loxpFRT识别位点，“正向”表示水稻来源的MAR（核基质结合序列），T-border（left）表示T-DNA左边界，T-border（right）表示T-DNA右边界，CaMV35Spromoter表示花椰菜花叶病毒35S启动子，hygromycin（R）表示潮霉素磷酸转移酶基因，CaMV35S polyA表示花椰菜花叶病毒的多聚腺苷酸终止序列。

图4b为植物表达载体pDMG-PAb-LF的线性化结构示意图；其中MPB-1和MPB-2为胚乳删除验证的引物。

图5 为PCR扩增转基因植株的目的基因cryIAb基因后的电泳结果示意图；其中1为DNA marker（从大到小的条带为10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），2为质粒的阳性对照，3为非转基因植株的阴性对照，4-13为转基因植株。

图6 为试纸条检测转基因植株的目的基因表达结果示意图；其中左边为阳性结果，右边为阴性结果。

图7 为PCR扩增胚乳基因组DNA后的电泳结果示意图，其中1和12为DNA marker（从大到小的条带为10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），2-9为转基因植株，10为非转基因植株的阴性对照，11为质粒的阳性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但是本发明不限于此。本发明所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。（以下实施例的实验材料为日本晴水稻(Oryza sativa L. japonica cv.)）

【实施例1】 植物表达载体的构建

pBlue2KS-PAb、pMD18T-LF-GLCMS和pDTM3均为本实验室（福建省农业科学院农业遗传工程重点实验室）保存，这些质粒均被热激转化于DH5α宿主菌中，30%甘油菌，-80℃低温保存。其质粒结构示意图参见图1、2、3所示。

HindIII单酶切质粒pBlue2KS-PAb获得PsbR-cryIAb-Tnos表达盒片段插入到StuI单酶切处理并经过小牛碱性磷酸酶去磷酸化处理的质粒pMD18T-LF-GLCMS中，构建成中间载体pMG-PAb。HindIII和SapI双酶切处理质粒pMG-PAb，并用Klenow大片段酶补平片段末端，然后插入到HpaI酶切并经过小牛碱性磷酸酶去磷酸化处理的质粒pDTM3中，获得最终的植物表达载体pDMG -PAb-LF。其质粒结构示意图参见图4a-b所示。

【实施例2】 转基因水稻的获得

2.1 NB培养基配方（基本培养基）

N6大量：硝酸钾KNO₃ 2830 mg.L^-1，硫酸氨（NH₄）₂SO₄ 463 mg.L^-1，磷酸二氢钾KH₂PO₄400 mg.L^-1，硫酸镁MgSO₄·7H₂O 185 mg.L^-1，氯化钙CaCl₂·2H₂O 166 mg.L^-1；

B5微量：硼酸H₃BO₄ 3 mg.L^-1，硫酸錳MnSO₄·H₂O 7.58 mg.L^-1，硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 2mg.L^-1，碘化钾KI 0.75 mg.L^-1，钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg.L^-1，硫酸铜CuSO₄·5H₂O0.025 mg.L^-1，氯化钴CoCl₂·6H₂O 0.025 mg.L^-1；

铁盐：硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 27.8 mg.L^-1，乙二胺四乙酸二钠Na₂EDTA 37.3 mg.L^-1；

肌醇：肌醇Myo-inositol 100 mg.L^-1；

有机成分：盐酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg.L^-1，盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 1 mg.L^-1，尼克酸Niacin 1 mg.L^-1，水解酪蛋白Casamino acids 300 mg.L^-1，谷氨酰胺Glutamine250 mg.L^-1，脯氨酸Proline 500 mg.L^-1，甘氨酸Glycine 2 mg.L^-1，蔗糖Sucrose 30000mg.L^-1，琼脂Phytagel 2400 mg.L^-1；

pH值5.8-5.9。

注意：有机成分不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20℃保存。

2.2 愈伤组织的培养

取水稻幼穗开花12-15 d后的幼嫩种子，剥去颖壳，于75%的乙醇灭菌0.5-1 min，再用10-30%次氯酸纳溶液灭菌15-30 min，超净台中无菌水冲洗3-4遍，置于无菌滤纸上晾干。用镊子及解剖针取出幼胚，置于诱导培养基（基本培养基 + 2, 4 - D 2 mg L^-1；pH 5.8-5.9）上，27℃暗培养。10-15 d后切除幼胚的芽鞘等，只留下末端的细胞膨大体，转接于新的诱导培养基（基本培养基 + 2, 4 - D 2 mg/L；pH 5.8-5.9）中，其后每20 d在诱导培养基上继代培养1次，3次后获得生长迅速的胚性愈伤组织作农杆菌转化。

2.3 农杆菌介导转化：

参照BIO-RAD公司电激仪的说明书，将植物表达载体pDMG-PAb-LF通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中。

取生长旺盛的胚性愈伤组织于灭菌培养皿中，加入相应浓度(OD600值1-2)的农杆菌液（上述载体转化后的根癌农杆菌LBA4404）浸泡3-5 min后将愈伤组织取出晾干，然后转接于铺有一张无菌滤纸的共培养基（基本培养基 + 2, 4 - D 2 mg L-1 + AS 100 µM；pH5.2）上，28℃避光共培养2-3 d。共培养后，将愈伤组织转移到无菌培养皿中，超净台中无菌水漂洗3次，再用含羧苄青霉素250 mg/L的无菌水洗1次以杀除农杆菌，取出愈伤组织后用无菌滤纸吸干，转接于含羧苄青霉素250 mg/L和hygromycin 50 mg/L或PPT 15 mg L-1的筛选培养基（基本培养基 + 2, 4 - D 2 mg/L +羧苄青霉素 250 mg/L + hygromycin 50mg L-1（或PPT 15 mg/L，pH 5.8-5.9）上28 ℃避光培养筛选抗性愈伤组织。侵染过的愈伤组织在筛选培养基上培养20-30 d后，将边缘长出的抗性愈伤组织转接于新的筛选培养基上继续筛选1-2次。

在筛选培养基筛选获得的抗性愈伤组织转接于分化培养基（基本培养基 + KT 10mg L-1 + NAA 0.4 mg L^-1；pH 5.8-5.9）上，28℃暗培养7-10 d，然后移至光照下（14 h/d）培养，随后逐渐长出绿点，最后分化成小苗。小苗完全分化后，转接于生根培养基中（1/2 MS无机盐（指无机盐含量减半）+ MS有机成分（是指NB培养基配方（基本培养基）中的有机成分，包含盐酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg.L^-1，盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 1 mg.L^-1，尼克酸Niacin 1 mg.L^-1，水解酪蛋白Casamino acids 300 mg.L^-1，谷氨酰胺Glutamine 250 mg.L^-1，脯氨酸Proline 500 mg.L^-1，甘氨酸Glycine 2 mg.L^-1，蔗糖Sucrose 30000 mg.L^-1，琼脂Phytagel 2400 mg.L^-1）+ hygromycin 30 mg L^-1（或PPT 10 mg L^-1）；pH 5.8-5.9）28℃，光照14 h/d培养14-21 d进行生根并筛选。生根后获得的抗性小苗洗去根部培养基后，移于1/10 MS营养液水培3-5 d可长出新根，然后移栽于温室或网室水田。

2.4 转基因水稻的PCR检测

提取植物基因组DNA，采用CTAB法，过程如下：

取约0.1g的水稻叶片在液氮中磨成粉末，将适量的粉末材料转移至1.5mlEP管中。加入600µl预热（95℃）的1.5×CTAB缓冲液，然后65℃温浴45min。取出EP管，冷却至室温后加入600µl 氯仿:异戊醇（24:1）混合均匀，然后10000rpm离心10min，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。加入2/3体积的异丙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。加入600µl75%乙醇洗涤，放置30min。倒掉上清液，室温下吹干DNA。加入100µlddH₂O溶解DNA。电泳检测植物总DNA含量。

PCR检测再生植株中目的基因cryIAb，根据cryIAb基因的序列特异性合成一对引物，如下：

（SEQ ID NO.7）上游引物AbF为：5’- CCATTGTTCGCAGTCCA -3’

（SEQ ID NO.8）下游引物AbR为：5'- AACGGTTCCGCTCTTTC -3'

PCR反应体系如下：

成分 浓度 体积

基因组模板DNA 50 ng/μl 1 ul

dNTP 2.5 mM 4 ul

Taq酶缓冲液 10倍 5 ul

引物 10 μM 5 ul

Taq酶 2.5 U

加ddH₂O至总体积50 ul。

PCR反应程序：94℃，5分钟；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

转基因PCR检测的结果参见图5所示，能扩增出786bp条带的样品为转基因水稻阳性植株，结果表明样品4-13均为转基因阳性植株。

【实施例3】转基因植株中目的基因的表达分析

分别取幼嫩叶片、幼嫩茎秆、幼嫩根以及成熟种子的糙米和精米各约0.1g，分别置于1.5mlEP管中，各加300ul灭菌水和一粒钢珠，在MP公司的FASTPrep-24样品研磨器上震荡20秒，4M/S。静置几分钟后，将一条CryIAb/Ac特异的胶体金试纸条插入其中，等待5分钟后，观察结果。如试纸条显示单带，则为阴性，表明样品中的目的基因不表达；如试纸条显示双带，则为阳性，表明样品中的目的基因有表达。其结果参见图6。

【实施例4】转基因植株胚乳中外源基因的删除分析

将转基因植株和对照的成熟种子先通过糙米机和精米机制成精米，实际就是获得纯胚乳样品。然后将精米研磨成粉末，通过实施例2的2.4节所述的CTAB法提取胚乳的基因组DNA。依据植物表达载体的结构，分别在两个loxpFRT识别序列的外侧设计一条引物，用来验证是否发生了特异性删除。引物序列如下：

（SEQ ID NO.9）上游引物MPB-1为：5’- gcctgtataccatggcaattgg -3’

（SEQ ID NO.10）下游引物MPB-2为：5'- gtcagatcaagcttagcgctg -3'，其在载体上的位置如图4所示。

PCR反应程序：94℃，5分钟；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

PCR检测的结果参见图7所示，能扩增出484bp条带的样品表明其胚乳中发生了特异性删除的转基因水稻植株，结果表明样品2-9的转基因植株其胚乳中均发生了特异性删除。

将扩增的484bp条带回收后插入到pMD18-T载体中，经测序验证，进一步确认胚乳特异性删除的发生。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acttgtactc aagcaagagt tacaattgac aacatgagta cattgactag ggcgtgcagt 60

ttttttagat ggttagggca tgcagttgcc actggtgcaa cgtaatagtt ggagtctcct 120

ttgtaaatag aggatacgag attctgaatt tttgtagcaa atagtcaatg attttttcac 180

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ttcttctgaa atgcagaata tgtggtcttg ttggtaaact gttgtcttgg actagtccat 300

gctatgcaat tttgagcaat tcgcatctgg ttgtaaaccg atatattcta tgggttgtgt 360

ttacgaacgt gactattgtt gagataatat gatgtcatta tctttgttta tcttctgtgg 420

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<210> 2

<211> 2331

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<213> 人工序列

<400> 2

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tcaagcatat aatgacttac aagtttttac ctatgccctt tttgcatcat cttgtttgca 2160

acagacaaac tagatattcc tttaggctat aaacacatca gcatgataaa gagattaggt 2220

aagtttgtta tccctttttg catatattct cgtctactcc gtgtatataa gcccctctcc 2280

tccaactcgt ccatccatca ccaagagcag tgggaaacta agtgaataac t 2331

<210> 3

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgactga agttcctata ctttctagag 60

aataggaact tcggaatagg aacttc 86

<210> 4

<211> 1222

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60

gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120

acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180

cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240

cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300

cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360

cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420

gatttcgacc aggtaaattt ctagtttttc tccttcattt tcttggttag gacccttttc 480

tctttttatt tttttgagct ttgatctttc tttaaactga tctatttttt aattgattgg 540

ttatggtgta aatattacat agctttaact gataatctga ttactttatt tcgtgtgtct 600

atgatgatga tgatagttac aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga 660

tatacgtaat ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat 720

tgccaggatc agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat 780

tggcagaacg aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt 840

aactaaactg gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta 900

cctgttttgc cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc 960

aactcgcgcc ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga 1020

tgactctggt cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg 1080

agatatggcc cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa 1140

tgtaaatatt gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg 1200

cctgctggaa gatggcgatt ag 1222

<210> 5

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcctcgaca tgccacagtt tgggatacta tgcaaaacac cacccaaggt gcttgttcgt 60

cagtttgtgg aacgcttcga aagaccttca ggtgagaaga tagcactttg tgctgcggaa 120

ctgacctact tatgctggat gattacacac aacggcacag ccatcaagcg tgccacattc 180

atgagctaca atacaatcat aagcaactcg ctgtccttcg acatcgtcaa caagtcacta 240

caattcaagt acaagacgca gaaggcgacc attctggaag cctccttgaa gaaactgatt 300

cctgcttggg agtttaccat cattccgtac tatggacaga aacatcaatc tgacatcact 360

gacatcgtaa gttccttgca actacagttt gagtcatcgg aagaagcgga taagggaaac 420

agccactcca agaagatgct caaagccctt ctgagtgagg gtgagagcat ctgggagatc 480

actgagaaga ttctcaattc gtttgagtat acttcgcgct tcacgaaaac gaagaccctc 540

taccaattcc tcttcctggc tacgttcatc aattgcggga gattcagcga catcaagaac 600

gtcgatccga agtccttcaa actcgtccag aacaagtatc tgggagtgat cattcaatgc 660

ttagtgaccg agaccaagac gagcgttagt aggcacatct acttcttcag cgcaaggggc 720

aggattgatc cccttgtgta cctggacgag tttctcagga actctgagcc agtcctcaaa 780

cgagtcaaca ggaccggcaa ctcttccagc aacaaacagg agtaccagtt gctcaaagac 840

aacctcgtcc gctcgtacaa caaagctctg aagaagaatg cgccgtattc catctttgcc 900

atcaagaatg gcccgaaatc tcacataggg agacatctga tgacctcatt cctttccatg 960

aagggcctca cggagttgac taatgttgtg ggcaactgga gcgataagcg tgcctctgcc 1020

gtggccagga ccacgtatac tcatcagatt acagcgattc ctgatcacta cttcgcactc 1080

gtttctcggt actatgcgta tgatccgatt tcaaaggaga tgatagcgtt gaaggacgag 1140

actaatccga ttgaggagtg gcagcacata gaacagctca agggtagtgc tgaaggcagc 1200

atacgctacc ccgcatggaa tgggatcatc tcacaagagg tactcgacta cctttcctcc 1260

tacatcaatc gc 1272

<210> 6

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggtcatagg gagagggagc ttttggaaag gtgccgtgca gttcaaacaa ttagttagca 60

gtagggtgtt ggtttttgct cacagcaata agaagttaat catggtgtag gcaacccaaa 120

taaaacacca aaatatgcac aaggcagttt gttgtattct gtagtacaga caaaactaaa 180

agtaatgaaa gaagatgtgg tgttagaaaa ggaaacaata tcatgagtaa tgtgtgagca 240

ttatgggacc acgaaataaa aagaacattt tgatgagtcg tgtatcctcg atgagcctca 300

aaagttctct caccccggat aagaaaccct taagcaatgt gcaaagtttg cattctccac 360

tgacataatg caaaataaga tatcattgat gacatagcaa ctcatgcatc atatcatgcc 420

tctctcaacc tattcattcc tactcatcta cataagtatc ttcagctaaa tgttagaaca 480

taaacccata agtcacgttt gatgagtatt aggcgtgaca catgacaaat cacagactca 540

agcaagataa agcaaaatga tgtgtacata aaactccaga gctatatgtc atattgcaaa 600

aagaggagag cttataagac aaggcatgac acaaaaattc atttgccttt cgtgtcaaaa 660

agaggagggc tttacattat ccatgtcata ttgcaaaaga aagagaaaga acaacacaat 720

gctgcgtcaa ttatacatat ctgtatgtcc atcattattc atccaccttt cgtgtaccac 780

acttcatata tcctgagtca cttcatgtct ggacattaac aaactctatc ttaacattta 840

gatgcaagag cctttatctc actataaatg cacgatgatt tctcattgtt tctcacaaaa 900

agcattcagt tcattagtcc taca 924

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccattgttcg cagtcca 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacggttccg ctctttc 17

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctgtatac catggcaatt gg 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcagatcaa gcttagcgct g 21

Claims (8)

1.一种绿色安全无标记转基因水稻的培育方法，其特征在于：包括以下几个步骤：

（1）构建基于水稻茎叶特异性表达外源基因与胚乳特异性表达调控位点特异性重组酶系统的水稻遗传表达载体；所述的水稻遗传表达载体，包含以下元件：双T-DNA分子；同向的双重组酶识别序列；水稻茎叶特异性表达启动子调控的外源基因表达盒；胚乳特异性表达启动子调控的重组酶基因表达盒；用于水稻遗传转化筛选的抗生素基因表达盒；其中一条T-DNA分子上包含同向双重组酶识别序列，且在双识别序列之间同时含有外源基因表达盒和重组酶基因表达盒；另一条T-DNA分子上包含抗生素基因表达盒；

（2）利用步骤（1）所构建的水稻遗传表达载体转化水稻愈伤组织，经筛选与分化获得水稻遗传转化绿苗植株；

（3）种植步骤（2）所获得的绿苗植株，检测外源基因在绿苗植株的根、茎、叶、胚及胚乳中的表达水平，筛选获得外源基因在水稻茎叶正常表达而根与种子中不表达的转基因水稻植株，进一步筛选出抗生素敏感的水稻植株，即获得绿色安全无标记的转基因水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的双重组酶识别序列是loxp、FRT或loxp-frt。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的水稻茎叶特异性表达启动子为启动子PsbR，所述的PsbR碱基序列SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的外源基因指抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因中的单价或多价基因。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的胚乳特异性表达启动子为启动子Gluc，所述的Gluc碱基序列SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重组酶基因为cre、frt，序列分别如SEQ ID NO：4-5所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的抗生素基因为潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因中的一种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的水稻愈伤组织来自籼稻或粳稻。