CN103614307B - 一种固体海洋红酵母制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固体海洋红酵母制剂，它主要由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为1.5~2.2︰1，所述固体海洋红酵母制剂中海洋红酵母菌的细胞密度为2000~4000亿/克，细胞活性为70~80%，所述的保护剂包括脱脂奶粉和蔗糖。还公开了上述固体海洋红酵母制剂的制备方法，其先采用液体深层通气连续流加的培养方式进行海洋红酵母菌的高密度培养，再采用真空冷冻干燥方法干燥，该固体海洋红酵母制剂海洋红酵母的细胞存活率能提高到70～80%，制剂中细胞密度能达到2000～4000亿/克，且由于产品为固体形式，保质期长，便于运输，还能作为添加剂用于水产饲料中。
Description
技术领域
本发明涉及一种固体海洋红酵母制剂及其制备方法和应用。
背景技术
海洋红酵母是存在于海洋自然环境中的单细胞真核生物，富含蛋白质、肝糖、不饱和脂肪酸、动物幼体生长激素及以虾青素为主的类胡萝卜素等多种营养物质，能显著提高养殖动物幼体的存活率，改善成体饲养效果，并能增强水产动物免疫力、减少抗生素用量，是生态养殖的优良添加剂；另外其适口性好，细胞大小在4～6μm之间,非常适宜替代传统饵料单细胞藻类作为海产动物幼体的开口饵料和整个幼体时期的补充性饵料，海洋红酵母作为一种生物饵料，被广泛应用于鱼类、虾蟹类、贝类、参类等水产品的育苗与成体养殖。鲜活海洋红酵母生态饵料为液体，产品存在保质期短、需要冷藏等不利于长期保存和长途运输的缺点。专利公开号CN1415738A，公开日为2003年5月7日的专利“一种固体海洋红酵母的淀粉吸附流化床干燥生产工艺”；专利公开号CN1415739A，公开日为2003年5月7日的专利“一种固体海洋红酵母的喷雾干燥生产方法”；专利公开号CN1415740A，公开日为2003年5月7日的专利“一种固体海洋红酵母的麸皮吸附干燥生产方法”，这些发明在说明书中公开了海洋红酵母的液体深层通气连续流加的培养方法，后期处理采用喷雾干燥或载体吸附流化床干燥生产方法，这些方法生产的固体海洋红酵母产品细胞密度与活菌率分别为50～100亿/克、20～30%，但也存在的如下的缺点：固体海洋红酵母产品细胞密度低，活菌率不够高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种固体海洋红酵母制剂，该固体海洋红酵母制剂为粉剂，与传统方法相比，细胞密度和存活率具有显著的提高，且由于产品为固体形式，保质期长，便于运输与冷藏。
本发明所要解决的技术问题还在于提供上述固体海洋红酵母制剂的制备方法，该制备方法先采用液体深层通气连续流加的培养方式进行海洋红酵母菌的高密度培养，提高了海洋红酵母的产量，后期处理采用真空冷冻干燥方法，得到高活性、高密度的海洋红酵母固体菌粉。
本发明所要解决的技术问题还在于提供上述固体海洋红酵母制剂作为水产饲料添加剂的用途。
本发明所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种固体海洋红酵母制剂，它主要由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为1.5~2.2︰1，所述的复合保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖和水，所述的固体海洋红酵母制剂中海洋红酵母的细胞密度为2000~4000亿/克，细胞活性为70~80%。
本发明所述复合保护剂中脱脂奶粉的质量百分含量为5%，蔗糖的质量百分含量为10%。
本发明所述的浓缩的海洋红酵母菌泥通过如下方法制备获得：
(1)活化传代培养：以海洋红酵母胶红酵母为菌种，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：挑取2~3环斜面活化传代后的菌种接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；然后，将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按5~10%的质量百分含量接种入30L种子培养液中，调节通气量为1：0.6V.V.m，通气搅拌速度为300～450rpm、温度为24～30℃培养22～28h，接着将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于500L种子罐培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按5~10%的质量百分含量转接于发酵培养液中，通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm，温度为24～30℃，通气培养20～28h；在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心、洗涤、浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母菌泥经水洗后再次离心浓缩处理，4℃低温保存得到的浓缩的海洋红酵母菌泥。
本发明步骤(1)-(3)中采用的种子培养液含以下重量份的组分：水1000、葡萄糖35～45、蛋白胨1.8～2.2、酵母粉5.5～6.5、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠5～15，其pH为5.0～5.5，该种子培养液在使用前经121℃下高压灭菌20min。
本发明步骤(4)中采用的发酵培养液优选含有以下重量份的组分：水1000、葡萄糖80～110、蛋白胨3.0～4.0、酵母粉5～7、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠8～12，其pH为5.0～5.5，该发酵培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
本发明步骤(5)中离心分离时，离心机的转速为4000~6000rpm，离心时间为10~20min。
本发明第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述固体海洋红酵母制剂的制备方法，含以下步骤：
(1)活化传代培养：以海洋红酵母胶红酵母为菌种，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：挑取2~3环斜面活化传代后的菌种接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；然后将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按5~10%的质量百分含量接种入30L种子培养液中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度300～450rpm、温度24～30℃培养22～28h，然后，将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于500L种子罐培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按5~10%的质量百分含量、转接于发酵培养液中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度300～450rpm，温度24～30℃，培养20～28h；在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母菌泥经水洗后再次离心浓缩处理，4℃低温保存得到的浓缩的海洋红酵母菌泥；
(6)冷冻真空干燥：将海洋红酵母菌泥与复合保护剂按质量比为1：1.5～2.2混匀，平铺厚度为0.5~1.0cm，预冷后，调节温度为-38~-42℃进行真空冷冻干燥22~30h，获得固体海洋红酵母菌粉，即为固体海洋红酵母制剂。
在上述步骤中：
本发明步骤(1)-(3)中采用的种子培养液含以下重量份的组分：水1000、葡萄糖35～45、蛋白胨1.8～2.2、酵母粉5.5～6.5、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠5～15，其pH为5.0～5.5，该种子培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
本发明步骤(4)中采用的发酵培养液含有以下重量份的组分：水1000、葡萄糖80～110、蛋白胨3.0～4.0、酵母粉5～7、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠8～12，其pH为5.0～5.5，该发酵培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
本发明步骤(4)中当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵，菌量可达50～100亿/毫升。
本发明步骤(5)中离心分离时，离心机的转速为4000~6000rpm，离心时间为10~20min。
本发明步骤(6)中可以在冰箱中预冷几个小时后，再真空冷冻干燥。
经过上述制备方法制备出来的固体海洋红酵母制剂的含水量为2～3%，活菌率为70～80%，细胞密度为2000~4000亿/克。
本发明的最后一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述固体海洋红酵母制剂作为水产饲料添加剂的用途。
本发明提供的固体海洋红酵母制剂为粉状制品，可以将海洋红酵母菌粉化水后稀释直接泼洒，作为微藻的部分替代品，或以0.5‰～1‰（质量百分含量）的比例添加在饲料中制成配合饵料。海洋红酵母富含蛋白质、类胡萝卜素和不饱和脂肪酸，用作水产养殖饵料或饲料添加剂可改善养殖动物的健康状况，增强其对环境因子的耐受性，提高其存活率与生长速度；提高养殖水体溶解氧，降解有机污染物，降低有害物质NO2--N、NH4--N的量，改善养殖水体的水质，提高养殖成功率。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)采用本发明制备方法生产的发酵液海洋红酵母菌的密度高，发酵液中的海洋红酵母细胞密度可达50～100亿/毫升；
(2)采用本发明制备方法制成的制剂为固体粉状，溶解性好，该制剂的活菌率高达70~80%，细胞密度高达2000~4000亿/克，且该产品脱水彻底，重量轻，便于保存和运输，保质期延长；
(3)本发明采用的液体深层通气连续流加的生产方法，通过设置发酵培养基中初始高含量的葡萄糖，发酵过程流加氨水，以控制发酵液的pH值并补充氮源，使海洋红酵母的发酵产量大幅提高；
(4)本发明采用冷冻真空干燥后处理方法，大大提高了产品的活菌率和细胞密度，提高了产品的使用效果，便于保存和运输；
(5)本发明生产的固体海洋红酵母制剂在对虾、鱼苗及贝、参的养殖中的使用，可提高养殖生物的健康状态，降低养殖生物的死亡率，提高其生长速度，还可有效地提高动物体的免疫功能、显著提高水产动物对环境的耐受力，存活率高，水产动物皮肤和肌肉色泽鲜艳、口味好，是生态养殖的优良添加剂。
具体实施方式
以下结合实施例和对比对本发明进行阐述，然而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属技术领域的普通技术人员依据本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。以下就本发明的发酵培养说明。
实施例1
本实施例中的固体海洋红酵母制剂，它主要由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为1.5：1，该固体海洋红酵母制剂的细胞密度为3000~4000亿/克，细胞活性为70~80%，保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖和水，其中脱脂奶粉5%（质量百分含量，下同），蔗糖10%（质量百分含量，下同）和余量为水。
其中浓缩的海洋红酵母菌泥通过如下方法制备获得：
(1)试管活化培养：在无菌条件下，将胶红酵母菌种接种于装有灭菌的种子培养液的试管斜面中，在25℃温度活化培养48小时；
其中，本发明中采用的海洋红酵母菌株为南海水产研究所实验室人员自行从海水鱼中分离、保存的。分离保存过程可以参照张纪忠主编的《微生物分类学》，复旦大学出版社出版，1990年12月第1版p：425~427。具体的分离过程如下：
分离培养基为葡萄糖-酵母汁-蛋白胨培养基。
培养基配方：葡萄糖20克，蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，蒸馏水1000毫升，，琼脂粉20克，不调pH，8磅20分钟灭菌。
海洋红酵母菌的分离方法：取活的野生的海洋鱼类、虾，体表用70%酒精无菌消毒后进行解剖，无菌操作，挑取肠的内含物或肠道粘膜上的粘液分别与无菌生理盐水共研磨，吸取研磨液涂布于上述固体培养基平板上，在温度25~28℃培养48h以上，挑取圆形、突起，红色的酵母菌菌落。
(2)摇瓶扩大培养：在无菌条件下，用接种环挑取活化的菌种2~3环接种于装有灭菌的液体种子培养液中（500mL三角瓶内装150mL种子培养基），25℃，200rpm震荡摇瓶培养24h至对数生长期，种子培养液再次以5%的接种量接种于装有灭菌的液体种子培养液的三角锥瓶中，25℃，200rpm震荡摇瓶培养24h，得到3L的菌液；
(3)种子罐培养：将三角瓶中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接种于装有30L灭菌种子培养基的50L种子罐中，通气量1：0.6V.V.m（1升的发酵液每分钟通入0.6升空气，其他同），搅拌速度300～400rpm，温度25℃，通气培养24h，菌处于对数生长期；
(4)发酵罐培养：将种子罐中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接入装有灭菌培养基的发酵罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度300～400rpm，温度25℃，培养20～28h；发酵过程流加氨水，流加氨水的量以发酵液的pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液4000rpm高速离心分离20min，得到菌密度300~400亿/克的菌泥，浓缩后的酵母菌泥用自来水溶解洗涤后再次进行离心浓缩，浓缩洗涤后的酵母菌泥用储罐4℃低温保存。
步骤(1)、(2)、(3)中的培养液（基）为种子培养液（基），其pH为5.0，种子培养液为每升水中包含以下重量份的组分：葡萄糖35g、蛋白胨1.8g、酵母粉5.5g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸二氢钠2.8g、硫酸镁7.0g、氯化钾2.8g、氯化钠5g，培养基在121℃下高压灭菌20分钟。
步骤(4)中的培养基为发酵培养液（基），其pH为5.5，培养基为每升水中包含以下重量的组分：葡萄糖90g、蛋白胨3.0g、酵母粉6g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸二氢钠3.0g、硫酸镁7.0g、氯化钾3.0g、氯化钠8g，培养基在121℃下高压灭菌20分钟。
上述固体海洋红酵母制剂的制备方法如下：
(1)试管活化培养：在无菌条件下，将菌种（菌种同上）接种于装有灭菌的种子培养液的试管斜面中，在25℃温度活化培养48小时；
(2)摇瓶扩大培养：在无菌条件下，挑取活化的菌种2~3环接种于装有灭菌的液体种子培养液中（500mL三角瓶内装150mL种子培养基），25℃，200rpm震荡摇瓶培养24h至对数生长期，种子培养液再次以5%（体积百分含量，下同）的接种量接种于装有灭菌的液体种子培养液的三角锥瓶中，25℃，200rpm震荡摇瓶培养24h，得到3L的菌液；
(3)种子罐培养：将三角瓶中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接种于装有30L灭菌种子培养基的50L种子罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度：300～400rpm，温度25℃，通气培养24h，菌还处于对数生长期；
(4)发酵罐培养：将种子罐中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接入装有灭菌培养基的发酵罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度：300～400rpm，温度25℃，通气培养20～28h；发酵过程流加氨水，流加氨水的量以发酵液的pH5.0为控制点；当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液4000rpm高速离心分离20min，离心得率大约为78%，得到菌密度300~400亿/克的菌泥，浓缩后的酵母菌泥用自来水溶解洗涤后再次进行浓缩，浓缩洗涤后的酵母菌泥用储罐4℃低温保存；
(6)冷冻真空干燥将上述在4℃低温储罐中保存的菌泥与保护剂按1：1.5的质量比混合均匀后，平铺厚度0.5cm，先在冰箱预冷冻8小时后，-40℃左右真空冷冻干燥22h以上，可获得含水量为2～3%，活菌率达70%以上、细胞密度达3000~4000亿/克的菌粉，即为固体海洋红酵母制剂。
其中固体海洋红酵母制剂的细胞密度的测定采用传统的稀释涂布平板计数法，具体过程为：
（1）在无菌条件下，将待测菌粉样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液均匀涂布于培养皿中的培养基内，在一定的温度下培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的活菌数（细胞密度）。
其中培养基的用量和组成为：葡萄糖45g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁7.5g/L，氯化钾3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉18g/L，水1L。
（2）测定步骤：
2.1培养基各成分在水中溶解，混匀，120℃，15分钟高压灭菌；
2.2称样：称取0.5克样品，放入有100毫升无菌生理盐水及几十粒玻璃珠的三角瓶中，振荡摇瓶约10分钟；
2.3熔化培养基：将上述灭菌好的固体培养基熔化，降温至约50℃，倒平板；
2.4编号：取7支无菌空试管，依次编号为10-1、10-2、10-3……10-7；取9个无菌培养皿，依次编号为10-5、10-6、10-7，每个稀释度三套；
2.5分装无菌水：用5毫升移液管分别精确吸取4.5毫升无菌水于已编号的无菌试管中；
2.6稀释：用1毫升移液管精确吸取2.2三角瓶中的菌液0.5毫升至上述的装有4.5毫升无菌水的无菌试管中，摇动待稀释的菌液试管，摇均菌液后逐级稀释；
2.7取样涂布：分别精确吸取10-5、10-6、10-7稀释菌液0.1毫升，放入对应的无菌培养皿培养基中，涂布棒均匀涂布；
2.8培养：将培养皿倒置于25℃恒温箱中培养；
2.9计数：培养２～３天后，取出平板计数，选取菌落数为30～300个之间的平板，从平板的菌落数及稀释倍数换算出菌粉样品的活细胞数。
活菌数／克样品＝平均菌落数×稀释倍数×200×10，即测定得冻干后的固体海洋红酵母制剂中细胞密度达3000~4000亿/克。
其中冻干后的固体海洋红酵母制剂的活菌率达70~80%的测定方法如下
（1）冻干前，测定一定体积菌液的活菌数，测的活菌数为A；
（2）再测定冻干菌粉的活菌数：先用无菌水稀释到原菌液体积，再按上述方法进行活菌数的测定，测的活菌数为B；
（3）活菌率（%）=B/A×100%，即计算得冻干后的固体海洋红酵母制剂的活菌率达70~80%。
其中种子培养液和发酵培养液的成分等同上。
实施例2
本实施例中的固体海洋红酵母制剂，为粉剂，它主要由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为2.2：1，该海洋红酵母菌粉的细胞密度为2000~3000亿/克，细胞活性为70~80%，保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖和水，脱脂奶粉5%（质量百分含量，下同），蔗糖10%（质量百分含量，下同）和余量为水。
其中浓缩的海洋红酵母菌泥通过如下方法制备获得：
(1)试管活化培养：在无菌条件下，将胶红酵母菌种(来源同实施例1)接种于装有灭菌的种子培养基的试管斜面中，在28℃温度活化培养48小时；
(2)摇瓶扩大培养：在无菌条件下，用接种环挑取活化的菌种2~3环接种于装有灭菌的液体种子培养基中（500mL三角瓶内装150mL种子培养基），28℃，250rpm震荡摇瓶培养24h至对数生长期，种子培养液以5%的接种量接种于装有灭菌的液体种子培养基的三角锥瓶中，28℃，200rpm震荡摇瓶培养22h，得到3L的菌液；
(3)种子罐培养：将三角瓶中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接种于装有30L灭菌种子培养基的50L种子罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度：300～400rpm，温度28℃，通气培养20h，菌还处于对数生长期；
(4)发酵罐培养：将种子罐中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接入装有灭菌培养基的发酵罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度：300～400rpm，温度25℃，培养20～28h；发酵过程流加氨水，流加氨水的量以发酵液的pH5.0为控制点；当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)分离洗涤离心：发酵液6000rpm高速离心分离15min，得到菌密度400~500亿/克的菌泥，浓缩后的酵母菌泥用自来水溶解洗涤后再次进行浓缩，浓缩洗涤后的酵母菌泥用储罐4℃低温保存。
步骤（1）（2）(3)中的培养基为种子培养基（液），其pH为5.5，培养基为每升水中包含以下重量的组分：葡萄糖40g、蛋白胨2.0g、酵母粉6.0g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸二氢钠3.0g、硫酸镁7.0g、氯化钾2.8g、氯化钠10g，培养基在121℃下高压灭菌20分钟。
步骤(4)中的培养基为发酵培养基（液），其pH为5.5，培养基为每升水(1000g)中包含以下重量的组分：葡萄糖110g、蛋白胨3.5g、酵母粉6g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸二氢钠3.2g、硫酸镁7.5g、氯化钾3.0g、氯化钠8g，培养基在121℃下高压灭菌20分钟。
上述固体海洋红酵母制剂的制备方法如下：
(1)试管活化培养：在无菌条件下，将胶红酵母菌种(来源同实施例1)接种于装有灭菌的种子培养基的试管斜面中，在28℃温度活化培养48小时；
(2)摇瓶扩大培养：在无菌条件下，用接种环挑取活化的菌种2~3环接种于装有灭菌的液体种子培养基中（500mL三角瓶内装150mL种子培养基），28℃，250rpm震荡摇瓶培养24h至对数生长期，种子培养液再次以5%的接种量接种于装有灭菌的液体种子培养基的三角锥瓶中，28℃，200rpm震荡摇瓶培养22h，得到3L的菌液；
(3)种子罐培养：将三角瓶中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接种于装有30L灭菌种子培养基的50L种子罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度：300～400rpm，温度28℃，通气培养20h，菌还处于对数生长期；
(4)发酵罐培养：将种子罐中的培养液以培养基总重量的5%的接种量接入装有灭菌培养基的发酵罐中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度：300～400rpm，温度25℃，通气培养20～28h；发酵过程流加氨水，流加氨水的量以发酵液的pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)分离洗涤离心：发酵液6000rpm高速离心分离15min，得到菌密度约为400~500亿/克的菌泥，浓缩后的酵母菌泥用自来水溶解洗涤后再次进行浓缩，浓缩洗涤后的酵母菌泥用储罐4℃低温保存；
(6)冷冻真空干燥：将酵母乳与保护剂按1：2.2的质量比例混合均匀后，平铺厚度0.5cm，先在冰箱预冷冻8小时后，-40℃左右真空冷冻干燥22h以上，可获得含水量为2～3%，活菌率达70%以上、细胞密度达2000~3000亿/克的菌粉，具体测试方法见实施例1，即为固体海洋红酵母制剂。
种子培养基（液）以及发酵培养基（液）的成分同上。
实施例3
本实施例中的固体海洋红酵母制剂，为粉剂，它主要由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为1.8：1，海洋红酵母菌粉的细胞密度为3000~4000亿/克，细胞活性为70~80%，保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖和水，脱脂奶粉5%（质量百分含量，下同），蔗糖10%（质量百分含量，下同），余量为水。
其中浓缩的海洋红酵母菌泥通过如下方法制备获得：
(1)活化传代培养：以胶红酵母为菌种（来源野生虾的肠道，分离过程同实施例1），以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：用接种环挑取斜面活化传代后的菌种2~3环接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36h；接着将培养液按10%的质量百分含量转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按10%的质量百分含量、接种入30L种子培养液中，通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm、温度为24～30℃培养22～28h后，将培养液按10%的质量百分含量转接种于500L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按10%的质量百分含量、转接于发酵培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm，温度为24～30℃，通气培养20～28h；并在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母泥经水洗后再次离心浓缩，4℃低温保存得到的海洋红酵母菌泥。
步骤(1)-(3)中采用的种子培养液含以下重量的组分：水1000g、葡萄糖35g、蛋白胨2.2g、酵母粉5.5g、磷酸二氢钾1.2g、磷酸二氢钠2.8g、硫酸镁8.0g、氯化钾2.8g、氯化钠15g，其pH为5.0，该种子培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
步骤(4)中采用的发酵培养液含有以下重量的组分：水1000g、葡萄糖80g、蛋白胨4.0g、酵母粉5g、磷酸二氢钾1.2g、磷酸二氢钠2.8g、硫酸镁8.0g、氯化钾2.8g、氯化钠12g，其pH为5.0，该发酵培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
步骤(5)中离心分离时，离心机的转速为4000rpm，离心时间为20min。
固体海洋红酵母制剂的制备方法如下：
(1)活化传代培养：以海洋红酵母胶红酵母为菌种，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：用接种环挑取斜面活化传代后的菌种2~3环接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；接着将培养液按10%的质量百分含量、转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按10%的质量百分含量、接种入30L种子培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm、温度为24～30℃培养22～28h，接着将培养液按10%的质量百分含量、转接种于500L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按10%的质量百分含量、转接于发酵培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm，温度为24～30℃，通气培养20～28h；并在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母菌泥经水洗后再次离心浓缩，低温保存得到的海洋红酵母菌泥；
(6)冷冻真空干燥将海洋红酵母菌泥与复合保护剂按质量比为1：1.8混匀，平铺厚度为0.5~1.0cm，预冷后，调节温度为-38~-42℃进行真空冷冻干燥22~30h，即获得固体海洋红酵母菌粉末，其中含水量为2～3%，活菌率达70%以上、细胞密度达2000~3000亿/克，具体测试方法见实施例1，即为固体海洋红酵母制剂。
步骤(1)-(3)中采用的种子培养液以及步骤(4)中采用的发酵培养液和步骤(5)中离心分离时的条件同上。
实施例4
本实施例中的固体海洋红酵母制剂，它主要由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为2.0：1，海洋红酵母菌粉的细胞密度为2000~3000亿/克，细胞活性为70~80%，保护剂包括脱脂奶粉和蔗糖，保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖和水，脱脂奶粉5%（质量百分含量，下同），蔗糖10%（质量百分含量，下同），余量为水。
其中浓缩的海洋红酵母菌泥通过如下方法制备获得：
(1)活化传代培养：以胶红酵母为菌种，其中菌种购自中国微生物菌种保藏委员会农业微生物中心，菌种全称为ACCC21164Rhodotorulamucilaginosa胶红酵母，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：用接种环挑取斜面活化传代后的菌种2~3环接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；接着将培养液按8%的质量百分含量转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按8%的质量百分含量、接种入30L种子培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm、温度为24～30℃培养22h～28h，接着将培养液按8%的质量百分含量转接种于500L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按8%的质量百分含量、转接于发酵培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm，温度为24～30℃，通气培养20h～28h；并在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母泥经水洗后再次离心浓缩处理，4℃低温保存得到海洋红酵母菌泥。
步骤(1)-(3)中采用的种子培养液含以下重量的组分：水1000g、葡萄糖45g、蛋白胨1.8g、酵母粉6.5g、磷酸二氢钾0.8g、磷酸二氢钠3.2g、硫酸镁7.0g、氯化钾3.2g、氯化钠5g，其pH为5.2，该种子培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
步骤(4)中采用的发酵培养液含有以下重量的组分：水1000g、葡萄糖100g、蛋白胨3.0g、酵母粉7g、磷酸二氢钾0.8g、磷酸二氢钠3.2g、硫酸镁7.0g、氯化钾3.2g、氯化钠8g，其pH为5.2，该发酵培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
步骤(5)中离心分离时，离心机的转速为6000rpm，离心时间为10min。
固体海洋红酵母制剂的制备方法如下：
(1)活化传代培养：以海洋红酵母胶红酵母为菌种，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48h；
(2)摇瓶扩大培养：用接种环挑取斜面活化传代后的菌种2~3环接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；接着将培养液按8%的质量百分含量、转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按8%的质量百分含量、接种入30L种子培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm、温度为24～30℃培养22～28h，接着将培养液按8%的质量百分含量、转接种于500L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按8%的质量百分含量、转接于发酵培养液中，调整通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm，温度为24～30℃，通气培养20～28h；并在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点；当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母菌泥经水洗后再次离心浓缩，4℃低温保存得海洋红酵母菌泥；
(6)冷冻真空干燥将海洋红酵母菌泥与保护剂按质量比为1：2.0混匀，平铺厚度为0.5~1.0cm，预冷后，调节温度为-38~-42℃进行真空冷冻干燥22~30h，即获得固体海洋红酵母菌粉末，其中含水量为2～3%，活菌率达70%~80%、细胞密度达2000~3000亿/克，具体测试方法见实施例1，即为固体海洋红酵母制剂。
步骤(1)-(3)中采用的种子培养液以及步骤(4)中采用的发酵培养液和步骤(5)中离心分离时的条件同上。
本发明提供的固体海洋红酵母制剂为粉状制品，可以将海洋红酵母菌粉化水后稀释直接泼洒，作为微藻的部分替代品，或以0.5‰～1‰（质量百分含量）的比例添加在饲料中制成配合饵料。海洋红酵母富含蛋白质、类胡萝卜素和不饱和脂肪酸，用作水产养殖饵料或饲料添加剂可改善养殖动物的健康状况，提高其对环境因子的耐受性存活率与存活率，提高其生长速度，改善养殖水体的水质，提高养殖水体溶解氧，降解有机污染物，降低有害物质NO2-N、NH4-N的量，提高养殖成功率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种固体海洋红酵母制剂，其特征是：它由复合保护剂和浓缩的海洋红酵母菌泥制成，二者的质量比为1.5~2.2：1，所述的复合保护剂为脱脂奶粉、蔗糖和水，所述的固体海洋红酵母制剂中海洋红酵母的细胞密度为2000~4000亿/克，细胞活性为70~80%；
所述的浓缩的海洋红酵母菌泥通过如下方法制备获得：
(1)活化传代培养：以海洋红酵母胶红酵母为菌种，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：挑取2~3环斜面活化传代后的菌种接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；然后，将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按5~10%的质量百分含量接种入30L种子培养液中，调节通气量为1：0.6V.V.m，通气搅拌速度为300～450rpm、温度为24～30℃培养22～28h，接着将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于500L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按5~10%的质量百分含量转接于发酵培养液中，通气量为1：0.6V.V.m，搅拌速度为300～450rpm，温度为24～30℃，通气培养20～28h；在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心、洗涤、浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母菌泥经水洗后再次离心浓缩处理，4℃低温保存得到的浓缩的海洋红酵母菌泥；
步骤(1)-(3)中采用的种子培养液含以下重量份的组分：水1000、葡萄糖35～45、蛋白胨1.8～2.2、酵母粉5.5～6.5、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠5～15，其pH为5.0～5.5，该种子培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟；
步骤(4)中采用的发酵培养液含有以下重量份的组分：水1000、葡萄糖80～110、蛋白胨3.0～4.0、酵母粉5～7、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠8～12，其pH为5.0～5.5，该发酵培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
2.根据权利要求1所述的固体海洋红酵母制剂，其特征是：所述复合保护剂中脱脂奶粉的质量百分含量为5%，蔗糖的质量百分含量为10%。
3.根据权利要求1所述的固体海洋红酵母制剂，其特征是：步骤(5)中离心分离时，离心机的转速为4000~6000rpm，离心时间为10~20min。
4.权利要求1-3任一项所述固体海洋红酵母制剂的制备方法，其特征是：含以下步骤：
(1)活化传代培养：以海洋红酵母胶红酵母为菌种，以种子培养液为培养基，菌种采用斜面活化传代，培养温度为24～30℃，培养时间为36～48小时；
(2)摇瓶扩大培养：挑取2~3环斜面活化传代后的菌种接种于150mL种子培养液中，在24～30℃、150～250rpm条件下摇瓶培养28～36小时；然后将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于3L～5L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(3)种子罐扩大培养：将摇瓶扩大培养后的培养液按5~10%的质量百分含量接种入30L种子培养液中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度300～450rpm、温度24～30℃培养22～28h，然后，将培养液按5~10%的质量百分含量转接种于500L种子培养液中，按相同条件进行再次培养；
(4)发酵罐培养：将经种子罐扩大培养的培养液按5~10%的质量百分含量、转接于发酵培养液中，通气量1：0.6V.V.m，搅拌速度300～450rpm，温度24～30℃，培养20～28h；在发酵培养过程中流加氨水，流加氨水的用量以发酵液pH5.0为控制点，当发酵罐内的溶氧开始上升时，终止发酵；
(5)离心洗涤浓缩：发酵液经离心分离，得到浓缩的酵母菌泥，浓缩后的酵母菌泥经水洗后再次离心浓缩处理，4℃低温保存得到的浓缩海洋红酵母菌泥；
(6)冷冻真空干燥：将海洋红酵母菌泥与复合保护剂按质量比为1：1.5～2.2混匀，平铺厚度为0.5~1.0cm，预冷后，调节温度为-38~-42℃进行真空冷冻干燥22~30h，获得固体海洋红酵母菌粉，即为固体海洋红酵母制剂。
5.根据权利要求4所述固体海洋红酵母制剂的制备方法，其特征是：步骤(1)-(3)中采用的种子培养液含以下重量份的组分：水1000、葡萄糖35～45、蛋白胨1.8～2.2、酵母粉5.5～6.5、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠5～15，其pH为5.0～5.5，该种子培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟；步骤(4)中采用的发酵培养液含有以下重量份的组分：水1000、葡萄糖80～110、蛋白胨3.0～4.0、酵母粉5～7、磷酸二氢钾0.8～1.2、磷酸二氢钠2.8～3.2、硫酸镁7.0～8.0、氯化钾2.8～3.2、氯化钠8～12，其pH为5.0～5.5，该发酵培养液在使用前经121℃下高压灭菌20分钟。
6.根据权利要求4所述固体海洋红酵母制剂的制备方法，其特征是：步骤(5)中离心分离时，离心机的转速为4000~6000rpm，离心时间为10~20min。
7.权利要求1-3任一项所述的固体海洋红酵母制剂作为水产饲料添加剂的用途。
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