CN112760348B - 一种n-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法 - Google Patents

一种n-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法。所述方法先利用大肠杆菌进行发酵，在发酵过程中接种枯草芽孢杆菌继续进行发酵；所述大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 15756。本发明提供的方法通过利用大肠杆菌CGMCC 15756与枯草芽孢杆菌配合，进行混菌发酵，使二者平衡共生，避免了单独采用大肠杆菌CGMCC 15756发酵时，因副产物快速积累导致发酵速度明显减慢甚至提前终止的问题，显著提高了发酵终点N‑乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率，降低了谷氨酸、乙酸等副产物的含量。

Description

一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法。
背景技术
氨基葡萄糖(GlcN，简称氨糖)及其衍生物的应用十分广泛，包括医药、食品、化妆品等方面。尤其从医药应用方面来说，氨基葡萄糖也是人体内可以合成的物质，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成分。随着年龄的增长，氨基葡萄糖缺乏会越来越严重，导致关节软骨不断退化和磨损，产生多种骨质疾病。而氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长。对关节炎、骨质增生、半月板损伤、颈椎病等都有显著治疗功能。由于氨基葡萄糖对人体没有毒性，日本和美国均将其作为食品配料广泛使用。
传统的氨基葡萄糖生产方法是用高浓度的盐酸对甲壳类原料进行水解制得，存在原料来源受限、易造成环境污染和过敏反应，难以实现大规模的工业化生产等诸多缺点。
目前，比较常用的生产氨基葡萄糖的方法是，先通过发酵制备N-乙酰氨基葡萄糖，之后再经过酸解等后提取处理，得到氨基葡萄糖及其衍生物，如氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐等。
发酵制备N-乙酰氨基葡萄糖常用的菌种为大肠杆菌，这种方法普遍存在N-乙酰氨基葡萄糖产量和转化率较低，谷氨酸、乙酸等副产物含量较高的问题。CN 104988196A、CN106191169A虽然均对现有发酵方法进行了改进，提高了发酵终点N-乙酰氨基葡萄糖的含量和转化率，但仍然存在副产物含量较高的问题。
因此，进一步提高发酵法制备N-乙酰氨基葡萄糖的含量和转化率，减少副产物含量，对于氨基葡萄糖生产行业具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法。与单独采用大肠杆菌进行发酵的方法相比，本发明提供的方法能够显著提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，所述方法先利用大肠杆菌进行发酵，在发酵过程中接种枯草芽孢杆菌继续进行发酵；
所述大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 15756。
本发明中所述大肠杆菌CGMCC 15756于2018年5月14日保藏于布达佩斯条约指定的微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内。
本发明的发明人通过研究发现，由于基因改造、诱导剂和产物毒性等原因，大肠杆菌CGMCC 15756在单独培养时生长代谢能力较弱，当单独采用大肠杆菌CGMCC 15756进行发酵时，发酵中前期就会出现副产物谷氨酸和乙酸积累，当积累达到一定数量(尤其是乙酸浓度达到3g/L以上时)会产生质变，即发酵速度明显减慢甚至提前终止，极大地影响到N-乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率。
本发明选择在发酵中前期的特定时间接入适量的枯草芽孢杆菌菌种。首先，枯草芽孢杆菌代能够将大肠杆菌在发酵中前期积累的谷氨酸、乙酸等副产物和多余残糖作为自身碳源进行消耗，避免了过多累积对后续发酵的影响；其次，枯草芽孢杆菌会在接种后逐渐形成芽孢，进入休眠状态，不再消耗营养物质，从而减少碳源等营养损失，节约成本；此外，枯草芽孢杆菌的部分胞外分泌物可能对大肠杆菌CGMCC 15756的生长代谢有促进作用(类似于古龙酸发酵中伴生菌对本菌的促进作用)。
通过大肠杆菌CGMCC 15756与枯草芽孢杆菌配合，进行混菌发酵，有效解决了上述副产物积累的问题，显著提高了N-乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率。
在本发明一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为所述枯草芽孢杆菌为标准菌株，从中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)购买，编号为CMCC 63501。
枯草芽孢杆菌CMCC 63501代谢能力强，能够充分消耗大肠杆菌CGMCC 15756在发酵中前期积累的副产物；且其从接种到形成芽孢的时间为20-30小时，与发酵全周期60-70小时的时间相匹配，能最大程度减少碳源等营养损失，节约成本。采用枯草芽孢杆菌CMCC63501与大肠杆菌CGMCC 15756进行混菌发酵，能够进一步提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率。
在本发明一些实施方式中，当发酵液在660nm处的OD(吸光度)值达到40-50(例如可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)时，接种所述枯草芽孢杆菌。
在本发明一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的接种量为0.5-1.5％；例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等。
本发明中，通过选择合适的接种时机，优化接种量，能够使两种菌基本达到平衡共生的关系，避免过度竞争，从而进一步提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率。
在本发明一些实施方式中，所述大肠杆菌的接种量为5-10％；例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％等。
在本发明一些实施方式中，所述方法还包括：在发酵过程中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导。
优选地，当发酵液在660nm处的OD值达到20-35(例如可以是20、22、23、25、26、28、30、32、33或35等)时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。
在本发明一些实施方式中，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加量为0.05-0.2mmol/L；例如可以是0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.08mmol/L、0.1mmol/L、0.12mmol/L、0.13mmol/L、0.15mmol/L、0.16mmol/L、0.18mmol/L或0.2mmol/L等。
在本发明一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
将活化后的所述大肠杆菌接种至发酵培养液中进行发酵，发酵过程中流加葡萄糖溶液，当发酵液在660nm处的OD值达到20-35时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，当发酵液在660nm处的OD值达到40-50时，接种活化后的所述枯草芽孢杆菌，继续进行发酵。
在本发明一些实施方式中，所述方法采用的发酵培养液包括如下组分：
葡萄糖5-10g/L、磷酸二氢钾7-12g/L、柠檬酸1-4g/L、硫酸铵10-15g/L、MgSO40.5-1.0g/L、CaCl2 0.05-0.1g/L、羽毛粉或毛发粉15-30g/L、FeSO4 0.04-0.08g/L、ZnCl20.015-0.03g/L、MnSO4 0.002-0.004g/L、CoCl2 0.004-0.008g/L、CuSO4 0.006-0.012g/L，溶剂为水。
其中，培养基中所用到的毛发粉一般为猪毛等，羽毛粉为鸡毛、鸭毛等，该原料富含角蛋白且价格低廉，而枯草芽孢杆菌对于角蛋白的分解代谢能力强，利用率高。毛发粉或羽毛粉在被枯草芽孢杆菌分解代谢为小分子氨基酸后，有利于本发明中大肠杆菌的进一步使用。因此，本发明中选择毛发粉或羽毛粉作为最佳发酵氮源。
在本发明一些实施方式中，所述发酵的温度为34-38℃；例如可以是34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等。
本发明中，当发酵液中产物N-乙酰氨基葡萄糖的含量不再明显增加时，结束发酵，该发酵时间即为发酵周期。本发明中，发酵周期一般为60-70h。
在本发明一些实施方式中，所述发酵过程中，发酵液的pH维持为6.5-7.0；例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0等。
优选地，所述发酵过程中通过添加氨水调节pH。
优选地，所述氨水的浓度为15-25wt％；例如可以是15wt％、16wt％、18wt％、20wt％、22wt％、23wt％或25wt％等。
在本发明一些实施方式中，所述发酵的初始无菌空气通气比为0.15-0.3vvm(例如可以是0.15vvm、0.18vvm、0.2vvm、0.22vvm、0.25vvm、0.28vvm或0.3vvm等)，初始压强为0.015-0.03Mpa(例如可以是0.015Mpa、0.018Mpa、0.02Mpa、0.022Mpa、0.025Mpa、0.028Mpa或0.03Mpa等)，初始搅拌转速为150-300rpm(例如可以是150rpm、180rpm、200rpm、220rpm、250rpm、280rpm或300rpm等)。
在本发明一些实施方式中，所述发酵过程中，当发酵液的溶氧量降至初始溶氧量的20-40％后，维持溶氧量为初始溶氧量的20-40％(例如可以是20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、38％或40％等)。
在本发明一些实施方式中，所述发酵过程中维持溶氧量的方法为调整通气比和搅拌转速。
在本发明一些实施方式中，所述发酵过程中，当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5g/L以下时，开始流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5g/L；例如可以是0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L或0.5g/L等。
优选地，所述葡萄糖溶液的浓度为50-70wt％；例如可以是50wt％、52wt％、53wt％、55wt％、56wt％、58wt％、60wt％、62wt％、65wt％、68wt％或70wt％等。
在本发明一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
将灭菌发酵培养液加入发酵罐中，所述发酵培养液包括如下组分：葡萄糖5-10g/L、磷酸二氢钾7-12g/L、柠檬酸1-4g/L、硫酸铵10-15g/L、MgSO4 0.5-1.0g/L、CaCl2 0.05-0.1g/L、羽毛粉或毛发粉15-30g/L、FeSO4 0.04-0.08g/L、ZnCl2 0.015-0.03g/L、MnSO40.002-0.004g/L、CoCl2 0.004-0.008g/L、CuSO4 0.006-0.012g/L，溶剂为水。
调节初始无菌空气通气比为0.15-0.3vvm，初始压强为0.015-0.03Mpa，初始搅拌转速为150-300rpm，按5-10％的接种量接种活化后的所述大肠杆菌，进行发酵；
发酵过程中，维持温度为34-38℃，同时添加浓度为15-25wt％的氨水，使pH维持为6.5-7.0；当发酵液的溶氧量降至初始溶氧量的40％以下时，调整通气比和搅拌转速，使溶氧量维持为初始溶氧量的20-40％；当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5g/L以下时，开始流加浓度为50-70wt％的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5g/L；当发酵液在660nm处的OD值达到20-35时，一次性加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，添加量为0.05-0.2mmol/L；当发酵液在660nm处的OD值达到40-50时，按0.5-1.5％的接种量接种活化后的所述枯草芽孢杆菌，继续进行发酵，总发酵时间为60-70h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在大肠杆菌CGMCC 15756发酵过程中引入枯草芽孢杆菌，进行混菌发酵，使二者平衡共生，避免了单独采用大肠杆菌CGMCC 15756发酵时，因副产物快速积累导致发酵速度明显减慢甚至提前终止的问题，提高了发酵终点N-乙酰氨基葡萄糖的产量和转化率，降低了谷氨酸、乙酸等副产物的含量。
本发明中采用的菌的保藏信息如下：
大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2018年5月14日保藏于布达佩斯条约指定的微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内，保藏号为CGMCC 15756。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例中，各项目测试方法如下：
OD值：采用72306可见分光光度计，在波长660nm可见光下测定吸光值；
葡萄糖含量：按照GB/T5009.7-2008的方法测定；
N-乙酰氨基葡萄糖含量：高效液相色谱法；
乙酸含量：高效液相色谱法；
谷氨酸含量：取发酵液离心后的上清液，稀释到残谷氨酸浓度在l g/L以内，用生物传感分析仪测定；
转化率＝N-乙酰氨基葡萄糖量/总耗葡萄糖量×100％。
本发明实施例中采用的菌种按如下方法进行活化：
大肠杆菌CGMCC 15756种子活化：从甘油管(原始菌种)中接种于试管斜面(LB培养基)，37℃培养48小时，之后将试管斜面菌种接于液体种子培养基(LB培养基，100ml/500ml锥形瓶)，最后将锥形瓶置于摇床，在37℃、转速为200r/min下培养18小时。
枯草芽孢杆菌CMCC 63501种子活化：从甘油管(原始菌种)中接种于试管斜面(LB培养基)，37℃培养56小时，之后将试管斜面菌种接于液体种子培养基(LB培养基，100ml/500ml锥形瓶)，最后将锥形瓶置于摇床，在37℃、转速为250r/min下培养24小时。
实施例1
本实施例提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤如下：
将15L发酵培养液加入50L发酵罐中，灭菌；所述发酵培养液包括如下组分：葡萄糖5g/L、磷酸二氢钾12g/L、柠檬酸1g/L、硫酸铵15g/L、MgSO4 0.5g/L、CaCl2 0.1g/L、猪毛粉15g/L、FeSO4 0.08g/L、ZnCl2 0.015g/L、MnSO4 0.004g/L、CoCl2 0.004g/L、CuSO4 0.012g/L，溶剂为水；
调节初始无菌空气通风量为4.5L/min(0.3vvm)，初始压强为0.03Mpa，初始搅拌转速为300rpm，初始溶氧量校订为100％，按10％(v/v)的接种量接种活化后的大肠杆菌CGMCC15756，进行发酵；
发酵过程中，维持温度为37℃，同时用浓度为20wt％的氨水调节pH，使pH维持为7.0；随着发酵的进行，发酵液的溶氧量开始下降，当溶氧量降至初始溶氧量的40％时，调整通气比和搅拌转速，使溶氧量维持为初始溶氧量的20-30％；当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5g/L以下时，开始流加浓度为56wt％的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5g/L；当发酵液在660nm处的OD值达到27时，一次性加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，添加量为0.1mmol/L；当发酵液在660nm处的OD值达到45时，按0.5％(v/v)的接种量接种活化后的枯草芽孢杆菌CMCC 63501，继续进行发酵，总发酵时间为65h。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为120.3g/L，谷氨酸含量为0.9g/L，乙酸含量为0.6g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率为40.1％。
对比例1
提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤与实施例1的区别仅在于：发酵过程中不接种枯草芽孢杆菌CMCC 63501，发酵51h后，发酵由于乙酸积累而终止，继续进行至65h。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为52g/L，谷氨酸含量为7.4g/L，乙酸含量为5.9g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率为25％。
对比例2
提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤与实施例1的区别仅在于：初始接种枯草芽孢杆菌CMCC 63501，而非大肠杆菌CGMCC 15756，接种量为0.5％，发酵过程中不再接种枯草芽孢杆菌CMCC 63501，总发酵时间达到65h后停止发酵。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为0.04g/L，谷氨酸含量为0.05g/L，乙酸含量为0.2g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率约为0。
实施例2
本实施例提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤如下：
将300L发酵培养液加入1m3发酵罐中，灭菌；所述发酵培养液包括如下组分：葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾7g/L、柠檬酸4g/L、硫酸铵10g/L、MgSO4 1.0g/L、CaCl2 0.05g/L、鸡毛粉30g/L、FeSO4 0.04g/L、ZnCl2 0.03g/L、MnSO4 0.002g/L、CoCl2 0.008g/L、CuSO4 0.006g/L，溶剂为水；
调节初始无菌空气通风量为60L/min(0.2vvm)，初始压强为0.03Mpa，初始搅拌转速为150rpm，初始溶氧量校订为100％，按8％(v/v)的接种量接种活化后的大肠杆菌CGMCC15756，进行发酵；
发酵过程中，维持温度为37℃，同时用浓度为20wt％的氨水调节pH，使pH维持为7.0；随着发酵的进行，发酵液的溶氧量开始下降，当溶氧量降至初始溶氧量的40％时，调整通气比和搅拌转速，使溶氧量维持为初始溶氧量的20-30％；当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5g/L以下时，开始流加浓度为58wt％的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5g/L；当发酵液在660nm处的OD值达到25时，一次性加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，添加量为0.1mmol/L；当发酵液在660nm处的OD值达到45时，按0.5％(v/v)的接种量接种活化后的枯草芽孢杆菌CMCC 63501，继续进行发酵，总发酵时间为71h。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为118.5g/L，谷氨酸含量为1.1g/L，乙酸含量为0.7g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率为38.6％。
实施例3
本实施例提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤如下：
将15L发酵培养液加入50L发酵罐中，灭菌；所述发酵培养液包括如下组分：葡萄糖8g/L、磷酸二氢钾10g/L、柠檬酸2g/L、硫酸铵12g/L、MgSO4 0.8g/L、CaCl2 0.08g/L、鸭毛粉20g/L、FeSO 40.06g/L、ZnCl2 0.02g/L、MnSO4 0.003g/L、CoCl2 0.006g/L、CuSO4 0.01g/L，溶剂为水；
调节初始无菌空气通风量为4.5L/min(0.3vvm)，初始压强为0.03Mpa，初始搅拌转速为300rpm，初始溶氧量校订为100％，按5％(v/v)的接种量接种活化后的大肠杆菌CGMCC15756，进行发酵；
发酵过程中，维持温度为35℃，同时用浓度为20wt％的氨水调节pH，使pH维持为6.5；随着发酵的进行，发酵液的溶氧量开始下降，当溶氧量降至初始溶氧量的40％时，调整通气比和搅拌转速，使溶氧量维持为初始溶氧量的20-30％；当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5g/L以下时，开始流加浓度为56wt％的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5g/L；当发酵液在660nm处的OD值达到35时，一次性加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，添加量为0.05mmol/L；当发酵液在660nm处的OD值达到50时，按1.5％(v/v)的接种量接种活化后的枯草芽孢杆菌CMCC 63501，继续进行发酵，总发酵时间为62h。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为122.5g/L，谷氨酸含量为0.5g/L，乙酸含量为0.5g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率为41.2％。
实施例4
本实施例提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤与实施例1的区别仅在于：当发酵液在660nm处的OD值达到35时，接种活化后的枯草芽孢杆菌CMCC 63501，总发酵时间为60h。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为112.7g/L，谷氨酸含量为0.4g/L，乙酸含量为0.4g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率为36.5％。
实施例5
本实施例提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，具体步骤与实施例1的区别仅在于：当发酵液在660nm处的OD值达到55时，接种活化后的枯草芽孢杆菌CMCC 63501，总发酵时间为79h。
经测定，发酵液中N-乙酰氨基葡萄含量为85g/L，谷氨酸含量为3.9g/L，乙酸含量为3.2g/L，葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄的质量转化率为28％。
从上述实施例和对比例可以看出，与单独使用大肠杆菌CGMCC15756进行发酵的方法(对比例1)或单独使用枯草芽孢杆菌CMCC63501进行发酵的方法(对比例2)相比，本发明提供的方法最终N-乙酰氨基葡萄糖的含量和转化率显著提高，而谷氨酸和乙酸等副产物含量显著降低，副产物的减少也有利于后提纯工作的进行。本发明提供的方法简单有效，对大规模生产成本无明显增加，因此适用于N-乙酰氨基葡萄糖的大规模工业化发酵生产。
其中，实施例4中由于枯草芽孢杆菌CMCC 63501的接种时间较早，导致放罐N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率有所降低；实施例5中由于枯草芽孢杆菌CMCC 63501的接种时间较晚，导致放罐N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率大幅降低，发酵周期以及副产物乙酸、谷氨酸含量明显升高。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (18)

1.一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，其特征在于，所述方法先利用大肠杆菌进行发酵，当发酵液在660 nm处的OD值达到40-50时，接种枯草芽孢杆菌CMCC 63501继续进行发酵；
所述大肠杆菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 15756；
所述枯草芽孢杆菌的接种量为0.5-1.5%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的接种量为5-10%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在发酵过程中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当发酵液在660 nm处的OD值达到20-35时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加量为0.05-0.2 mmol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将活化后的所述大肠杆菌接种至发酵培养液中进行发酵，发酵过程中流加葡萄糖溶液，当发酵液在660 nm处的OD值达到20-35时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，当发酵液在660 nm处的OD值达到40-50时，接种活化后的所述枯草芽孢杆菌，继续进行发酵。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用的发酵培养液包括如下组分：
葡萄糖5-10 g/L、磷酸二氢钾7-12 g/L、柠檬酸1-4 g/L、硫酸铵10-15 g/L、MgSO40.5-1.0 g/L、CaCl20.05-0.1 g/L、羽毛粉或毛发粉15-30 g/L、FeSO40.04-0.08g/L、ZnCl20.015-0.03g/L、MnSO4 0.002-0.004 g/L、CoCl20.004-0.008 g/L、CuSO40.006-0.012g/L，溶剂为水。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为34-38℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的周期为60-70 h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，发酵液的pH维持为6.5-7.0。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中通过添加氨水调节pH。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述氨水的浓度为15-25 wt%。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的初始无菌空气通气比为0.15-0.3 vvm，初始压强为0.015-0.03Mpa，初始搅拌转速为150-300 rpm。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当发酵液的溶氧量降至初始溶氧量的20-40%后，维持溶氧量为初始溶氧量的20-40%。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中维持溶氧量的方法为调整通气比和搅拌转速。
16.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中，当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5 g/L以下时，开始流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5 g/L。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的浓度为50-70 wt%。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将灭菌发酵培养液加入发酵罐中，所述发酵培养液包括如下组分：葡萄糖5-10 g/L、磷酸二氢钾7-12 g/L、柠檬酸1-4 g/L、硫酸铵10-15 g/L、MgSO40.5-1.0 g/L、CaCl20.05-0.1g/L、羽毛粉或毛发粉15-30 g/L、FeSO40.04-0.08g/L、ZnCl20.015-0.03g/L、MnSO4 0.002-0.004 g/L、CoCl20.004-0.008 g/L、CuSO40.006-0.012 g/L，溶剂为水；
调节初始无菌空气通气比为0.15-0.3 vvm，初始压强为0.15-0.03 Mpa，初始搅拌转速为150-300 rpm，按5-10%的接种量接种活化后的所述大肠杆菌，进行发酵；
发酵过程中，维持温度为34-38℃，同时添加浓度为15-25 wt%的氨水，使pH维持为6.5-7.0；当发酵液的溶氧量降至初始溶氧量的40%以下时，调整通气比和搅拌转速，使溶氧量维持为初始溶氧量的20-40%；当发酵液中的葡萄糖含量降至0.5 g/L以下时，开始流加浓度为50-70 wt%的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持为0.1-0.5 g/L；当发酵液在660nm处的OD值达到20-35时，一次性加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，添加量为0.05-0.2 mmol/L；当发酵液在660 nm处的OD值达到40-50时，按0.5-1.5%的接种量接种活化后的所述枯草芽孢杆菌，继续进行发酵，总发酵时间为60-70 h。
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