CN108865964A - 乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛‑3‑磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。本发明还公开了上述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用。本发明的重组枯草芽孢杆菌消除了枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力，乙酰氨基葡萄糖发酵产量大大提高。

Description

乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌。
背景技术
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖反应式为：
5/2葡萄糖+ATP+5NAD++2NH3→N-乙酰氨基葡糖+谷氨酸盐+ADP+5NADH+2CO2+磷酸盐。
该方程是通过计算从头合成乙酰氨基葡萄糖的3个前体六磷酸果糖、乙酰辅酶A和谷氨酰胺得到，从方程中可以看出在乙酰氨基葡萄糖合成的过程中伴随着大量的NADH的产生。过量生成的NADH对N-乙酰氨基葡萄糖生产途径最大理论得率(Yc)产生巨大的消极影响。因为细胞要维持还原力平衡，过量产生的NADH将通过两种方式消耗，一方面参与其他代谢的合成(导致副产物的产生)，另一方面被氧化产生ATP(导致发酵过程需要消耗大量O2，同时也会造成菌体量大量生成)。此外，利用枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖时会伴随着代谢溢流，导致副产物乙偶姻的大量合成。因此，如何有效处理伴随乙酰氨基葡萄糖生成的NADH及乙酰氨基葡萄糖合成效率，同时避免中心碳代谢溢流，提碳原子经济性，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量过程中亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，本发明的重组枯草芽孢杆菌消除了枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力，乙酰氨基葡萄糖发酵产量大大提高。
在一方面，本发明提供了一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。
进一步地，重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株，枯草芽孢杆菌BSGNKAP2如专利申请号为CN201610517961.9的中国专利所公开的。
进一步地，丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh分别使用强组成型启动子表达。
进一步地，强组成型启动子为可使用于枯草芽孢杆菌的启动子，如P43、PabrB、PvalS、Phag、PspoVG、PyvyD、PhemA或Pffh启动子。优选地，强组成型启动子为P43启动子
进一步地，丙酮酸羧化酶BalpycA的编码基因balpycA如NCBI-ProteinID:AAS42897所示；丙酮酸羧化酶BalpycA整合至枯草芽孢杆菌基因组malS、pyk、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，丙酮酸羧化酶BalpycA整合至枯草芽孢杆菌基因组malS位点。
进一步地，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor的编码基因如NCBI-ProteinID:CAF30501所示；甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk、malS、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk位点。
进一步地，异柠檬酸NAD+脱氢酶icd的编码基因如NCBI-Protein ID:AKC61181所示；异柠檬酸NAD+脱氢酶icd整合至枯草芽孢杆菌基因组ywkA、pyk、malS、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，异柠檬酸NAD+脱氢酶icd整合至枯草芽孢杆菌基因组ywkA位点。
进一步地，苹果酸醌脱氢酶mqo的编码基因如NCBI-Protein ID:ADK05552所示；苹果酸醌脱氢酶mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdgA、pyk、ywkA、malS、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，苹果酸醌脱氢酶mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdgA位点。
进一步地，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB的编码基因如NCBI-ProteinID:ADK06337和NCBI-ProteinID:ADK06336所示；丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB整合至枯草芽孢杆菌基因组melA、pyk、ywkA、kdgA、malS、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB整合至枯草芽孢杆菌基因组melA位点。
进一步地，固氮酶铁蛋白cyh的编码基因如NCBI-ProteinID:ACV00712所示；固氮酶铁蛋白cyh整合至枯草芽孢杆菌基因组pckA、pyk、ywkA、kdgA、melA、malS、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。优选地，固氮酶铁蛋白cyh整合至枯草芽孢杆菌基因组pckA位点。
进一步地，丙酮酸羧化酶BalpycA来源于蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的丙酮酸羧化酶PycA。外源引入来源于蜡样芽孢杆菌等菌株的丙酮酸羧化酶BalpycA，可消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。
进一步地，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor来源于甲烷球菌Methanococcusmaripaludis KA1，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶。
进一步地，异柠檬酸NAD+脱氢酶icd来源于生孢梭菌Clostridium sporogenes，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的异柠檬酸NAD+脱氢酶。
进一步地，苹果酸醌脱氢酶mqo来源于蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的苹果酸醌脱氢酶。
进一步地，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB来源于蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶。
进一步地，固氮酶铁蛋白cyh来源于Cyanothece sp.PCC 8802，或其他宿主来源能在枯草芽孢杆菌中有效表达的固氮酶铁蛋白。
进一步地，引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径以及三羧酸循环中产生NADH的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。操作简单，便于使用，且所构建的重组枯草芽孢杆菌完全避免中心碳代谢以溢流、平衡胞内还原力NADH代谢。
进一步地，上述乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：
(1)分别构建丙酮酸羧化酶BalpycA编码基因balpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶编码基因icd、苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porAB和固氮酶铁蛋白编码基因cyh的同源重组整合框；
(2)经同源重组，将步骤(1)中得到的整合框分别整合至枯草芽孢杆菌基因组中。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，用整合位点的上游序列(长度为500-1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子、目的基因序列以及下游序列(长度为500-1000bp)，构建整合框。
进一步地，目的基因序列为丙酮酸羧化酶BalpycA编码基因balpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶编码基因icd、苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porAB和固氮酶铁蛋白编码基因cyh。
在另一方面，本发明还公开了上述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用。
进一步地，应用时，包括以下步骤：
将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，在35～38℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35～38℃下发酵培养。
进一步地，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
进一步地，以其重量为基准，种子培养基包括以下成分：5～15g/L蛋白胨、5～10g/L酵母粉和5～15g/L氯化钠。
进一步地，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
进一步地，以其重量为基准，发酵培养基包括以下成分：15～25g/L葡萄糖、5～8g/L蛋白胨、10～15g/L酵母粉、5～8g/L硫酸铵、10～15g/L磷酸氢二钾、2～3g/L磷酸二氢钾、4～6g/L碳酸钙和8～12ml/L微量元素溶液。
进一步地，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
进一步地，以其重量为基准，微量元素溶液包括以下成分：0.8～1.2g/L硫酸锰、0.2～0.6g/L氯化钴、0.1～0.3g/L钼酸钠、0.1～0.3g/L硫酸锌、0.1～0.3g/L氯化铝、0.1～0.3g/L氯化铜、0.04～0.06g/L硼酸和3～8mol/L盐酸。
进一步地，活化后的种子以5～15％的接种量转入发酵培养基中进行培养。
进一步地，诱导剂为木糖，每升发酵培养基的木糖用量为5～10g。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，通过外源引入来源于丙酮酸羧化酶BalpycA，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。进一步引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生NADH的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸NAD+脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白获得。与出发菌株BSGNKAP2相比，避免了中心碳代谢溢流，消除副产物乙偶姻的合成；同时在生成乙酰氨基葡萄糖的过程中，胞内的NADH有效的减少，同时促进了乙酰氨基葡萄糖的合成。在使用复合培养基摇瓶发酵过程中，重组菌株的乙酰氨基葡萄糖的产量为24.50g/L，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，分别是出发菌株BSGNKAP2的1.97和2.13倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为使用不同枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖高效液相(HPLC)示差检测色谱图，(a)BSGNKAP2发酵液HPLC检测结果，(b)BSGNKAP3发酵液HPLC检测结果；
图2为不同枯草芽孢工程菌株胞内NADH水平测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：构建枯草芽孢杆菌BSGNKAP3
枯草芽孢杆菌BSGNKAP2为B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔgl cKΔpckAΔpykP43-glmS P43-pycA::lox72，以pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因。具体构建方法参见申请号为201610517961.9的中国专利。然后在此基础上，于枯草芽孢杆菌BS GNKAP2基因组malS位点整合蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶BalpycA(NCBI-ProteinID:AAS 42897)编码基因balpycA。用整合位点malS位点的上游序列(SEQ ID No.1，长度1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子P43、目的基因序列balpycA以及malS位点的下游序列(SEQ ID No.2，长度1000bp)，构建整合框。经同源重组，将中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP2基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP3。
实施例2：构建枯草芽孢杆菌BSGNKAP4
枯草芽孢杆菌BSGNKAP3为宿主，以pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌BSGNKAP3基因组pyk位点整合甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶(NCBI-ProteinID:CAF30501)编码基因gor。用整合位点pyk位点的上游序列(SEQ ID No.3，长度1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子P43、目的基因序列gor以及pyk位点的下游序列(SEQ ID No.4，长度1000bp)，构建整合框。经同源重组，将中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP3基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP4。
实施例3：构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP5
以BSGNKAP4为宿主，以pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌BSGNKAP4基因组ywkA位点整合异柠檬酸NAD+脱氢酶(NCBI-Protein ID:AKC61181)编码基因icd。用整合位点ywkA位点的上游序列(SEQ ID No.5，长度1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子P43、目的基因序列icd以及ywkA位点的下游序列(SEQ ID No.6，长度1000bp)，构建整合框。经同源重组，将中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP4基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP5。
实施例4：构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP6
以BSGNKAP5为宿主，以pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因，然后在此基础上将枯草芽孢杆菌基因组苹果酸醌脱氢酶(NCBI-Protein ID:ADK05552)编码基因mqo整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP4基因组kdgA位点。用整合位点kdgA位点的上游序列(SEQ ID No.7，长度1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子P43、目的基因序列mqo以及kdgA位点的下游序列(SEQ ID No.8，长度1000bp)，构建整合框。经同源重组，将中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP5基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP6。
实施例5：构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP7
以BSGNKAP6为宿主，以pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌BSGNKAP6基因组melA位点整合丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(NCBI-ProteinID:ADK06337和NCBI-ProteinID:ADK06336)编码基因porAB。用整合位点melA位点的上游序列(SEQ ID No.9，长度1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子P43、目的基因序列porAB以及melA位点的下游序列(SEQ ID No.10，长度1000bp)，构建整合框。经同源重组，将中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP6基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP7。
实施例6：构建枯草芽孢杆菌BSGNKAP8
以BSGNKAP7为宿主，以pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌BSGNKAP7基因组pckA位点整合固氮酶铁蛋白(NCBI-ProteinID:ACV00712)编码基因cyh。用整合位点pckA位点的上游序列(SEQ ID No.11，长度1000bp)、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子P43、目的基因序列cyh以及pckA位点的下游序列(SEQ IDNo.12，长度1000bp)，构建整合框。经同源重组，将中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP7基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP8。
本发明以上实施例中，所使用的启动子除了P43启动子，还可以使用其他可用于枯草芽孢杆菌的启动子，如PabrB、PvalS、Phag、PspoVG、PyvyD、PhemA或Pffh等。
丙酮酸羧化酶BalpycA还可整合至枯草芽孢杆菌基因组的其他位点，如pyk、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor还可整合至枯草芽孢杆菌基因组的其他位点，如malS、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
异柠檬酸NAD+脱氢酶icd还可整合至枯草芽孢杆菌基因组的其他位点，如pyk、malS、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
苹果酸醌脱氢酶mqo还可整合至枯草芽孢杆菌基因组的其他位点，如pyk、ywkA、malS、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB还可整合至枯草芽孢杆菌基因组的其他位点，如pyk、ywkA、kdgA、malS、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
固氮酶铁蛋白cyh还可整合至枯草芽孢杆菌基因组的其他位点，如pyk、ywkA、kdgA、melA、malS、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
实施例7：重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙10ml/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准，包括如下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
使用高效液相色谱法检测乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色谱法测试条件：仪器型号Agilent 1200，RID检测器，柱子：NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪。
在种子培养基中将重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP8于37℃、220rpm下培养8h，然后将种子以5％的接种量转入发酵培养基，于500mL摇瓶中37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。
摇瓶发酵结束后，BSGNKAP8乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的产量为24.50g/L，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，分别是出发菌株BSGNKAP2的1.97和2.13倍(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。此外，乙偶姻得到完全消除(结果如图1所示)。
表1乙酰氨基葡萄糖产量及乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖测试结果
实施例8：重组枯草芽孢杆菌胞内NADH的检测
胞内NADH的检测检测使用青岛捷世康生物科技有限公司试剂盒。收集对数期菌体于离心管内(104个)，按照500～1000mL:1mL的体积比，加入碱性提取液，超声波破碎(冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，95℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g、4℃离心10min，取500μL上清液加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10000g、4℃离心10min，取上清，置于冰上按试剂盒标准程序检测NADH。
BSGNKAP3、BSGNKAP4、BSGNKAP5、BSGNKAP6、BSGNKAP7和BSGNKAP8的胞内NADH水平如图2所示。结果表明，本发明的重组枯草芽孢杆菌可以完全避免中心碳代谢溢流，并有效避免胞内还原力NADH的积累，促进乙酰氨基葡萄糖的合成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
<141> 2018-07-24
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
taaagacaga ctctgacagg agtctgtttt ttttatgggc cgtttgctac catgatgata 60
ggggggggtg aaaatggaaa caatgaaaat tggaaacatc acgttgacct ggcttgacgg 120
aggcgtgacg catatggacg gaggcgccat gttcggcgtt gtgccaaagc cgctttggtc 180
taaaaaatat ccagtcaatg aaaaaaacca gattgaacta agaacagacc ctattttgat 240
tcaaaaggat gggctcaata tcatcattga cgccggaatt gggtacggca agctgactga 300
taaacaaaaa cgaaactatg gcgtgacaca agagtcgaat gtgaaaccct cattagctgc 360
actcggatta acggttgccg atatagatgt gatcgcaatg acacaccttc attttgatca 420
tgcatgcggt ttaacggaat atgaaggtga acggctcgtc tctgtctttc cgaatgcagt 480
gatttataca tcagctgttg aatgggacga aatgcgccat ccgaatatca ggtcgaaaaa 540
tacgtattgg aaagaaaatt gggaggctgt agctggccaa gtcaaaacct ttgaagacac 600
cttaacgatc acagagggta ttacaatgca tcacaccgga ggccatagcg acggacacag 660
tgtcctgata tgcgaggatg cgggtgaaac tgccgtacat atggcagatc tgatgccgac 720
acatgcccac cgcaatccgc tatgggtgct ggcttacgat gattatccga tgacctctat 780
cccgcaaaag cagaaatggc aggcgttcgc agcagaaaaa gatgcttggt ttatttttta 840
ccatgatgcc gagtatcgcg cccttcaatg ggaggaggac ggaagcatca aaaagtcagt 900
taagcgaatg aagcgatagc atatttttat gtttaccctg catgttttcc ggctaataat 960
gcaaacctag tactattatg ctcagaaagg aagaggcagg 1000
<210> 2
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
taaaaaagag ccgctgcata ggcagcggct tctatttttt gcttgtccgg tgttaagagg 60
cgattgtatc aatgacatca acaatttctc ccgttttcgc atccaccatg acttcatact 120
gttctaattc tccgaaagct gatcgtgtaa tgccggtttt gtatacctgt accgtttctc 180
cgttaatatt gtagggctcc ggctgggtgt aaatccatga tccgtcaatc gggccccgct 240
gcttaaaagc agattttaca attcgaagcg ctttttctga agaaatataa ggcttcatca 300
catattgtct cacaacgaca gccgtacaaa ttccaagtcc tgctcctaaa agaagatgac 360
gcaatttcaa aataaagcac ctcctggttg atcgtacttt tcattataca gaaacagcca 420
aatcctgtta agcaatacgc ggctgatcga gcagattggg tcagagtgct tggaaaactt 480
cattgtttct aataaaataa aaggactaca tagaaatgag gggaaaacat gaatcaagaa 540
acgaaagcgc ttttccaaac actgacgcag cttcccggcg cgccgggcaa tgagcatcag 600
gttcgtgctt ttatgaagca ggagctagcc aaatatgcag atgacatcgt tcaggacaga 660
ctgggaagtg ttttcggagt cagacgaggc gcagaggacg caccgagaat tatggtagcc 720
gggcacatgg acgaagtcgg cttcatggtg acatccatta cagacaacgg gctgctcaga 780
ttccagacgc tcggaggctg gtggagccaa gttttgcttg cgcagcgggt tgaaattcaa 840
acagataacg ggccggttcc gggtgtgatt tcaagcatac cgccgcattt attgacagat 900
gcgcagcgaa accgaccgat ggatatcaaa aacatgatga tcgacattgg agcggatgat 960
aaggaagacg ccatcaaaat cggcattaga ccgggacagc 1000
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
gaaacgaata ggggtattaa cgagcggcgg ggattccccg ggaatgaacg cagcagttcg 60
cgcagtagtc agaaaagcga tctatcatga cgttgaagtt tacggtattt acaacggata 120
cgcgggattg atcagcggaa agattgaaaa gcttgaactc ggatcagtag gcgatattat 180
acatcgtgga gggactaagc tttatacggc gagatgtcct gaattcaaaa cagttgaagg 240
ccgtgaaaaa gggatagcaa acttgaagaa gcttggtatt gaaggccttg ttgttatcgg 300
tggagacggt tcctatatgg gtgcgaaaaa attaacggaa cacgggtttc catgtgtagg 360
tgtaccgggt acaattgata atgacattcc gggcactgat tttacaatcg gtttcgatac 420
agctttaaat acagtaattg acgcaattga taagattcgc gatacagcga cttctcatga 480
acgtacatat gtaatcgaag taatgggccg tcatgccggc gatatcgcat tgtgggccgg 540
tcttgcaggg ggcgcagaat cgatcttaat ccctgaggca gactatgaca tgcacgaaat 600
cattgcccgc ttaaaacgcg gccacgaacg cggcaagaag cacagtatta ttattgttgc 660
cgaaggtgta ggcagcggtg ttgaattcgg gaaacgcatt gaagaagaaa caaatcttga 720
aactagggta tctgtattgg gccatatcca gcgcggaggt tctccgagtg ctgctgaccg 780
tgtgttggca agccgtctcg gcgcatatgc agttgaactg ctgcttgaag gaaaaggcgg 840
acgctgtgta ggtatacaaa acaataagct tgtagaccat gatattatag aaatacttga 900
gacaaaacac acagttgagc aaaacatgta tcagctttca aaagaactgt ctatctaatg 960
tacagctgaa ggctgaagat ttcagaagga agtgaaccaa 1000
<210> 4
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ttacaggtga aaatggaagg ggaatccctt ccttttctct ttatcatgcc ttttgttgaa 60
cagaacgtgt tacacgtgtg gggggcttgg atatgagatt tttgtttttg ctttttattg 120
tgtttccggc aatagaaatc ggtatattcc tatttttagg aaatctgatt ggtattttgc 180
cgacagttct attcatgatt ctgactggca ttatcggcgc agcagctgca aaaaaacaag 240
gaaccgaagt gtattataag gttcagcgtg atcttcaata tggcaaaatg ccgggagaag 300
cgattgctga cggtctgtgc attttcattg gcggtctatt gctgatgctt ccgggctttt 360
tatcagattt ggccggcgcc tgtcttctta tcccgtttac ccgcggctgg tgtaagccga 420
ttctgttcaa atggctgaga ggaatgtcga agaataagcg gatcatcatc aaataaaaaa 480
cggcagccat gaaaaaacgg ctgccgtttt atttttgctg aacggtgata taggaccata 540
tttcttttaa tgcgcctgtt gtgatgaaag cttggatgat gacgagtaca gccggtcccg 600
caatcagtcc taaaaacccg aataatttaa agccggcaaa cagggcgatg agtgttgcca 660
gcggatcgat cccgatagat ttacttagta tcttgggctc tgtcagctgc cgctgaataa 720
gaacgacgag gtacaggata ccaattccga ttgcttgggg cagctggccc gtaatcgata 780
aatacaaaat ccagggcaca aatacggagc cggcacctaa gtaagggaga agatctacaa 840
gcccgattaa aaaagcaatt gttgcggcgt gttcaacctt taagagagaa aggccgataa 900
atacaatcac catcgtgatg aaaacgagga cggcttgtgc tttgataaaa ccagtcattg 960
ctttttttaa ttcgctgctg attgctttgc tgttagctgt 1000
<210> 5
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
gccacccatt ctacactggc cgtcaaaaat tcgcttctgc tgatggtcgt gttgatcgct 60
ttaacaaaaa atacggtctt aagtaataat agatttctca acaggcaagc agcagtcttg 120
cctgtttttt atattgtcta aaacacagct ggcagagaga ggggagcgaa gcctatgtac 180
ataatgaaac aaagcgggtg gcttgagctg atttgcggca gcatgttctc ggggaaatct 240
gaagagctga tcagaagagt gaagagagca acttatgcca agcaggaagt cagggtattt 300
aagcctgtaa ttgataaccg atacagcgaa gctgctgttg tctcccataa tggaacatcg 360
atgacgagct atgccatttc gtctgctgcg gacatttggg atcacatcag tgaaagtaca 420
gatgtggttg cggttgatga agtgcagttt tttgatcagg aaattgttga ggttttatca 480
tctcttgccg ataaaggcta ccgtgtgata gcagcaggcc ttgatatgga ttttagggga 540
gagccgttcg gtgtcgtccc gaatatcatg gcgattgcgg aaagtgtgac aaagctgcaa 600
gccgtctgtt ctgtttgcgg atcaccggcg agcagaacac agcgcctcat tgacggcaaa 660
cctgcttctt acgatgatcc ggtcattttg gttggtgcag ctgaatcata tgaagcaaga 720
tgcagacatc atcacgaagt cccaggtaaa tctaaaaaat agtccaaaac atgggtataa 780
agatagaatg caccggctaa aaacaccggt gtttttttta tattctgata atattcaatt 840
aaaaaattta aataagtata ttaaaaaatt aagtaatttt cttctcttga attttgattt 900
tgacaggcat acaatagctt acgtaatgta aatagttttg agacattgtt cgaataattg 960
tcacaaagtc gcataaagat catgatcggt catattttag 1000
<210> 6
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
ttagcgagta aatttttctg tccgagggaa agctttttgt aaagctaaag tatacggaca 60
taggatttgg aggagaatat tttgagcatc ttagatatct taatcctcct ggcgccgatc 120
ttctttgtta tcgtgctggg ttggtttgca ggacattttg gaagttatga tgccaagtcg 180
gcaaaagggg taagtacgtt agtaacgaaa tacgcacttc cagctcactt tatcgctggt 240
attttgacaa cttccagaag tgaattttta tcacaagtac ctttaatgat ttctttaatt 300
attgggattg ttggtttcta tatcatcatt cttttggttt gcagatttat attcaagtat 360
gatttaacga actcatctgt attttctttg aactctgcac agccgacatt cgcatttatg 420
ggtatcccgg tattgggaag cttattcgga gcgaatgaag ttgcgattcc gatcgcggtc 480
acaggtatcg tggttaacgc gattcttgat ccgctcgcga tcattatcgc tactgttggt 540
gagtcttcta agaaaaacga agagagtggc gacagcttct ggaagatgac aggaaaatca 600
atcctgcatg gtctttgtga gccgcttgca gctgctccgt taatcagtat gatcttggtg 660
ctggttttca atttcactct tcctgagctg ggtgttaaaa tgcttgatca gcttggaagc 720
acaacatctg gtgttgctct cttcgctgtt ggtgttaccg ttggtattcg taaaattaaa 780
ctcagtatgc cggctatcgg tattgcgtta ctaaaagttg cggttcagcc tgcgttaatg 840
ttcctgattg ctcttgctat cggacttcca gctgaccaaa caacaaaagc aatccttctt 900
gttgcattcc ctggttctgc cgttgcagcc atgattgcga ctcgtttcga gaaacaagaa 960
gaagaaactg caactgcgtt tgtggtcagt gcgattctgt 1000
<210> 7
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
caactaagag gaggttggga agagatgaag cttgatgcgg tgacattcgg ggaatcaatg 60
gccatgtttt atgcaaatga gtatggaggc cttcatgaag tatccacttt ttctaaaggg 120
cttgccggag cagaaagcaa tgtcgcctgc ggccttgcca gactcggatt tcgaatggga 180
tggatgagca aggtcggcaa tgatcagctc ggaacgttta ttttacaaga gcttaaaaaa 240
gagggagtgg atgtgtcccg cgtgatccgc tcgcaggacg aaaatcccac cgggctgctg 300
ctgaagtcaa aagtgaaaga aggcgacccg caagttacct actataggaa aaactcagct 360
gcaagcacat taactacagc tgaatatccg agagattatt ttcaatgcgc aggccatttg 420
catgtgacag gtattccgcc tgctttatca gccgagatga aagacttcac gtatcatgtc 480
atgaacgaca tgagaaacgc agggaagacc atttcattcg accctaatgt aagaccttcg 540
ctttggcctg atcaagcaac aatggtacac acaatcaatg atctggctgg gcttgcagac 600
tggtttttcc cgggtatcgc agagggagag ctattgaccg gagaaaaaac acctgaaggc 660
attgccgact attatttgaa aaaaggtgcc agctttgttg ctattaaact tggaaaagaa 720
ggcgcttact ttaaaacggg gacaagtgaa ggatttctag aaggctgccg ggtcgaccgg 780
gtggttgata cggtcggcgc cggagacgga tttgcagtcg gtgtaatcag cggtatccta 840
gacggtttgt cgtacaagga tgcggtgcaa aggggaaatg cgattggcgc tttgcaagtg 900
caggcaccgg gggatatgga cggtttgccg accagggaga aattagcttc ttttttatct 960
gctcaaagaa cggttcacca aaagaaaggg gattattaat 1000
<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
gtggaattgt tttttcataa ccggaggatg ggagaatcca caatatgaaa atcaaggcga 60
caattgaacg ggtacctggc ggaatgatga ttattccgct atttcttgga gcggcgctca 120
acacgtttgc gcctggaaca gcggagttct ttggagggtt tacgggtgct ttgattaccg 180
gaacgctgcc gatactgggt gtttttatct tttgcgtagg agcaacgatt gattttcgtt 240
cttcaggcta tatcgcaaga aaaggaatca cgttattatt ggggaagatc ggatttgcgg 300
cgctgctcgg cgtgatcgca gcgcaattta tacctgacga tggcatacaa tccggctttt 360
ttgcaggcct ttctgtttta gcaattgtcg cggtaatgaa tgaaacgaac ggcggactgt 420
atttggcgct catgaatcac atgggaagaa aagaggatgc gggcgctttc gcctttatca 480
gtacagaatc tggtcctttt atgaccatgg tgacgtttgg tgtgacggga cttgccgcat 540
tcccatggga aacgctggca gcgacagtca tcccgttttt acttggatgt atacttggaa 600
atctggatca tgatctcaga gacttattca gcaaggttgt gccggcgatc attccatttt 660
tcgccttttc gctcggcaat accttgaatt ttggaatgct gatccaatca gggctgctcg 720
gcatttttat cggagtttct gtcgtcattt tatcgggcag ttctttgttt ttgcttgatc 780
gttttattgc gcggggagat ggtgtcgcgg gagtggccgc ttcttctacg gcaggggcgg 840
ctgtagccgt gccatatgca ttagcggaag cgaatgcctc atttgcgcca gttgctgagt 900
cggcaactgc aattatcgcg acaagcgtta ttgtcacctc gctcttaacc ccgctggcaa 960
cagtgtgggt agataaaaaa atcaagcaga aaaagcggag 1000
<210> 9
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
acaatccatg tccacgttta tgtatgattt gtatttcaaa cggcaggatg ccggctatgc 60
cgcaacgcaa ggcatattta tggcatttgt cattttgatc atcagctttt gcgcgcttgc 120
gtactttaaa agaaaggaga cggaaatgtc atgagagccg cccgtacaaa aagcatgcgg 180
atcattacgc ttcttgcagc cattgtggcc tgtgcgcatt ttattccttt ttatatcctg 240
ctgaccactt cattgaaagc aaaaggagac tacagttcga aatggatatt tccagccgac 300
atctcctttc ataatttttc agaggcgtgg gagcgcgctt cgctaggaaa ctcttttata 360
aacaccatga tcatcacagg tttttctgcc ttgttattaa ttatattcgg ctcacttgcc 420
gcctacccgc ttgcccggcg ggaaacgaaa ctgaataaag ccgtttttgc cttgctgatt 480
tccattatga tcatccctcc gttaacgtcc atggttcctt tgtaccgaat ggtcgtggac 540
gccggaatgg tcaatacaca cgcaatcgcc attttcatca atacagcggc ttacatgccg 600
ttaaccgtat tcttatattc aggctttatc cgatcgacca ttccaaaaga gcttgtagaa 660
gccgcaagaa ttgacggtgc aggcatgctg aaaatctttt ttacgattgt gtttcctctg 720
ctgaagccga tcactgcgac catctgtatc atttcttgtg tctttatttg gaacgactat 780
caatttgcca ttttcttttt acaagatcaa aaggttcaga cattaacagt agccatggca 840
ggttttttcg gagaaaacgc aaacaacctt catttagttg ccgcagcggc acttatggca 900
atgctgccga tggttgttct gtttttggcg ctgcaaaaat actttattgc cggcctgtct 960
tccggagcgg taaagggtta acattaaagg gggaagcaat 1000
<210> 10
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
aaactagggg accgctctcc cctagttttt tggttttgtt tcgccttccc aggccatcat 60
gccgccttca acattgactg ttttaaagcc ttgctcatcc aggtacttgc agacgttcat 120
gctgcgcatt cctgagcggc agataaatac gtactctttg tctttatcaa gggtttccat 180
tttttcagga atatccccca tgcgaatatg aacggcttgc gggatcatgc cttccgctac 240
ctcttcatct tctctgacat caattaaata taattcttcg tccgcctcaa ttttttcttt 300
caaagcggct gtgctgattt cttttatttc caaagaaaac actcctattc acagtgatca 360
tgttcagtat atcaaagtca gccgaacgat tgctattctg agactgatga aaaaaaatcc 420
ccttttggca aaggggattt tttctaggct tagtttgcca caatattgac aagcttccca 480
ggcaccgcga tgattttccg aatcgttttg ccttcaagct gctctttgac cttttcatct 540
gcttgagcaa gctgttccag ctgttctttc gttgcatcgg caggaacctg taatttcgct 600
tttacttttc cgttcagctg aacaacgatt tcaacttcat catccacaag ttttgtttca 660
tcatatacag gccaagcttc gtaggcaatt gtgccggaat ggccaagctt ctcccatagc 720
tcttccgcta agtgtggcgc gacaggagaa agaagcttca cgaagccttc catatattct 780
ttcggcagtt ctgttgcttt ataagcttca ttaataaaga ccatcagctg ggaaataccc 840
gtgttgaaac gaaggccttc ataatggtct gtgactttca tgaccgtttc atgatagacg 900
cgctccaatg tttcacccgc gccttcaacg atttttccat taagctcacc gctgtcttca 960
ataaataggc gccatacacg gtcaaggaaa cggcgcgcac 1000
<210> 11
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
acggacttca cttaggcggc gggctaattt atgggcaagt gaaattggaa gaggcataag 60
ctctttcgtt tcgttgcacg cataaccgaa cattaatcct tggtcacccg caccaatcgc 120
ttcaatttct tcgtcgctca ttgtgccttc acgggcttca agcgcttggt ctacgcccat 180
cgcgatatca gcagactgct catcaattga tgttaaaacc gcacaagttt ccgcatcaaa 240
tccgtatttt gcacgtgtgt atccgatttc tttaatggtt tggcgaaccg ttttcggaat 300
gtcaacatac gtagaagttg tgatctctcc gcttacaaga accaaacctg ttgtcacaga 360
tgtttcacaa gcaacacgcg cgttagggtc tttctttaaa atttcatcta aaatgctgtc 420
agaaatctgg tcacagattt tatccggatg cccctccgta acagattctg atgtaaataa 480
acgacgattt ttactcatga tttgcttcct cctgcacaag gcctcccgaa agaccttgta 540
tatatgatac ggaactcgct ccctcttata caatgtacag ttatattaga gaatgttaat 600
tggcatattt atgaaataaa aaaacctttt ccatcgagga aagggtttgg tctttgtgcc 660
tttcactctt atcgctcaag gaatcataca accttgcaac aggttagcac cttggttgtc 720
tcactcagtt gaacataata aataacagag aaaccggttg ctgggcttca tagggcctgt 780
ccctccgcca gctcgggata agagtatccg ctcaatgaaa tatcttatcg taaaagggtt 840
tgcaatgtca atatgattca gaagaaatag gcacctatat tgagggaaaa caatggaaat 900
gcacacacaa aaaacaataa atagtataga ctatttgaaa atatatgtta tactaattca 960
caattagcaa aacacaaaaa acgataaagg aaggtttcat 1000
<210> 12
<211> 1000
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
aaaacaaaag ccaagagcaa ttatgctctt ggcttgtttt aattgacgga atgcaaagaa 60
gtcagcttgt atgtaatgat ggtccggcct tcttcccatt gaagcttctg cacttcagct 120
gtgcctgact tttcgccaaa ctttgttttg cgtacatcca ttggaatctc catcggatat 180
actcggtatc cgtccttctc taacgtgaat atattttcat ctatgcgaac ttcttttcct 240
tttgtcacaa tcagtgtatt aaattcaaca ggcattccca aagtgaaatc ccctttcgtt 300
ctcttttttc tttatcataa catatttcac tgtcagcggt ttttcatcca ttgtgtgagc 360
tgccgcacga tacgccggtt ttcttttggc gggaaataat gtgtgaatgt actgtagtac 420
catgtttcca ccggcttatg cagttgtttt agcttctctt ctaataaata ggaatgctga 480
atcgaaacat tttggtcttt ttctccatgg attaacagca cgggagcctg aattttgttt 540
acttggtcaa acggtgtcct ccattgatat tcctcaggca cctttttcgg tgttccgccg 600
atgactcttt tcatcattcg ccgcaaatcc tgccgctcct cgtatgtaag aatcatatca 660
ctgacgcctc cccaggaaac aaatgaagct gcctgcccgc ccatttcgat cgcagtgagc 720
attcccataa ttccgccgcg ggaaaaaccg aagatatgga ttctatcctt cttgacattt 780
gggtgctgct gaagcaggcg aaaagcagaa aatgcatcct ccctgtcttc tccggcaaaa 840
tcctcattgc cttctcctcc ttgattgcct ctgtaaaaag gagcaaacac cacaaaccct 900
tgggatgcaa actggataat ccggcccggc cgaaccatgc ccacgctttt aatcccgccg 960
cgcaaatata aaaatccgtc atattgtccc ggttccgccg 1000

Claims (11)

1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor、异柠檬酸NAD+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh分别使用强组成型启动子表达。
4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述强组成型启动子为P43、PabrB、PvalS、Phag、PspoVG、PyvyD、PhemA或Pffh启动子。
5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶BalpycA的编码基因balpycA如NCBI-ProteinID:AAS42897所示；所述丙酮酸羧化酶BalpycA整合至枯草芽孢杆菌基因组malS、pyk、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
6.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor的编码基因如NCBI-ProteinID:CAF30501所示；所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gor整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk、malS、ywkA、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
7.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述异柠檬酸NAD+脱氢酶icd的编码基因如NCBI-Protein ID:AKC61181所示；所述异柠檬酸NAD+脱氢酶icd整合至枯草芽孢杆菌基因组ywkA、pyk、malS、kdgA、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
8.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述苹果酸醌脱氢酶mqo的编码基因如NCBI-Protein ID:ADK05552所示；所述苹果酸醌脱氢酶mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdgA、pyk、ywkA、malS、melA、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
9.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB的编码基因如NCBI-ProteinID:ADK06337和NCBI-ProteinID:ADK06336所示；所述丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB整合至枯草芽孢杆菌基因组melA、pyk、ywkA、kdgA、malS、pckA、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
10.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述固氮酶铁蛋白cyh的编码基因如NCBI-ProteinID:ACV00712所示；所述固氮酶铁蛋白cyh整合至枯草芽孢杆菌基因组pckA、pyk、ywkA、kdgA、melA、malS、ctc、yckB、ydgG、speA、bshB、yojF、brxA、yqhS、yqeT、recJ、yvmB、spSC、nupG或rrnO位点。
11.权利要求1-10中任一项所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用。
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