CN113957025A - 一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用，利用表达载体向地衣芽胞杆菌原始菌株中导入额外拷贝的bshC基因、bshB基因和bshA基因，使得bshC基因、bshB基因和bshA基因在地衣芽胞杆菌中过表达，达到了提高菌株的杆菌肽及其A组分合成能力的目的。

Description

一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程菌改造技术领域，尤其是一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

杆菌肽（英文名称：Bacitracin），又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素。它是多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，含A、B₁、B₂、B₃、D₁、D₂、D₃和E多种组分。其中，组分A的活性最高，含量也最为丰富，分子式为C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S。它是一个十二肽，含有一个七元环。它含有一个由L-异亮氨酸与L-半胱氨酸形成的噻唑啉环，一个在赖氨酸的ε-NH₂侧链和天冬酰胺的C-端之间连接形成的环状七肽结构，以及四个D-氨基酸(D-谷氨酸、D-鸟氨酸、D-苯丙氨酸和D-天冬氨酸)。

杆菌肽的化学结构式

杆菌肽为无臭、味苦，类白色或淡黄色的粉末，易溶于水，能溶于乙醇、甲醇和冰乙酸，不溶于丙酮、三氯甲烷或乙醚，有吸湿性，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。其独特的组成和结构使它对各种蛋白质水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，具有很大的抗性，同时也不受蛋白酶抑制剂的影响。杆菌肽在医学上主要用于治疗痤疮、化脓性皮肤病、阿米巴痢疾、淋球菌和脑膜炎双球菌等感染症。

杆菌硫醇 (Bacillithiol，简称“BSH”) 是谷胱甘肽的结构类似物，是由半胱氨酸、N-乙酰葡糖胺和苹果酸组成的小分子化合物(Cys-GlcN-Mal)，其可能是芽胞杆菌中重要的抗氧化物质。BSH 生物合成需要三种酶：L-苹果酸糖基转移酶BshA、N-乙酰氨基葡萄糖-苹果酸脱乙酰酶BshB、半胱氨酸添加酶BshC，依次通过L-苹果酸糖基转移酶BshA将N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）与苹果酸（Mal）偶联形成GlcNAc-Mal 中间体，再通过N -乙酰氨基葡萄糖-苹果酸脱乙酰酶BshB使 GlcNAc-Mal 中间体脱乙酰以生成 GlcN-Mal，最后通过半胱氨酸添加酶BshC将GlcN-Mal 与Cys偶联以生成BSH。

BSH的合成途径

地衣芽孢杆菌中合成BSH中关键的基因是bshC基因、bshB基因和bshA基因。

杆菌肽是以氨基酸为前体物质，通过非核糖体合成酶进行合成的。在关于提高地衣芽孢杆菌的杆菌肽产量的策略方面，目前的研究主要集中在通过增加杆菌肽的几种前体氨基酸的供应来提高杆菌肽的产量上。并且，目前尚未见关于谷胱甘肽或BSH与杆菌肽合成之间关系的报道，同时，地衣芽孢杆菌中与菌株代谢产物的合成息息相关的基因也非常多，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌（拉丁名：Bacillus licheniformis），利用表达载体向地衣芽孢杆菌原始菌株中导入额外拷贝的bshC基因、bshB基因和bshA基因，使得bshC基因、bshB基因和bshA基因在地衣芽孢杆菌中过表达，达到了提高菌株的杆菌肽及其A组分合成能力的目的。

一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，采用现有的外源基因导入宿主细胞的方法将外源的bshC基因、bshB基因和bshA基因三个基因通过过表达质粒导入原始地衣芽孢杆菌中得到所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌菌株。

本申请首次通过在原始地衣芽孢杆菌中过表达bshC基因、bshB基因和bshA基因，来提高菌株的杆菌肽合成能力，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与原始地衣芽孢杆菌相比，通过本发明构建得到的所述过表达bshC基因、bshB基因和bshA基因的地衣芽孢杆菌菌株的杆菌肽产量大幅提升。本发明的研究结果表明：通过过表达bshC基因、bshB基因和bshA基因来提高菌株的杆菌肽合成能力以及杆菌肽产量是一个十分有效的方法。

所述的原始地衣芽孢杆菌为产杆菌肽的地衣芽孢杆菌。

优选的，所述bshC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示；所述bshB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2中所示，所述bshA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3中所示。

优选的，所述的原始地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌DW2（Bacillus licheniformis DW2），所述的原始地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344。优选的，所述过表达质粒采用过表达质粒pHY300PLK。过表达质粒pHY300PLK不仅应用成熟，并且，其属于原核细胞表达载体，该载体具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，能够保证bshC基因、bshB基因、bshA基因的稳定表达。

优选的，将所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌用于发酵生产杆菌肽，其包括发酵培养，所述发酵培养的培养基配方为：30~50g/L玉米淀粉，60~100g/L豆粕，5~8g/L花生粕，6~8g/L碳酸钙，1~2g/L硫酸铵，0.5~1.5g/L硫酸镁，2.5~7.5g/L玉米浆。该培养基配方为适于地衣芽孢杆菌产杆菌肽的配方。

优选的，所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2作为模板，利用同源序列克隆法克隆出bshC基因片段和同时含有bshB基因与bshA基因的bshBA基因片段；

（2）通过重叠延伸PCR将所述bshC基因和所述bshBA基因，与P43启动子和淀粉酶终止子连接在一起，构建完整的bshCBA表达元件，所述bshCBA表达元件的排列顺序为：P43启动子—bshC基因—bshBA基因—淀粉酶终止子；

（3）采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对所述bshCBA表达元件进行双酶切得到酶切基因片段，同时，准备质粒pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对所述质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；

（4）将步骤（3）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接得到连接产物，之后将所述连接产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序确认得到过表达质粒pHY-bshCBA；

（5）将步骤（4）得到的过表达质粒pHY-bshCBA转入地衣芽孢杆菌DW2中，以四环素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，即为所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌DW2/pHY-bshCBA。

附图说明

图1为本发明的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌的构建方法中步骤（1）得到的bshC基因和bshBA基因，以及步骤（2）的P43启动子、淀粉酶终止子TamyL和bshCBA表达元件的琼脂糖凝胶图；

其中，泳道1为P43启动子，泳道2为bshC基因片段，泳道3为bshBA基因片段，泳道4为淀粉酶终止子TamyL，泳道5为bshCBA表达元件，泳道6为DNA marker。

图2为本发明的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌的构建方法中步骤（4）得到的游离的过表达质粒pHY-bshCBA进行菌落PCR验证图；

其中，泳道1为游离表达质粒pHY-bshCBA进行菌落PCR验证的条带，泳道2为DNAmarker。

图3为本发明的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌的构建方法中步骤（5）得到的阳性转化子DW2/pHY-bshCBA进行菌落PCR验证图；

其中，泳道1为阳性转化子DW2/pHY-bshCBA进行菌落PCR验证的条带，泳道2为DNAmarker；

其中，上述图1～图3任一图中DNA marker泳道中从上到下的条带分别对应的分子量依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。

具体实施方式

现根据附图具体阐述本发明的实施方式：

一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，采用现有的外源基因导入宿主细胞的方法将外源的bshC基因、bshB基因和bshA基因三个基因通过过表达质粒导入原始地衣芽孢杆菌中得到所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌菌株；所述的原始地衣芽孢杆菌为产杆菌肽的地衣芽孢杆菌。

本发明的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌的具体构建方法为：

1、步骤（1）的具体操作步骤为：

根据Bacillus licheniformis DW2的基因组DNA序列中的bshC基因、bshB基因、bshA基因的基因序列，设计上游引物（bshCBA-F1、bshCBA-F2）和下游引物（bshCBA-R1、bshCBA-R2）；并以地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis DW2的基因组DNA为模板，分别以所述上游引物、下游引物进行PCR扩增，由于bshB基因与bshA基因在基因组上的位置是在一起的，而bshC基因在基因组上的位置距离bshB基因和bshA基因很远，所以经PCR扩增之后会得到bshC基因片段（1617bp）和同时含有bshB基因与bshA基因的bshBA基因片段（1883bp）两个基因片段；

其中，bshCBA-F1、bshCBA-F2和bshCBA-R1、bshCBA-R2的序列为：

bshCBA-F1: TAAGAGAGGAATGTACACATGCTTGATATACTGGCT

bshCBA-F2: TCTTCCTCTCCTTCGTGAGTATATTAGAAAGGAGGAATATATAATGCAGCTTACTGAACTT

bshCBA-R1: AAGTTCAGTAAGCTGCATTATATATTCCTCCTTTCTAATATACTCACGAAGGAGAGGAAGA

bshCBA-R2: TCCGTCCTCTCTGCTCTTTCAAAGTTTGACAACTTG；

2、步骤（2）的具体操作步骤为：

以枯草芽胞杆菌168的基因组DNA为模板，PCR扩增得到P43启动子（所用引物为P43-F和P43-R）；以地衣芽孢杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增得淀粉酶终止子（所用引物为TamyL-F和TamyL-R），随后将启动子、bshC基因片段、bshBA基因片段和终止子通过SOE-PCR连到一起（所用引物为P43-F和TamyL-R），构成完整的bshCBA表达元件（4265 bp），所述bshCBA表达元件的排列顺序为：P43启动子—bshC基因—bshBA基因—淀粉酶终止子；

其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：

P43-F: GCGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCT

P43-R: CGAAAGCCAGTATATCAAGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTA

TamyL-F: GCATCAAGTTGTCAAACTTTGAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTC

TamyL-R: GGTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTGG；

3、步骤（3）的具体操作步骤为：

采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对所述bshCBA表达元件进行双酶切得到酶切基因片段bshCBA（4536 bp），同时，准备质粒pHY300PLK（购买自Takara公司），并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段（4870 bp）；其中，所述的限制性内切酶EcoRI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

4、步骤（4）的具体操作步骤为：

将步骤（3）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经 T4 DNA 连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：pHY-F和pHY-R）。若转化子的PCR验证结果为：在4536 bp处出现电泳条带，说明过表达构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：过表达质粒pHY-bshCBA)；

pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC

pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC；

5、步骤（5）的具体操作步骤为：

将过表达质粒pHY-bshCBA通过电击转化的方法转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基（常用的细菌性培养基均可，通常为LB培养基）进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：pHY-F和pHY-R）。若转化子的PCR验证结果为：在4836 bp处出现电泳条带（如图3所示），证明：过表达质粒pHY-bshCBA成功转入地衣芽孢杆菌DW2中，此时，该转化子为阳性转化子，即转入了过表达质粒pHY-bshCBA的地衣芽孢杆菌DW2，本发明命名为地衣芽孢杆菌DW2/pHY-bshCBA。

上述bshC基因、bshB基因、bshA基因均公布于美国国立生物技术信息中心—NCBI的基因库中。获取外源的bshC基因、bshB基因、bshA基因片段的方式可以是：以地衣芽孢杆菌（例如地衣芽孢杆菌DW2）的基因组DNA为模板，经PCR扩增得到；也可以是：通过人工合成法获得；等。当然，bshC基因、bshB基因、bshA基因也可以来源于其他含有所述基因的微生物均可，bshC基因、bshB基因、bshA基因片段的来源菌株不同，所获得的基因片段的核苷酸序列中个别碱基会存在差异，但这些不同来源的bshC基因、bshB基因、bshA基因片段应该具有基本相同的功能（编码杆菌硫醇BSH的功能）。

所述的原始地衣芽孢杆菌不限于地衣芽孢杆菌DW2，其也可以为从自然界筛选得到的野生型的产杆菌肽的地衣芽孢杆菌，或经人工改造后的产杆菌肽的地衣芽孢杆菌均可。

所述淀粉酶终止子的来源菌株不限于上述的地衣芽孢杆菌WX-02，其可以是所有具有淀粉酶终止子的生物安全性微生物菌株均可；同样的，P43启动子的来源菌株也不限于上述的枯草芽胞杆菌168，其可以是所有具有P43启动子的生物安全性微生物菌株均可。

本发明的所述的地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344。

本发明的所述bshC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示。

本发明的所述bshB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2中所示。

本发明的所述bshA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3中所示。

优选的，将所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌用于发酵生产杆菌肽，其包括发酵培养，所述发酵培养的培养基配方为：30~50g/L玉米淀粉，60~100g/L豆粕，5~8g/L花生粕，6~8g/L碳酸钙，1~2g/L硫酸铵，0.5~1.5g/L硫酸镁，2.5~7.5g/L玉米浆。该培养基配方为适于地衣芽孢杆菌产杆菌肽的配方。

本发明的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌—地衣芽孢杆菌DW2/pHY-bshCBA用于发酵生产杆菌肽的具体步骤为：

1）种子液获得的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌DW2/pHY-bshCBA活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5ml LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子培养基后于230r/min、37℃中培养12小时，得到种子培养的菌液；

所述的种子培养基的配方是30g/L玉米淀粉，70g/L豆粕，5g/L花生粕，4g/L碳酸钙，1g/L硫酸铵，pH自然；

2）向250ml三角瓶中装入20ml的不同配方的发酵培养基（具体配方见表1，表1中的发酵培养基pH自然），然后将种子培养的菌液以接种量为3%（体积百分比）接入，转速230r/min，温度37℃，发酵培养28小时，即得。

本发明中所述的pH自然是指：不需要通过加酸或加碱去调节pH，培养基的pH完全由配方的成分组成来决定。

上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。以转入空载的pHY300PLK的地衣芽孢杆菌DW2（本发明命名为地衣芽孢杆菌DW2/pHY300）以相同方法发酵生产杆菌肽为对照组。

采用高效液相色谱法（HPLC）测量杆菌肽产量，具体操作步骤如下：将发酵液置于10 mL离心管内，3000 r/min 离心10 min，取上清液。精密量取5 mL上清液于25 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容，置磁力搅拌器上搅拌5 min，以10000 r/min离心5 min，取上清液，用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC测定。根据HPLC法计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的效价（见表2）及其A组分的效价（见表3）。

从表2及表3可看出，在相同的发酵的条件下，采用本发明的地衣芽孢杆菌DW2/pHY-bshCBA的发酵的菌液中杆菌肽及其A组分效价较对照菌有了大幅提升（提高20%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽及其A组分效价方面具有重大应用价值。

序列表

<110> 绿康生化股份有限公司

<120> 一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用

<130> DS-P21224

<141> 2021-09-01

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌DW2(Bacillus licheniformis DW2)

<400> 1

atgcagctta ctgaactttc catacaaagt caaaaccctt ttgttcgaga ctatataaat 60

ggaaaaaagg agatagagcc gtttttcgat tacggcctga gcaatgaaag ttggagtgtc 120

cgtttggatg acctttcctc ccggacgtat gaccgcgatg ctttagctga ctatttgctc 180

gactatcaca gcaaatttca atcggcaagc atgaatgaaa caatcgaacg gcttcgcgat 240

ccgaaaagcg tcgtcgttgt cggagggcag caggccggcc ttttaacagg tcctctttac 300

actatacata aaatcgtatc gatccttgta tttgcaaagc aaaaagaaca agagctgaac 360

gttccggtca ttccggtatt ctgggttgcg ggggaagacc acgatctgga agaaatcaat 420

cacgtctaca tttctgacgg gggcaaggtg aaaaagcaca agctcccgca gtctcactgg 480

aaaaaaagcc aggcgtcaaa aacggcgctc gatgccgaaa aagctgaaaa gtggctggac 540

gggatttttg cctcatttga agaaacggag tatacgaatg atcttctcag ccatttgcgc 600

cgatgtttaa ggcagtctct ttccttcacc gattttttcg aatatcttgt tgccggcatg 660

tttgaacaag acggactgat ccttctgaat tccggcgacc cgggcatcag agcccttgaa 720

gcgcgttttt tccggcagct gctgaacaga aacgacgagc tgaccgattc tgtcaaacgg 780

cagcaggaat tcatgcaaca actgggctac acaccgatta tcgaaggagc cgcacagcat 840

gcgaaccttt tttatgagca cgacggcgag cgctttttaa tcgaaaaaga aaacggggcg 900

ttttttataa aagagcttca ccttcagtgg tctgaagcag agctttgcga tttgatctgc 960

caaaagccgg aagcgttcag caataatgtc gtaacaaggc cgctcatgca ggaatacctt 1020

cttccgacat tggcgttcat cgccggtccc ggagagatca attattgggg cgagctgaaa 1080

ggcgcttttc aggttatggg ctataaaatg ccgcctgtca taccgaggct tcaggttaca 1140

ttccttgagc ggcacatcga aaaaaagctg ggcgagcggg gaatcgaact ccgtgaatcg 1200

attgaaaagg gagcccgcgc caaaaaagag cagtattttg aagataaggt tccgagcggt 1260

tttaccgatt cggtcaaaca ggcgaaagaa aaaatcgaaa acatccattc cgctgtgcgc 1320

gctgaagccc tcgaaatcga tgggagcctc ggcccccttt tagaaaaaaa ctcaggcttc 1380

attcaagacc agctcgaatt tttggagaaa acggttatta aaaggattga agaaagagaa 1440

aactacattt tgcgtgattt tgacaaaatt caaacgagca tcaagccttt agacgctccg 1500

caggagagaa tttggaacat cgtgtattat ttgaacaaat acggtccgaa tttcttggaa 1560

aaatacaagg atttgccata ttcatttcaa aacatgcatc aagttgtcaa actttga 1617

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌DW2(Bacillus licheniformis DW2)

<400> 2

atgcttgata tactggcttt cggcgcgcac agcgatgatg tagaaatcgg catgggagga 60

accattgcca aatatactaa aaaaggcttt caaattggca tctgcgattt aacccaggct 120

gaactgtctt caaacggaac agtcgaaacg agaaaaagcg aagcggcgca ggcggccgac 180

attctcggcg ccagcgcgcg gatttccctc acgctgccgg acagggggct gtttcccagc 240

caggaggcga tcagggaagc ggttgccgtc attcgaaaac ataagccgaa gcttgtcttt 300

gtcccttatc cgaaggaccg gcatcccgat cacgggcatg cagcggaaat cgtcgaagaa 360

gcggtctttt ccgctggaat acataaatac gaagatgcag aaaaacagcc ggcccataaa 420

gtccaaaacg tgtactacta tatgatcaac ggttttcaca aacccgaatt tgtcatcgac 480

atttccgaaa cgatcaatca aaaaaaggaa agccttgctg cttatcagag ccagttcacc 540

cgttcccggc agtcggttga aacaccgttg acgaacggat atattgaaac ggtcgaagca 600

agggaaaagc ttttgggaaa agaggtcggc gtcgcatacg cggaagggtt tttttcaaag 660

cggactcttc tgttaaacaa cgatttattt gggggcggat ga 702

<210> 3

<211> 1185

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌DW2(Bacillus licheniformis DW2)

<400> 3

atgatgaaac agttaaaaat cggaatcaca tgttatccga gtgtcggagg atcaggaatt 60

atcgctaccg agctcggcaa gctccttgcg gaaaaaggac atgaaattca ttttattaca 120

tcaagtgttc cgtacaggct caataaagtg tattccaaca tctattttca cgaagtcgaa 180

gtcaatcaat atgccgtgtt taagcacccg ccgtatgatt tggctttggc cagcaaaatg 240

gcggaggtgg cgaagcggga acagcttgat gttctgcatg cccactacgc ggtgcctcac 300

gcgatttccg cttttttagc gaagcaaatg ctgaacggaa acattaaaac ggtcacaacg 360

ctgcacggca cagatataac cgttctcggc tatgatccgt ctttaaaaga tctgatcaaa 420

tttgcgatcg agtcgtctga ccgcgtaaca gcggtttctt cagctcttgc cgcgcaaacg 480

tacgatttga tcaaaccgaa caaaaaaatc gaaacgatct ataattttgt ggatgagcgc 540

gtgtatttaa aaaagcagga gcatcattcg ctgaaagagc agtacggcat cgcccctgat 600

gaaaaagtga tcatccacgt atccaatttc agacaggtga agcgcgtgca ggacgtcatc 660

catgtcttca gccgcattgt caaacgaatg aagtcgaagc tgattctcgt cggcgacggg 720

ccggagatga ccgtgatctg ccagcttgtc agacagctcg gactaaaaga tgatgttctt 780

ttcctgggca aacaggacag cgtagaagag ctttacgcca tcagcgattt aaagctgctt 840

ttgtccgaga aggaaagctt cggtttagtg ctgctggagg cgatggcctg cggcgttccg 900

tgcatcggca ccaatatcgg aggtattccc gaggtgatca aaaacggtaa atccggttac 960

ttggtcgatg taggagatat tgaaggcgca gctcgtaaag cgctccattt gctgactgat 1020

gaaagcctgc agcgccagtt tgcggaagcg gcgctagaaa gcatcaagga gcgcttttct 1080

tccagtaaaa tcatcgcgca atatgaagaa atttatcaac aattaacaga cggggagtgt 1140

gacaatggag gatctctttt tgaaggctct tcctctcctt cgtga 1185

Claims (7)

1.一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，其特征在于：采用现有的外源基因导入宿主细胞的方法将外源的bshC基因、bshB基因和bshA基因三个基因通过过表达质粒导入原始地衣芽孢杆菌中得到所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述的原始地衣芽孢杆菌为产杆菌肽的地衣芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述的原始地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌DW2，所述的原始地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344。

4.根据权利要求1所述的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述bshC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示；所述bshB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2中所示，所述bshA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3中所示。

5.根据权利要求1所述的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述过表达质粒采用过表达质粒pHY300PLK。

6.根据权利要求1~5中任一项所述的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于：将所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌用于发酵生产杆菌肽，其包括发酵培养，所述发酵培养的培养基配方为：30~50g/L玉米淀粉，60~100g/L豆粕，5~8g/L花生粕，6~8g/L碳酸钙，1~2g/L硫酸铵，0.5~1.5g/L硫酸镁，2.5~7.5g/L玉米浆。

7.根据权利要求1~5中任一项所述的过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2作为模板，利用同源序列克隆法克隆出bshC基因片段和同时含有bshB基因与bshA基因的bshBA基因片段；

（2）通过重叠延伸PCR将所述bshC基因和所述bshBA基因，与P43启动子和淀粉酶终止子连接在一起，构建完整的bshCBA表达元件，所述bshCBA表达元件的排列顺序为：P43启动子—bshC基因—bshBA基因—淀粉酶终止子；

（3）采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对所述bshCBA表达元件进行双酶切得到酶切基因片段，同时，准备质粒pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对所述质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；

（4）将步骤（3）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接得到连接产物，之后将所述连接产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序确认得到过表达质粒pHY-bshCBA；

（5）将步骤（4）得到的过表达质粒pHY-bshCBA转入地衣芽孢杆菌DW2中，以四环素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，即为所述过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌DW2/pHY-bshCBA。

Images