CN104004701B - 一种构建高产5‑氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法 - Google Patents
一种构建高产5‑氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种构建高产5‑氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pACYCDuet‑1过量表达5‑氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶谷氨酰‑tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶的基础上，将来源于大肠杆菌血红素生物合成途径中的尿卟啉原III合酶(uroporphyrinogen III synthase,UROS,hemD编码)及粪卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen III oxidase,CPO,hemF编码)，使用pCDFDuet‑1单独表达或共表达两个酶基因，构建重组菌株。通过发酵验证，单独表达hemD或hemF以及共表达hemD和hemF，ALA产量均明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式为C5O3NH9，分子量为131.13，熔点为149-151℃，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等的关键前体物质。ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已经成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，ALA作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药，在农药领域应用非常广泛，如作为一种无公害的绿色农药、除草剂以及植物生长调节剂等。
目前，ALA合成主要采用化学法合成，最早出现在上世纪50年代，直到20世纪90年代，相关研究才大量开展，并取得了一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AM，hemL编码)催化生成ALA。该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中。
早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，通过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高。
本发明在系统阐述分析大肠杆菌中C5途径(图1)调控机制，及表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA基础上，进一步表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF，实现了ALA产量的进一步提高，且发酵周期明显缩短，降低了生产成本。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其在表达C5途径关键基因hemL(编码谷氨醛氨基转移酶)和hemA(编码谷氨酰-tRNA还原酶)的基础上，共表达来源于大肠杆菌的尿卟啉原III合酶(hemD编码)和/或粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)。
所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述大肠杆菌优选DH5α、JM109、W3110或BL21(DE3)。
所述大肠杆菌进一步优选BL21(DE3)。
所述hemL与hemA优选以pACYCDuet-1表达载体进行共表达，得到表达载体pACYCDuet-1-hemLA。
表达hemD或hemF时，优选将hemD或hemF基因分别通过酶切位点NdeI、XhoI连接pCDFDuet-1，得到重组表达载体pCDFDuet-1-hemD或pCDFDuet-1-hemF。
表达hemD和hemF时，可以共用一个表达载体。优选将hemD与pCDFDuet-1-hemF连接。进一步优选通过酶切位点BamHI和PstI与pCDFDuet-1-hemF连接，得到重组表达载体pCDFDuet-1-hemD-hemF。
本发明还提供一种构建所述大肠杆菌工程菌株的方法，利用pACYCDuet-1表达hemL和hemA，以pCDFDuet-1表达来源于大肠杆菌的尿卟啉原III合酶(hemD编码)和/或粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)，获得高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株。
具体包括以下步骤：
将来源于大肠杆菌的基因hemL与来源于伤寒沙门氏菌的基因hemA通过扩增利用酶切位点BamHI和PstI连接表达载体pACYCDuet-1，获得hemL与hemA基因的共表达载体pACYCDuet-1-hemLA。将来源于大肠杆菌的hemD和hemF基因通过扩增利用酶切位点NdeI和XhoI连接表达载体pCDFDuet-1中，分别得到载体pCDFDuet-1-hemD和pCDFDuet-1-hemF。同时将hemD基因与经BamHI和PstI双酶切的质粒pCDFDuet-hemF连接，得到质粒pCDFDuet-1-hemD-hemF。
将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-1-hemD共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌LAD；将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-1-hemF共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌LAF；将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-hemD-hemF共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌LADF。
本发明要解决的第三个技术问题是应用所述大肠杆菌工程菌发酵生产ALA。
所述大肠杆菌工程菌优选：
LAD:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD或
LAF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF或
LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD-hemF。
所述发酵生产ALA涉及的培养基优选：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH7.0；
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH7.0，装液量20mL/250mL；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O15，MgSO4·7H2O1.0，酵母提取物(Yeast extract)1.0，葡萄糖20，pH7.0。
所述发酵生产ALA的培养条件优选：
菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；
种子培养：平板挑取菌体，37℃，200r/min，根据要求添加氯霉素34μg/mL，链霉素100μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
发酵培养：以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mMIPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素(34μg/mL)以及链霉素(100μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期28-36h。
本发明在表达C5途径关键基因hemL和hemA的基础上，共表达ALA代谢途径的下游基因hemD和/或hemF，取得了意料不到的技术效果：所得大肠杆菌工程菌株LADF在3L发酵罐中能够积累5-氨基乙酰丙酸1800mg/L，有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，从而实现微生物发酵法直接发酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸，缩短发酵周期、降低生产成本。
附图说明
图1：大肠杆菌中ALA C5合成途径。
图2：重组质粒构建酶切电泳图；M：DL 5000Marker；A：pACYCDuet-hemLA；B：pCDFDuet-hemD；C：pCDFDuet-hemF；D,E：pCDFDuet-hemD-hemF。
图3：重组菌摇瓶发酵ALA产量；LA：E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-1；LAD:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD；LAF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF；LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-hemD-hemF。
图4：重组菌LADF发酵过程曲线图；LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-hemD-hemF。
具体实施方式
ALA分析方法：采用Mauzerall和Granick的分光光度法：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸盐缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
培养基：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH7.0；
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH7.0，装液量20mL/250mL；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O15，MgSO4·7H2O1.0，Yeast extract1.0，Glucose20，pH7.0。
培养条件：
菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；
种子培养：平板挑取菌体，37℃，200r/min，根据要求添加氯霉素34μg/mL，链霉素100μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
发酵培养：以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素(34μg/mL)以及链霉素(100μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期28-36h。
实施例1重组质粒的构建及鉴定
(1)重组质粒pACYCDuet-1-hemLA，pCDFDuet-1-hemD，pCDFDuet-1-hemF，及pCDFDuet-1-hemD-hemF的构建
以大肠杆菌基因组为模板获取hemL，hemD，以及hemF，hemA来源于伤寒沙门氏菌
引物如下(下划线部分为酶切位点)
hemL-hemAF:CGCGGATCCATAAAAGGAGGAAAATATATGAGTAAGTCTGAA
hemL-hemAR:TGCACTGCAGCTACTCCAGCCCGAGGCTG
hemD-F:CGCCATATGAGTATCCTTGTCACCCGCC
hemD-R:CCGCTCGAGTTATTGTAATGCCCGTAAAAGCG
hemF-F:CGCCATATGAAACCCGACGCACACC
hemF-R:CCGCTCGAGTTACACCCAATCCCTGACCTTAAT
hemD(2)-F:CGCGGATCCATAAAAGGAGGAAAATATATGAGTATCCTTGTCACCCG
hemD(2)-R:TGCACTGCAGTTATTGTAATGCCCGTAAAAGCG
反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃150s(hemL-hemA)/60s(hemD和hemF)(30个循环)；72℃10min进行PCR反应，并以0.8％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，用限制性内切酶双酶切并纯化后，用T4DNA连接酶与相应的表达载体于16℃过 夜连接，连接产物转化E.coli JM109，挑选阳性克隆子提取质粒并送上海生工测序验证，质粒构建酶切电泳图如图2。
将所得来源于大肠杆菌的基因hemL与来源于伤寒沙门氏菌的hemA通过扩增利用酶切位点BamHI和PstI连接表达载体pACYCDuet-1中，获得hemL与hemA基因的共表达载体pACYCDuet-1-hemLA。将所得来源于大肠杆菌的hemD和hemF基因通过扩增利用酶切位点NdeI和XhoI连接表达载体pCDFDuet-1中，分别得到载体pCDFDuet-1-hemD和pCDFDuet-1-hemF。同时将hemD基因与经BamHI和PstI双酶切的质粒pCDFDuet-1-hemF连接，得到质粒pCDFDuet-1-hemD-hemF。
(2)ALA发酵重组菌株的构建
基本方法是将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-1-hemD共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌LAD。将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-1-hemF共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌LAF。将构建的重组质粒pACYCDuet-1-hemLA与pCDFDuet-hemD-hemF共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌LADF。
实施例2重组菌摇瓶发酵验证
菌株：
LA：E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-1
LAD:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD
LAF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF
LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD-hemF
不同重组大肠杆菌与对照菌进行发酵实验对比。重组菌LAD，LAF以及LADF进行发酵实验，测定ALA产量如图3所示：通过单独以及共同表达hemD和hemF，与对照菌株LA相比，ALA产量均有提高，而且同时表达两个酶基因的情况下ALA的产量最高，为1200mg/L(图3)。
实施例3重组菌LADF3L发酵罐发酵验证
菌株：LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD-hemF。
重组大肠杆菌LADF在3L发酵罐中发酵生产，接种量2％，初始葡萄糖浓度为33g/L，0h添加0.1-0.5mMIPTG诱导以及相应的抗生素，随着时间的变化，10h后ALA开始大量积累，在30hALA产量最高，为1800mg/L，发酵周期明显缩短(图4)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
Claims (5)
1.一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，在串联表达C5途径基因hemL和hemA的基础上，再串联表达编码尿卟啉原III合酶的基因hemD和粪卟啉原III氧化酶的基因hemF；所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，hemA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述hemF的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemL与hemA以pACYCDuet-1为表达载体进行串联表达，得到表达载体pACYCDuet-1-hemL-hemA。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，串联表达hemD和hemF时，所用表达载体是pCDFDuet-1。
4.一种构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，利用pACYCDuet-1串联表达hemL和hemA，以pCDFDuet-1串联表达编码尿卟啉原III合酶的基因hemD和粪卟啉原III氧化酶的基因hemF，转化筛选获得高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemD-hemF。
5.应用权利要求1所述大肠杆菌工程菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，将工程菌株活化后，转接发酵培养基，30-37℃，200r/min培养，发酵周期28-36h。
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