CN105907694A - 一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

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刘幽燕
梁文思
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Abstract

本发明公开了本发明提供一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年05月，保藏号为CGMCC No.7.239。所述的重组大肠杆菌为将氰水合酶基因与表达载体连接，然后将该载体转入大肠杆菌(Escherichia coli)中得到重组菌株。本发明提供的大肠杆菌，可以合成大量高效可溶性表达的氰水合酶，为合成氰水合酶提供了另一条途径；本发明所得氰水合酶纯度高，用于降解无机氰化物效果佳，具有极高的降解率。

Description

一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株重组大肠杆菌及其应用，特别涉及一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
氰在工业生产中应用较广，产生的含氰废水所造成的环境污染急需治理。生物法处理含氰废水具有转化产物无毒无害、不易发生二次污染，建设和运行成本较低，能处理金属络合氰化物等优势。在自然界中超过2000种植物以及一些微生物能产生氰或利用氰。另一方面，氰化氢(HCN)是一种弱酸(pKa＝9.2)，在酸性或中性条件下易形成挥发性HCN，从而可能造成空气污染。而且氰本身对微生物具有毒性，因此从实际应用角度看，只有在高碱性下具有氰耐受性的菌株才有工业应用价值。从目前国内外的研究情况看来，能在碱性条件下降解无机氰化物的菌种并不多，而能耐受高浓度氰的菌种则更少。
与细胞降解相比，利用酶作催化剂处理环境污染物具有反应速度快、效率高、条件温和、能耗低、操作简便等优点，因此酶治理环境污染具有广阔的应用前景。根据目前研究，氰水合酶(cyanide hydratase)和氰水解酶(cyanidase/cyanide dihydratase)是两种较为重要的无机氰降解酶。但是从野生菌株中无法获得大量的降解酶，限制了酶在氰方面的降解。目前Watanabe等从Pseudomonas stutzeri AK61中克隆出氰水解酶cyanidase的基因并成功在大肠杆菌中表达，Jandhyala等也成功克隆和表达了来自Bacillus pumilus C1的氰水解酶基因cynD。国内关于降氰酶的克隆研究报道仅见于乔琳等对一株能以氰化物为唯一碳氮源的铜绿假单胞细菌Pseudomonas aeruginosa KT-C001所产的氰水合酶基因(cya-1)进行了克隆和活性表达的研究，发现 cya-1的表达需要氰化物的诱导。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明提供一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年05月10日，保藏号为CGMCC No.7.239；所述的重组大肠杆菌为将氰水合酶基因与表达载体连接，然后将该载体转入大肠杆菌(Escherichia coli)中得到重组菌株。
其中，所述的氰水合酶基因来源于产碱杆菌(Alcaligenes sp.)DN25；所述的大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，即E.coli BL21。
其中，所述的氰水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。
一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌的构建方法，包含以下操作步骤：
(1)将氰水合酶基因连接到表达载体相应的多克隆位点上；
(2)将步骤(1)中所得表达载体导入大肠杆菌中，即得。
其更详细的步骤为：
(1)将经聚合酶链式反应(PCR)获得的氰水合酶目的基因连接到表达载体相应的多克隆位点上，并转入大肠杆菌DH5α内，经测序验证获得正确的重组质粒；
(2)利用热激法将步骤(1)中所得重组质粒导入大肠杆菌BL21内，即得重组菌株。
其中，步骤(1)中所述的表达载体为pET28a。
一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌，通过诱导剂诱导重组大肠杆菌，可实现目标氰水合酶的高效表达，获得可溶性好及活性高的氰水合酶蛋白，分子量约为38kDa；其诱导条件为OD600为0.6，温度为28℃，诱导剂浓度为0.3mM，诱导时间为12小时；其中，所述的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
其中，上述所得具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌用于对氰化物进行降解，降解反应为在pH值为8.0的磷酸缓冲液中，保持温度为30℃，反应50分钟，氰化物完全被降解。
其中，大肠杆菌内所得氰水合酶利用镍柱亲和层析进行纯化，即依次使用含浓度为10mM、100mM咪唑的缓冲液洗脱，最后经浓度为500mM的咪唑洗脱可获得氰水合酶，纯度达95％以上。
其中，上述所得纯化的氰水合酶用于氰化物降解。
其中，利用纯化的氰水合酶降解氰化物时，降解反应为在pH值为8.0的磷酸缓冲液中，保持温度为30℃，反应50分钟，氰化物完全被降解。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供的大肠杆菌，可以合成大量高效可溶性表达的氰水合酶，为合成氰水合酶提供了另一条途径；
2)本发明所得氰水合酶纯度高，用于降解无机氰化物效果佳，具有极高的降解率。
附图说明
图1本发明菌株构建流程图。
图2本发明菌株的发酵产酶。
图3本发明菌株的最佳pH和温度。
图4本发明菌株的分离纯化电泳图谱。
图5本发明所得氰水合酶水解氰化钾的实验结果。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
1.具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌的构建：
1)用引物1：5`-GCCCATATGATGGCGCATTACCCTAAATTC-3`(SEQ ID NO.2)，引物2：5`-TTCAAGCTTTTACTTCCGCAAGCTCCGAAC-3`(SEQ ID NO.3)对Alcaligenes sp.DN25(Alcaligenes sp.DN25保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.5734)基因组进行PCR扩增，反应条件如表1所示：
表1
其中，步骤(2)进行30个循环，即得目的基因氰水合酶基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示；
2)用限制性内切酶Hind III和NdeI对所得氰水合酶目的基因和表达载体pET28a在37℃下酶切8h；
3)在16℃下用T4连接酶将酶切后的氰水合酶目的基因和表达载体 pET28a连接10h，并转入大肠杆菌DH5α内，经测序验证获得正确的重组质粒，用热激法将所得重组质粒转入表达菌株E.coli BL21(即Escherichia coli BL21)，并涂布于50μg/mL卡纳霉素抗性平板培养12h；
4)用菌落PCR和双酶切从平板筛选阳性克隆并经测序验证，对构建成功的重组菌进行诱导表达12h，经蛋白电泳确定目的蛋白条带为38kDa，可溶性良好。
2.具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌的诱导发酵产酶
将重组大肠杆菌种子液接种于含1‰卡那霉素的新鲜培养基中，在37℃，180rpm下培养至OD600为0.6，加入诱导剂IPTG浓度为0.3mM，再于28℃，180rpm的恒温摇床中培养12h。
3.氰水合酶蛋白分离纯化
用Binding buffer(10mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl,pH 8)重悬菌体，利用高压匀浆机(800bar～1000bar)破碎菌体并以4℃、9000rpm和离心30min获取粗酶液；将粗酶液过先用Binding buffer平衡的镍柱，使用Binding buffer洗掉非目标蛋白，再用Elution buffer A(100mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl,pH 8)进一步洗脱，最后用Elution buffer(500mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl,pH 8)洗脱获得目的蛋白，即得高纯度氰水合酶。
所得纯化的氰水合酶用于氰化物降解，降解反应在pH值为8.0的磷酸缓冲液中，保持温度为30℃，反应50分钟，氰化物完全被降解。
图2表明在本发明工艺条件下的菌株生长曲线，培养7h后菌株生长达到稳定期(实验中通常取稳定期中部的细胞进行实验)，此时可获得具有高活性目标酶的重组大肠杆菌。图3表明纯化所得的氰水合酶降解无机氰化物的最 适条件为pH8.0、温度30℃。图4说明经过分离纯化后，可获得纯度达98％的目标蛋白，其分子量约为38kDa。图5反映氰水合酶对10mM氰化钾的降解进程曲线，由图可见，目标酶降解活力高，10min可快速降解约50％的氰化钾，50min后氰化钾降解完全。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一株具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌，其特征在于：将氰水合酶基因与表达载体连接，然后将该载体转入大肠杆菌(Escherichia coli)中得到重组菌株。
2.根据权利要求1所述具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌，其特征在于：所述的氰水合酶基因来源于产碱杆菌(Alcaligenes sp.)DN25；所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
3.根据权利要求1所述具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌，其特征在于：所述的氰水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一株如权利要求1所述的具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌的构建方法，包含以下操作步骤：
(1)将氰水合酶基因连接到表达载体相应的多克隆位点上；
(2)将步骤(1)中所得表达载体导入大肠杆菌中，即得。
5.根据权利要求1所述具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所述的表达载体为pET28a。
6.一株如权利要求1所述的具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌的诱导发酵产酶的方法，其特征在于：通过诱导剂诱导重组大肠杆菌，可实现目标氰水合酶的高效表达，获得可溶性好及活性高的氰水合酶蛋白；其诱导条件为OD600为0.6，温度为28℃，诱导剂浓度为0.3mM，诱导时间为12小时，诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
7.根据权利要求6所述的诱导发酵产酶的方法诱导所得的具有高表达氰水合酶的重组大肠杆菌用于对氰化物进行降解。
8.根据权利要求6所述诱导发酵产酶的方法，其特征在于：重组大肠杆菌内诱导发酵所得的氰水合酶利用镍柱亲和层析进行纯化，即依次使用含浓度为10mM、100mM咪唑的缓冲液洗脱，最后经浓度为500mM的咪唑洗脱可获得氰水合酶，纯度达95％以上。
9.根据权利要求8所述的诱导发酵产酶的方法，其特征在于：所得的纯化的氰水合酶用于氰化物降解。
10.根据权利要求9所述的诱导发酵产酶的方法，其特征在于：利用纯化的氰水合酶降解氰化物时，降解反应在pH值为8.0的磷酸缓冲液中，保持温度为30℃，反应50分钟。
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汪艳华 等: "产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性", 《应用与环境生物学报》 *
陈焕基: "产碱杆菌DN25的氰代谢机理研究及其降氰酶的克隆和表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

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