WO2004031228A1 - Protein aus penicillium olsonii, das resistenz gegen 2-deoxyglucose verleiht - Google Patents

Protein aus penicillium olsonii, das resistenz gegen 2-deoxyglucose verleiht Download PDF

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WO2004031228A1
WO2004031228A1 PCT/EP2003/010730 EP0310730W WO2004031228A1 WO 2004031228 A1 WO2004031228 A1 WO 2004031228A1 EP 0310730 W EP0310730 W EP 0310730W WO 2004031228 A1 WO2004031228 A1 WO 2004031228A1
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seq
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nucleic acid
dog
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PCT/EP2003/010730
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Irene Kunze
Ute Heim
Gotthard Kunze
Thomas Wartmann
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Sungene Gmbh & Co. Kgaa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/385—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Penicillium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers

Definitions

  • the present invention relates to new proteins which confer resistance to 2-deoxyglucose, nucleic acid sequences coding for said proteins, transgenic expression cassettes comprising said nucleic acid sequences and transgenic organisms transformed with said expression cassettes. Furthermore, the invention relates to methods for the selection of genetically transformed cells using said expression cassettes based on the increase in resistance to 2-deoxyglucose (2-DOG).
  • the introduction of genetic material into target cells is usually only successful for a very limited number of cells in a population or tissue. This requires the distinction and isolation of successfully transformed from non-transformed cells, a process called selection. Traditionally, the selection is carried out by means of a so-called "positive selection", in which the non-transformed cells are either severely damaged or killed and only the transformed cell acquires the appropriate resistance so that it can survive and divide, or only the transformed cell receives a growth advantage.
  • Such a positive selection is usually realized by genes which are resistant to a biocide (for example a herbicide such as p osphinothricin, glyphosate or bromoxynil, a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose (2-DOG; WO 98/45456) or encode an antibiotic such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, G 418, neomycin, - bleomycin or hygomycin).
  • a biocide for example a herbicide such as p osphinothricin, glyphosate or bromoxynil, a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose (2-DOG; WO 98/45456) or encode an antibiotic such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, G 418, neomycin, - bleomycin or hygomycin).
  • a biocide for example a herbicide such as p osphinothricin
  • the gene of the positive selection marker is coupled into the cell with the nucleic acid sequence to be introduced into the cell genome (physically or by means of cotransformation).
  • the cells are then cultivated on a medium under the appropriate selection pressure (i.e. in the presence of an appropriate antibiotic or herbicide), as a result of which the transformed cells have a growth / survival advantage due to the acquired resistance to said selection pressure and can thus be selected.
  • appropriate selection pressure i.e. in the presence of an appropriate antibiotic or herbicide
  • PPT Phosphinothricin acetyltransferases
  • PPT also called Bialop os ® - resistance gene (bar)
  • PPT glutamine synthase inhibitor phosphinothricin
  • EDP synthase genes which confer resistance to the non-selective herbicide Glyphosat® (N- (phosphonomethyl) glyci ⁇ ) (Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate; A literature analysis, p. 48-74 In: Grossbard E and Atkinson D (eds.) The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston).
  • Glyphosate-tolerant EPSPS variants for use as selection markers have been described (Padgette SR et al. (1996) New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready TM gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke SO, ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL).
  • Neomy ⁇ inphosphotransferases confer resistance to antibiotics (aminoglycosides) such as neomycin, G418, hygromycin, paromycin or kanamycin by reducing their inhibitory effect through a phosphorylation reaction (Beck et al. (1982) Gene 19: 327-336).
  • Genes such as the isopentenyl transferase gene (ipt) from Agrobacterium tumefaciens can also be used as so-called "positive" selection markers. They give the transformed cells a growth advantage without killing the non-transformed cells.
  • the ipt gene is a key enzyme in cytokinin biosynthesis. Its overexpression facilitates the regeneration of plants (eg selection on cytokinin-free medium) (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94: 2117-2121).
  • the disadvantage here is that strict regulation of gene expression is required, otherwise a non-optimally controlled cytotoxicity kininbiosynth.ese the success of regeneration or at least the phenotype of the regenerants.
  • Various other positive selection markers include in EP-A 0 601 092.
  • Examples include ß-glucuronidase (in connection with e.g. cytokininglucuronide), mannose-6-phosphate-isomerase (in connection with mannose), UDP-galactose-4-epimerase (in connection with e.g. galactose).
  • 2-deoxyglucose is a non-metabolizable glucose analogue.
  • 2-DOG-6-P inhibits glycolysis and protein biosynthesis, interferes with protein glycosylation and disrupts the biosynthesis of cell wall polysaccharides such as mannans and thus cell wall formation. Phenotypically there is an inhibition of shoot elongation and root formation.
  • the gene D0G R 1 from Saccharomyces cerevisiae codes for a 2-DOG-6-P-phosphatase.
  • the enzyme enables the dephosphorylation of 2-DOG-6-P, which is formed by phosphorylation of 2-deoxyglucose using the plant's own hexokinase, and thus initiates a cyclic detoxification process.
  • This enables selection on a medium containing 2-DOG (EP-A 0 870 836; Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11: 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202) ,
  • This system can be used as a selection marker for the transformation of tobacco and potatoes in particular (Kunze et al. (2001) Mol Breeding 7: 221-227).
  • Types can be used and also only achieve low efficiencies.
  • a new selection marker isolated from a Penicillium olsonii strain, is provided which is able to confer resistance to 2-deoxyglucose (SEQ ID NO: 2).
  • a first object of the invention relates to an amino acid sequence coding for a protein which is capable of conferring resistance to 2-deoxyglucose, the amino acid sequence comprising a sequence selected from the group of sequences consisting of
  • DGRl protein or also Dgrlp.
  • the Dgrlp amino acid sequence codes for a fusion protein from an amino acid sequence coding for a DGRl protein and an amino acid sequence coding for a 2-DOG-6-P-phosphatase.
  • the order in which DGR1 and D0G R 1 are linked can be arbitrary.
  • the fusion protein according to SEQ ID NO: 6 is particularly preferred.
  • nucleic acid sequences which code for said amino acid sequences.
  • the nucleic acid sequence encoding a DGR1 protein comprises a sequence selected from the group of sequences consisting of a) the sequence according to SEQ ID NO: 1, and
  • a nucleic acid sequence encoding a fusion protein according to is particularly preferred SEQ ID NO: 5.
  • the invention further relates to transgenic expression cassettes for expressing the nucleic acid sequences according to the invention in host organisms or cells, cell cultures, organs, tissues or propagation material (such as seeds or fruits) derived therefrom.
  • Said transgenic expression cassettes include:
  • At least one promoter which is capable of regulating transcription in at least one host organism
  • SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent fragment thereof which have at least 60% homology with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or the functionally equivalent fragment thereof,
  • the transgenic expression cassettes comprise a sequence coding for a fusion protein from the DGRI protein from Penicillium olsonii according to SEQ ID NO: 2 and the D0G R 1 gene product from Saccharomyces cerevisiae according to SEQ ID NO: 4.
  • the fusion protein is particularly preferred according to SEQ ID NO: 6.
  • the transgenic expression cassette can, in functional linkage with the nucleic acid sequence to be expressed, comprise further regulatory sequences which can serve, for example, as transcription termination and / or polyadenylation signals in the respective host organism.
  • the expression cassette can also contain further functional elements such as further selection markers (eg D0G R 1).
  • the invention further relates to methods for selecting transgenic organisms or cells, comprising the following steps:
  • promoter a) and said nucleic acid sequence b) are functionally linked to one another, in combination with at least one further nucleic acid sequence in cells of a 2-deoxyglucose-sensitive cell population, and
  • transgenic expression cassettes are used in the selection method according to the invention which encode a sequence for a fusion protein from the DGRI protein from Penicillium olsonii according to SEQ ID NO: 2 and a 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase, preferably the D0G R 1 gene product from Saccharomyces cerevisiae according to SEQ ID NO: 4.
  • the fusion protein according to SEQ ID NO: 6 is particularly preferred.
  • further sequences such as, for example, "linkers" or the like can be located.
  • a 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase can also be expressed parallel to the expression of one of the DGR1 proteins according to the invention, without a fusion protein from both having to be present.
  • the 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphate can be expressed from a separate expression cassette.
  • the DGR1 protein and the 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase are preferably expressed using a bidirectional promoter.
  • IRES internal ribosome entry sequence
  • the DGR1 protein from the fungus Penicillium olsonii is able to confer efficient resistance to 2-DOG.
  • the expression of the DGR1 protein can therefore be used for selection in the context of transformations. In principle, it is suitable for the selection of all host organisms on which 2-DOG can have a toxic effect.
  • the usability in the context of yeast and plant transformation was demonstrated (Examples 2 and 3).
  • the DGR1 protein proved to be more efficient than the one already knew D0G R 1 gene product from Saccharomyces cerevisiae and thus represents a significant improvement in the selection process described for this protein.
  • “Functional equivalents” in relation to the DGR1 protein according to SEQ ID NO: 2 means in particular natural or artificial mutations of the DGR1 protein according to SEQ ID NO: 2 and homologous polypeptides from other organisms, preferably from fungi, which have the same essential Have properties.
  • Essential properties of the DGR1 protein described by SEQ ID NO: 2 means in particular the property of resistance to transgenic expression in an organism (preferably a plant organism) or a cell, cell culture, organ, tissue or propagation material derived therefrom To be able to effect 2-DOG, this resistance preferably not being caused by dephosphorylation of 2-DOG-6-P.
  • At least one property selected from the following group also applies as essential properties:
  • Functional equivalents from other organisms for example from plant organisms whose genomic sequence is known in whole or in part, such as, for example, from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum or Solanum tuberosum - can e.g. by database search in sequence databases such as GenBank or by screening gene or cDNA banks - e.g. using the sequence according to SEQ ID NO: 1 or a part thereof as a search sequence or probe. Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more amino acid residues.
  • Said functional equivalents preferably have a homology of at least 60%, particularly preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, most preferably at least 95% of the DGRI protein with SEQ ID NO: 2.
  • the homology extends over at least 30 amino acids, preferably at least 60 amino acids, particularly preferably at least 90 amino acids, most preferably over the entire length of the DGRI protein according to SEQ ID NO: 2.
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • a sequence which has a homology of at least 80% on a protein basis with the sequence SEQ ID NO: 2 is understood to mean a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above parameter set, has a homology of has at least 80%.
  • Functional equivalents also include those proteins which are encoded by nucleic acid sequences which have a homology of at least 60%, particularly preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, most preferably at least 95% to the nucleic acid sequence with SEQ ID NO: 1 , The homology extends over at least 100 bases, preferably at least 200 bases, particularly preferably at least 300 bases, most preferably over the entire length of the sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Homology between two nucleic acid sequences is understood to mean the identity of the two nucleic acid sequences over the respective sequence length, which by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff) using the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • a sequence which has a homology of at least 80% on a nucleic acid basis with the sequence SEQ ID NO: 1 is understood to mean a sequence which in a Comparison with the sequence SEQ ID NO: 1 according to the above program algorithm with the above parameter set has a homology of at least 80%.
  • Functional equivalents also include those proteins which are encoded by nucleic acid sequences which, under standard conditions, hybridize with one of the nucleic acid sequences described by SEQ ID NO: 1, the nucleic acid sequence complementary to this or parts of the abovementioned and the essential properties of the protein according to SEQ ID NO: 2 exhibit.
  • standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, in Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C, preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Hybridization conditions can be selected from the following conditions, for example:
  • Washing steps can be selected, for example, from the following conditions:
  • Functional equivalents furthermore comprise fusion proteins from one of the DGR1 proteins according to the invention and sequences which code for transit peptides (so-called "targeting" peptides).
  • the expression of said fusion proteins can thus be carried out for any desired cell compartment, e.g. the endomembrane system, the vacuole, the chloroplasts, apoplasts or other plastids, the mitochondria, the endoplasmic reticulum (ER), the cell nucleus, the oil corpuscles or other compartments.
  • signal peptide sequences are known (e.g.
  • a transgenic expression cassette can also be inserted directly into the genome of the organelles (e.g. the plastids or mitochondria).
  • the organelles e.g. the plastids or mitochondria.
  • Appropriate methods are familiar to the person skilled in the art and are based, for example, on targeted insertion into the plastid DNA using homologous recombination.
  • the person skilled in the art preferably uses appropriate promoters which are functional in the organelles.
  • expression cassette generally means constructions in which a nucleic acid sequence to be expressed is functionally linked to at least one genetic control sequence - preferably a promoter sequence.
  • Expression cassettes preferably consist of double-stranded DNA and can have a linear or circular structure. They can be in various forms, for example as separate molecules or integrated into the genome of a cell.
  • Transgene means - for example with respect to an expression cassette (or an expression vector or transgenic organism comprising this) all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods and in which either
  • nucleic acid sequence coding for a Dgrlp protein for example the sequence according to SEQ ID NO: 1
  • the promoter sequence according to the invention contained in the expression cassettes is preferably heterologous with respect to the nucleic acid sequence which is functionally linked to it and which is to be expressed transgenically.
  • heterologous means that the nucleic acid sequence coding for a Dgrlp protein does not code for the gene which is naturally under the control of said promoter.
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin or the presence in a genomic library.
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, particularly preferably at least 1000 bp, very particularly preferably at least 5000 bp.
  • a naturally occurring expression construct for example the naturally occurring combination of the promoter of a gene coding for a Dgrlp protein according to SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof with its corresponding coding sequences becomes a transgenic expression construct if said expression cassette is not replaced by natural processes (such as mutagenesis) are changed or introduced into a heterologous organism. Corresponding methods for mutagenesis are described (US 5,565,350; WO 00/15815).
  • transgenic expression “transgenic expression”), “transgene” preferably means all those expressions which have been implemented using a transgenic expression cassette, transgenic expression vector or transgenic organism - in accordance with the definitions given above.
  • heterologous means that said nucleic acid sequence naturally does not occur in said cell.
  • heterologous means that the nucleic acid sequence does not code for the gene which is naturally under the control of said promoter.
  • Gene means all of the genetic information of a cell and includes both the genetic information of the cell nucleus and that of the plastids (e.g. chloroplasts) and mitochondria. However, “genome” preferably means the genetic information of the cell nucleus (for example of the nuclear chromosomes).
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of a promoter with a nucleic acid sequence to be transcribed (for example coding for a DGR1 protein) and possibly further genetic control sequences or regulatory elements such as a terminator and / or polyadenylation signals such that each of the regulatory elements can perform its function in the transcription of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences. Function can, for example, control the
  • Control includes, for example, the initiation, increase, control or suppression of expression, ie transcription and, if necessary, translation. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as, for example, enhancer sequences, can also perform their function on the target sequence from more distant positions or even from other DNA molecules. Arrangements are preferred in which the nucleic acid sequence to be transcribed is positioned behind the sequence which acts as a promoter, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • An expression cassette according to the invention is preferably produced, for example, by direct fusion of a nucleic acid sequence which acts as a promoter with a nucleic acid sequence to be expressed (for example coding for a DGR1 protein).
  • an expression cassette is also to be understood to mean constructions in which, for example, a nucleic acid sequence (for example coding for a DGR1 protein) is placed behind an endogenous promoter that the same effect occurs. This approach also leads to an expression cassette according to the invention.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences ensure, for example, transcription and, if necessary, translation in prokaryotic or eukaryotic organisms. Genetic control sequences are described, for example, in “Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)” or “Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton , Florida, eds.: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108 "and the citations cited therein.
  • Advantageous control sequences for the expression cassettes or vectors according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, lpp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara -, SP6, 1-PR or contained in the 1-PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria. Further advantageous control sequences are contained, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 or ADH.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, lpp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara -, SP6, 1-PR or contained in the 1-PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous control sequences are contained, for example, in the
  • Vectors such as the TK promoter, the RSV 3 'LTR promoter, the CMV promoter, the SV40 "early” or late "promoter are suitable for expression in vertebrates, preferably in mammals.
  • Other promoters are known to the person skilled in the art Inducible promoters suitable for use in vertebrates, preferably in
  • Mammals include, for example, the Tet promoter / repressor inducible or repressible by tetracycline or derivatives, the dexamethasone inducible MMTV-LTR promoter, the Drosophila minimal "heat shock” promoter inducible by Ecdysone or the analog Ponasterone A (in the context of e.g. pVgRXR expression system; Invitrogen, Inc.).
  • Genetic control sequences include functional promoters, particularly in plants.
  • any promoter which can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants is suitable as preferred promoter for the expression cassettes.
  • the expression cassettes according to the invention preferably comprise a promoter 5 ′ upstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically and a terminator sequence 3 ′ downstream as an additional genetic control sequence, as well as optionally other customary regulatory elements, in each case functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
  • Plant-specific promoter basically means any promoter that can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants or plant parts, cells, tissues, cultures.
  • the expression can, for example, be constitutive, inducible or development-dependent. Preferred are:
  • Constant promoters means those promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a relatively long period of plant development, preferably at all times during plant development (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202).
  • a plant promoter or a promoter which is derived from a plant virus or another plant pathogen (for example Agrobacterium) is preferably used in particular.
  • the 35S- are particularly preferred.
  • CaMV cauliflower mosaic virus promoter (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al.
  • the expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter (review article: Gatz et al. (1997) Annu).
  • promoters e.g. the PRPl promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443)
  • a benzenesulfonamide-inducible promoter (EP 0 388 186), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), an abscisic acid-inducible promoter (EP 0 335 528) and a ethanol or cyclohexanone inducible promoter (WO 93/21334) can also be used
  • GST-II-27 the promoter of the glutathione-S-transferase isoform II gene (GST-II-27), which is administered by exogenously applied safeners such as e.g. N, N-diallyl-2,2-dichloroacetamide can be activated (WO 93/01294) and is functional in numerous tissues of both monocotyledons and dicotyledons.
  • Constitutive promoters are particularly preferred.
  • Genetic control sequences also include other promoters, promoter elements or minimal promoters that express
  • Genetic control sequences can, for example, also result in tissue-specific expression depending on certain stress factors.
  • Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH (1991) J Biol Chem
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes such as, for example, the actin-1 intron, or the Adhl-S introns 1, 2 and 6 (general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5'-untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al.
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially contain T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens.
  • Examples of particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator (Depicker A et al (1982) J Mol Appl Genet 1: 561-573), as well the terminators of soybean actin, RUBISCo or alpha-amylase from wheat (Baulcombe DC et al (1987) Mol Gen Genet 209: 33-40).
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as, for example, E. coli bacteria.
  • plastid-specific promoters are preferred for the targeted expression in the plastids.
  • Suitable promoters are described, for example, in WO 98/55595 or WO 97/06250. These include the rpo B promoter element, the atoB promoter element, the clpP promoter element (see also WO 99/46394) or the l ⁇ SrDNA promoter element. Viral promoters are also suitable (WO 95/16783).
  • Targeted plastid expression can also be achieved if, for example, a bacterial or bacteriophage promoter is used, the resulting expression cassette is inserted into the plastid DNA and the expression is then expressed by a fusion protein consisting of a bacterial or bacteriophage polymerase and a plastid transit peptide , A corresponding method is described in US 5,925,806.
  • the expression cassette can advantageously contain one or more so-called "enhancer sequences" functionally linked to the promoter, which enable increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome.
  • Methods such as cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible, removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal using the cre recombinase.
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be transcribed, can preferably be integrated in an expression vector and introduced into the eukaryotic cell or organism by, for example, transformation - according to one of the methods described below.
  • the subsequent expression can be transient or else - preferably - take place stably after insertion (for example using selection markers) of the expression cassettes into the genome.
  • Further expression vectors which are suitable in the context of the invention are described below by way of example in the context of the transformation method.
  • the expression cassettes used in the process according to the invention and / or the expression vectors derived from them can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the expression cassettes and / or the expression vectors or organisms derived from them. Examples include, but are not limited to:
  • Selection marker means all those nucleic acid or protein sequences whose expression (ie transcription and possibly translation) gives a cell, tissue or organism a different phenotype than an untransformed one. Selection marker includes, for example, those nucleic acid or protein sequences, the expression of which gives a cell, tissue or organism an advantage (positive selection marker) or disadvantage (negative selection marker) over cells which do not express this nucleic acid or protein. Positive selection markers work, for example, by detoxifying a substance that has an inhibitory effect on the cell (e.g. antibiotic / herbicide resistance), or by forming a substance that enables the plant to improve regeneration or increase growth under the selected conditions (for example nutritive Markers, hormone-producing markers such as ipt; see below).
  • a substance that has an inhibitory effect on the cell e.g. antibiotic / herbicide resistance
  • hormone-producing markers such as ipt; see below.
  • positive selection marker includes mutated proteins or RNAs that are not sensitive to a selective agent (for example, 16S rRNA mutants that are insensitive to spectinomycin).
  • Negative selection markers work, for example, in that they catalyze the formation of a toxic substance in the transformed cells (for example the codA gene) and thus damage or kill the transformed cells.
  • selection markers can also include reporter proteins, insofar as these are suitable for distinguishing transformed from untransformed cells, tissues or organs (for example by coloring or another detectable phenotype).
  • the expression cassettes can (e.g. to further increase the efficiency of the selection method according to the invention) comprise additional positive selection markers.
  • Appropriate proteins and sequences as well as selection methods are familiar to the person skilled in the art.
  • Preferred are selectable markers which give the successfully transformed cells resistance to a biocide (for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate or bromoxynil), a metabolism inhibitor (for example 2-deoxyglucose; WO 98/45456) or an antibiotic (for example tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin or Hygromycin) and thus enable the selection of the transformed cells from untransformed ones.
  • a biocide for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate or bromoxynil
  • a metabolism inhibitor for example 2-deoxyglucose; WO 98/45456
  • an antibiotic for example tetracycline, Amp
  • PPT phosphinothricin acetyltransferases
  • PPT also Bialophos ® resistance (bar)
  • PPT glutamine synthase inhibitor
  • the bar gene coding for a phosphinothricinacetyltransferase (PAT) can be obtained, for example, from Streptomyces hygroscopicus or S. viridochromogenes can be isolated.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
  • Glyphosat® degrading enzymes such as Glyphosate oxidoreductase (gox gene product).
  • GOX catalyzes the cleavage of a C-N bond in glyphosate, which is thus converted to aminomethylphosphonic acid (AMPA) and glyoxylate.
  • AMPA aminomethylphosphonic acid
  • GOX can do one
  • Neomycin phosphotransferases confer resistance to antibiotics (aminoglycosides) such as neomycin, G418, hygromycin, paromomycin or kanamycin by reducing their inhibitory effect through a phosphorylation reaction.
  • antibiotics aminoglycosides
  • the nptll gene is particularly preferred. Sequences can be obtained from GenBank (GenBank Acc.-No: AF080390; AF080389).
  • the gene is already part of numerous expression vectors and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (GenBank Acc.-No: AF234316; AF234315; AF234314).
  • nptll gene codes for an aminoglycoside-3'0-phosphotransferase from E. coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19: 327-336).
  • the gene D0G R 1 was isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836). It codes for one
  • 2-D0G-6-P-phosphatase conferring resistance to 2-DOG (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11: 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202, sequence: GenBank Acc.-No.: NC001140; position 194799 to 194056).
  • sulfonylurea and imidazolinone tolerant acetolactate synthases, which confer resistance to the herbicide classes mentioned.
  • the active substances imazamethabenz-methyl, imazzamox, imazapyr, imazaquin, imazethapyr may be mentioned as examples of imidazolinone herbicides.
  • Examples of sulfonylurea herbicides are amidosulforon, azimsulfuron, chlorimuronethyl, chlorosulfuron, cinosul Solutionson, imazosulforon, oxasulforon, prosulforon, rimsulforon, sulfosulforon. Numerous other active substances of the classes mentioned are known to the skilled worker.
  • Nucleic acid sequences such as the sequence stored under GenBank Acc-No .: X51514 are suitable for the Arabidopsis thaliana Csr 1.2 gene (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18 (8): 2188) , Imidazolinone tolerant acetolactate synthases are also described under GenBank Acc. -No. : AB049823, AF094326, X07645, X07644, A19547, A19546, A19545, 105376, 105373, AL133315.
  • Hygromycin phosphotransferases confer resistance to the antibiotic hygromycin (e.g. GenBank Acc.-No .: X74325).
  • the gene is part of numerous expression vectors (e.g. GenBank Acc. -No.: AF294981; AF234301; AF234300; AF234299; AF234298; AF354046; AF354045) and can be used using the Processes known to those skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) can be isolated from these.
  • chloramphenicol chloramphenicol acetyl transferase
  • tetracycline e.g. GenBank Acc. -No.: X65876
  • Streptomycin e.g. GenBank Acc. -No.: AJ278607
  • Zeocin e.g. comprised by GenBank Acc.-No .: L36849
  • Ampicillin ß-lactamase gene; Datta N, Rich ond MH. (1966) Biochem J 98 (l ): 204-9; Heffron F et al (1975) J Bacteriol 122: ' 250-256
  • ipt gene such as the isopentenyl transferase from Agrobacterium tumefaciens (strain: P022) (Genbank Acc.-No.: AB025109).
  • the ipt gene is a key enzyme in cytokinin biosynthesis. Its overexpression facilitates the regeneration of plants (e.g. selection on cytokinin-free medium).
  • the procedure for using the ipt gene is described (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94: 2117-2121; Ebinuma, H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
  • EP-A 0 601 092 Various other positive selection markers that give the transformed plants a growth advantage over non-transformed ones, and methods for their use include described in EP-A 0 601 092. Examples include ⁇ -glucuronidase (in connection with, for example, cytokininglucuronid), mannose-6-phosphate isomerase (in connection with mannose), UDP-galactose-4-epimerase (in connection with, for example, galactose), with mannose-6-phosphate isomerase being particularly preferred in connection with mannose.
  • ⁇ -glucuronidase in connection with, for example, cytokininglucuronid
  • mannose-6-phosphate isomerase in connection with mannose
  • UDP-galactose-4-epimerase in connection with, for example, galactose
  • mannose-6-phosphate isomerase being particularly preferred in connection with mannose.
  • a selection marker which is functional in plastids preference is given in particular to those which are resistant to spectinomyein, streptomycin, kanamycin, lincomycin, gentamycin, hygromyein, methotrexate, bleomycin, phleomycin, blasticidin, sulfonamide, phosphinotricin, chlorosulfuron, bromoxymil, Add glyphosate, 2, 4-datrazine, 4-methyltryptophan, nitrate, S-aminoethyl-L-cystein, lysine / threonine, aminoethyl cysteine or betaine aldehyde.
  • aadA a fusion of aadA and GFP, described in Khan MS & Maliga P (1999) Nature Biotech 17: 910-915) are particularly preferred.
  • the aadA gene product is very particularly preferred (Svab Z and Maliga P (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90: 913-917).
  • Negative selection markers enable the selection of organisms with successfully deleted sequences that comprise the marker gene (Koprek T et al. (1999) Plant J 19 (6): 719-726).
  • negative selection markers preferably selected from the group of the above-mentioned marker protein genes
  • the marker introduced as a functional element preferably being a different one from that already in the plant cell present marker protein genes.
  • concentrations of antibiotics, herbicides, biocides or toxins used for the selection must be adapted to the respective test conditions or organisms.
  • Examples of plants to be mentioned are kanamycin (Km) 30 to 100 mg / L, hygromycin B 40 mg / L, phosphinothricin (Ppt) 6 mg / L, spectinomycin (Spec) 500 mg / L.
  • Reporter genes code for easily quantifiable proteins and thus guarantee an assessment of the transformation efficiency, the expression site or via their own color or enzyme activity
  • Green fluorescent protein (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5): 912-8; Sheen et al. (1995 ) Plant J 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94 (6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228)
  • Origins of replication which ensure an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli.
  • Examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ,
  • Elements for example “border sequences”, which enable an agrobacterium-mediated transfer into plant cells for the transfer and integration into the plant genome, such as for example the right or left border of the T-DNA or the vir region.
  • MCS Multiple cloning regions
  • the D0G R 1 gene (see above) is particularly preferred as an additional functional element.
  • the parallel expression of the DOG R 1 gene product can significantly increase resistance to 2-DOG.
  • the parallel expression can be implemented in the form of two separate marker proteins (D0G R 1 gene product in addition to DGR-1) or in the form of a DOG- R 1 / DGR-1 fusion protein (see above), the latter embodiment being preferred since, for example, only requires an expression cassette.
  • the invention further relates to transgenic cells or organisms which contain one of the nucleic acid sequences, expression cassettes or expression vectors according to the invention.
  • the cell can be derived from or contained in an organism. But it can also be unicellular organisms such as microorganisms.
  • the cell can be prokaryotic or eukaryotic in nature.
  • the selection method according to the invention is preferably applied to 2-DOG-sensitive host organisms, most preferably to 2-DOG-sensitive bacteria, fungi, yeasts, animal or plant organisms. These are particularly preferred as the subject of the invention.
  • the invention also includes other organisms (such as, for example, prokaryotic organisms) which contain the expression systems according to the invention, for example for the purpose of vector production.
  • Procaryotic organisms for example agrobacteria, can also advantageously be used as vehicles for the transformation of, for example, plant organisms.
  • Preferred prokaryotes are above all bacteria such as bacteria of the genus Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostridium, Propionibacterium, Butyrivibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, Colpidomhecium, Mortodella, Mortierella Nobacteria, for example, of the genus Synechocystis.
  • Particularly preferred are microorganisms which are capable of infecting plants and thus of transmitting the constructs according to the invention.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the type Agrobacterium tumefaciens.
  • eukaryotic cells and organisms includes plant and animal, non-human organisms and / or cells and eukaryotic microorganisms such as yeasts, algae or fungi.
  • a corresponding transgenic organism can be introduced, for example, by inserting the appropriate expression cassette or expression vector into a zygote, stem cell, proto- plast or another suitable cell derived from the organism.
  • Animal organism means non-human vertebrates or invertebrates.
  • Preferred vertebrates include, for example, fish species, non-human mammals such as cattle, horses, sheep, goats, mice, rats or pigs, and birds such as chicken or goose.
  • Preferred animal cells include CHO, COS, HEK293 cells.
  • Invertebrates include nematodes or other worms as well as insects.
  • Invertebrates include insect cells such as Drosophila S2 and Spoptera Sf9 or Sf21 cells.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, Table 6 described mushrooms.
  • the filamentous Hemiascomycet Ashbya gossypii is particularly preferred.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, Hansenula, Yarrowia, Arxula or Pichia, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha or Pichia pastoris (ATCC Accession No. 201178) are particularly preferred.
  • Plant cells and plant organs are particularly preferred.
  • plant cell means any type of cells which are derived from or are present in a plant organism.
  • the term includes, for example, protoplasts, callus or cell cultures, microspores, pollen, cells in the form of tissues such as leaves, meristems, roots, etc.
  • Plant organism includes any organism that is capable of photosynthesis, as well as the cells, tissues, parts or reproductive material derived from it (such as seeds or fruits). Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Annual, perennial, monocot and dicot plants and gymnosperms are preferred.
  • Plant in the context of the invention means all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Included under the term are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts derived therefrom, propagation material (for example tubers, seeds or fruits), plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell culture ren, as well as all other types of groupings of plant cells to functional or structural units. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Keimling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant includes all annual and perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants and includes, by way of example but not by way of limitation, those of the genera Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoskyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Penniseum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lol
  • Plants from the following plant families are preferred: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rubaceaeae, Rosaceaeaea, Rosaceaeaea Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
  • Preferred monocotyledonous plants are selected in particular from the monocotyledonous crop plants, such as, for example, the family of the Gramineae such as alfalfa, rice, maize, wheat or other types of cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats as well as sugar cane and all types of grasses.
  • the family of the Gramineae such as alfalfa, rice, maize, wheat or other types of cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats as well as sugar cane and all types of grasses.
  • the invention is particularly preferably applied to dicotyledonous plant organisms.
  • Preferred dicotyledonous plants are selected in particular from the dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes or calendula and others
  • Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini and others
  • - Leguminosae especially the genus Glycine, especially the type max (soybean) as well as alfalfa, peas, beans or peanuts and others
  • Rubiaceae preferably of the subclass Lamiidae such as Coffea arabica or Coffea liberica (coffee bush) and others,
  • - Solanaceae especially the genus Lycopersicon, especially the type escule tum (tomato), the genus Solanum, especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and the genus Capsicum, especially the species annum (pepper) as well as tobacco and others more,
  • Sterculiaceae preferably of the subclass Dilleniidae such as Theobroma cacao (cocoa bush) and others,
  • Theaceae preferably of the subclass Dilleniidae, such as, for example, Camellia sinensis or Thea sinensis (tea bush) and others,
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae, cyanobacteria and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella. Synechocystis is particularly preferred.
  • rapeseed which are suitable for oil production, such as, for example, rapeseed, sunflower, sesame, safflower (Carthamus tincorius), olive tree, soybean, corn, peanut, castor bean, oil palm, wheat, cocoa or various types of nuts such as wise walnut, coconut or almond.
  • dicotyledonous plants in particular rapeseed, soya and sunflower, are particularly preferred.
  • Plants used for starch production such as corn, wheat or potatoes.
  • Plants which are used as food and / or feed and / or crop and in which resistance to pathogens would be advantageous such as barley, rye, rice, potatoes, cotton, flax, flax.
  • Plants that can be used to produce fine chemicals such as vitamins and / or carotenoids, such as rape.
  • Cell population means any group of cells which can be subjected to a transformation in the context of the present invention and from which transgenic cells transformed by the method according to the invention can be obtained and isolated. Said population can also be, for example, a tissue, a cell culture, etc.
  • 2-DOG sensitive host organism or "2-DOG sensitive cell population” means in the context of the selection process according to the invention all those of the above-mentioned organisms and cells derived from them, to which 2-DOG directly or indirectly (for example by a through the Host organism produced 2-DOG metabolites) can have a toxic effect.
  • Toxic effect has a measurable, negative influence on the physiology of an organism (e.g. a plant) or a cell derived from it and can thereby include symptoms such as, but not limited to, for example, a reduced or disturbed growth, a reduced or disturbed photosynthesis rate, a decreased or disturbed cell division , a diminished or disturbed membrane formation, a diminished or disturbed rung elongation, a diminished or disturbed regeneration of a complete organism (eg a plant) from cell culture or callus etc.
  • the cells successfully transformed by means of the method according to the invention have a growth advantage or selection advantage under the action of 2-DOG compared to the non-transformed ones.
  • the advantage in terms of growth or selection is to be understood broadly and means, for example, the fact that said transformed cells are able to form shoots and / or can be regenerated into complete plants, whereas the Untransformed cells cannot do this or can only do so with a significant delay.
  • the toxic concentrations of 2-DOG which are advantageous for achieving a toxic effect can vary depending on the organism, type of cell or tissue, stage of development, etc. In particular, the toxic concentration can also depend on cell culture conditions such as the availability of additional carbon sources (e.g. metabolizable carbohydrates). Furthermore, the 2-DOG concentration used should not be chosen too high, since otherwise an efficient detoxification may not be guaranteed. As a rule, 2-DOG concentrations in a range from approximately 10 to 5000 mg / 1, preferably 20 to 2000 mg / 1, particularly preferably 50 to 1000 mg / 1, most preferably 100 to 500 mg / 1 can be used.
  • “Selection” means the identification and / or isolation of successfully transformed plant cells from a population of non-transformed cells using the method according to the invention. It is not absolutely necessary that the selection is made directly after the transformation with the transformed cells. It is also possible to make the selection only at a later point in time, even with a later generation of the plant organisms resulting from the transformation (or cells, tissues, organs or propagation material derived therefrom).
  • Arabidopsis plants can be used directly with e.g. The vacuum infiltration method can be transformed (Clough S & Bent A (1998) Plant J 16 (6): 735-43 / Bechtold N et al. (1993) CR Acad Sei Paris 1144 (2): 204-212) and result as a result of transgenic seeds which can then be exposed to the selection.
  • the further nucleic acid sequence is transformed "in combination with" the expression cassette for the DGR1 protein is to be understood broadly and means that at least one further nucleic acid sequence and at least one of the said transgenic expression cassettes are functional, physico-chemical or otherwise are coupled, so that the presence of the expression cassette in a cell - and the associated selection advantage - indicates the parallel presence of the further nucleic acid sequence as probable.
  • the further nucleic acid sequence and the expression cassette can preferably, but not necessarily, be part of a single nucleic acid construct (for example a transformation vector). However, they can also be separated, for example as part of a Co-transformation are introduced and also perform their function in the context of the method according to the invention.
  • insertion comprises all methods which are suitable for directly or indirectly inserting a nucleic acid sequence (for example an expression cassette according to the invention) into an organism (for example a plant) or a cell, compartment, tissue, organ or propagation material ( as seeds or fruits) thereof, or generating it therein '.
  • the introduction can lead to a temporary (transient) presence of said nucleic acid sequence or else to a permanent (stable) one.
  • Introducing includes, for example, methods such as transfection, transduction or transformation. Depending on the host organism, the organisms used in the processes are grown or cultivated in a manner known to those skilled in the art.
  • transgenic expression cassettes can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or else agrobacteria.
  • the transgenic expression cassettes can be inserted into the vector (preferably a plasmid vector) via a suitable restriction site.
  • the resulting vector can first be introduced into E. coli and amplified. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant vector is obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
  • Preferred vectors are those which enable stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • a transformed organism or a transformed cell or tissue
  • the corresponding DNA eg the expression vector
  • RNA be introduced into the corresponding host cell.
  • transformation or transduction or transfection
  • the DNA or RNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion.
  • the DNA can also be obtained by protoplast fusion with other DNA-containing units such as minicells, Cells, lysosomes or liposomes occur.
  • Electroporation is another suitable method for introducing DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse. Appropriate methods are described (for example in Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111- 116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985 ) Science 227: 1229-1231; De-Block et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for
  • Preferred vectors for expression in E. coli are pQE70, pQE60 and pQE-9 (QIAGEN, Inc.); pBluescript vectors, Phagescript vectors, pNH8A, pNHl ⁇ a, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc.).
  • Preferred vectors for expression in mammalian cells include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl and pSG (Stratagene Inc.); pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (Pharmacia Biotech, Inc.).
  • inducible vectors examples include pTet-tTak, pTet-Splice, pcDNA4 / T0, pcDNA4 / TO / LacZ, pcDNA6 / TR, pcDNA4 / TO / Myc-His / LacZ, pcDNA4 / TO / Myc-His A, pcDNA4 / TO / Myc -His B, pcDNA4 / T0 / Myc-His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc.) or the pMAM series (Clontech, Inc .; GenBank Accession No.: U02443). These already provide the inducible regulatory control element, for example for chemical, inducible expression.
  • Vectors for expression in yeast include, for example, pYES2, pYDl, pTEFl / Zeo, pYES2 / GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, PHIL-D2, PHIL-Sl, pPIC3SK, pPIC9K, and PA0815 (Invitro- , Inc.).
  • Cloning vectors and techniques for the genetic manipulation of ciliates and algae are known to the person skilled in the art (WO 98/01572; Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1 (3): 239-251; Dunahay et al. (1995) J Phycol 31: 10004 -1012).
  • processes similar to those for the "direct" transformation of plant cells are to be used for the transformation of animal cells or of yeast cells.
  • processes such as the transformation mediated by calcium phosphate or liposomes or else electroporation are preferred.
  • Various methods and vectors for introducing genes into the genome of plants and for regenerating plants from plant tissues or plant cells are known (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, p. 71 -119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, ed.: Kung and Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al.
  • PACYC184 etc. can be used. If entire plants are to be regenerated from the transformed cells, then it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
  • a transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium (for example EP 0 116 718), viral infection using viral vectors (EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161) or pollen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611).
  • Agrobacterium for example EP 0 116 718
  • viral infection using viral vectors
  • viral vectors EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161
  • pollen EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611
  • the transformation is preferably carried out by means of agrobacteria which contain "disarmed” Ti plasmid vectors, their natural ability for gene transfer to plants being used (EP-A 0 270 355; EP-A 0 116 718). 5
  • Agrobacterium transformation is widely used for the transformation of dicotyledons, but is also increasingly being applied to monocotyledons (Toriyama et al. (1988) Bio / Technology 6: 1072-1074; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep 7: 379-384; Zhang
  • T-DNA transferred DNA
  • binary vectors can also be transferred to plants by Agrobacterium and integrated into their genome.
  • the Agrobacterium-mediated transformation is best suited for dicotyledonous, diploid plant cells, whereas the direct transformation techniques are for everyone
  • 35 cell types are suitable.
  • the expression cassette is to be integrated into special plasmids, either into an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or into a binary vector.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in Agrobacterium are preferably used. They usually contain a selection marker gene " and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA limiting sequence. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187) in this case, the agrobacterium acting as the host organism should already contain a plasmid with the vir region, which is necessary for the transfer of the T-DNA to the plant cell.
  • An agrobacterium transformed in this way can be used for the transformation of plant cells.
  • DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP-A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277- 287)
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al. (1984) Nucl Acids R es 12: 8711), pBinAR, pPZP200 or pPTV.
  • the agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g. of rapeseed can be used, for example, by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • agrobacteria The transformation of plants by agrobacteria is described (White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R Wu, Academic Press, p. 15 -38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, pp.
  • transgenic plants From the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces, transgenic plants can be regenerated in a known manner which contain the expression systems according to the invention described above in an integrated manner.
  • Stably transformed cells ie those which contain the introduced DNA integrated into the DNA of the host cell, can (or else also on the basis of the selection method according to the invention using other selectable markers (see above) that may be included in the expression cassettes or expression vectors according to the invention, and be isolated (ie selected).
  • Transformed cells that express such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of 2-DOG (or possibly an appropriate antibiotic or herbicide) that kill an untransformed wild type.
  • the plants obtained can be grown and crossed in a conventional manner. Two or more generations should preferably be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • a complete plant can be obtained using methods known to those skilled in the art.
  • callus cultures individual cells (e.g. protoplasts) or leaf disks are used here (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press).
  • the formation of shoots and roots can be induced in a known manner from these still undifferentiated callus cell masses.
  • the sprouts obtained can be planted out and grown.
  • Appropriate methods have been described (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533).
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro by increasing the shoot meristem using one of the selection methods described above.
  • a change in the type and level of expression of a target gene and the effect on the phenotype of the plant can be tested on test plants in greenhouse experiments.
  • the selection methods according to the invention are preferably used in the context of plant biotechnology for the production of plants with advantageous properties.
  • the suitability of the plants or their seeds as food or feed can be improved, for example by changing the composition and / or the content of metabolites, in particular proteins, oils, vitamins and / or starch.
  • the growth rate, yield or resistance to biotic or abiotic stress factors can also be increased.
  • Advantageous effects can be achieved both by transgenic expression of nucleic acids or proteins and by a targeted reduction in the expression of endogenous genes with regard to the phenotype of the transgenic plant.
  • the advantageous effects to be achieved in the transgenic plant include, for example:
  • transgenic organisms according to the invention preferably the transgenic plants, and the cells, cell cultures, parts derived from them - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms, and transgenic propagation material such as Seeds or fruits, for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals, such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • pharmaceuticals or fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • triacylglycerides, lipids, oils, fatty acids, starch, tocopherols and tocotrienols and carotenoids is particularly preferred.
  • Genetically modified plants according to the invention that can be consumed by humans and animals can also be used, for example, directly or after preparation known per se as food or feed.
  • SEQ ID NO: 1 nucleic acid sequence coding for the DGR1 protein from P. olsonii
  • SEQ ID NO: 3 nucleic acid sequence coding for the D0G R 1-
  • SEQ ID NO: 5 Nucleic acid sequence encoding a fusion protein of PED and DOG R l
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence coding for a fusion protein from DGR1 and D0G R 1
  • SEQ ID NO: 8 oligonucleotide primer DGRlBam
  • SEQ ID NO: 10 oligonucleotide primers DGRlSal
  • SEQ ID NO: 11 oligonucleotide primer KR-05 20 5 x -GGGCGCCCGGTTCTTTTTG-3 *
  • SEQ ID NO: 12 oligonucleotide primer KR-06
  • SEQ ID NO: 13 oligonucleotide primer KR-13
  • SEQ ID NO: 14 oligonucleotide primer KR-14
  • SEQ ID NO: 15 oligonucleotide primer KR-07
  • SEQ ID NO: 16 oligonucleotide primer KR-08
  • SEQ ID NO: 17 oligonucleotide primer KR-09
  • SEQ ID NO: 18 oligonucleotide primer KR-10
  • SEQ ID NO: 19 pUC plasmid (pNIT18) comprising the nucleotide sequence of the nitrilase I promoter from 45 Arabidopsis thaliana pictures
  • Fig. 1 Schematic representation of the DGR1 nucleic acid sequence with some restriction sites.
  • DGRl coding region of DGRl. Important restriction interfaces are also given with their position.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the yeast expression vector pAD-GAL4-2.1-DGR1 for the expression of DGR1 (abbreviations: Amp:
  • Adhl-prom promoter of alcohol dehydrogenase 1
  • Adhl-term transcription terminator of alcohol dehydrogenase 1
  • fl-origin fl replication origin for replication in E. coli
  • 2 ⁇ origin 2 ⁇ origin of replication for replication in yeast
  • PED
  • the resistance-mediating effect of DGRl was determined on the basis of the 2-DOG resistance of DGRl-transformed (DGRl) and non-transformed ("wild type", WT) yeasts.
  • DGRl DGRl-transformed
  • WT wild type
  • yeasts were cultivated in SD medium with 1% fructose until the stationary growth phase began (48 h) and aliquots (10 ⁇ l each) of a 10 ⁇ 2 , 10 -3 , 10 " 4 or 10-5 dilution ( Lane 1, 2, 3 or 4)
  • FIG. 4 construction scheme for the plasmid YEpll2-DGRl.
  • LB / RB left or right T-DNA border
  • Nit-P Nitrilase-I promoter
  • nos-T nos terminator
  • nos-P nos promoter
  • nptll kanamycin resistance gene
  • DGRl nucleic acid sequence coding for DGRl markers from P.olsonii). Important restriction interfaces are also given.
  • LB / RB Left or right T-DNA border
  • Fig. 6 Efficiency of selective regeneration six weeks after transformation of the original yeast gene DOGRl (white columns) and the P. olsonii gene DGRl (striped columns). The regeneration took place during the entire six weeks in the presence of the specified selective component. Three independent experiments were carried out. The number of explants used was between 100 and 250 for the transformation of DGR1 and between 20 and 70 for the gene D0G R 1.
  • Fig. 7 Selective regeneration of tobacco explants after transformation of the 2-DOG resistance-conferring genes DOGRl and DGRl in the presence of 500, 600 and 700 mg / 1 2-DOG. The picture was taken five weeks after the start of the experiment.
  • Fig. 8 DOGRI and DGRI transcripts in transgenic and non-transformed tobacco lines. a) Blot hybridized with P32-labeled DOGRI (yeast gene) and DGRI (penicillium gene) probes,
  • Fig. 9 HPLC profiles for the detection of 2-DOG-6-P in radioactively labeled yeast strains with and without DGR1 Examples:
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner, using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pp. 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavage, agarose gel electro-
  • the sequencing of recombinant DNA molecules is carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI using the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463- 5467).
  • Example 1 Isolation and characterization of the nucleic acid sequence coding for the selection marker according to the invention from P. olsonii.
  • the nucleic acid sequence (cDNA; SEQ ID NO: 1) coding for the selection marker according to the invention was isolated from a P. olsonii strain.
  • the cDNA codes for an open reading frame (ORF) of 786 nucleotides and thus for a protein comprising 261 amino acids (SEQ ID NO: 2). Since the ORF screened from P. olsonii
  • the corresponding gene was designated as the DGRl gene and the protein as DGRlp.
  • the protein shows no significant homology to the known gene product of the D0G R 1 gene (note: the D0G R 1 gene codes for a 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase from S. cerevisiae; EP-A 0 870
  • the plasmid 45 pAD-GAL4-2.1-DGR1 was determined using helper phages, as described in the “Instruction
  • the transformants can also be cultivated on SD plates with 1% fructose and 0.5 mg / ml 2-DOG. This shows an increase in resistance to 2-DOG (Fig. 5).
  • Example 2 Establishment of the DRGl-coding sequence as a selection marker in S. cerevisiae
  • the nucleic acid sequence coding for DGRl was incorporated into a S. cerevisiae expression plasmid, this was transformed into S. cerevisiae and the yeast transformants were selected for their resistance to 2-DOG.
  • the nucleic acid sequence coding for DGRl was first amplified by means of PCR from the plasmid pAD-GAL4-2.1-DGRl comprising it, the primers DGRIPst and DGRlBam (Tab. 1; SEQ ID NO: 7 and 8) being selected such that the amplification product was flanked by the recognition regions of the restriction endonucleases PstI or BamHI.
  • This fragment was inserted into the S. cerevisiae expression plasmid YEP112A1NE (Riesmeier JW et al. (1992) EMBO J 11: 4705-4713) between the ADH1 promoter and the ADH1 terminator of S. cerevisiae.
  • the ADHL promoter is a strong constitutive promoter and causes a constitutive expression of Dgrlp in S. cerevisiae (Fig. 7).
  • the plasmid YEpll2-DGRl was then in S. cerevisiae SEY6210 according to the method of Ito et al. (Ito T et al. (1987) J Bacteriol 169: 4171-4176) and the transformants were selected via the resistance to 2-DOG or the complementation of the trpl mutation by the TRPl gene. To do this they were on
  • transformation frequencies 5.0 x 10 2 transformants per ⁇ g DNA are achieved. If selection is made simultaneously via the TRP1 and DGRI selection markers, there is a small - statistically insignificant - drop in the transformation frequency.
  • Table 2 Transformation frequencies of S. cerevisiae SEY6210 with the plasmid Yepll2-DRG1 after selection via the
  • the DGR1 coding sequence will be tested in comparison to the yeast gene D0G R 1 with regard to its suitability as a selection marker for plant transformation.
  • the following constructs are made as follows:
  • the construct BINAR-DOG R 1 described in EP-A 0 870 836 is like the nitrilase I promoter from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: U38846, nucleotides 3862 to 5342; GenBank Acc. -No.: Y07648. 2, nucleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170: 197-200) digested construct pNitl ⁇ (SEQ ID NO: 19) digested with the restriction enzymes EcoRI and BamHI. The promoter contained in the construct BINAR-DOG R 1 is thereby deleted. This fragment and the fragment from pNitl ⁇ carrying the nitrilase I promoter are then ligated, which leads to the binary plasmid pBi-Nit-P-DOG R 1 (FIG. 5A).
  • the plasmids pBiNit-P-DOGRI and the plasmid pAD-GAL4-2.1-DGR1 described in Example 1 are digested with the restriction enzymes Ncol and Sall.
  • the original yeast gene DOG R 1 can be removed from the plasmid pBiNit-P-DOG R 1 and replaced by the Ncol-SalI fragment carrying DGR 1 (FIG. 5B).
  • the nucleic acid sequence coding for DGRl was amplified by means of PCR from the plasmid pAD-GAL4-2.1-DGRl comprising it, the primers DGRlNcoI and DGRlSall (Tab.
  • the plasmid pBiNit-P-DGRl is obtained by ligation of the vector fragment remaining from pBiNit-P-DOG R 1 with the Ncol / Sall-digested DGRl-PCR product described above.
  • the nucleic acid sequences are transformed coding for DOG R l (Saccharomyces cerevisiae) and PED (cDNA from P. olsonii) compared.
  • DOG R l Sacharomyces cerevisiae
  • PED cDNA from P. olsonii
  • the two constructs are transferred separately to the EHA105 agrobacteria strain and used for three independent experiments.
  • Leaf pieces from young in vitro plants of the cultivar Nicotiana tabacum cv. SNN are cut into approximately 1 cm 2 pieces and transferred to a Petri dish containing approximately 20 ml of liquid MS medium in which the pelleted agrobacteria are resuspended for the purpose of infection.
  • the optical density of the agrobacterial suspension should be between 1 and 2 (ODgoo nm ) and is obtained by resuspending in the same volume of the centrifuged overnight culture which is carried out in Kanamycin-containing (50 mg / 1) YEB medium.
  • the infection takes place for about 20 minutes at room temperature with slowly rotating shaking.
  • the agrobacterial suspension is then suctioned off and the leaf pieces are transferred to solid MS medium for the co-culture.
  • the plates are sealed with parafilm and incubated in the dark at 24 ° C for two days.
  • the explants are then regenerated under selective conditions as follows.
  • the explants of both transformation approaches are placed on solid MG medium (MS with 1.6% glucose, 1 mg / 1 BAP, 0.2 mg / 1 NAA, 500 mg / 1 timentin) as well as with different ones Transfer 2-DOG concentrations (500, 600 or 700 mg / 1) and incubate at 24 ° C in low light (50 to 100 ⁇ M / m 2 s).
  • the explants are transferred to fresh medium every two weeks.
  • three independent experiments are carried out.
  • the 2-DOG selection pressure is removed after 6 weeks, in the following two experiments 2-DOG remains in the medium during the entire regeneration. 6 shows the result of the quantitative evaluation selective regeneration after six weeks of culture.
  • the number of explants used is between 100 and 250 for the transformation of PED and between 20 and 70 for the gene DOG R l. In this respect, DGR shows a significantly better efficiency in the selection of appropriately transformed tobacco cells.
  • nptll gene which was found in both expression constructs and the 2-DOG resistance conferring selection marker on the T-DNA, was amplified. Since an nptll positive reaction can also be caused by the presence of contaminating Agrobacteria DNA, the agrobacterial gene virD2 'has been amplified as a control reaction. With virD2 positive samples a decision about the transgenicity is not possible.
  • Table 3 Result of the genomic PCR analysis of putative transgenic tobacco plants that were selected as indicated.
  • the 2-DOG selection was carried out for six weeks. Then the explants, which had developed small shoot approaches up to this point, were further cultivated without 2-DOG.
  • 2-DOG was present in the respective concentrations during the entire regeneration.
  • ⁇ total tobacco plants tested nptll +: number of tobacco plants virD + tested positive for nptll: number of tobacco plants tested positive for virD
  • transgenic plants that tested positive for the nptll gene usually also contained the 2-DOG resistance conferring sequence.
  • the genomic DNA was extracted from approximately 100 mg of young leaf material from in vitro plants using the Qiagen DNeasy plant mini kit (catalog no. 69106) according to the In ⁇
  • the DNA was resuspended in 100 ul. 5 ⁇ l of the DNA isolated in this way was checked for quality and quantity in a gel electrophoresis. 2 ⁇ l of the DNA isolated in this way were each used for a PCR reaction.
  • the nptll gene is amplified using the two primers KR-05 40 and KR-06, resulting in a fragment of 515 bp.
  • the virD2 gene is amplified with the primers KR-07 and KR-08. The corresponding fragment has a size of
  • the Asp718 / HindIII fragment (containing the Nitrilasel promoters:: GUS fusion) is cleaved into the plasmid pSUN3 (WO 02/00900) with Asp718 / HindIII as well.
  • the resulting construct pSUN3-Nit-P-DGRl is checked by means of restriction analysis.
  • Example 6 Use of DGR1 as a selection marker for the transformation of rapeseed
  • the (example 5) construct pSUN3-Nit-P-DGRl described above is used, which contains both the nptll gene and the gene DGRl and consequently the selection for both kanamycin and 2-DOG Resistance allowed.
  • the construct is transferred to the Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 and used for three independent transformation experiments.
  • glycerol culture (1 ml, in 10% glycerol, stored at -80 ° C., prepared by mixing 900 ⁇ l of a ÜN + 100 ⁇ l sterile glycerin), 50 ml of YEB medium [5 g / 1 beef extract, 1 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 peptone, 5 g / 1 sucrose, 0.49 g / 1 MgSO 4 ] + 100 mg / 1 spectinomycin. The culture is grown for about 24 hours at 28 ° C. with shaking.
  • the four-day-old seedlings prepare the cotyledons with their petioles.
  • the petioles are inserted into the co-culture medium [germination medium, however pH 5.2, + 0.5 g / 1 MES, + 0.5 mg / 1 GA3 + 3.75 mg / 1 BAP] such that the cotyledo does not touch the agar.
  • the co-culture medium pH 5.2, + 0.5 g / 1 MES, + 0.5 mg / 1 GA3 + 3.75 mg / 1 BAP
  • the explants are removed individually and the petioles are immersed in the Agrobacterium tumefaciens suspension for about 2 to 3 seconds.
  • the cotyledo should not be wetted.
  • the optical density of the bacterial suspension is determined and diluted with liquid co-culture medium in such a way that an optical density of 0.5 results. 10 ml of the bacterial culture set in this way are poured into small petri dishes which are used for dipping. One bowl is used to dip a maximum of 300 petioles.
  • the co-culture takes place for 3 days at 24 ° C in low light (approx.
  • the explants (10 explants per plate) are transferred to regeneration medium (co-culture medium + 18 mg / 1 cananomine, + 300 mg / 1 timentin). The explants are transferred to fresh medium every 4 weeks.
  • ELRO-1 medium MS medium, 2% sucrose, pH 5.8, 0.5% agar, 100 mg / 1 myo-inositol, 40 mg / 1 adenine sulfate, 500 mg / 1 MES, 0.0025 mg / 1 BAP, 150 mg / 1 timentin, 15 mg / 1 kanamycin, 0.1 mg / 1 IBA).
  • Example 23/1 means first sprout of explant 23.
  • ELRO-2 medium corresponds to ELRO-1 medium without BAP. If necessary, it is used for hard-to-root shoots.
  • Table 6 shows the results of the first three independent transformation experiments.
  • Preliminary transformation efficiency (preliminary transformation efficiency) defined as follows: Preliminary transformer 3 Q tion efficiency in% ,. which results from the number of transgenic in vitro plants based on the number of explants used for transformation.
  • both 300, 35 400 and 500 mg / 1 2-DOG resistance as well as for kanamycin resistance are selected in parallel.
  • Putative transgenic in vitro plants are tested for the presence of the genes nptll, DGRl and virD2 using genomic PCR. All virD2 negative plants mean that no contaminating Agrobacterium tumefaciens DNA is present 4 Q (result not shown).
  • the selection of transgenic plants is possible at a concentration of 300 mg / 1 2-DOG. Regeneration in the presence of 400 and 500 mg / 1 2-DOG is not possible (data not shown).
  • the number of explants that produce transgenic plants is low with both 2-DOG and kanamycin. ⁇ B But the few explants produce a number of plants, but it is not clear whether the result is more independent Transformation events are or have arisen retrospectively from a transformation event.
  • Example 7 In vivo experiment to characterize the DGR1 gene product using tobacco plant material
  • the detection of a possible in vivo functionality of the 2-DOG-6-P phosphatase is carried out as follows: leaf disks (approx. 100 mg fresh weight) of transgenic tobacco plants which either carry the Penicillium gene DGRl or the yeast gene D0G R 1 or as a control express any foreign gene (eg green fluorescent protein - GFP) whose gene product is not involved in the expression of 2-D0G resistance, and non-transformed control plants are incubated for 24 hours in the dark in 300 mM 2-DOG solution. The leaf disks are then washed with water for one minute and frozen in liquid nitrogen.
  • the plant material is homogenized to a fine powder in mortars pre-cooled on dry ice and mixed with 1.5 ml 16% (w / v) trichloroacetic acid (TCA) in diethyl ether (pre-cooled to 4 ° C). The homogenates are then incubated on dry ice for 15 minutes. The metabolites are dissolved by adding 0.8 ml of 16% TCA, 5 mM EGTA. After transferring the homogenates into Eppendorf vessels, they are incubated for 3 hours at 4 ° C. The samples are then centrifuged for 5 minutes at 15,000 rpm and 4 ° C in a Biofuge 15R (Heraeus).
  • TCA trichloroacetic acid
  • the aqueous phase is transferred to Eppendorf vessels and washed 4 times with water-saturated ether.
  • the samples are then neutralized with 5 M KOH / 1 M triethanolamine mixture and gassed with nitrogen for 1 minute.
  • the samples prepared in this way are analyzed by HPLC.
  • HPLC HPLC system from Dionex is used, which has a PA-1 (4x250 mm) column and a pulsed electrochemical Detector is equipped. Before the injection, the samples are centrifuged for 2 minutes at 13,000 rpm. Metabolites are then eluted with a 50-minute concave gradient from 1 mM to 500 mM sodium acetate after 40 minutes at 10 mM NaOH and a flow rate of 1 ml / min.
  • the standard 2-DOG-6-P from Sigma is used to identify and quantify 2-DOG-6-P.
  • the data correspond to the mean values + standard deviation.
  • Northern blot analyzes are intended to clarify whether the results summarized in Table 7 merely have to be attributed to expression differences between the two genes conferring 2-DOG resistance or whether they actually come about through the action of different gene products.
  • the same leaf material that was used for the HPLC analyzes to quantify the 2-DOG-6-P is used for a semi-quantitative comparison of the expression levels of the two genes.
  • leaf samples of the plants transferred to the greenhouse are also harvested and used for the extraction of the total RNA. The extraction of the total RNA, its gel electrophoretic separation and its subsequent transfer to a nylon membrane, which is finally used for hybridization, is described in the patent EP-A 0 870 836.
  • Fig. 8 shows the accumulation of D0G R 1 or DGR1 transcripts in transgenic tobacco plants that carry the corresponding genes. Wild type plants or transgenic plants which have the reporter gene GFP do not, as expected, accumulate accordingly Transcripts. Since all three lines (7, 8, 9 and 10, 11, 12) each express their 2-DOG resistance-conferring genes, the differences in the 2-DOG-6-P quantities described above are not due to differences in expression, but rather large Probability can be explained by differences in the mechanism of action.
  • Example 8 In vivo experiment to characterize the DGR1 gene product using yeast cultures
  • a mechanism of action which differs from the known 2-DOG-6-P phosphatase system can also be achieved with the aid of yeast cultures using radioactively labeled 2-DOG.
  • the S. cerevisiae DGRl strain, together with its DGRl-free starting strain, are used as a control (see Example 1) in the presence of

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, die eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose verleihen, Nukleinsäuresequenzen kodierend für besagte Proteine, transgene Expressionskassetten umfassend besagte Nukleinsäuresequenzen sowie transgene Organismen transformiert mit besagten Expressionskassetten. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Zellen unter Verwendung besagter Expressionskassetten basierend auf der Steigerung der Resistenz gegenüber 2-Deoxyglucose (2-DOG).

Description

PROTEIN AUS PENICILLIUM OLSONII , DAS RESISTENZ GEGEN 2-DEOXYGLUCOSE VERLEIHT
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, die eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose verleihen, Nukleinsauresequenzen kodierend für besagte Proteine, transgene Expressionskassetten umfassend besagte Nukleinsauresequenzen sowie transgene Organis- men transformiert mit besagten Expressionskassetten. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Zellen unter Verwendung besagter Expressionskassetten basierend auf der Steigerung der Resistenz gegenüber 2-Deoxy- glucose (2-DOG) .
Das Einführen von genetischem Material in Zielzellen gelingt meist nur für eine sehr begrenzte Anzahl von Zellen einer Population bzw. eines Gewebes. Dies macht die Unterscheidung und Isolierung von erfolgreich transformierten von nicht transformierten Zellen erforderlich, ein Verfahren, das als Selektion bezeichnet wird. Traditionell erfolgt die Selektion mittels einer sogenannten "positiven Selektion" , wobei die nicht-transformierte Zellen entweder stark geschädigt bzw. abgetötet werden und nur die transformierte Zelle die entsprechende Resistenz erwirbt, damit überlebt und sich teilen kann oder nur die transformierte Zelle einen Wachstumsvorteil erhält. Üblicherweise wird eine derartige positive Selektion durch Gene realisiert, die für eine Resistenz gegen ein Biozid (z.B. ein Herbizid wie P osphinothricin, Glypho- sat oder Bromoxynil, einen Metabolismusinhibitor wie 2-Deoxyglu- cose (2-DOG; WO 98/45456) oder ein Antibiotikum wie Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin,- Bleomycin oder Hygro- mycin) kodieren. Derartige Gene werden auch als positive Selek- tionsmarker bezeichnet.
Das Gen des positiven Selektionsmarkers wird mit der in das Zellgenom einzuführenden Nukleinsäuresequenz gekoppelt (physikalisch oder mittels Cotransformation) in die Zelle eingebracht. Anschließend werden die Zellen auf einem Medium unter dem entsprechenden Selektionsdruck (d.h. in Gegenwart eines entsprechten- den Antibiotikums oder Herbizids) kultiviert, wodurch die transformierten Zellen aufgrund der erworbenen Resistenz gegen besagten Selektionsdruck einen Wachstums-/Überlebensvorteil haben und so selektioniert werden können. Beispielhaft als positive Selek- tionsmarker seien genannt:
BESTATIGUNGSKOPIE Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) (auch Bialop os®- Resistenzgen (bar) genannt) , welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifizierung des PPT erreichen (de Block et al. (1987) EMBO J 6: 2513-2518).
5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSP Synthase- gene) , die eine Resistenz gegen das nicht-selektive Herbizid Glyphosat® (N- (phosphonomethyl)glyciή) verleihen (Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate; A literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E und Atkinson D (eds.) The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston) . Glyphosat-tolerante EPSPS Varianten zur Verwendung als Selektionsmarker sind beschrieben (Padgette SR et al. (1996) New weed control opportuni- ties: development of soybeans with a Roundup Ready™ gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke SO, ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL) .
Neomyσinphosphotransferasen verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paro omycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphory- lierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduzieren (Beck et al. (1982) Gene 19:327-336).
- Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon tolerante Acetolactat- synthasen (Sathasivan K et al. (1990) Nucl Acids Res 18(8) :2188) .
Darüber hinaus sind Resistenzgene gegen die Antibiotika Hygromy- ein (Hygromycinphosphotransferasen) , Chloramphenicol (Chloramphe- nicolacetyltransferase) , Tetracyclin, Streptomycin, Zeocin, Ampi- cillin (ß-Lactamase Gen; Datta N, Richmond MH (1966) Biochem J 98(l):204-9) beschrieben.
Gene wie das Isopentenyltransferasegen (ipt) aus Agrobakterium tumefaciens (Genbank Acc.-No.: AB025109) können ebenfalls als sogenannte "positive" Selektionsmarker eingesetzt werden. Sie verschaffen den transformierten Zellen einen Wachstumsvorteil, ohne dass die nicht-transformierten Zellen abgetötet werden. Das ipt-Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokinin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z.B. Selektion auf Cytokinin-freiem Medium) (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:2117- 2121). Nachteilig ist hier, dass eine strenge Regulation der Genexpression erforderlich ist, an- dernfalls beeinträchtigt eine nicht-optimal kontrollierte Cyto- kininbiosynth.ese den Regenerationserfolg oder zumindest den P änotyp der Regeneranten.
Verschiedene weitere positive Selektionsmarker sind u.a. in EP-A 0 601 092 beschrieben. Beispielhaft sind zu nennen ß-Glucu- ronidase (in Verbindung mit z.B. Cytokininglucuronid) , Man- nose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Mannose) , UDP-Galak- tose-4-Epimerase (in Verbindung mit z.B. Galactose) .
2-Deoxyglucose (2-DOG) ist ein - abgesehen von einer Hexokinase vermittelten Phosphorylierung - nicht-metabolisierbares Glucosea- nalogon. Die Applikation von 2-DOG zu lebenden Zellen führt zur Bildung von 2-DOG-6-phosphat (2-DOG-6-P) . 2-DOG-6-P inhibiert die Glykolyse und die Proteinbiosynthese, interferiert mit der Pro- teinglycosylierung und stört die Biosynthese von Zellwandpolysac- chariden wie Mannanen und damit die Zellwandbildung. Phänotypisch resultiert eine Inhibition der Sprosselongation und der Wurzelbildung.
Das Gen D0GR1 aus Saccharomyces cerevisiae (Genbank Acc.-No.: NC001140, Chromosom VIII S. cerevisiae Position 194799-194056) kodiert für eine 2-DOG-6-P-Phosphatase. Das Enzym ermöglicht die Dephosphorylierung von 2-DOG-6-P, welches sich durch Phosphorylierung von 2-Deoxyglucose unter Verwendung der pflanzeneigenen Hexokinase bildet, und initiiert damit einen zyklischen Detoxifi- zierungsprozess. Dadurch wird die Selektion auf einem 2-DOG haltigen Medium möglich (EP-A 0 870 836; Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11:1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10:1195-1202). Dieses System kann als Selektionsmarker für die Transformation ins- besondere von Tabak und Kartoffel eingesetzt werden (Kunze et al. (2001) Mol Breeding 7:221-227).
Die im Stand der Technik beschriebenen Systeme haben oft einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile:
1) Zahlreiche Systeme basieren auf der Verwendung von Antibiotika. Derartige Systeme können aus Gründen der Verbraucherakzeptanz und der ProduktZulassung problematisch sein.
2) Zahlreiche Systeme sind nur in einer begrenzten Anzahl von
Arten einsetzbar und erreichen zudem nur geringe Effizienzen.
Zudem erfordern komplexe biotechnologische Arbeiten oft Mehrfachtransformationen. Hier ist das Repertoire an kompatiblen Selek- tionssystemen nach wie vor beschränkt und erzwingt oft eine auf- wendige Deletion von Markern um nachfolgende Selektionen effizient durchführen zu können.
Es besteht daher die Aufgabe, neue Selektionsmarker zur Verfügung zu stellen, die zur Selektion transformierter Bakterien-, Hefe- und Pflanzenzellen oder Pflanzen eingesetzt werden können. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Im Rahmen der Erfindung wird ein neuer Selektionsmarker, isoliert aus einem Penicillium olsonii Stamm, bereitgestellt, der eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose zu verleihen vermag (SEQ ID NO: 2) .
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft eine Aminosäuresequenz, kodierend für ein Protein, das eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose zu verleihen vermag, wobei die Aminosäuresequenz eine Sequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus
a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
b) funktioneil äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
c) funktionellen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder eines funktioneil äquivalenten Fragmentes dersel- ben, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder dem funktioneil äquivalenten Fragment derselben aufweisen.
Alle diese Aminosäuresequenzen bzw. Proteine sind infolge unter dem Begriff DGRl-Protein (oder auch Dgrlp) subsumiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Dgrlp-Amino- säuresequenz für ein Fusionsprotein aus einer Aminosäuresequenz kodierend für ein DGRl-Protein und einer Aminosäuresequenz kodie- rend für eine 2-DOG-6-P-Phosphatase. Besonders bevorzugt sind
Fusionsproteine aus dem D0GR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO: 4 und dem DGRl-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO: 2. Dabei kann die Reihenfolge der Verknüpfung von DGRl und D0GR1 beliebig sein. Besonders bevorzugt ist beispielsweise das Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO: 6.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsauresequenzen, die für die besagten Aminosäuresequenzen kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäurese- quenz, kodierend für ein DGRl-Protein eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, und
b) Sequenzen, die sich entsprechend dem degenerierten genetischen Code von einer Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 ableiten, und
c) Sequenzen, die eine Homologie von mindestens 60 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 aufweisen.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfasst die
Nukleinsäuresequenz die Sequenz kodierend für ein DGRl-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO: 1 und die Sequenz kodierend für das DOGR1-Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO: 3. Besonders bevorzugt ist beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO: 5.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Sequenzen in WirtsOrganismen oder davon abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut (wie z.B. Samen oder Früchten) . Besagte transgene Expressionskassetten umfassen:
a) mindestens einen Promotor, der zur Regulation der Transkription in mindestens einem Wirtsorganismus befähigt ist, und
b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen beste- end aus
i) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
ii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
iii) funktioneilen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß
SEQ ID NO: 2 oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes derselben, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment derselben aufweisen,
wobei der Promotor a) und die besagte Nukleinsäuresequenz b) funktionell miteinander verknüpft sind und die Nukleinsäurese- quenz b) in Bezug auf den Promotor a) oder den Wirtsorganismus heterolog ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die transgenen Expressionskassetten eine Sequenz kodierend für ein Fusionsprotein aus dem DGRl-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO: 2 und dem D0GR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO: 4. Besonders bevorzugt ist beispielsweise das Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO: 6.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform kann die transgene Expressionskassette in funktioneller Verknüpfung mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz weitere regulatorische Sequenzen umfassen, die beispielsweise als Transkriptions- Termina- tions- und/oder Polyadenylierungssignale in dem jeweiligen Wirtsorganismen dienen können. Auch kann die Expressionskassette weitere Funktionselemente wie beispielsweise weitere Selektionsmar- ker (z.B. D0GR1) enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Selektion transgener Organismen oder Zellen, umfassend nachfolgende Schritte :
I. Einführen mindestens einer Expressionskassette umfassend
a) mindestens einen Promotor, der zur Regulation der Transkription in besagten Zellen befähigt ist, und
b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus
i) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
ii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
iü) funktioneilen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes derselben, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment der- selben aufweisen,
wobei der Promotor a) und die besagte Nukleinsäuresequenz b) funktionell miteinander verknüpft sind, in Kombination mit mindestens einer weiteren Nukleinsauresequenzen in Zellen einer 2-Deoxyglukose-sensitiven Zellpopulation, und
II. Behandlung besagter Zellpopulation mit 2-Deoxyglucose in einer Konzentration, die für nicht-transformierte Zellen der Zellpopulation einen toxischen Effekt hat, und
III. Selektion von transformierten Zellen,' die in ihrem Genom min- destens eine der besagten weiteren Nukleinsäuresequenz aufweisen und die gegenüber nicht-transformierten Zellen einen Wachstumsvorteil aufweisen, aus besagter Zellpopulation.
In einer bevorzugten Ausführungsform kommen in dem erfindungs- gemäßen Selektionsverfahren transgene Expressionskassetten zum Einsatz, die eine Sequenz kodierend für ein Fusionsprotein aus dem DGRl-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO: 2 und einer 2-Deoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, bevorzugt dem D0GR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO: 4 umfas- sen. Besonders bevorzugt ist beispielsweise das Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO: 6. Zwischen den beiden Sequenzen können weitere Sequenzen wie zum Beispiele "Linker" o.a. lokalisiert sein.
Alternativ kann auch parallel zu der Expression einer der erfindungsgemäßen DGRl-Proteine eine 2-Deoxyglukose-6-phosphat Phosphatase exprimiert werden, ohne dass ein Fusionsprotein aus beiden vorliegen muß. So kann die 2-Deoxyglukose-6-phosphat Phosphatse von einer separaten Expressionskassette exprimiert werden. Bevorzugt werden das DGRl-Protein und die 2-Deoxyglu- kose-6-phophat Phosphatase dabei unter Verwendung eines bidirektionalen Promotors exprimiert. Weiterhin bevorzugt ist die Expression von einem Promotor, wobei zwischen die die Sequenzen kodierend für die jeweiligen Proteine (DGRl und 2-Deoxyglu- kose-6-phosphat Phosphatase) eine sogenannte "IRES"-Sequenz (interne Ribosomen-Eintrittssequenz) lokalisiert wird, die eine separate Translation beider Proteine von einem RNA-Strang ermöglicht.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das DGRl-Protein aus dem Pilz Penicillium olsonii in der Lage ist, eine effiziente Resistenz gegenüber 2-DOG zu verleihen. Die Expression des DGRl-Pro- teins kann daher zur Selektion im Rahmen von Transformationen genutzt werden. Es ist prinzipiell zur Selektion aller Wirtsorganismen geeignet, auf die 2-DOG eine toxische Wirkung ausüben kann. Die Nutzbarkeit im Rahmen der Hefe- als auch der Pflanzentransformation wurde demonstriert (Beispiel 2 und 3). Dabei erwies sich das DGRl-Protein als effizienter als das bereits be- kannte D0GR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae und stellt insofern eine deutliche Verbesserung des bezüglich dieses Proteins beschriebenen Selektionsverfahrens dar.
"Funktionelle Äquivalente" meint in Bezug auf das DGRl-Protein gemäß SEQ ID NO: 2 insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des DGRl-Proteins gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Poly- peptide aus anderen Organismen, bevorzugt aus Pilzen, die die gleichen wesentlichen Eigenschaften aufweisen.
"Wesentliche Eigenschaften" des DGRl Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 meint insbesondere die Eigenschaft, bei transgener Expression in einem Organismus (bevorzugt einem pflanzlichen Organismus) oder einer von diesem abgeleiteten Zellen, Zellkultu- ren, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut eine Resistenz gegen 2-DOG bewirken zu können, wobei bevorzugt diese Resistenz nicht durch Dephosphorylierung von 2-DOG-6-P bewirkt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform gelten als wesentliche Ei- genschaften ferner mindestens eine Eigenschaft ausgewählt aus nachfolgender Gruppe:
a) ein rechnerisches Molekulargewicht entsprechend der Polypep- tidsequenz in einem Bereich von ungefähr 14 bis ungefähr 44 kDa, bevorzugt ungefähr 24 bis ungefähr 34 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 29 kDa.
b) einen theoretischen isoelektrischen Punkt (pl) in einem Bereich von ungefähr 4,0 bis ungefähr 5,8, bevorzugt ungefähr 4,5 bis ungefähr 5,3, besonders bevorzugt ungefähr pH 4,8 bis 5,1, am meisten bevorzugt ungefähr pH 4,9.
Funktionelle Äquivalente aus anderen Organismen, beispielsweise aus pflanzlichen Organismen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabi- dopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum - können z.B. durch Datenbanksuche in Sequenzdatenbanken wie GenBank oder Durchmustern von Gen- oder cDNA-Banken - z.B. unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines teils derselben als Suchsequenz bzw. Sonde - aufgefunden werden. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste.
Bevorzugt haben besagte funktioneile Äquivalente eine Homologie von mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 95 % zu dem DGRl-Protein mit der SEQ ID NO: 2. Dabei er- streckt sich die Homologie über mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren besonders bevorzugt mindestens 90 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge des DGRl Proteins gemäß SEQ ID NO: 2.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, Univ'ersity of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight : 8 Length Weight : 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2, 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Proteine, die durch Nukleinsauresequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 95 % zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 haben. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 100 Basen, bevorzugt mindestens 200 Basen besonders bevorzugt mindestens 300 Basen, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsauresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA; Altschul et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch:0
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsauresequenzen kodiert werden, die unter Standardbedingungen mit einer der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäuresequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften des Proteins gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen.
Der Begriff "Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybri- disierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen- wart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritte sind infolge gegeben:
(1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fisch- sper a-DNA bei 68°C, f) 50% Formamid, 4X SSC bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung) .
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumeitrat/0, 1% SDS bei 50°C. b) 0,1X SSC bei 65°C. c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) .
Funktionelle Äquivalente umfassen ferner Fusionsproteine aus einer der erfindungsgemäßen DGRl-Proteine und Sequenzen, die für Transitpeptide (sogenannte "Targeting"-Peptide) kodieren. Die Expression besagter Fusionsproteine kann so für jedes gewünschte Zellkompartiment, wie z.B. dem Endomembransystem, der Vakuole, den Chloroplasten, Apoplasten oder anderen Piastiden, den Mito- chondrien, dem Endoplasmatisehen Retikulum (ER) , dem Zellkern, den Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten gewährleistet werden. Derartige Signalpeptidsequenzen sind bekannt (z.B. Braun (1992) EMBO J 11:3219-3227; Wolter (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85:846-850; Sonnewald (1991) Plant J 1:95-106). Entsprechende Verfahren, z.B. um an sich nicht in den Piastiden lokalisierte Proteine gezielt in die Piastiden zu transportieren, sind beschrieben (Klosgen RB & Weil JH (1991) Mol Gen Genet 225(2) :297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38(3) :491-496) .
Alternativ kann auch eine transgene Expressionskassette direkt in das Genom der Organellen (z.B. der Piastiden oder Mitochondrien) eingebracht werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann geläufig und basieren beispielsweise auf gezielter Insertion in die plastidäre DNA unter Verwendung homologer Rekombination. Um eine Expression in den Organellen zu gewährleisten, verwendet der Fachmann bevorzugt entsprechende in den Organellen funktionelle Promotoren.
"Expressionskassette" meint im Rahmen dieser Erfindung allgemein solche Konstruktionen in denen eine zu exprimierende Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einer genetischen Kontrollsequenz - bevorzugt einer Promotorsequenz - steht. Expressionskassetten bestehen bevorzugt aus doppelsträngi- ger DNA und können eine lineare oder zirkuläre Struktur haben. Sie können in verschiedener Form vorliegen, beispielsweise als separate Moleküle oder aber integriert in das Genom einer Zelle.
"Transgen" meint - zum Beispiel bezüglich eine Expressionskas- sette (oder einen diese umfassenden Expressionsvektor oder trans- genen Organismus) alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder
a) die für ein Dgrlp-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz (beispielsweise die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1) , oder
b) eine mit a) funktionell verknüpfte Promotor, oder
c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Dele- tion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Bevorzugt ist die in den Expressionskassetten enthaltene erfindungsgemäße Promotorsequenz heterolog in Bezug auf die mit ihr funktionell verknüpfte, transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz. "Heterolog" meint in diesem Zusammenhang, dass die für ein Dgrlp-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz nicht für das Gen kodiert, das natürlicherweise unter der Kontrolle des besagten Promotors steht.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromoso- malen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Ein natürlich vorkommendes Expres- sionskonstrukt - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Promotors eines Gens kodierend für ein Dgrlp-Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben mit seinen entsprechenden kodierenden Sequenzen wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn besagte Expressionskassette durch nicht-natürliche Verfahren (wie beispielsweise einer Muta- genese) geändert oder in einen heterologen Organismus eingebracht wird. Entsprechende Verfahren zur Mutagenese sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815). "Transgen" meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression") bevorzugt all solche unter Einsatz einer transgenen Expressionskassette, transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus - entsprechend dem oben gegebenen Definitionen - rea- lisierten Expressionen.
"Heterolog" meint in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz und die sie umfassende Zelle, dass besagte Nukleinsäuresequenz natürlicherweise nicht in der besagten Zelle vorkommt.
"Heterolog" meint in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz und den mit ihr funktionell verknüpften Promotor, dass die Nukleinsäuresequenz nicht für das Gen kodiert, das natürlicherweise unter der Kontrolle des besagten Promotors steht.
"Genom" meint die Gesamtheit der Erbinformation einer Zelle und umfasst sowohl die genetische Information des Zellkerns als auch die der Piastiden (z.B. Chloroplasten) und Mitochondrien. Bevorzugt meint "Genom" jedoch die genetische Information des Zell- kerns (beispielsweise der nuklearen Chromosomen) .
Unter einer funktioneilen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz (beispielsweise kodierend für ein DGRl-Protein) und ggf. weiterer genetischen Kontrollsequenzen oder regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator und/ oder Polyadenylierungssignalen derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsauresequenzen erfüllen kann. Funktion kann dabei beispielsweise die Kontrolle der
Expression d.h. Transkription und/oder Translation der Nukleinsäuresequenz (beispielsweise kodierend für ein DGRl-Protein) bedeuten. "Kontrolle" umfasst beispielsweise das Initiieren, Steigerung, Steuerung oder Suppression der Expression d.h. Trans- kription und ggf. Translation. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer der erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt beispielsweise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promotor fungierenden Nukleinsäuresequenz mit einer zu exprimierenden Nukleoteinsäuresequenz (beispielsweise kodierend für ein DGRl-Protein) . Die Herstellung einer funktioneilen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, FM et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen zum Beispiel eine Nukleinsäure- sequenz (beispielsweise kodierend für ein DGRl-Protein) hinter einen endogenen Promotor platziert wird, dass der gleiche Effekt auftritt. Auch dieser Ansatz führt zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassette .
Der Begriff der "genetischen Kontrollsequenzen" ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen gewährleisten zum Beispiel die Transkription und gegebenenfalls Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise beschrieben bei "Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)" oder "Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds . : Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108" sowie den dort aufgewiesenen Zitaten.
Vorteilhafte Kontrollsequenzen für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 oder ADH enthalten.
Für eine Expression in Vertebraten, bevorzugt in Säugern, sind Vektoren wie der TK-Promotor, der RSV 3' LTR-Promotor, der CMV- Promotor, der SV40 "early"- oder late"-Promotor, geeignet. Weitere Promotoren sind dem Fachmann geläufig. Induzierbare Promoto- ren geeignet für die Verwendung in Vertebraten, bevorzugt in
Säugern, umfassen beispielsweise den Tet-Promotor/Repressor induzierbar oder reprimierbar durch Tetrazyklin oder Derivate, den Dexamethason-induzierbaren MMTV-LTR-Promotor, den Drosophila minimal "heat shock"-Promotor induzierbar durch Ecdysone oder das Analog Ponasterone A (im Rahmen beispielsweise des pVgRXR Expressionssystems; Invitrogen, Inc.).
Genetische Kontrollsequenzen umfassen insbesondere in Pflanzen funktionelle Promotoren. Als bevorzugte Promotoren für die Expressionskassetten ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen steuern kann.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5 ' -stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
"Pflanzenspezifischer Promotor" meint, grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitu- tiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein. Bevorzugt sind:
a) Konstitutive Promotoren
"Konstitutive Promotoren" meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). Vorzugsweise verwendet man ins- besondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus oder einem anderen Pflanzenpathogen (z.B. Agrobakterium) entstammt. Insbesondere bevorzugt sind der 35S- Promotor des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al . (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228), der 19S CaMV-Promotor 5 (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J
8:2195-2202), der Promotor der Nopalinsynthase (NOS) oder der Octopinsynthase (OCS) aus Agrobakterium, der TR-Doppelpromotor, Ubiquitin Promotoren (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649; Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; 10 Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9692-9696), sowie der Promotor des Nitrilase-1 Gens aus Arabidopsis thaliana (Gen- Bank Acc.-No.: U38846, Nukleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342; GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hille- brand et al. (1996) Gene 170:197-200).
15 b) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu
20 Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die
Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein
25 durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon- induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet
30 werden. Ferner geeignet ist der Promotor des Glutathione-S-trans- ferase Isoform II Gens (GST-II-27) , der durch exogen applizierte Safener wie z.B. N,N-Diallyl-2,2-dichloroacetamid aktiviert werden kann (WO 93/01294) und in zahlreichen Geweben von sowohl Monokotyledonen als auch Dikotyledonen funktionell ist.
35
Besonders bevorzugt sind konstitutive Promotoren.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions-
40 teuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Biol Chem
45 266(26) :17131 -17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Molecular & General Genetics 217 (2-3) :246-53) beschrieben. Genetische KontrollSequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3 '-Region von Genen wie beispielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression hete- rologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspe- zifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440). Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebs- spezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobakterium tumefaciens . Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequen- zen sind der OCS (Octopin-Synthase) -Terminator und der NOS (Nopa- lin-Synthase) -Terminator (Depicker A et al (1982) J Mol Appl Genet 1:561-573), als auch die Terminatoren von Sojabohnen Actin, RUBISCo oder alpha-Amylase aus Weizen (Baulcombe DC et al (1987) Mol Gen Genet 209:33-40).
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen.
Ferner sind für die gezielte Expression in den Piastiden plasti- den-spezifische Promotoren bevorzugt. Geeignete Promotoren sind beispielsweise beschrieben in WO 98/55595 oder WO 97/06250. Zu nennen sind das rpo B-Promotorelement, das atoB Promotorelement, das clpP-Promotorelement (siehe auch WO 99/46394) oder das lδSrDNA-Promotorelement . Weiterhin sind virale Promotoren geeignet (WO 95/16783) . Eine gezielte plastidäre Expression kann auch erreicht werden, wenn man zum Beispiel einen bakteriellen oder bakteriophagen Promotor verwendet, die resultierende Expres- sionskassette in die plastidäre DNA einbringt und die Expression dann durch ein Fusionsprotein aus einer bakteriellen oder bacte- riophagen Polymerase und einem plastidären Transitpeptid exprimiert. Ein entsprechendes Verfahren ist in US 5,925,806 beschrieben. Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen insertiert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebsspezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4) :381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu transkribierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Expressionsvektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation - nach einem der unten beschriebenen Verfahren - in die eukaryotische Zelle oder Organismus eingebracht werden. Die nachfolgende Expression kann transient sein oder aber auch - bevorzugt - stabil nach Insertion (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) der Expressionskassetten in das Genom erfolgen. Weitere im Rahmen der Erfindung geeignete Expressionsvektoren sind weiter unten im Rahmen der Transformationsverfahren beispielhaft beschrieben.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Expressionskassetten und/oder die von ihnen abgeleiteten Expressionsvektoren können weitere Funktionselernente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der Expressionskassetten und/oder der von diesen abgeleitete Expressionsvektoren oder Organismen haben. Beispiel- haft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
1. Selektionsmarker
"Selektionsmarker" meint all solche Nukleinsäure- oder Proteinse- quenzen, deren Expression (d.h. Transkription und ggf. Translation) einer Zelle, Gewebe oder Organismus einen anderen Phänotyp verleiht, als einer nicht transformierten. Selektionsmarker um- fasst beispielsweise solche Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen, deren Expression einer Zelle, Gewebe oder Organismus einen Vorteil (positiver Selektionsmarker) oder Nachteil (negativer Selektionsmarker) gegenüber Zellen vermittelt, die diese Nukleinsäure oder Protein nicht exprimieren. Positive Selektionsmarker wirken beispielsweise dadurch, das eine auf die Zelle inhibitorisch wirkende Substanz detoxifiziert wird (Bsp. Antibiotika-/Herbizid- resistenz) , oder eine Substanz gebildet wird, welche der Pflanze unter den gewählten Bedingungen verbesserte Regeneration oder erhöhtes Wachstum ermöglicht (zum Beispiel nutritive Marker, hormonproduzierender Marker wie ipt; s.u.). Eine andere Form positiver Selektionsmarker umfasst mutierte Proteine oder RNAs, die gegenüber einem selektiven Agenz nicht empfindlich sind (beispielsweise 16S rRNA Mutanten, die unempfindlich gegenüber Spectinomycin sind) . Negative Selektionsmarker wirken beispielsweise dadurch, dass sie die Bildung einer toxischen Substanz in den transformierten Zellen katalysieren (zum Beispiel das codA-Gen) und damit die transformierten Zellen schädigen oder abtöten. Ferner können Selektionsmarker auch Reporterproteine um- fassen, insofern diese geeignet sind, transformierte von nicht- transformierten Zellen, Geweben oder Organen (beispielsweise durch Farbgebung oder einen anderen detektierbaren Phänotyp) zu unterscheiden.
1.1 Positive Selektionsmarker:
Die Expressionskassetten können (z.B. zur weiteren Steigerung der Effizienz der erfindungsgemäßen Selektionsverfahren) zusätzliche positive Selektionsmarker umfassen. Entsprechende Proteine und Sequenzen sowie Selektionsverfahren sind dem Fachmann geläufig. Bevorzugt sind selektionierbare Marker, die den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxy- nil) , einen Metabolismusinhibitor (z.B. 2-Deoxyglucose; WO 98/45456) oder ein Antibiotikum (z.B. Tetracycline, Ampicil- lin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin) verleihen und so die Selektion der transformierten Zellen von un- transformierten ermöglichen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
- Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT; auch Bialophos®resi- stenz (bar) ) , welche die freie A inogruppe des Glutaminsyntha- seinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifizierung des PPT erreichen (de Block et al. (1987) EMBO J 6:2513-2518). Das bar-Gen kodierend für eine Phosphinothri- cinacetyltransferase (PAT) kann aus beispielsweise Streptomyces hygroscopicus oder S. viridochromogenes isoliert werden. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (GenBank Acc.- No.: X17220, X05822, M22827 undX65195; US 5,489,520). Ferner sind synthetische Gene beispielsweise für die Expression in Piastiden beschrieben. Ein synthetisches Pat-Gen ist beschrieben in Becker et al. (1994) Plant J 5:299-307. Die Gene verleihen Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos oder Glufosinat und sind viel benutze Marker für die Herstellung von transgenen Pflanzen (Vickers JE et al. (1996) Plant Mol Miol Reporter 14:363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO J 6:2519-2523).
- 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSPS) , die eine Resistenz gegen Glyphosat (N- (phosphonomethyl)glycin) verleihen. Das nicht-selektive Herbizid Glyphosat hat die EPSPS als molekulares Target. Diese hat eine Schlüsseifunktion in der
Biosynthese aromatischer Aminosäuren in Mikroben und Pflanzen, jedoch nicht in Säugern (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem Biophys Res Commun 94:1207-1212; Levin JG & Sprinson DB (1964) J Biol Chem 239:1142-1150; Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate a literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E und Atkinson D (eds.). The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston.). Glyphosat-tolerante EPSPS Varianten werden bevorzugt als Selektionsmarker verwendet (Padgette SR et al. (1996) New weed control opportunities : development of soybeans with a Roundup Ready™ gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke, S.O., ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL; Saroha MK & Malik VS (1998) J Plant Biochem Biotechnol 7:65-72). Das EPSPS Gen des Agrobakterium sp. Stammes CP4 vermittelt eine natürliche Toleranz gegen Glyphosat, die auf entsprechende transgene Pflanzen transferiert werden kann (Padgette SR et al.
(1995)Crop Science 35 (5) :1451-1461) . Sequenzen von Glyphosat- toleranten EPSPS Varianten sind beschrieben (z.B. in
US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435;
US 5, 627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571; GenBank Acc . -No . : X63374; insbesondere das aroA-Gen M10947) .
- Glyphosat® degradierende Enzyme wie z.B. Glyphosatoxidoreduk- tase (gox-Genprodukt) . GOX katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung im Glyphosat, welches so zu Aminomethylphosphonsäure (AMPA) und Glyoxylat umgesetzt wird. GOX kann dadurch eine
Resistenz gegen Glyphosat vermitteln (Padgette SR et al. (1996) J Nutr 126(3) :702-16; Shah D et al . (1986) Science 233:478-481) .
- Dehalogenasen, die Dalapon® inaktivieren (z.B. das deh-Genpro- dukt; GenBank Acc.-No.: AX022822, AX022820 sowie WO 99/27116). - Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme (z.B. das bxn-Genpro- dukt aus Klebsiella ozanenae) . Sequenzen sind beschrieben (GenBank Acc.-No: E01313; J03196) .
- Neomycinphosphotransferasen verleihen Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomy- cin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreak- tion deren inhibierende Wirkung reduzieren. Besonders bevorzugt ist das nptll-Gen. Sequenzen können aus der GenBank erhalten werden (GenBank Acc.-No: AF080390; AF080389) . Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (GenBank Acc.-No : AF234316; AF234315; AF234314) . Das nptll-Gen kodiert für eine Aminoglycosid-3'0-phosphotransferase aus E.coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 Position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19: 327-336).
- das D0GR1-Genprodukt. Das Gen D0GR1 wurde aus der Hefe Saccharo- myces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836) . Es kodiert für eine
2-D0G-6-P-Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11: 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10:1195-1202, Sequenz: GenBank Acc . -No . : NC001140; Position 194799 bis 194056).
- Sulfonylurea- und Imidazolinon tolerante Acetolactatsynthasen, die eine Resistenz gegen die genannten Herbizidklassen verleihen. Beispielhaft seien für Imidazolinon-Herbizide die Wirkstoffe Imazamethabenz-methyl, Imazzamox, Imazapyr, Imazaquin, Imazethapyr zu nennen. Für Sulfonylharnstoff-Herbizide seien beispielhaft Amidosulforon, Azimsulfuron, Chlorimuronethyl , Chlorsulfuron, Cinosulfüron, Imazosulforon, Oxasulforon, Prosulforon, Rimsulforon, Sulfosulforon zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Wirkstoffe der genannten Klassen be- kannt. Geeignet sind Nukleinsauresequenzen wie beispielsweise die unter der GenBank Acc-No.: X51514 abgelegte Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res . 18(8):2188). Imidazolinon tolerante Acetolactatsynthasen sind ferner beschrieben unter den GenBank Acc . -No . : AB049823, AF094326, X07645, X07644, A19547, A19546, A19545, 105376, 105373, AL133315.
- Hygromycinphosphotransferasen, verleihen eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin (z.B. GenBank Acc.-No.: X74325) . Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren (z.B. GenBank Acc . -No . : AF294981; AF234301; AF234300; AF234299; AF234298; AF354046; AF354045) und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerase- kettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
- Resistenzgene gegen Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyl- transferase) , Tetracyclin (z.B. GenBank Acc . -No . : X65876) ,
Streptomycin (z.B. GenBank Acc . -No. : AJ278607) , Zeocin (z.B. umfasst von GenBank Acc.-No.: L36849), Ampicillin (ß-Lactamase Gen; Datta N, Rich ond MH. (1966) Biochem J 98(l):204-9; Heffron F et al (1975) J Bacteriol 122:' 250-256)
- Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobakterium tumefaciens (Stamm:P022) (Genbank Acc.-No. : AB025109) . Das ipt- Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokinin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z.B. Selektion auf Cytokinin-freiem Medium) . Das Verfahren zur Nutzung des ipt-Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:2117-2121; Ebinuma, H et al . (2000) Selec- tion of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecu- lar Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers) .
- Verschiedene weitere positive Selektionsmarker, die den transformierten Pflanzen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht- transformierten verleihen, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung sind u.a. beschrieben in EP-A 0 601 092. Beispielhaft sind zu nennen ß-Glucuronidase (in Verbindung mit z.B. Cytokininglucu- ronid) , Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Man- nose) , UDP-Galaktose-4-Epimerase (in Verbindung mit z.B. Galac- tose) , wobei Mannose-6-phosphat-Isomerase in Verbindung mit Mannose besonders bevorzugt ist.
- Für einen in Piastiden funktionellen Selektionsmarker sind insbesondere solche bevorzugt, die eine Resistenz gegen Spectino- myein, Streptomycin, Kanamycin, Lincomycin, Gentamycin, Hygro- myein, Methotrexat, Bleomycin, Phleomycin, Blasticidin, Sulfon- amid, Phosphinotricin, Chlorsulfuron, Bromoxymil, Glyphosat, 2, 4-Datrazin, 4-Methyltryptophan, Nitrat, S-Aminoethyl-L-cy- stein, Lysin/Threonin, Aminoethyl-Cystein oder Betainaldehyd verleihen. Besonders bevorzugt sind die Gene aadA, nptll, BADH, FLARE-S (eine Fusion aus aadA und GFP, beschrieben bei Khan MS & Maliga P (1999) Nature Biotech 17:910-915). Ganz besonders bevorzugt ist das aadA Genprodukt (Svab Z und Maliga P (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90:913-917). 1.2 Negative Selektionsmarker
Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) Plant J 19(6): 719-726) . Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können mit der erfindungsgemäßen Expressionskassette auch negative Selektionsmarker (bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der oben genannten Markerproteingene) eingebracht werden", wobei der als Funkti- onselement eingebrachte Marker bevorzugt ein anderer ist, als der von dem bereits in der pflanzlichen Zelle vorliegenden Marker- proteingen kodierte .
Die jeweils für die Selektion verwendeten Konzentrationen der Antibiotika, Herbizide, Biozide oder Toxine müssen an die jeweiligen Testbedingungen bzw. Organismen angepasst werden. Beispielhaft seien für Pflanzen zu nennen Kanamycin (Km) 30 bis- 100 mg/L, Hygromycin B 40 mg/L, Phosphinothricin (Ppt) 6 mg/L, Spectinomycin (Spec) 500 mg/L.
2 ) Reporte gene
Reportergene kodieren für leicht quantifizierbare Proteine und gewährleisten so über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewer- tung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder
-Zeitpunktes. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(l):29-44) wie
- "green fluorescent protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23(5):912-8; Sheen et al. (1995) Plant J 8 (5) :777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94 (6) :2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12) :5888-5893 ; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228)
•- Chloramphenicoltransferase
- Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science 234:856-859); erlaubt Biolu- minescenzdetektion.
- ß-Galactosidase (kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen) - ß-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907) oder das uidA-Gen (kodieren für Enzyme für die verschiedene chromogene Substrate zur Verfügung stehen)
- R-Locus Genprodukt, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al . (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282)
- Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129:2703- 2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
- Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) :1259-1268) , kann in der Calcium-sensitiven Biolumine- scenzdetektion verwendet werden.
3) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Clo- ning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
4) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen" , die einen Agrobakte- rien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertra- gung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
5) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsauresequenzen.
Als zusätzliches Funktionselement besonders bevorzugt ist das D0GR1-Gen (s.o.). Die parallele Expression des DOGR1-Genproduktes vermag die Resistenz gegen 2-DOG signifikant zu steigern. Die parallele Expression kann in Form von zwei separaten Markerproteinen (D0GR1-Genprodukt neben DGR-1) oder in Form eines DOG- R1/DGR-1 Fusionsproteins realisiert werden (s.o.), wobei letztere Ausführungsform bevorzugt ist, da sie z.B. nur eine Expressionskassette erfordert. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Zellen oder Organismen, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen, Expressionskassetten oder Expressionsvektoren enthalten. Die Zelle kann von einem Organismus abgeleitet oder in diesem enthalten sein. Es können aber auch einzellige Organismen wie Mikroorganismen sein. Die Zelle kann prokaryotisch oder eukaryoti- scher Natur sein.
Das erfindungsgemäße Selektionsverfahren wird bevorzugt auf 2-DOG-sensitive Wirtsorganismen angewendet, am meisten bevorzugt auf 2-DOG-sensitive Bakterien, Pilze, Hefen, tierisch oder pflanzliche Organismen. Diese sind als Gegenstand der Erfindung besonders bevorzugt.
In den Beispielen 7 und 8 werden Experimente beschrieben, die zeigen, dass das Penicillium olsonii DGRl Genprodukt im Gegensatz zu dem Genprodukt des aus der Hefe stammenden Gens DOGRl nicht für eine 2-DOG-6-P Phosphatase codiert. Das bedeutet, dass der durch das Penicillin Gen DGRl bewirkte 2-DOG-Resistenzmechanismus nicht auf einer Dephosphorylierung von 2-DOG-P beruht, wie er in EP-A 0 870 836 für das Hefegen D0GRl beschrieben ist.
Erfindungsgemäß umfasst sind jedoch auch weitere Organismen (wie z.B. prokaryotische Organismen), die die erfindungsgemäßen Ex- pressionssysteme - beispielsweise zum Zwecke der Vektorproduktion - enthalten. Auch können prokaryotische Organismen, beispielsweise Agrobakterien, vorteilhaft als Vehikel für die Transformation beispielsweise pflanzlicher Organismen eingesetzt werden.
Bevorzugte Prokaryoten sind vor allem Bakterien wie Bakterien der Gattung Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostridium, Pro- pionibacterium, Butyrivibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwi- nia, Agrobakterium, Flavobakterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthora, Crypthecodinium oder Cya- nobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis . Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agrobakterium tumefaciens .
Der Begriff "eukaryotische Zellen und Organismen" umfasst pflanzliche und tierische, nicht-menschliche Organismen und/oder Zellen sowie eukaryotische Mikroorganismen wie beispielsweise Hefen, Algen oder Pilze. Eine entsprechender transgener Organismus kann beispielsweise durch Einführen der entsprechenden Expressionskassette oder Expressionsvektors in eine Zygote, Stammzelle, Proto- plast oder eine andere geeignete von dem Organismus abgeleitete Zelle hergestellt werden.
"Tierischer Organismus" meint nicht-menschliche Vertebraten oder Invertebraten. Bevorzugte Vertebraten umfassen beispielsweise Fischarten, nicht-menschliche Säugetiere wie Rind, Pferd, Schaf, Ziege, Maus, Ratte oder Schwein, sowie Vögel wie Huhn oder Gans. Bevorzugte tierische Zellen umfassen CHO, COS, HEK293 Zellen. Invertebraten umfassen Nematoden oder andere Würmer sowie Insekten. Invertebraten umfassen Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spo- doptera Sf9 oder Sf21 Zellen.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neu- rospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze. Besonders bevorzugt ist der filamentöse Hemia- scomycet Ashbya gossypii .
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula, Yarro- wia, Arxula oder Pichia, besonders bevorzugt sind Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris (ATCC Accession No. 201178) .
Besonders bevorzugt sind pflanzliche Zellen und pflanzliche Orga- nis en.
"Pflanzliche Zelle" meint im Rahmen der vorliegenden Erfindung jegliche Art von Zellen, die von einem pflanzlichen Organismus abgeleitet oder in diesem vorhanden ist. Der Begriff umfasst da- bei beispielhaft Protoplasten, Kallus- oder Zellkulturen, Mikros- poren, Pollen, Zellen in Form von Geweben wie Blättern, Meristem, Wurzeln usw.
"Pflanzlicher Organismus" umfasst dabei jeden Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, sowie die von diesem abgeleitete Zellen, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) . Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monokotyledone und dikotyledone Pflanzen sowie Gymnospermen sind bevorzugt.
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches . Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkultu- ren, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktioneilen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen EntwicklungsStadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in ei- nem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährigen, monokotyle- donen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigo- nella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidop- sis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyo- scyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, An- tirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennise- tum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Gly- cine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amarant- haceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Pa- pilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubia- ceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyledone Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotyledonen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Alfalfa, Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt auf dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyledone Pflan- zen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotyledonen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps) , campestris (Rübe) , oleracea cv Tastie
(Kohl) , oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Em- peror (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabi- dopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Ca- nola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art escule tum (Tomate) , die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) sowie Tabak und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und an- dere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte) ) und Apium (ganz besonders die Art gra- veolens dulce (Sellerie) ) und andere mehr;
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuk- kerrübe- und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi .
"Pflanzliche Organismen" im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
Am meisten bevorzugt sind
a) Pflanzen, die zur Olproduktion geeignet sind, wie beispiels- weise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel (Carthamus tinc- torius) , Ölbaum, Soja, Mais, Erdnuss, Rizinus, Ölpalme, Weizen, Kakaostrauch oder verschiedene Nussarten wie beispiels- weise Walnuss, Kokosnuss oder Mandel. Unter diesen wieder besonders bevorzugt sind dikotyledonen Pflanzen, insbesondere Raps, Soja und Sonnenblume.
b) Pflanzen, die der Stärkeproduktion dienen, wie beispielsweise Mais, Weizen oder Kartoffel.
c) Pflanzen, die als Nahrungs- und/oder Futtermittel und/oder Nutzpflanze genutzt werden und bei denen eine Resistenz gg. Pathogene vorteilhaft wäre, wie beispielsweise Gerste, Roggen, Reis, Kartoffel, Baumwolle, Flachs, Lein.
d) Pflanzen, die zur Produktion von Feinchemikalien wie beispielsweise Vitaminen und/oder Carotinoiden dienen können, wie beispielsweise Raps .
"Zellpopulation" meint jede Gruppe von Zellen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung einer Transformation unterworfen werden kann und von der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren transfor- mierte transgene Zellen erhalten und isoliert werden können. Besagte Population kann dabei beispielsweise auch ein Gewebe, eine Zellkultur usw. sein.
"2-DOG sensitiver-Wirtsorganismus" oder "2-DOG sensitive Zell- population" meint im Rahmen des erfindungsgemäßen Selektionsverfahrens alle diejenigen der oben genannten Organismen und von denen abgeleitete Zellen, auf die 2-DOG direkt oder indirekt (z.B. durch einen durch den Wirtsorganismus hergestellten 2-DOG Metabo- liten) einen toxischen Effekt auszuüben vermag.
"Toxischer Effekt" einen messbaren, negativen Einfluss auf die Physiologie eines Organismus (z.B. einer Pflanze) oder einer davon abgeleiteten Zelle und kann dabei Symptome wie beispielsweise jedoch nicht einschränkend ein vermindertes oder gestörtes Wachstum, eine verminderte oder gestörte Photosyntheserate, eine verminderte oder gestörte Zellteilung, eine verminderte oder gestörte Membranausbildung, eine verminderte oder gestörte Sprosse- longation, eine verminderte oder gestörte Regeneration einer vollständigen Organismus (z.B. einer Pflanze) aus Zellkultur oder Kallus usw. umfassen. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgreich transformierten Zellen weisen - anders ausgedrückt - gegenüber den nicht-transformierten einen Wachstumsvorteil oder Selektionsvorteil unter Einwirkung von 2-DOG auf. Wachstums- oder Selektionsvorteil ist dabei breit zu verstehen und meint beispielsweise die Tatsache, dass besagte transformierte Zellen in der Lage sind, Schösslinge auszubilden und/oder zu vollständigen Pflanzen regenerierbar sind, wohingegen die nicht-transformierten Zellen dies nicht oder nur mit deutlicher Verzögerung realisieren können.
Die zum Erzielen eines toxischen Effektes vorteilhaften toxischen Konzentrationen an 2-DOG können je nach Organismus, Zeil- oder Gewebeart, Entwicklungsstadium etc. unterschiedlich sein. Insbesondere kann die toxische Konzentration auch von Zellkulturbedingungen wie beispielsweise dem Angebot weiterer Kohlenstoffquellen (z.B. metabolisierbarer Kohlenhydrate) abhängig sein. Ferner sollte die eingesetzte 2-DOG Konzentration nicht zu hoch gewählt werden, da ansonsten eine effiziente Detoxifizierung unter Umständen nicht gewährleistet werden kann. In der Regel können 2-DOG Konzentrationen in einem Bereich von ungefähr 10 bis 5000 mg/1, bevorzugt 20 bis 2000 mg/1, besonders bevorzugt 50 bis 1000 mg/1, am meisten bevorzugt 100 bis 500 mg/1 eingesetzt werden.
"Selektion" meint das Identifizieren und/oder Isolieren von erfolgreich transformierten pflanzlichen Zellen aus einer Popula- tion nicht-transformierter Zellen unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei ist es nicht zwingend erforderlich, dass die Selektion unmittelbar nach der Transformation direkt mit den transformierten Zellen erfolgt. Es ist auch möglich, die Selektion erst zu einem späteren Zeitpunkt, ja sogar bei einer späte- ren Generation der aus der Transformation resultierenden pflanzlichen Organismen (bzw. von diesen abgeleiteten Zellen, Geweben, Organen oder Vermehrungsgut) vorzunehmen. So können beispielsweise Arabidopsispflanzen direkt mit z.B. der Vakuuminfiltrationsmethode transformiert werden (Clough S & Bent A (1998) Plant J 16(6) : 735-43/ Bechtold N et al. (1993) CR Acad Sei Paris 1144 (2) :204-212) und ergeben infolge transgene Samen, welche anschließend der Selektion ausgesetzt werden können.
Die Tatsache, dass die weitere Nukleinsäuresequenz "in Kombina- tion mit" der Expressionskassette für das DGRl-Protein transformiert wird, ist breit zu verstehen und meint, dass mindestens eine weitere Nukleinsäuresequenz und mindestens eine der besagten transgenen Expressionskassetten funktionell, physikalisch-chemisch oder andersartig gekoppelt sind, so dass das Vorliegen der Expressionskassette in einer Zelle - und des damit verbundenen Selektionsvorteils - das parallele Vorliegen der weiteren Nukleinsäuresequenz als wahrscheinlich anzeigt. Die weitere Nukleinsäuresequenz und die Expressionskassette können dabei bevorzugt, jedoch nicht zwingend, Teil eines einzigen Nuklein- säurekonstruktes (z.B. eines Transformationsvektors) sein. Sie können jedoch auch getrennt, beispielsweise im Rahmen einer Co-Transformation eingeführt werden und auch so ihre Funktion im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wahrnehmen.
"Einführen" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet sind, eine Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine erfindungsgemäße Expressionskassette) direkt oder indirekt, in einen Organismus (z.B. ein Pflanze) oder eine Zelle, Komparti- ment, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial (z.B. Samen oder Früchte) derselben einzuführen oder dort 'zu generieren. Das Ein- bringen kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz besagter Nukleinsäuresequenz führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen) . Einführen umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation. Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet.
Das Einführen einer erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zel- len, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen Expressionskassetten enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakte- rien sein. Die transgenen Expressionskassetten können in den Vek- tor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle insertiert werden. Der entstandene Vektor kann zunächst in E.coli eingeführt und amplifiziert werden. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewon- nen. Restriktionsan.alyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z.B. der Expressionsvektor) oder RNA in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylen- glycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protopla- stenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zum Einführen von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al . (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231; De- Block et al . (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for
Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds . ) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Als Vektoren zur Expression in E.coli sind bevorzugt pQE70, pQE60 und pQE-9 (QIAGEN, Inc.); pBluescript Vektoren, Phagescript Vektoren, pNH8A, pNHlδa, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc. ) .
Bevorzugte Vektoren zur Expression in Säugerzellen umfassen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl und pSG (Stratagene Inc.); pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL (Pharmacia Biotech, Inc.). Als induzierbare Vektoren seien pTet-tTak, pTet-Splice, pcDNA4/T0, pcDNA4/TO / LacZ, pcDNA6/TR, pcDNA4/TO/Myc-His /LacZ, pcDNA4/TO/Myc-His A, pcDNA4/TO/Myc-His B, pcDNA4/T0/Myc-His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc.) oder die pMAM-Serie (Clontech, Inc.; GenBank Accession No. : U02443) zunennen. Diese stellen bereits das induzierbare regulatorische Kontrollelement beispielsweise für eine chemisch, indu- zierbare Expression zur Verfügung.
Vektoren für die Expression in Hefe umfassen beispielhaft pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9 , pPIC3.5, PHIL-D2, PHIL-Sl, pPIC3SK, pPIC9K, und PA0815 (Invitro- gen, Inc. ) .
Klonierungsvektoren und Techniken zur genetischen Manipulation von Ciliaten und Algen sind dem Fachmann bekannt (WO 98/01572; Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1(3) :239-251; Dunahay et al. (1995) J Phycol 31:10004-1012).
Prinzipiell sind für die Transformation tierischer Zellen oder von Hefezellen ähnliche Verfahren wie für die "direkte" Transformation von pflanzlichen Zellen anzuwenden. Insbesondere Verfahren wie die Calciumphosphat oder Liposomen vermittelte Transformation oder aber Elektroporation sind bevorzugt. Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapi- tel 6/7, S. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Haiford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56 (1) : 62-73) . Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Auf ahme, Calciumphosphat-vermittelte Transformation, DEAE- Dextran-vermittelte Transformation, Liposomen vermittelte Trans- formation (Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29:1353ff; US 4,536,475), biolistische Verfahren mit der Genkanone ("parti- cle bombardment" Methode; US 5,100,792; EP-A 0 444 882; EP-A 0 434 616; Fromm ME et al . (1990) Bio/Technology. 8(9):833-9; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, Elektroporation (EP-A 290 395, WO 87/06614), Mikroin- jektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP-A 0 331 083, EP-A 0 175 966) oder andere Methoden der direkten DNA-Einführung (DE 4 005 152, WO 90/12096, US 4,684,611). Physikalische Methoden der DNA-Einführung in pflanzliche Zellen sind im Überblick beschrieben bei Oard (1991) Biotech Adv 9:1-11.
Im Falle dieser "direkten" Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt . Ein- fache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, Ml3mp Reihe,
PACYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist es erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektio- nierbares Markergen befindet .
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobakterium (z.B. EP 0 116 718), virale Infektion mittels viraler Vektoren (EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161) oder mit- tels Pollen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611) durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Transformation mittels Agrobakterien, die "entwaffnete" (disarmed) Ti-Plasmidvektor enthalten, wobei deren natürliche Fähigkeit zum Gentransfer auf Pflanzen genutzt wird (EP-A 0 270 355; EP-A 0 116 718). 5
Agrobakterium-Transformation ist weit verbreitet für die Transformation von Dicotyledonen, wird aber auch zunehmend auf Mono- cotyledonen angewandt (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep 7:379-384; Zhang
10 et al. (1988) Theor Appl Genet 76:835-840; Shimamoto et al.
(1989) Nature 338:274-276; Datta et al . (1990) Bio/Technology 8: 736- 740; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9:957-962; Peng et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao et al. (1992) Plant Cell Rep 11:585-591; Li
15 et al. (1993) Plant Cell Rep 12:250-255; Rathore et al. (1993) Plant Mol Biol 21:871-884; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; D'Hal- luin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505; Walters et al. (1992) Plant Mol Biol 18:189-200; Koziel et al. (1993) Biotechnology
20 11:194-200; Vasil IK (1994) Plant Mol Biol 25:925-937; Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102:1077-1084; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10:1589-1594; WO 92/14828; Hiei et al. (1994) Plant J 6:271-282) .
25 Die für die Agrobakterium-Transformation meist verwendeten Stämme Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid) , das auf die Pflanze nach Agrobakterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA) , wird in das Genom der Pflanzen-
30 zelle integriert. Alternativ können durch Agrobakterium auch binäre Vektoren auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden. Die Agrobakterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die sich direkte Transformationstechniken für jeden
35 Zelltyp eignen.
Die Anwendung von Agrobakterium tumefaciens für die Transformation von Pflanzen unter Verwendung von Gewebekulturexplantaten ist beschrieben (u.a. Horsch RB et al. (1985) Science
40 225:1229ff .; Fraley et al . (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80:
4803-4807; Bevans et al. (1983) Nature 304:184-187). Viele Stämme von Agrobakterium tumefaciens sind in der Lage, genetisches Material - beispielsweise die erfindungsgemäßen Expressionskassetten - zu übertragen, wie z.B. die Stämme EHA101 [pEHAlOl] ,
45 EHAl05[pEHAl05] , LBA4404 [pAL4404] , C58Cl[pMP90] und
C58Cl[pGV2260] (Hood et al. (1993) Transgenic Res 2:208-218; Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-181; Koncz and Schell (1986) Gen Genet 204:383-396; Deblaere et al. (1985) Nucl Acids Res 13: 4777-4788) .
Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet, die sowohl in E.coli als auch in Agrobakterium replizieren können. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen "und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobakterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobakterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobakterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP-A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al.(1984) Nucl Acids Res 12:8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.
Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Raps, verwendet wer- den, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engi- neering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 15-38; Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionssysteme enthalten.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können auf der Basis des erfindungsgemäßen Selektionsverfahrens (oder aber auch unter Nutzung anderer gegebenenfalls von den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren umfassten selektio- nierbarer Marker (s.o.)) identifiziert und isoliert (d.h. selektiert) werden. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen von 2-DOG (oder ggf. eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides) zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten vorzugs- weise kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be- kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen, einzelnen Zellen (z.B. Protoplasten) oder Blattscheiben aus (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press) . Aus diesen noch undifferenzierten Callus-Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533).
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermeh- rung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression eines Zielgens und die Auswirkung auf den Phäno- typ der Pflanze an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Selektionsverfahren im Rahmen der Pflanzenbiotechnologie zur Erzeugung von Pflanzen mit vorteilhaften Eigenschaften eingesetzt . So kann Eignung der Pflanzen oder deren Samen als Nahrungs- oder Futtermittel verbes- sert werden, beispielsweise über eine Veränderung der Zusammensetzungen und/oder des Gehalt an Metaboliten, insbesondere Proteinen, Ölen, Vitaminen und/oder Stärke. Auch können Wachstumsrate, Ertrag oder die Resistenz gegen biotische oder abiotische Stressfaktoren erhöht werden. Vorteilhafte Effekte können sowohl durch transgene Expression von Nukleinsäuren oder Proteinen als auch durch gezielte Verminderung der Expression endogener Gene hinsichtlich des Phänotypes der transgenen Pflanze erzielt werden. Die in der transgenen Pflanze zu erzielenden vorteilhaften Effekte umfassen beispielsweise:
Erhöhte Resistenz gegen Pathogene (biotischer Stress)
Erhöhte Resistenz gegen Umwelteinflüsse wie Hitze, Kälte, Frost Trockenheit, UV-Licht, oxidativen Stress, Nässe, Salz etc. (abiotischer Stress)
Erhöhte Ertragsleistung
- Verbesserte Qualität z.B. erhöhter Nährwert, erhöhte Lagerfähigkeit
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen, bevorzugt der transge- nen Pflanzen, und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, wie beispielsweise Enzymen, Vitaminen, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Triacylglyceriden, Lipiden, Ölen, Fettsäuren, Stärke, Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das DGRl- Protein aus P. olsonii
2 . SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz kodierend für das DGRl- Protein aus P. olsonii
3. SEQ ID NO : 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für das D0GR1-
Protein aus Saccharomyces cerevisiae
4. SEQ ID NO: 4 Aminosäuresequenz kodierend für das D0GR1-
Protein aus Saccharomyces cerevisiae 5. SEQ ID NO: 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Fusionsprotein aus DGRl und DOGRl
6. SEQ ID NO: 6 Aminosäuresequenz kodierend für ein Fusions- 5 protein aus DGRl und D0GR1
7. SEQ ID NO: 7 Oligonukleotidprimer DGRlPst
5 ' -CTGCAGATGGCAACCCCCCAAACAGT-3 '
10 8. SEQ ID NO: 8 Oligonukleotidprimer DGRlBam
5 ' -GGATCCTTATCTAGATCCCCTCGAAGTC-3 '
9. SEQ ID NO: 9 Oligonukleotidprimer DGRlNcoI
5 ' -CCATGGCAACCCCCCAAACAGT-3 ' 15
10. SEQ ID NO: 10 Oligonukleotidprimer DGRlSal
5 ' -GTCGACTTATCTAGATCCCCTCGAAGTC-3 '
11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotidprimer KR-05 20 5 x-GGGCGCCCGGTTCTTTTTG-3 *
12. SEQ ID NO: 12 Oligonukleotidprimer KR-06
5 -ACACCCAGCCGGCCACAGTCG-3 λ
25 13. SEQ ID NO: 13 Oligonukleotidprimer KR-13
5 ' -ATGCCCGATCGMGCTCAAGT-3 '
14. SEQ ID NO: 14 Oligonukleotidprimer KR-14
5 ' -CCTGACCCAAACATCTCGGC-3 ' 30
15. SEQ ID NO: 15 Oligonukleotidprimer KR-07
5 v -CCACAGCGCCGAAGTCCTCT-3 λ
16. SEQ ID NO: 16 Oligonukleotidprimer KR-08
35 5 λ-GTCCGTATCCCTCACCATCATCTC-3 λ
17. SEQ ID NO: 17 Oligonukleotidprimer KR-09
5 λ -CCATGGCAGAATTTTCAGCTGATCTAT-3 λ
40 18. SEQ ID NO: 18 Oligonukleotidprimer KR-10
5 -TACTCAGGCCCTTGTCAAAGG-3 λ
19. SEQ ID NO: 19 pUC Plasmid (pNIT18) umfassend die Nukleotid- sequenz des Nitrilase-I Promotors aus 45 Arabidopsis thaliana Abbildungen
Fig. 1 Schematische Darstellung der DGRl-Nukleinsäuresequenz mit einigen Restriktionsschnittstellen.
DGRl : kodierende Region von DGRl . Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen mit ihrer Position.
Fig. 2 Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsvektors pAD- GAL4-2.1-DGR1 zur Expression von DGRl (Abkürzungen: Amp:
Ampicillinresistenz; Adhl-prom: Promotor der Alkoholde- hydrogenase 1; Adhl-term: Transkriptionsterminator der Alkoholdehydrogenase 1; fl-origin: fl-Replikations- ursprung zur Replikation in E.coli; 2μ-origin: 2μ-Re- plikationsursprung zur Replikation in Hefe; DGRl:
Nukleinsäuresequenz kodierend für DGRl Marker aus P. olsonii; LEU2 : Leucin-Komplementierungsmarker) . Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen mit ihrer Position.
Fig. 3 2-DOG-Resistenzsteigerung nach Transformation von pAD- GAL4-2.1-DGR1 in S. cerevisiae CL3ABY S86.
Der Resisistenz-vermittelnde Effekt von DGRl wurde anhand der 2-DOG-Resistenz von DGRl-transformierten (DGRl) und nicht-transformierten ("Wildtyp", WT) Hefen ermittelt. Dazu wurden die Hefen in SD-Medium mit 1% Fructose bis zum Beginn der stationären Wachstumsphase kultiviert (48 h) und davon Aliquote (je 10 μl) einer 10~2, 10-3, 10"4 bzw. 10-5 Verdünnung (Bahn 1, 2, 3 bzw. 4) auf
SD-Agar-Platten mit 1% Fructose und den entsprechenden DOG-Konzentrationen ausplattiert. Diese Platten wurden anschließend 5 d bei 30°C inkubiert . Man erkennt eine signifikante Steigerung der Resistenz gg. 2-DOG.
Fig. 4 Konstruktionsschema für das Plasmid YEpll2-DGRl.
(Abkürzungen: Amp(r): Ampicillinresistenz; Adhl-p: Promotor der Alkoholdehydrogenase 1; Adhl-t: Transkriptions- terminator der Alkoholdehydrogenase 1; 2μ-origin: 2μ-Re- plikationsursprung zur Replikation in Hefe; DGRl: Nukleinsäuresequenz kodierend für DGRl Marker aus P. olsonii ; TRPl : Tryptophan-Komplementierungsmarker . ) . Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen. Fig. 5A Konstruktionsschema für das Plasmid pBi-Nit-P-DGRl .
(Abkürzungen: LB/RB: Linke bzw. recht T-DNA-Grenze; Nit- P: Nitrilase-I Promotor; nos-T: nos-Terminator, nos-P: nos-Promotor; nptll: Kanamycinresistenzgen, OCS-T OCS- Terminator, DGRl: Nukleinsäuresequenz kodierend für DGRl Marker aus P.olsonii) . Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen.
Fig. 5B Konstruktionsschema für das Plasmid pBi-Nit-P-DOGRl . (Abkürzungen: LB/RB: Linke bzw. recht T-DNA-Grenze; Nit-
P: Nitrilase-I Promotor; nos-T: nos-Terminator, nos-P: nos-Promotor; nptll: Kanamycinresistenzgen, OCS-T OCS- Terminator, D0GR11: Nukleinsäuresequenz kodierend für DOGRl Marker aus s.cerevisae) . Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen.
Fig. 6 Effizienz der selektiven Regeneration sechs Wochen nach Transformation des originalen Hefegens DOGRl (weiße Säulen) and des P. olsonii Gens DGRl (gestreifte Säulen) . Die Regeneration fand während der gesamten sechs Wochen in Gegenwart der jeweils angegebenen selektiven Komponente statt. Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt. Die Anzahl der eingesetzten Explantate betrug zwischen 100 und 250 für die Transformation von DGRl and zwischen 20 and 70 für das Gen D0GR1.
Fig. 7 Selektive Regeneration von Tabakexplantaten nach Transformation der 2-DOG Resistenz verleihenden Gene DOGRl und DGRl in Gegenwart von 500, 600 and 700 mg/1 2-DOG. Die Abbildung wurde fünf Wochen nach Versuchsbeginn aufgenommen.
Fig. 8: DOGRl und DGRl Transkripte in transgenen und nicht- transformierten Tabaklinien. a) mit P32 markierten DOGRl (Hefegen) und DGRl (Penicil- liumgen) Sonden hybridisierter Blot,
b) RNA Agarosegel unmittelbar vor Transfer der RNA auf die Nylonmembran 1: WT, 4: GFP - Kontrolle;
7, 8, 9: hybridisiert mit dem DOGRl Gen und 10, 11, 12 transgene Tabaklinien, die das Penicilliumgen DGRl tragen, hybridisiert mit der entsprechenden Sonde.
Fig. 9: HPLC-Profile zum Nachweis von 2-DOG-6-P in radioaktiv markierten Hefestämmen mit und ohne DGRl Beispiele:
Allgemeine Methoden:
5 Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S.896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro-
10 phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor
15 Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463- 5467) .
20
Beispiel 1: Isolation und Charakterisierung der Nukleinsäuresequenz kodierend für den erfindungsgemäßen Selektionsmarker aus P. olsonii.
25 Aus einem P. olsonii Stamm wurde die Nukleinsäuresequenz (cDNA; SEQ ID NO: 1) kodierend für den erfindungsgemäßen Selektionsmarker isoliert. Die cDNA kodiert für ein offenes Leseraster (ORF) von 786 Nukleotiden und damit für ein 261 Aminosäuren umfassendes Protein (SEQ ID NO: 2) . Da der aus P. olsonii gescreent ORF die
30 Resistenz gegenüber 2-DOG beeinflusst, wurde das entsprechende Gen als DGRl-Gen, das Protein als DGRlp bezeichnet. Das Protein zeigt keine signifikante Homologie zu dem bekannten Genprodukt des D0GR1-Gens (Anmerkung: Das D0GR1-Gen kodiert für eine 2-Deo- xyglukose-6-phosphat Phosphatase aus S. cerevisiae; EP-A 0 870
35 836; Kunze et al. (2001) Molecular Breeding 7:221-227).
Anhand der Aminosäuresequenz ließen sich folgende potentielle Eigenschaften ableiten:
40 Anzahl der Aminosäuren: 261, theoretisches Molekulargewicht: 28,561 kDa, theoretischer pl : 4,87,
Ausgehend von einer P. olsonii Phagemid-Genbank wurde das Plasmid 45 pAD-GAL4-2.1-DGRl mittels Helferphagen, wie im „Instruction
Manual - HybridZAP-2.1 Two-Hybrid cDNA Gigapack Cloning Kit and HybridZAP-2.1 Two-Hybrid cDNA Synthesis Kit" der Fa. Stratagene beschrieben, ausgeschnitten, im E.coli-System vermehrt und in die Hefe S. cerevisiae SEY6210 [α leu2-3 - 112 ura3-52 his3-Δ200 trplΔ901 lys2-801 suc2-Δ9] (Robinson JS, Klionsky DJ, Banta LM, Emr SD (1988) Mol Cell Biol 8: 4936-4948) nach der im „Instruc- tion Manual - HybridZAP-2.1 Two-Hybrid cDNA Gigapack Cloning Kit and HybridZAP-2.1 Two-Hybrid cDNA Synthesis Kit" der Fa. Stratagene beschriebenen Prozedur transformiert und auf SD-Medium (Rose MD et al. (1990) Methods in yeast genetics. A laboratory course anual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York) mit 1 % Glucose plus 1 mg/ml DOG ausplattiert. Unter diesen Bedingungen ist der untransformierte S. cerevisiae Stamm SEY6210 nicht mehr in der Lage zu wachsen.
Die Analyse von S. cerevisiae C13ABY S86/pAD-GAL4-2.1-DGRl zeigte, dass sie auf flüssigem und festem SD-Medium plus 2-D0G- Konzentrationen bei denen der entsprechende Ausgangsstamm kein Wachstum aufweist, wachsen können. Für diese Analyse wurden die Transformanten in SD-Medium mit 1% Fructose (unter diesen Bedingungen ist der Ausgangsstamm sensitiver gegenüber 2-DOG) für 48 h kultiviert, geerntet und entsprechende Verdünnungsstufen auf SD- Medium mit 1% Fructose plus 2-DOG ausplattiert und alles für 5 Tage bei 30°C inkubiert. Im Gegensatz zum Ausgangsstamm S. cerevisiae C13ABY S86, der bis maximal 0,2 mg/ml DOG Wachstum aufweist, lassen sich die Transformanten auch noch auf SD-Platten mit 1% Fructose und 0,5 mg/ml 2-DOG kultivieren. Damit weisen sie eine Steigerung in der Resistenz gegenüber 2-DOG auf (Fig.5) .
Beispiel 2 : Etablierung der DRGl-kodierenden Sequenz als Selektionsmarker in S. cerevisiae
Zur Testung der Eignung von DGRl als Selektionsmarker für die Hefetransformation wurde die für DGRl kodierende Nukleinsäuresequenz in ein S. cerevisiae Expressionsplasmid eingebaut, diese in S. cerevisiae transformiert und die Hefetransformanten über ihre Resistenz gegen 2-DOG selektiert.
Dazu wurde zunächst die für DGRl kodierende Nukleinsäuresequenz mittels PCR aus dem sie umfassenden Plasmid pAD-GAL4-2.1-DGRl amplifiziert, wobei die Primer DGRIPst und DGRlBam (Tab. 1; SEQ ID NO: 7 und 8) so gewählt wurden, dass das Amplifikationsprodukt von den Erkennungsregionen der Restriktionsendonukleasen PstI bzw. BamHI flankiert war. Dieses Fragment wurde in das S. cerevisiae Expressionplasmid YEP112A1NE (Riesmeier JW et al. (1992) EMBO J 11:4705-4713) zwischen den ADHl-Promotor und dem ADHl-Ter- minator von S. cerevisiae eingebaut. Der ADHl-Promotor ist ein starker konstitutiver Promotor und bewirkt eine konstitutive Expression von Dgrlp in S. cerevisiae (Fig. 7) .
Tabelle 1: Primer zur Amplifikation des DGRl-Gens
Figure imgf000044_0001
Das Plasmid YEpll2-DGRl wurde anschließend in S. cerevisiae SEY6210 nach der Methode von Ito et al. (Ito T et al. (1987) J Bacteriol 169:4171-4176) transformiert und die Transformanten über die Resistenz gegenüber 2-DOG bzw. die Komplementation der trpl Mutation durch das TRPl-Gen selektiert. Dazu wurden sie auf
1) SD-Agar mit 1% Fructose ohne Tryptophan, 2) SD-Agar mit 1% Fructose ohne Tryptophan mit 0,5 mg/ml 2-DOG und
3) SD-Agar mit 1% Fructose mit Tryptophan plus 0,5 mg/ml 2-DOG
ausplattiert.
Bei Nutzung allein des TRPl-Selektionsmarkers werden Transformationsfrequenzen von 5,0 x 102 Transformanten pro μg DNA erreicht. Wird gleichzeitig über den TRP1- und den DGRl-Selektionsmarker selektiert, kommt es zu einem geringen - statistisch insignifi- kanten - Abfall in der Transformationsfrequenz.
Wird auf die Resistenz gegenüber 2-DOG selektiert, so lassen sich im Gegensatz zu den Kontrollen (Versuchsansatz ohne DNA) 2-DOG- resistente Kolonien erhalten. Diese waren auf die Gegenwart des entsprechenden Plasmides zu prüfen. Dazu wurden die Kolonien sowohl auf die Komplementation des TRPl-Selektionsmarkers als auch auf das Vorhandensein des zur Transformation genutzten Plasmides geprüft. 80 bis 90% aller 2-DOG-resistenten Kolonien komplementierten auch die trpl-Mutation. Für die Überprüfung der in den Hefetransformanten S. cerevisiae SEY6210/YEpll2-DGRl enthaltenen Plasmide wurde deren pDNA isoliert und in E. coli retransformiert. Von den dabei erhaltenen E. coli-Transformanten wurde die pDNA isoliert und deren Restriktionsmuster mit dem des zur Transformation genutzten Plasmides verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Restriktionsmuster der Plasmide von S. cerevi- siae SEY6210/YEpll2-DGRl mit dem des Ausgangsplasmides YEpll2-DGRl identisch waren.
Tabelle 2: Transformationsfrequenzen von S. cerevisiae SEY6210 mit dem Plasmid Yepll2-DRG1 nach Selektion über den
Auxotrophie- und/oder DGRl-Marker.
Figure imgf000045_0001
Beispiel 3 Etablierung der DGRl-kodierenden Sequenz als Selektionsmarker zur Transformation von Pflanzen
Die DGRl kodierende Sequenz wird im Vergleich zum Hefegen D0GR1 hinsichtlich ihrer Eignung als Selektionsmarker für die Pflanzen- transformation getestet werden. Zu diesem Zweck werden die folgenden Konstrukte wie folgt hergestellt:
3.1 Herstellung des Konstruktes pBiNit-P-DOGRl
Das in EP-A 0 870 836 beschriebene Konstrukt BINAR-DOGRl wird wie das den Nitrilase-I Promotor aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U38846, Nukleotide 3862 bis 5342; GenBank Acc . -No . : Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200) umfassende Konstrukt pNitlδ (SEQ ID NO: 19) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut . Der in dem Konstrukt BINAR-DOGRl enthaltene Promotor wird dadurch deletiert. Dieses Fragment und das Nitrilase-I Promotor tragende Fragment aus pNitlδ werden anschließend ligiert, was zu dem Binärplasmid pBi- Nit-P-DOGRl führt (Fig. 5A) .
3.2 Herstellung des Konstruktes pBiNit-P-DGRl
Die Plasmide pBiNit-P-DOGRl und das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pAD-GAL4-2.1-DGRl werden mit den Restriktionsenzymen Ncol und Sall verdaut. Dadurch kann das originale Hefegen DOGRl aus dem Plasmid pBiNit-P-DOGRl entfernt und durch das DGRl tragende Ncol- Sall Fragment ersetzt werden (Fig. 5B) . Dazu wurde zunächst die für DGRl kodierende Nukleinsäuresequenz mittels PCR aus dem sie umfassenden Plasmid pAD-GAL4-2.1-DGRl amplifiziert, wobei die Primer DGRlNcoI und DGRlSall (Tab. 1; SEQ ID NO: 9 und 10) so gewählt wurden, dass das Amplifikationsprodukt von den Erken- nungsregionen der Restriktionsendonukleasen Ncol bzw. Sall flankiert war. Durch Ligation des von pBiNit-P-DOGRl verbleibenden Vektorfragmentes mit dem oben beschriebenen Ncol/Sall-verdauten DGRl-PCR Produkt wird das Plasmid pBiNit-P-DGRl erhalten.
3.3 Verwendung von DGRl als Selektionsmarker für die Transformation von Tabak
Für die Transformation von Tabak werden die Nukleinsauresequenzen kodierend für DOGRl (aus Saccharomyces cerevisiae) und DGRl (cDNA aus P. olsonii) im Vergleich transformiert. Zu diesem Zweck werden die oben beschriebenen Vektoren pBiNit-P-DOGRl bzw. pBiNit- P-DGRl. Die beiden Konstrukte werden separat in den Agrobakte- rienstamm EHA105 übertragen und jeweils für drei unabhängige Experimente verwendet.
Blattstücken von jungen in vitro Pflanzen des Kultivars Nicotiana tabacum cv. SNN werden in ca. 1 cm2 Stücke geschnitten und in eine Petrischale, die ca. 20 ml flüssiges MS Medium enthält, in dem die pelletierten Agrobakterien resuspendiert werden, zum Zwecke ihrer Infektion überführt. Die optische Dichte der Agrobakterien- suspension sollte zwischen 1 und 2 (ODgoonm) liegen und ergibt sich durch Resuspendierung in demselben Volumen der zentrifugier- ten Übernachtkultur, die in Kanamycin haltigem (50 mg/1) YEB Medium erfolgt .
Die Infektion findet für ca. 20 Minuten bei Raumtemperatur unter langsam rotierendem Schütteln statt . Anschließend wird die Agro- bakteriensuspension abgesaugt und die Blattstücke für die Co-Kul- tur auf festes MS Medium übertragen. Die Platten werden mit Para- film verschlossen und im Dunkeln bei 24°C für zwei Tage inkubiert. Danach werden die Explantate unter selektiven Bedingungen wie folgt regeneriert. Die Explantate beider Transformationsansätze (DOG^l und DGRl) werden auf festes MG Medium (MS mit 1,6 % Glukose, 1 mg/1 BAP, 0,2 mg/1 NAA, 500 mg/1 Timentin) sowie mit un- terschiedlichen 2-DOG Konzentrationen (500, 600 bzw. 700 mg/1) übertragen und bei 24°C im schwachen Licht (50 bis 100 μM/m2s) inkubiert. Alle zwei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium. Wie oben erwähnt, werden jeweils drei unabhängige Experimente durchgeführt. In Experiment I wird der 2-DOG Selektionsdruck nach 6 Wochen entfernt, bei den beiden folgenden Experimenten bleibt 2-DOG während der gesamten Regeneration im Medium. Fig. 6 zeigt das Ergebnis der quantitativen Auswertung der selektiven Regeneration nach sechswöchiger Kultur. Die Anzahl der eingesetzten Explantate beträgt zwischen 100 und 250 für die Transformation von DGRl and zwischen 20 and 70 für das Gen DOGRl. DGR zeigt insofern eine signifikant bessere Effizienz bei der Selektion entsprechend transformierter Tabakzellen.
Bei den 2-DOG Selektionen wurden Unterschiede in Abhängigkeit des verwendeten Gens deutlich. Bei Verwendung des Hefegens DOGRl wurden Regenerationseffizienzen von 35 % "(500 mg/1 2-DOG) , 15 % (600 mg/1 2-DOG) und 21 % (700 mg/1 2-DOG) erfasst während nach Einsatz von DGRl aus P. olsonii bei den entsprechenden 2-DOG Konzentrationen Regenerationseffizienzen von 49 %, 60 % bzw. 56 % registriert wurden. (Fig. 10 zeigt repräsentative Explantate aus den Versuchsvarianten nach fünf wöchiger Regenerationszeit) .
Überraschenderweise konnte bei der Mehrzahl der Experimente keine Korrelation zwischen 2-DOG verursachten Schädigungen der Explantate und der 2-DOG Konzentration festgestellt werden. Meistens sahen die Explantate, die in Gegenwart von 600 und 700 mg/1 2-DOG regeneriert worden sind besser aus als diejenigen, die mit 500 mg/1 2-DOG inkubiert worden waren. Diese Beobachtung war unabhängig davon ob DGRl oder DOGRl als Selektionsmarker verwendet wurde.
Nachdem die regenerierten Sprosse bewurzelt waren, wurden sie mit Hilfe der genomischen PCR Analyse hinsichtlich ihrer Transgenizi- tät analysiert. Dabei wurde das Gen nptll, das sich in beiden Expressionskonstrukten ebenso wie die 2-DOG Resistenz verleihenden Selektionsmarker auf der T-DNA befand, amplifiziert . Da eine nptll positive Reaktion auch durch die Gegenwart kontaminierender Agrobakterien DNA verursacht werden kann, ist als Kontrollreaktion das Agrobakteriengen virD2' amplifiziert worden. Bei virD2 positiven Proben ist eine Entscheidung über die Transgenizität nicht möglich.
Tabelle 3 : Ergebnis der genomischen PCR Analyse putativ transgener Tabakpflanzen, die, wie angezeigt selektiert worden sind. In Experiment I erfolgte die 2-DOG Selektion für sechs Wochen. Anschließend wurden die Explantate, die bis zu diesem Zeitpunkt kleine Sprossansätze entwickelt hatten, 2-DOG-frei weiter kultiviert. In Experiment II war 2-DOG während der gesamten Regeneration in den jeweiligen Konzentrationen anwesend.
Figure imgf000048_0001
Σ: insgesamt getestete Tabakpflanzen nptll+: Anzahl der auf nptll positiv getesteten Tabakpflanzen virD+ : Anzahl der auf virD positiv getesteten Tabakpflanzen
Im Falle der 2-DOG selektierten Pflanzen zeigten sich Unterschiede zwischen den beiden Experimenten. Wenn 2-DOG nach sechs wöchiger Regenerationszeit (Experiment I) abgesetzt wird, sind - nach Transformation mit dem DOGRl-Gen - drei von 12 (500 mg/1 2-DOG) , drei von 11 (600 mg/1 2-DOG) bzw. fünf von zehn (700 mg/1 2-DOG) regenerierten Pflanzen nicht transgen. Pflanzen aus Experiment II sind dagegen - unabhängig ob mit DOGRl oder DGRl trans- formiert - bis auf eine Ausnahme (DGRl - 500 mg/1 2-DOG) alle transgen. Da die Versuchsauswertung hinsichtlich der selektiven Regenerationseffizienz noch zu einem Zeitpunkt vorgenommen worden ist, wo bei allen Experimenten 2-DOG bis zum Zeitpunkt der Auswertung anwesend war, können diese Effizienzen als tatsächliche " Transformationseffizienzen angenommen werden. Das bedeutet, dass DGRl - unter den hier zugrundeliegenden experimentellen Bedingungen - signifikant höhere Transformationseffizienzen bei Tabak liefert als das das bekannte D0GR1.
Einige der transgenen Pflanzen wurden hinsichtlich der Gegenwart der 2-DOG Resistenz verleihenden Sequenz (DOGRl bzw. DGRl) überprüft (Tab. 4) . Tabelle 4: PCR-Analyse nptll positiv getesteter Tabaklinien hinsichtlich der Gegenwart die 2-DOG Resistenz verleihenden Sequenz (D0GR1 bzw. DGRl) .
Figure imgf000049_0001
^ Σ: Anzahl der insgesamt getesteten nptll positiven Linien
DOGRl+ Positiv auf D0GR1 getestet
DGR1+ Positiv auf DGRl getestet n.d. nicht durchgeführt
25 Transgene Pflanzen, die für das nptll Gen positiv getestet worden sind, enthielten in der Regel auch die 2-DOG Resistenz verleihende Sequenz .
4.1.1. Genomische PCR Analyse
30
Von den zu testenden, putativ transgenen Pflanzen sowie von nicht transformierten Wildtyppflanzen wurde die genomische DNA aus ca. 100 mg Material junger Blätter von in vitro Pflanzen mit Hilfe des Qiagen DNeasy plant mini kit (Katalog-Nr. 69106) nach den In¬
35 struktionen des Herstellers isoliert. Die DNA wurde in 100 μl resuspendiert. 5 μl der so isolierten DNA wurde in einer Gelelektrophorese auf Qualität und Quantität geprüft . 2 μl der so isolierten DNA sind jeweils für eine PCR Reaktion eingesetzt worden. Das nptll Gen wird durch die Verwendung der beiden Primer KR-05 40 und KR-06 amplifiziert wobei ein Fragment von 515 bp entsteht. Als Kontrolle für die Gegenwart von kontaminierender Agrobakterium tumefaciens DNA wird das Gen virD2 mit den Primern KR-07 und KR-08 amplifiziert. Das entsprechende Fragment hat eine Größe von
338 bp (Tab. 5) . Der PCR-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen: 5 17,5 μl H20 2,5 μl lOx Puffer 2,0 μl dNTPs 1,25 μl jeden Primers 2,0 μl genomische DNA
0,1 μl Taq Polymerase (Takara, Japan)
Folgende Inkubationsschritte liefen ab:
95°C - 5 min
62°C - 1 min
72°C - 1 min
95°C - 0,5 min
24 malige Wiederholung der Schritte 2 bis 4 62°C - 1 min
72°C - 10 min
4°C - Stop
Im Ansehluss an die PCR Reaktion sind 5 μl der einzelnen Proben mit 5 μl Stopperlösung (10 mM Tris HCl, pH 8,0, 50% Glyeerin, 0,05 % SDS, 0,2 % Xylencyanol) versetzt und in einem l%igen Agarosegel aufgetrennt worden. Nach Ablauf der elektrophoreti- schen Trennung bei 100 V für 30 min wurde das Gel unter UV-Licht ausgewertet.
Tab. 5: Primer für die PCR-Analyse
Figure imgf000050_0001
Beispiel 5 Herstellung des Transformationsvektors pSUN3-Nit- P-DGR1
Das Asp718/HindIII Fragment (die Nitrilasel Promoter: :GUS Fusion enthaltend) wird in das Plasmid pSUN3 (WO 02/00900) ebenfalls mit Asp718/HindIII gespalten, kloniert. Mittels Restriktionsanalyse wird das entstandene Konstrukt pSUN3-Nit-P-DGRl überprüft.
Beispiel 6 : Verwendung von DGRl als Selektionsmarker für die Transformation von Raps
Für die Transformation von Raps wird das oben beschriebene (Beispiel 5) Konstrukt pSUN3-Nit-P-DGRl verwendet, das sowohl das nptll Gen als auch das Gen DGRl enthält und demzufolge die Selek- tion sowohl für Kanamycin- als auch für 2-DOG Resistenz erlaubt. Das Konstrukt wird in den Agrobakterium tumefaciens Stamm GV3101 übertragen und für drei unabhängige Transformationsexperimente verwendet .
Oberflächen-sterilisierte Rapssamen werden auf das Keimungsmedium MSB5 [MSB5 (Duchefa) , 3% Saccharose, 0,8% Agar, pH5,8] gelegt. Die Keimung findet für 4 d bei 24°C und einer Lichtintensität von < 50 μMol/m2s statt.
Ein Tag vor der Transformation wird ausgehend von einer Glyzerinkultur (1 ml, in 10% Glyzerin, aufbewahrt bei -80°C, hergestellt durch Mischung von 900 μl einer ÜN + 100 μl steriles Glyeerin) 50 ml YEB Medium [5 g/1 Beef extract, 1 g/1 Yeast Extract, 5 g/1 Peptone, 5 g/1 Sucrose, 0,49 g/1 MgS04] + 100 mg/1 Spectinomycin beimpft. Die Kultur wird für ca. 24 h bei 28°C unter Schütteln angezogen.
Am Tag des Transformationsstarts werden von den vier Tage alten Keimlingen die Kotyledonen mit ihren Petiolen präpariert. Die Pe- tiolen werden derart in das Co-culturmedium [Keimungsmedium, allerdings pH5,2, + 0,5 g/1 MES, + 0,5 mg/1 GA3 + 3,75 mg/1 BAP] gesteckt, daß das Cotyledo den Agar nicht berührt. Um ein Austrocknen der Sämlinge während der Präparation zu vermeiden, werden nur 5 Sämlinge zeitgleich aus dem Keimungsbecher entnommen. Sobald die Petiolen eines Sämlings präpariert worden sind, werden diese sofort ins Co-Kulturmedium überführt.
Nachdem die Präparation abgeschlossen ist werden die Explantate einzeln herausgenommen und die Petiolen für ca. 2 bis 3 Sekunden in die Agrobakterium tumefaciens Suspension getaucht. Das Cotyledo sollte dabei nicht benetzt werden. Unmittelbar danach werden die infizierten Explantate für die dreitägige Co-Kultur in das Medium auf die gleiche Weise zurückgesteckt ( max. 20 pro Platte) . Die optische Dichte der Bakteriensuspension wird bestimmt und mit flüssigem Co-Kulturmedium derart verdünnt, dass sich eine optische Dichte von 0 , 5 ergibt . 10 ml der so einge- stellten Bakterienkultur werden in kleine Petrischalen gefüllt, die für das Dippen verwendet werden. Eine Schale wird für das Dippen von maximal 300 Petiolen verwendet. Die Co-Kultur findet für 3 Tage bei 24°C im schwachen Licht (ca. 50 μMol/m2s) statt. Nach der Co-Kultur werden die Explantate (10 Explantate pro Platte) auf Regenerationsmedium (Co-Kulturmedium + 18 mg/1 Kana- mycin, + 300 mg/1 Timentin) überführt. Alle 4 Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium. Sobald die Explantate einen oder mehrere recht gut entwickelte Sprosse gebildet haben, werden sie in ELRO-1 Medium (MS Medium, 2% Saccharose, pH 5,8, 0,5% Agar, 100 mg/1 myo-Inositol, 40 mg/1 Adeninsulfat, 500 mg/1 MES, 0,0025 mg/1 BAP, 150 mg/1 Timentin, 15 mg/1 Kanamy- cin, 0,1 mg/1 IBA) überführt.
Wenn die Elongation beginnt und die Sprosse gut entwickelte Sprossachsen haben, werden sie vom Explantat getrennt. Sobald Wurzeln gebildet werden, erfolgt die Probennahme für die PCR Analyse. Die sprossbildenden Explantate werden fortlaufend numme- riert. Jeder Sproß dieses Explantates bekommt eine separate Nr. - Beispiel 23/1 bedeutet erster Sproß von Explantat 23.
ELRO-2 Medium entspricht ELRO-1 Medium ohne BAP. Es wird bei Bedarf für schwer bewurzelbare Sprosse verwendet.
Tabelle 6 enthält die Ergebnisse der ersten drei unabhängigen Transformationsexperimente.
Tab. 6: Transformation des Gens DGRl in Raps. Transgene Pflanzen werden parallel für Kanamycin- und für 2-DOG Resistenz selektioniert.
Figure imgf000053_0001
PTE = "preliminary transformation efficiency" (vorläufige Transformationseffizienz) definiert wie folgt: Vorläufige Transforma- 3Q tionseffizienz in %,. die sich aus der Anzahl transgener in vitro Pflanzen bezogen auf die Anzahl der zur Transformation eingesetzten Explantate ergibt.
In drei unabhängigen Experimenten wird parallel sowohl für 300, 35 400 und 500 mg/1 2-DOG Resistenz als auch für Kanamycin Resistenz selektioniert. Putative transgene in vitro Pflanzen werden mit Hilfe der genomischen PCR auf die Gegenwart der Gene nptll, DGRl und virD2 geprüft. Alle virD2 negativen Pflanzen bedeuten, dass keine kontaminierende Agrobakterium tumefaciens DNA anwesend sind 4Q (Ergebnis nicht gezeigt) . Die Selektion transgener Pflanzen ist bei einer Konzentration von 300 mg/1 2-DOG möglich. Regeneration in Gegenwart von 400 und 500 mg/1 2-DOG ist nicht möglich (Daten nicht gezeigt) . Die Anzahl der Explantate, die transgene Pflanzen produzieren ist sowohl mit 2-DOG als auch mit Kanamycin gering. Λ B Doch die wenigen Explantate produzieren etliche Pflanzen, von denen jedoch nicht klar ist, ob sie das Ergebnis unabhängiger Transformationsereignisse sind oder nachträglich aus einem Transformationsereignis entstanden sind.
Mit Hilfe der 2-DOG Selektion wird eine vorläufige Transformati- onseffizienz von 1 bis 5,5 erzielt während die Kanamycin-Selek- tion 2,8 bis 7,3% liefert. Dies zeigt, dass eine Selektion mit 2-DOG unter Verwendung des DGRl-Markers mit einer der Kanamycin- Selektion vergleichbaren Effizienz erfolgt.
Beispiel 7 : In vivo Experiment zur Charakterisierung des DGRl Genproduktes unter Verwendung von Tabak-Pflanzenmaterial
Im Folgenden wird ein Experiment erläutert, dessen Ergebnis zeigt, das das Penicillium olsonii DGRl Genprodukt im Gegensatz zu dem Genprodukt des aus der Hefe stammenden Gens D0GR1 nicht für eine 2-DOG-6-P Phosphatase codiert. Das bedeutet, dass der durch das Penicillium Gen DGRl bewirkte 2-DOG Resistenzmechanismus nicht auf einer Dephosphorylierung von 2-DOG-P beruht, wie er in Patent EP-A 0 870 836 für das Hefegen D0GR1 beschrieben ist.
Der Nachweis einer eventuellen in vivo Funktionalität der 2-DOG-6-P Phosphatase wird wie folgt durchgeführt: Blattscheiben (ca. 100 mg Frischgewicht) von transgenen Tabakpflanzen, die entweder das Penicillium Gen DGRl bzw. das Hefegen D0GR1 tragen oder zur Kontrolle ein beliebiges Fremdgen (z.B. Green Fluorescen Protein - GFP) , dessen Genprodukt nicht an der Ausprägung der 2-D0G Resistenz beteiligt ist, exprimieren sowie von nicht transformierten Kontrollpflanzen werden für 24 Stunden im Dunkeln in 300 mM 2-DOG Lösung inku-biert. Anschließend werden die Blattscheiben eine Minute mit Wasser gewaschen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Extraktion der Metabolite wird das Pflanzenmaterial in auf Trockeneis vorgekühlten Mörsern zu einem feinen Pulver homogenisiert und mit 1,5 ml 16 % (w/v) Trichlor- essigsaure (TCA) in Diethylether (vorgekühlt auf 4°C) versetzt. Anschließend werden die Homogenate für 15 Minuten auf Trockeneis inkubiert. Durch Zugabe von 0,8 ml 16% TCA, 5 mM EGTA werden die Metabolite gelöst. Nach Transfer der Homogenate in Eppendorfge- fäße werden diese 3 Stunden bei 4°C inkubiert . Anschließend werden die Proben 5 Minuten bei 15.000 rpm und 4°C in einer Biofuge 15R (Heraeus) zentrifugiert . Die wäßrige Phase wird in Eppendorfge- fäße überführt und 4mal mit wassergesättigtem Ether gewaschen. Danach werden die Proben mit 5 M KOH/1 M Triethanolamin-Gemisch neutralisiert und für 1 Minute mit Stickstoff begast. Die so vor- bereiteten Proben werden mittels HPLC analysiert. Für die Analyse wird ein HPLC System der Firma Dionex verwendet, welches mit einer PA-1 (4x250 mm) Säule und einem gepulsten elektrochemischen Detektor ausgestattet ist. Vor der Injektion werden die Proben für 2 Minuten bei 13.000 rpm abzentrifugiert . Metabolite werden anschließend mit einem 50-minütigen konkaven Gradienten von 1 mM bis 500 mM Natriumacetat nach 40 Minuten bei 10 mM NaOH und einer Durchflußrate von lml/min eluiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung von 2-DOG-6-P wird als Standard 2-DOG-6-P der Firma Sigma verwendet.
Wie in Tabelle 7 dargestellt, führt die Expression der 2-DOG-6-P Phosphatase codiert von dem Hefegen D0GR1 wie erwartet zu einer Verminderung der 2-DOG-6-P Akkumulation. Dies ist jedoch nicht der Fall bei Expression des Penicillium Gens DGRl. Das Ausbleiben der Verminderung der 2-DOG-6-P Akkumulation legt nahe, dass das DGRl Genprodukt keine Phosphataseaktivität besitzt.
Tab. 7: Nachweis von 2-DOG-6-P in Blattscheiben von transgenen und nichttransformierten Tabakpflanzen.
Figure imgf000055_0001
Die Daten entsprechen den Mittelwerten + Standardabweichung.
Ob die in Tabelle 7 zusammengefaßten Ergebnisse lediglich auf Expressionsunterschiede der beiden 2-DOG Resistenz verleihenden Gene zurückgeführt werden müssen oder tatsächlich durch die Wirkung unterschiedlicher Genprodukte zustande kommen, sollen Northernblot Analysen klären. Das gleiche Blattmaterial, das für die HPLC Analysen zur Quantifizierung des 2-DOG-6-P ver- wendet worden ist, wird für einen semiquantitativen Vergleich der Expressionslevel der beiden Gene verwendet. Hierzu werden ebenfalls Blattproben der ins Gewächshaus überführten Pflanzen geerntet und für die Extraktion der Gesamt-RNA verwendet . Die Extraktion der Gesamt RNA, ihre gelelektrophoretische Auftrennung sowie ihr nachfolgender Transfer auf eine Nylonmembran, die schließlich zur Hybridisierung eingesetzt wird, ist in dem Patent EP-A 0 870 836 beschrieben.
Abb. 8 zeigt die Akkumulation von D0GR1 bzw. DGRl Transkripten in transgenen Tabakpflanzen, die die entsprechenden Gene tragen. Wildtyppflanzen bzw. transgene Pflanzen, die das Reportergen GFP besitzen, akkumulieren erwartungsgemäß keine entsprechenden Transkripte. Da jeweils alle drei Linien (7, 8, 9 bzw. 10,11,12) ihre 2-DOG Resistenz verleihenden Gene exprimieren, sind die oben beschriebenenen Unterschiede in den 2-DOG-6-P Mengen nicht durch Expressionsunterschiede, sondern mit großer Wahrscheinlich- 5 keit durch Unterschiede im Wirkmechanismus zu erklären.
Beispiel 8 : In vivo Experiment zur Charakterisierung des DGRl Genproduktes unter Verwendung von Hefekulturen
10 Ein vom bekannten 2-DOG-6-P Phosphatasesystem abweichender Wirkmechanismus kann auch mit Hilfe von Hefekulturen unter Verwendung von radioaktiv markiertem 2-DOG erbracht werden. Dazu werden der S. cerevisiae DGRl-Stamm gemeinsam mit seinem DGRl-freien Ausgangsstamm als Kontrolle (siehe Beispiel 1) in Gegenwart von
15 14C-2-D0G für 5 Stunden (Pulse) in flüssigem Minimalmedium kultiviert und anschließend für weitere 3 Stunden ohne radioaktiv markiertes 2-D0G inkubiert (Chase) . Nach dem 5-stündigen Pulse als auch nach dem 3-stündigen Chase werden die Zellen durch Zentri- fugation bei 8.000 rpm für 10 Minuten bei 4°C geerntet und dreimal
20 mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wird das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und wie im Beispiel 7 beschrieben aufgeschlossen. Akkumuliertes 2-DOG-6-P wird durch HPLC Analyse detektiert (Abb. 9) . Dabei zeigt es sich, dass 2-DOG-6-P während des 5-stündigen „Pulses" sowohl in Kontroll-
25 zellen als auch in Zellen des DGRl-Stammes akkumuliert wird.
Diese Akkumulation erklärt sich durch die Aufnahme des radioaktiv markierten 2-DOG und seine Phoyphorylierung durch die Hefe-eigene Hexokinase. Auch in dem sich anschließenden 3-stündigen „Chase" ist in beiden Stämmen noch das Phosphat nachweisbar. Wenn DGRl 0 für eine 2-DOG-6-P Phosphatase codieren würde, so sollte diese Akkumulation sowohl während des „Pulses" als auch während des „Chases" unterbleiben oder doch mindestens deutlich niedriger sein als bei dem DGRl-freien Kontrollstamm. Da dies jedoch nicht der Fall ist, ist ein anderer als der bekannte Phosphatase- 5 mechanismus für DGRl bzw. sein Genprodukt naheliegend.
0
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Claims

Patentansprüche
1. Aminosäuresequenz, kodierend für ein Protein, das eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose zu verleihen vermag, wobei die Aminosäuresequenz eine Sequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus
a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
b) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
c) funktioneilen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes derselben, die eine Homologie von mindestens 60 % zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment derselben aufweisen.
2. Aminosäuresequenz nach Anspruch 1, wobei die Sequenz zusätzlich eine Aminosäuresequenz kodierend für eine 2-Deoxy- glucose-6-phosphat Phosphatase umfasst.
3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 , wobei die Sequenz die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 und die Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 4 umfasst.
4. Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei die Aminosäuresequenz durch die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 beschrieben ist.
5. Nukleinsauresequenzen kodierend für eine Aminosäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 5 umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus
a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, und
b) Sequenzen, die sich entsprechend dem degenerierten genetischen Code von einer Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 ableiten, und
Figuren + Sequenzen c) Sequenzen, die eine Homologie von mindestens 40 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 aufweisen.
7. Transgene Expressionskassetten zur Expression der erfindungs- gemäßen Nukleinsauresequenzen in Wirtsorganismen oder davon abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut (wie z.B. Samen oder Früchten) umfassend
a) mindestens einen Promotor, der zur Regulation der Transkription in mindestens einem WirtsOrganismus befähigt ist, und
b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus
i) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
ii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäure- sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
iii) funktioneilen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes derselben, die eine Homologie von min- destens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment derselben aufweisen,
wobei der Promotor a) und die besagte Nukleinsäuresequenz b) funktionell miteinander verknüpft sind und die Nukleinsäuresequenz b) in Bezug auf. den Promotor a) oder den Wirtsorganismus heterolog ist .
8. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei die Aminosäuresequenz wie in einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.
9. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei der Promotor ein in Pflanzen oder davon abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut funktioneller Promotor ist .
10. Transgener Expressionsvektor enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 oder mindestens eine transgene Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9.
11. Transgener Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, mindestens eine transgene Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 oder mindestens einen transgenen Expressionsvektor gemäß Anspruch 10.
12. Transgener Organismus nach Anspruch 11 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, nicht-menschlichen Tieren und Pflanzen, oder davon abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut.
13. Transgener Organismus nach Ansprüche 12 , dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen.
14. Verfahren zur Selektion transgener Organsismen oder Zellen, umfassend nachfolgende Schritte:
I. Einführen mindestens einer Expressionskassette umfassend
a) mindestens einen Promotor, der zur Regulation der Transkription in besagten Zellen befähigt ist, und
b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von
Sequenzen bestehend aus
i) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
ii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und
iii) funktioneilen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder eines funktionell äqui- valenten Fragmentes derselben, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment derselben aufweisen,
in Kombination mit mindestens einer weiteren Nukleinsauresequenzen in Zellen einer 2-Deoxyglucose-sensitiven Zellpopulation, wobei der Promotor a) und die besagte Nukleinsäuresequenz b) funktionell miteinander verknüpft sind und die Nukleinsäuresequenz b) in Bezug auf den Pro- motor a) oder den Wirtsorganismus heterolog ist, und II. Behandlung besagter Zellpopulation mit einer 2-Deoxy- glukose in einer Konzentration, die für nicht-trans- formierte Zellen der Zellpopulation einen toxischen Effekt hat, und
5
III. Selektion von transformierten Zellen, die in ihrem Genom •mindestens eine der besagten weiteren Nukleinsäuresequenz aufweisen und die gegenüber nicht-transformierten Zellen einen Wachstumsvorteil aufweisen, aus besagter Zell- 10 population.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz wie in einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist .
15 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei zusätzlich eine transgene Expressionskassette umfassend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine 2-Deoxyglukose- 6ph.osph.at Phosphatase eingebracht wird.
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