PT709462E - Regeneração rápida e eficiente de plantas transgénicas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "REGENERAÇÃO RÁPIDA E EFICIENTE DE PLANTAS TRANSGENICAS" A presente invenção refere-se a plantas geneticamente modificadas. Refere-se particularmente a um método para regenerar células de plantas gue tenham sido transformadas.

ANTECEDENTES

Durante a última década, tem-se tornado possivel a transferência de genes de um largo espectro de organismos para plantas de cultivo através da tecnologia do DNA recombinante. Este avanço forneceu enormes oportunidades para aumentar a resistência de plantas a pestes, doenças e herbicidas, e para modificar os processos biossintéticos para alterar a gualidade dos produtos das plantas (Knutson et al., PNAS, USA 89, 2624-2628, (1992); Piorier et al.,

Science, 256, 520-523, (1992); Vasil et al.,

Bio/Technology, 10, 667-674, (1992)). No entanto, a viabilidade de um método de transformação eficiente para introduzir DNA estranho tem sido uma barreira substancial para a maioria das espécies monocotiledóneas, incluindo milho, arroz, aveia, cevada, e particularmente trigo. São normalmente utilizados dois métodos de transformação alternativos para as espécies monoco- 2 ΡΕ0709462 tiledóneas: transferência directa de DNA para protoplastos isolados e distribuição de DNA mediada por microprojéctil (Shimamoto et al., Nature, 338, 274-276, (1989); Fromm et al., Bio/Technology, 8, 833-839 (1990)).

Os métodos dos protoplastos têm sido largamente utilizados em arroz, onde o DNA é entregue aos protoplastos através dos lipossomas, PEG, e electroporação. Enguanto que um grande número de plantas transgénicas têm sido recuperadas em diversos laboratórios (Shimamoto et al., (1989); Datta et al., Bio/Technology, 8, 736-740, (1990)), os métodos dos protoplastos requerem o estabelecimento de culturas embriogénicas em suspensão de longo prazo. Alguns regenerantes de protoplastos são inférteis e fenotipi-camente anormais devido à cultura em suspensão de longo prazo (Davey et al., J. of Exp. Botany, 42, 1129-1169, (1991); Rhodes et al., Science, 240, 204-207, (1988)). 0 método da distribuição de DNA mediada por microprojéctil pode utilizar embriões imaturos ou embriões imaturos derivados de calos como tecidos alvo.

As plantas transgénicas têm sido obtidas a partir do método de bombardeamento com microprojéctil no milho, na aveia, na cevada e no trigo (Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2, 603-618, (1990); Somers et al., Bio/Technology, 10, 1589-1594, (1992); Wan et al., Plant Physiol., 104, 37-48 (1994); Vasil et al. (1992)). 3 ΡΕ0709462 0 método de bombardeamento com microprojéctil demora normalmente 10 a 15 meses para obter plantas trans-génicas (Gordon-Kamm et al., (1990); Vasil et al. (1992)). Mesmo com os avanços mais recentes nos métodos de transformação utilizando embriões imaturos como tecidos alvo, são necessários ainda 4 a 6 meses para obter plantas transgénicas (Weeks et al., Plant Physiol., 102, 1077-1084, (1993) ; Vasil et al., (1992); Vasil et al., Bio/Technology, 11, 1153-1158 (1993); Becker et al., Plant J., 5, 299-307, (1994) ). Além disso, estes métodos sofrem frequentemente uma perda na fertilidade nas plantas obtidas (Vasil et al., (1993); Becker et al., (1994)). Adicionalmente, a frequência de transformação por estes métodos é muito baixa, cerca de um evento por cada mil embriões bombardeados. Esta eficiência de transformação é muito baixa para estudos genéticos e para aplicações comerciais.

Assim, existe uma necessidade não só de um método mais rápido de regeneração do tecido da planta transformada, como também existe uma necessidade de um método que retenha a fertilidade nas plantas resultantes e que produza uma eficiência de transformação mais elevada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um sistema de transformação e regeneração rápido e eficiente. A presente invenção é particularmente útil na transformação e regeneração de plantas de trigo. As plantas regeneradas a partir deste sistema são fenotipicamente normais e totalmente 4 ΡΕ0709462 férteis. Os transgenes são transmitidos à progénie Ri de uma forma Mendeliana.

Numa versão preferencial, a presente invenção fornece um sistema de regeneração rápido e eficiente para a transformação de colheitas de monocotiledóneas utilizando embriões imaturos proliferados como tecidos alvo. 0 novo sistema demora menos de dois meses a obter plantas trans-génicas. As frequências de transformação pelo novo sistema são 5 a 100 vezes maiores do que a dos métodos normais utilizados noutros laboratórios. Este novo sistema pode ser utilizado com uma variedade de sistemas de marcadores selectivos, incluindo a selecção utilizando herbicidas, tais como o glifosato e o bialafos, bem como antibióticos tais como a canamicina. A presente invenção fornece um método para a regeneração de uma planta monocotiledónea transformada para conter DNA estranho compreendo os seguintes passos: a) isolamento de tecido regenerável a partir da planta; b) inserção no referido tecido regenerável do referido DNA estranho onde o referido DNA estranho compreende uma sequência de DNA seleccionável, onde a referida sequência pode funcionar num tecido regenerável como um marcador selectivo e manutenção do referido tecido regenerável durante um dia num meio que não contenha qualquer composto de selecção; 5 ΡΕ0709462 c) colocação do referido tecido regenerável do passo b) num meio capaz de produzir brotos a partir do referido tecido onde o referido meio contém adicionalmente um composto utilizado para seleccionar o tecido regenerável contendo as referidas sequências de DNA seleccionáveis; e d) após pelo menos um broto ser formado a partir do passo c) , é efectuada a transferência do broto para um segundo meio capaz de produzir raizes a partir do broto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção pode ser utilizada em qualquer espécie de planta. É particularmente útil para espécies monocotiledóneas. Mais particularmente, é útil em espécies de plantas que não conseguem permanecer num estado de calo por longos períodos de tempo sem perder a capacidade de se regenerar. Uma espécie particularmente útil na presente invenção é o trigo. A presente invenção, quando aplicada ao trigo, possui a vantagem de ser genotipicamente independente. Isto é, pode ser utilizada em qualquer tipo de variedade de trigo, incluindo tanto trigo de inverno como trigo de primavera. Pode ser utilizada para produzir plantas de trigo transgénicas de culturas de primavera, tais como, por exemplo, Bobwhite e Marshall bem como de culturas de inverno, tais como, por exemplo, Neeley. 6 ΡΕ0709462 A presente invenção é utilizada para introduzir DNA estranho em tecidos de plantas regeneráveis. Pode ser inserido qualquer tipo de DNA estranho nas espécies de plantas utilizando o método da presente invenção. Normalmente, o "DNA estranho" pode ser definido para incluir qualquer tipo de DNA que seja inserido numa célula de planta com excepção do da própria célula da planta. Os métodos de inserção de DNA em células de planta são normalmente bem conhecidos, tais como o bombardeamento utilizando um engenho descrito na Patente dos E.U.A. No. 5, 179, 022 . O tipo de DNA incluido no DNA estranho pode incluir DNA que já esteja presente na célula da planta, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente, ou um DNA criado externamente, tal como uma sequência de DNA contendo uma mensagem anti-sentido de um gene da planta, ou uma sequência de DNA que codifica uma versão sintética de um gene onde a sequência de nucleótidos tenha sido modificada.

Numa versão preferencial, o DNA estranho contém uma sequência de DNA que pode funcionar num tecido de planta regenerável como um marcador selectivo. Tal DNA pode incluir um gene que poderá funcionar num tecido de planta regenerável para produzir um composto que poderá conferir ao do tecido da planta resistência para um composto tóxico diferente. Estes genes são bem conhecidos na área e podem conferir resistência a compostos tais como antibióticos como a canamicina (Dekeyser et al., Plant Physiol., 90, 7 ΡΕ0709462 217-223, (1989)), e herbicidas como o glifosato (Della-

Cioppa et al., Bio/Technology, 5, 579-584 (1987)) e o bialafos (Vasil, et al., (1992)). Outros marcadores selectivos podem ser utilizados dentro do âmbito da presente invenção. 0 primeiro passo na presente invenção é isolar tecido regenerável da planta. Qualquer tecido de planta regenerável pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Tecido de planta regenerável refere-se normalmente a tecido que após a inserção de DNA estranho pode ser regenerado numa planta diferenciada. Por exemplo tais tecidos podem incluir calos e/ou embrióides a partir de anteras (Zhou e Konzak, Crop Sei., 29, 817-821 (1989)), micrósporos (Ziauddin et al., Plant Cell Rep., 11, 489-493 (1992)), inflorescências (Barcelo et al., Plant Journal, 5, 583-592, (1994)) e tecidos da folha (Conger et al., Plant

Cell Reports, 6, 345-347, (1987)).

Numa versão da presente invenção, um embrião imaturo de uma planta é utilizado como material de inicio. Os embriões imaturos podem ser produzidos utilizando métodos conhecidos descritos na técnica. Por exemplo, a produção de embriões imaturos de trigo é descrita por Weeks et al., (1993) e Vasil et al., (1993).

Noutra versão preferencial da presente invenção, os tecidos de planta regenerável são calos. Os calos preferido são os calos embriogénicos. Os calos embrio- ΡΕ0709462 génicos são produzidos a partir de embriões imaturos. Estes calos podem ser produzidos isolando e cultivando embriões imaturos num meio de nutrientes com hidratos de carbono e reguladores do crescimento da planta. Na versão preferencial da presente invenção, quando se produzem calos embriogénicos a partir de trigo, a eliminação do eixo embrionário como descrito por Nehra et al., Plant J., 5, 285-297, (1994) não é necessária.

Os meios de produção de calos são bem conhecidos na técnica e pode ser utilizado qualquer meio de cultura ou método de preparação. Na versão preferencial, onde os calos de trigo são preparados, um embrião imaturo de trigo é cultivado durante 1 dia até um mês, preferencialmente durante 4 a 7 dias, num meio MS modificado contendo maltose a 40 g/1 e 2,4-D a 2 mg/1. Noutra versão, o 2,4-D pode ser substituído por uma combinação de 2,4-D a 0,5 mg/1 e picloram a 2,2 mg/1. O meio é solidificado por GELRITE® a 2 g/1 ou por agarose de baixa de fusão a 4 g/1.

Assim que o tecido regenerável da planta é isolado, o segundo passo do método é introduzir o DNA estranho no tecido da planta. Este processo é referido aqui também como "transformação". Qualquer método pode ser utilizado para inserir o DNA estranho no tecido regenerável da planta. Tais métodos incluem o bombardeamento (Weeks et al., (1993); Vasil et al., (1992)), a transformação por Agrobacterium (Chan et al., Plant Molecular Biology, 22, 491-506, (1993)), a electroporação de tecidos regeneráveis (Shillito et al, Bio-Technology, 3, 1099-1103, (1985)) e a 9 ΡΕ0709462 distribuição de genes facilitada por protoplastos (Shimamoto et ai., (1989); Datta et ai., (1990)).

Numa versão preferencial, o tecido regenerável é transformado utilizando o método de bombardeamento. Nesta versão, é também preferível que seja utilizado um tecido de calo, mais preferencialmente um calo embriogénico Após o bombardeamento, este calo pode crescer durante um curto periodo de tempo antes da regeneração ou selecção ou, de acordo com uma versão preferencial da invenção, pode imediatamente ser sujeito a ambas as condições de regeneração e selecção. Com outros métodos de transformação, este periodo pode ou não ser desejável, dependendo do método de selecção utilizado.

Numa versão da invenção, o tecido regenerável é crescido durante um curto periodo após o bombardeamento. O meio utilizado para este periodo de crescimento preferencialmente não contém qualquer tipo de selecção ou qualquer meio capaz de produzir brotos. A utilização de um periodo de crescimento depende do tipo de selecção utilizado. Alguns tipos de selecção beneficiam da utilização de tecido de calo maior ou mais velho antes da selecção ser aplicada. Este periodo de crescimento é de cerca de 1 dia.

Após a transformação, o tecido regenerável da planta é colocado num meio capaz de produzir brotos a partir do tecido regenerável onde o meio contém adicionalmente um composto para seleccionar tecido regenerável 10 ΡΕ0709462 contendo as sequências de DNA seleccionáveis. Isto contrasta com a técnica anterior onde o tecido regenerável da planta é normalmente sujeito primeiramente a um período prolongado de selecção antes da exposição do tecido regenerável a um meio capaz de produzir brotos. O meio utilizado neste passo pode ser qualquer meio que permita a formação de brotos a partir de tecido regenerável. Numa versão, um composto de produção de brotos é adicionado ao meio. Estes compostos de produção de brotos são bem conhecidos na técnica (Murashige e Skoog, Physiol. Plant, 15, 473-497, (1962); Kasha et al., Gene Manipulation in Plant Improvement II, 213-239, (1990)). Tais compostos incluem fracos reguladores de crescimento de plantas e incluem IAA, IBA, e BA a baixas concentrações (Becker et al., (1994); Vasil, et al., (1992)). Noutra versão da invenção, pode ser utilizada um meio sem um regulador de crescimento de plantas para induzir a formação de brotos (Weeks et al., (1993)).

Numa versão preferencial, o meio onde um calo de trigo embriogénico é regenerado, compreende um meio MS modificado com 2,4-D a 0,2 mg/1 (Murashige e Skoog, (1962); Wan e Lemaux, (1994)).

Na presente invenção o tecido regenerável da planta é geralmente colocado neste meio o mais rapidamente possível após a transformação. Normalmente, isto pode variar de 1 dia a três semanas, mas preferencialmente de 1 dia a duas semanas. Mais preferencialmente o tecido é 11 ΡΕ0709462 transferido para este meio uma semana a duas semanas após a transformação. Ainda mais preferencialmente, a transferência ocorrerá entre 5 e 11 dias. 0 composto utilizado para seleccionar o tecido regenerável contendo as sequências de DNA seleccionáveis pode ser qualquer um de uma variedade de compostos de selecção bem conhecidos, tais como antibióticos e herbicidas. Os compostos preferenciais podem incluir a canamicina (Dekeyser et al., (1989)), glifosato (Della-Cioppa et al. , (1987)), e bialafos (Vasil et al., (1992); Weeks et al., (1993)). A disponibilidade dos agentes de selecção alternativos é um requerimento importante para a aplicação comercial na agricultura biotecnológica. A utilização de canamicina tem tido menos êxito para as culturas de cereais devido ao elevado nivel de tolerância endógeno (Dekeyser et al., (1989)). 0 bialafos tem sido largamente utilizado como um agente de selecção na transformação de culturas de cereais (Weeks et al., (1993); Vasil et al., (1993); Becker et al., (1994); Nehra et al., (1994); Wan e Lemaux (1993)). No entanto, pode ser um potencial desastre a utilização exclusiva de genes que codificam a resistência ao bialafos como um marcador seleccionável em todas as experiências de transformação. São necessários outros marcadores seleccionáveis e os nossos resultados demonstram que o sistema de regeneração rápida aqui descrito funciona bem com diferentes agentes de selecção. 12 ΡΕ0709462

Após os brotos terem sido formados os brotos são transferidos para um segundo meio capaz de produzir raizes a partir dos referidos brotos. Este meio pode conter adicionalmente um composto utilizado para seleccionar tecido regenerável contendo as sequências de DNA seleccionáveis. A transferência para este meio ocorre quando tiverem sido desenvolvidos brotos suficientes, como é conhecido normalmente na técnica. Isto ocorre, para o trigo, entre os 25 e os 40 dias após a transformação. O meio capaz de produzir raizes pode ser qualquer meio de produção de raizes. Estes meios são bem conhecidos na técnica (Weeks et al., (1993); Vasil et al., (1992)). Um meio de produção de raizes preferencial é um meio MS modificado sem qualquer regulador de crescimento de plantas (Murashige e Skoog, (1962); Zhou et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture, 30, 78-83, (1992)).

Uma vez as raizes formadas, as plantas podem então ser transferidas para o solo e crescerem seguindo os métodos conhecidos na técnica para produzir sementes.

Uma vantagem do método de transformação e regeneração acima descrito é a de que as plantas obtidas a partir deste processo são normalmente férteis. A perda de fertilidade entre plantas transgénicas utilizando métodos de técnicas anteriores crê-se ser atribuída ás culturas de longo prazo antes e depois dos tratamentos de transformação em vez do acto de transformação per si. 13 ΡΕ0709462

Outra vantagem da presente invenção é a de que os métodos de bombardeamento biolístico actuais requerem 4 a 6 meses para a obtenção de plantas transgénicas (Becker et al., (1994); Vasil et al., (1992), (1993); Weeks et al., (1993)). Os tecidos regeneráveis bombardeados destes métodos das técnicas anteriores eram subcultivados em meio de selecção durante 2 a 3 meses ou mais para permitir a proliferação de calos. Reduzindo o tempo de cultura da proliferação de calos, o método da regeneração rápida descrito aqui requer menos de 2 meses para a obtenção de plantas transgénicas. 0 uso do presente método causa também a regeneração mais rápida dos tecidos transformados. Os regenerantes eram também mais vigorosos e saudáveis tanto em cultura como no solo. 0 sistema de regeneração rápida aqui descrito produz também normalmente transformantes não quiméricos, uniformes. Com o método de regeneração rápida, os sectores de calos embriogénicos são normalmente pequenos no estádio de regeneração. Por esse motivo, apenas um único broto é regenerado a partir de cada sector de calos. A análise histoquimica para a actividade estável de GUS mostrou que os segmentos de folha de diferentes partes das plantas transgénicas eram normalmente uniformes na expressão de GUS. A análise da progénie indica também que a maioria das plantas transgénicas segregadas a taxas de 3:1 entre plantas tolerantes e sensíveis possuem um único gene dominante. 14 ΡΕ0709462

Os exemplos seguintes descrevem versões específicas da invenção. Os meios utilizados estão descritos na Tabela 9. Os exemplos são fornecidos para melhor elucidar a prática da presente invenção e não devem ser interpretados de qualquer forma de forma a limitar o âmbito da presente invenção. EXEMPLO 1: Transformação Utilizando CP4 e GOX Como Marcadores Seleccionáveis 1. Cultura de embrião imaturo Foi utilizado

ao longo deste estudo um trigo de primavera Bobwhite Triticum aestivum cv. As plantas em stock foram crescidas num ambiente controlado em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16-h a 800 ymol m“1s‘1 provida por lâmpadas de descarga de alta intensidade (HID) Sylvania (GTE

Products Corp., Manchester, NH. 03103). As temperaturas dia/noite foram de 18/16 °C. Foram retiradas das plantas cariopses imaturas 14-d após a antese. Os embriões imaturos ("IE") foram dissecados e cultivados num meio MS modificado (Sais Murashige e Skoog, Gibco BRL) suplementado com maltose a 40g/l, 2,4-D a 0,5 mg/1, e picloram a 2,2 mg/1 (CM4) . Os embriões imaturos foram cultivados a 26 °C no escuro. 1

Distribuição de DNA Cinco dias após a iniciação da cultura, foram transferidos embriões imaturos para um meio de tratamento osmótico 4-h antes do 15 ΡΕ0709462 bombardeamento. 0 meio osmótico era o mesmo de CM4 com manitol a 0,35 M. Trinta dos 40 embriões foram colocados no cento de cada placa, e os embriões foram bombardeados com uma mistura de pMON19305 e pMON19328 a uma razão de 1:1. O pMON19305 continha o gene uidA enquanto que o pMON19328 continha os genes da tolerância ao glifosato CP4 e o GOX. O CP4 é um gene da 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase bacteriana (EPSPS) que expressa uma enzima altamente resistente ao glifosato. O glifosato oxidoreductase (GOX) é um gene bacteriano que degrada o glifosato em ácido metil amino fosfónico. Todos os genes foram regulados pelo promotor de ubiquitina de milho Ubil (Christensen et al., (1992)) . Cada placa foi bombardeada duas vezes com uma pistola de pó PDS 1000. Foram observados niveis elevados da expressão transiente de GUS por cada bombardeamento em cada experiência, indicando que o método de distribuição do DNA era bastante eficiente. 3. Regeneração de plantas tolerantes ao glifosato Após um tratamento pós bombardeamento de 16-h no meio de manitol a 0,35 M, os embriões bombardeados foram transferidos para um meio CM4 (Tabela 1) para selecção durante 1-semana. Neste estádio, dois embriões de cada placa bombardeada serviram de amostras para ensaios de GUS transiente. Após uma espera de uma ou duas semanas, os embriões foram transferidos para um meio CM4 contendo glifosato a 4 mM. Após uma a duas semanas de cultura de proliferação de calos neste meio de selecção, os embriões foram transferidos para meio de regeneração contendo glifosato a 0,1 mM (Protocolo 1) . Em alguns casos, os embriões bombardeados foram transfe- 16 ΡΕ0709462 ridos directamente para o meio de regeneração uma a duas semanas após o bombardeamento (Protocolo 2) . Os brotos obtidos a partir do meio de regeneração foram transferidos para um meio de enraizamento contendo glifosato a 0,02 mM. As plantas tolerantes foram transferidas para o solo cresceram numa câmara de crescimento de ambiente controlado como descrito. Duas semanas mais tarde, as plantas foram pulverizadas com ROUNDUP® (active ingredient glyphosate, Monsanto) a 56 mg/m2 (8 oz/a).

Protocolo 1: O método de regeneração rápida da transformação para a selecção por glifosato - cultura de proliferação de calos reduzida.

Processo Janela de Tempo Cultura de IE em meio CM4 | 0-d ? Bombardear calos embrionários 1 5-d f Transferir os calos para CM4 + Gt a 4 1 mM 12-d ? Regenerar em MMS.2 + Gt a 0,1 mM após 1 semana de cultura de proliferação de calos I 19-d ¥ Enraizar em MMSO + Gt a 0,02 mM I 40-d ¥ Transferir as plantas para o solo 60-d

Protocolo 2: 0 método de regeneração rápida da 17 ΡΕ0709462 transformação para a selecção por glifosato - cultura de proliferação de calos eliminada.

Processo Janela de Tempo Cultura de IE em meio CM4 | Ί3 1 o ? Bombardear calos embrionários 1 5-d 4 Regenerar em MMS.2 + Gt a 0,1 mM após 1 semana de espera 1 12-d 4 Enraizar em MMSO + Gt a 0,02 mM i 35-d 4 Transferir as plantas para o solo 60-d

No meio de proliferação de calos, não existe diferença visual na embriogénese entre os tecidos bombardeados com e sem plasmídeos de DNA. No entanto, quando transferidos para um meio de regeneração, os brotos verdes foram regenerados a partir dos embriões transformados, enquanto que não foram recuperados nenhuns brotos a partir de controlos bombardeados sem plasmídeos de DNA. Conseguimos recuperar brotos tolerantes ao glifosato a partir da maioria das experiências. Em média, cerca de 1-2% dos embriões bombardeados produziram plantas tolerantes ao glifosato (ver Tabela 1). Sob as nossas condições de experimentação, a eficácia de transformação com o método antigo era muito baixa. Cerca de 0,05% de embriões bombardeados produziram plantas tolerantes ao glifosato 18 ΡΕ0709462 (Tabela 2). A eficiência de transformação a partir de método rápido foi 25 vezes maior do que a partir do método antigo. A frequência de transformação a partir do método antigo era equivalente à da selecção por bialafos anteriormente descrita por outros grupos (Vasil et al. 1992, 1993; Weeks et al. 1993, Nehra et al. 1994).

Tabela 1. Plantas tolerantes ao glifosato recuperadas de diferentes regimes de regeneração selectiva pelo método da regeneração rápida.

Tratamento Expt/ Trt# #I.E. # eventos # GUS pos. 1 semana de espera, regeneração directa 37-2 300 3 2 42-2 350 3 3 43-2 400 5 5 2 semanas de espera, regeneração directa 37-3 300 1 1 42-3 350 3 2 43-3 400 7 3 1 semana de espera/1 semana de proliferação de calos 43-4 400 11 11 1 semana de espera/2 semanas de proliferação de calos 42-4 175 3 3 Total 2675 36 (1 ,3%) Expt: experiência; Trt: tratamento; I .E. : embriões imaturos; GUS: β-glucuronidase. 19 ΡΕ0709462

Tabela 2. Um resumo das plantas tolerantes ao glifosato produzidas a partir dos métodos de regeneração antigo e rápido. Métodos # Expt # I. E. # eventos Freq. Meses Antigo 14 13,000 6 0,05% 4,5 Rápido 3 2675 36 1,3% 2,0 Expt: experiência; Trt: tratamento; I .E. : embriões imaturos; Freq.: frequência. 4. Ensaio de enzima de Plantas Transformadas com CP4 e GOX Proteínas puras foram extraídas a partir de folhas frescas de plantas transgénicas segundo um método da BioRad. As proteínas CP4 e GOX foram sondadas com anticorpos e calculadas como percentagens das proteínas totais. As plantas transgénicas continham 0,007-0,160% e 0, 004-0,062% de GOX, o que era equivalente a uma planta transgénica confirmada previamente (Tabela 3) . Cinco plantas transgénicas não possuíam expressão de CP4. A tolerância destas plantas ao glifosato era provavelmente conferida pelo gene GOX. 20 ΡΕ0709462

Tabela 3. Expressão estável de GUS e percentagem da proteína CP4 e GOX contida nas plantas tolerantes ao glifosato.

Linhas Transgénicas GUS Estável % CP4 % GOX 42-2-02 + 0,079 0,014 42-3-01 + 0,017 0,009 42-3-02 - 0,009 0,051 42-4-01 + 0,160 0,017 42-4-02 + - 0,007 42-4-03 + 0,106 0,022 43-2-01 + 0,079 0,038 43-2-02 + 0,037 0,017 43-2-03 + 0,017 0,018 43-2-05 + 0,028 0,028 43-3-01 + 0,030 0,017 43-3-02 - 0,007 0,004 43-3-03 - 0,008 0,004 43-3-04 + - 0,011 43-3-05 - - 0,020 43-3-06 + 0,007 0,004 43-3-07 - - 0,045 43-3-08 - - 0,027 43-4-01 + 0,070 0,062 43-4-02 + 0,022 0,012 43-4-03 + 0,019 0,042 43-4-04 + 0,151 0,035 43-4-05 + 0,034 0,044 43-4-06 + 0,076 0,028 43-4-11 + 0,016 0,017 Bobwhite 0,001 0,001 16-5 (CK+) 0,028 0,011 21 ΡΕ0709462 5. Análise da progénie de plantas tolerantes ao glifosato Embriões imaturos de plantas tolerantes ao glifosato foram isolados 20-d após a antese e cultivados num meio de germinação (meio MMS sem o regulador de crescimento da planta) com glifosato a 0,02 mM. Os embriões germinados e não germinados foram separados e guardados 10 dias após a cultura e foram analisados os dados pelo teste X2 para segregação 3:1 (Tabela 4). O teste X2 indicou que o transgene segregou a uma taxa de 3:1 como esperado. As plantas tolerantes foram então transplantadas para o solo e pulverizadas com ROUNDUP® a 56 mg/m2 (8 oz/a). Os indivíduos germinados no meio de selecção eram também tolerantes à pulverização.

Tabela 4. Teste de germinação de embriões a partir de plantas Ro tolerantes ao glifosato. o o o o Teste de Germinação Linhas transgénicas Proteína CP4 Proteína GOX Tolerância Sensibilidade 3:1 prob. 93-42-2-2 0,079 0,014 31 11 >0, 9 93-43-2-1 0,079 0,038 27 26 <0,01 93-43-2-3 0,017 0,018 48 9 >0,1 93-43-2-5 0,028 0,028 33 17 >0,1 93-43-4-1 0,070 0,062 24 10 >0,1 93-43-4-2 0,022 0,012 6 32 <0,01 93-43-4-3 0,019 0,042 39 13 >0, 9 93-43-4-4 0,151 0,035 9 29 <0,01 93-43-4-5 0,034 0,044 52 6 <0,01 Bobwhite (controlo) 0 45 22 ΡΕ0709462 EXEMPLO 2: Transformação Utilizando o Gene bar Como Marcador Seleccionável 1. Transformação e Selecção 0 método de transformação para o gene bar foi essencialmente o mesmo que o utilizado para os genes CP4 e GOX. Foram bombardeados embriões imaturos com o pAHC25, que transporta os genes bar e uiclA. Ambos os genes foram direccionados pelo promotor Ubiql. 0 gene bar codifica a fosfinotricina acetiltransferase (PAT) que acetila a fosfinotricina, o ingrediente activo do herbicida não selectivo Basta® (Hoechst AG) . Os embriões bombardeados foram transferidos para o meio MMS2 com bialafos a 4 mg/1 um dia após o bombardeamento (Protocolo 3).

Protocolo 3: 0 sistema de regeneração rápida para a transformação do gene bar.

Processo Janela de Tempo

Cultura de IE em meio MMS2 0-d 4

Bombardear calos embrionários 5-d 4

Transferir para MMS2 + bialafos a 4 mg/1 6-d 4

Transferir para MMSO + bialafos a 4 mg/1 13-d 4

Transferir para copo de gelado no mesmo meio 30-d 4

Transferir as plantas para o solo 50-d 23 ΡΕ0709462 2. Regeneração de plantas tolerantes ao blalafos A seguir a uma proliferação de calos de uma a duas semanas no meio MMS2, os embriões foram transferidos para um meio de regeneração MMSO com a bialafos a 4 mg/1. Os brotos e as plantas do meio de regeneração foram transferidos para copos de gelados com o mesmo meio para enraizamento. As plantas tolerantes ao bialafos foram recuperadas e transferidas para o solo dentro de dois meses. De um total de 828 embriões bombardeados nas três experiências, 566 embriões produziram plantas tolerantes ao bialafos (Tabela 5) . Cerca de 15% dos embriões produziram uma única planta, 20% deles duas plantas, 40% 3 plantas, e 25% 4 ou mais plantas. Cada embrião foi contabilizado como um único evento de transformação independentemente do número de plantas recuperadas. Um terço (190 dos 566) dos eventos de transformação eram GUS positivos. A actividade GUS varia muitas vezes entre os eventos individuais, desde completamente azul escuro até tiras azuis em tecidos vasculares ou pontos azuis aleatoriamente espalhados nas folhas. A frequência de transformação com a selecção de bialafos foi mais elevada do que com o glifosato sob as nossas condições experimentais, e 10 a 100 vezes mais elevada do que aquela anteriormente reportada para o trigo e a cevada (Vasil et al. 1992, 1993; Weeks et al. 1993;

Nehra et al. 1994; Wan e Lemaux 1993). 24 ΡΕ0709462

Tabela 5. Plantas tolerantes ao bialafos recuperadas pelo sistema de regeneração rápida.

Expt- Tempo de N.° de Tolerância ao bialafos GUS positivo Trt#* proliferação embriões N. ° o “O N. ° o o Expt 44-3 2 semanas 269 212 78,8 63 29, 7 Expt 46-3 1 semana 192 146 76, 0 52 35, 6 Expt 46-4 2 semanas 187 119 63, 6 42 35, 3 Expt 48-3 1 semana 90 59 65, 6 22 37,3 Expt 48-4 2 semanas 90 43 47,8 17 39, 5

Expt: experiência; Trt: tratamento; GUS: β-glucuronidase. 3. Pulverização Basta® Uma amostra de 20 plantas tolerantes ao bialafos foram transferidas para o solo e pulverizadas com Basta® a 1% (glufosinato a 200 g/1, Hoechst AG) . As plantas controlo apresentaram necroses e acastanhamento 3-d após a pulverização. As folhas danificadas tornaram-se amarelas e secaram passado pouco tempo. Dez das 20 plantas tolerantes ao bialafos não apresentaram quaisquer lesões necróticas após a pulverização. 25 ΡΕ0709462 4. Ensaio PAT As plantas tolerantes a Basta® foram analisadas relativamente à actividade PAT seguindo o método de De Block et al., (EMBO J, 6, 2513-2518, 1987). Todas as plantas tolerantes a Basta® eram PAT positivas, enquanto que não foi observada nenhuma actividade PAT nas plantas de controlo Bobwhite (Tabela 6). 5. Teste de germinação e análise da progénie

As plantas tolerantes a Basta® cresceram normalmente e formaram sementes. Os embriões imaturos das plantas foram cultivados num meio de germinação com bialafos a 2 mg/1. Os embriões imaturos de plantas controlo Bobwhite não conseguiram germinar no meio de selecção com bialafos, enquanto que os embriões das plantas tolerantes a Basta® segregaram plantas tolerantes e sensíveis. Duas das dez plantas apresentaram taxas de segregação de 3:1 como esperado. Cinco apresentavam segregação menor que 3:1 enquanto que as outras três não produziam quaisquer embriões tolerantes (Tabela 6). Desconhece-se neste estádio o que causou a segregação inesperada. Pode ter sido devida ao pequeno tamanho das amostras ou devida ao silenciamento do gene. Não obstante, a produção de plantas tolerantes ao bialafos demonstrou que o sistema de regeneração rápida é independente de marcadores seleccionáveis ou de qualquer gene de interesse. 26 ΡΕ0709462

Tabela 6. Teste de germinação para plantas Ro tolerantes ao bialafos recuperadas a partir do sistema de regeneração rápida.

Transgénicas GUS PAT Teste de Germinação Tolerância Sensibilidade 3:1 prob. 44-3-01 - + 0 30 na 44-3-02 - + 28 8 .5-.75 44-3-03 + + 21 15 <. 05 44-3-06 + + 18 8 ,25-.50 44-3-07 - + 14 15 <.01 46-3-01 + + 0 40 na 46-3-02 + + 11 31 <.01 46-3-05 + + 0 48 na 46-3-06 + + 4 32 <.01 46-3-07 - + 14 27 <. 01 Bobwhite (CK) - - 0 40 na GUS: β-glucuronidase; PAT: fosfinotricina acetiltransferase. EXEMPLO 3: Transformação Utilizando o Gene nptll Como Marcador Seleccionável 0 sistema de regeneração da transformação rápida foi demonstrado também com selecção de paromomicina para o gene nptll. 1. Cultura de embrião imaturo Foi utilizado ao longo deste estudo um trigo de primavera Bobwhite 27 ΡΕ0709462

Triticum aestivum cv. As plantas em stock foram crescidas num ambiente controlado em câmara de crescimento com _9 _i fotoperiodo de 16-h a 800 ymol m s provida por descarga de alta intensidade (HID) Sylvania (GTE Corp.)· As temperaturas dia/noite foram de 18/16 °C. Foram retiradas das plantas cariopses imaturas 13 ou 14-d após a antese e. cultivadas num meio MS modificado (Sais Murashige e Skoog, Gibco BRL) suplementado com maltose a 40g/l, 2,4-D a 0,5 mg/1, e picloram a 2,2 mg/1 (CM4) . Os embriões imaturos foram cultivados a 26 °C no escuro. 2. Distribuição de DNA Cinco dias após a iniciação da cultura, foram transferidos embriões imaturos para um meio de tratamento osmótico 4-h antes do bombardeamento. O meio osmótico era o mesmo de CM4 com manitol a 0,35 M ou manitol a 0,125 M e rafinose a 0,125 M. Aproxi-madamente 40 embriões foram colocados no cento de cada placa, e os embriões foram bombardeados com uma mistura de pMON19476 e pMON19468 a uma razão de 1:1. O pMON19476 continha o promotor 35S aumentado de CaMV (Odell et al, 1985, Kay et al. 1987), o gene NPTII (Fraley et al 1983), e o terminador NOS do gene da nopalina sintase (Fraley et al. 1983) . O pMON19468 transporta o gene uidA (que codifica a β-glucuronidase (GUS)) de Escherichia coli (Jefferson et al 1986) e o terminador NOS. Ambos os genes nptll e GUS foram regulados pelo promotor 35S (Odell et al, 1985, Kay et al. 1987) . Cada placa foi bombardeada duas vezes com uma pistola de pó PDS 1000 como descrito em detalhe por Klein et al 1987. Foram observados niveis elevados da expressão 28 ΡΕ0709462 transiente de GUS (uma média de 84 pontos por embrião) por cada bombardeamento em cada experiência, indicando que o método de distribuição do DNA era bastante eficiente. 3. Regeneração de plantas tolerantes à paromo-mlclna Após um tratamento pós bombardeamento de 18-h no meio de manitol a 0,35 M ou no meio com uma combinação de manitol a 0,125 M e rafinose a 0,125 M, os embriões bombardeados foram transferidos para um meio CM4 (Tabela 9) para selecção durante 6 ou 7 dias. Neste estádio, dois embriões de cada placa bombardeada serviram de amostras para ensaios de GUS transiente. Após uma espera de uma ou duas semanas, os embriões foram transferidos para um meio CM4 contendo paromomicina a 100, 200, ou 300 mg/1 para a proliferação de calos. Outro conjunto de embriões foram transferidos directamente para meio de regeneração contendo paromomicina a 100 ou 200 mg/1 (Protocolo 4) . Em alguns casos, os embriões bombardeados foram transferidos directamente para o meio de regeneração uma a duas semanas após o bombardeamento (Protocolo 5) . Os brotos obtidos a partir do meio de regeneração foram transferidos para um meio de enraizamento não contendo agente selectivo (Tabela 9) . As plantas foram avaliadas para GUS por análise histoquímica. As plantas positivas e algumas plantas negativas (controlos) foram transferidas para o solo e cresceram numa câmara de crescimento de ambiente controlado como descrito. 4. Análise da progénie de plantas tolerantes à 29 ΡΕ0709462 paromomicina Embriões imaturos de plantas tolerantes à paromomicina foram isolados 20-d após a antese e cultivados num meio de germinação (meio MMSO sem o regulador de crescimento da planta) com paromomicina a 10 mg/1. Os embriões germinados e não germinados foram separados e guardados 10 dias após a cultura e foram analisados os dados pelo teste X2 para segregação 3:1 (Tabela 8). O teste X2 indicou que o transgene não segregou a uma taxa de 3:1 como esperado.

Protocolo 4: O sistema de regeneração rápida para a selecção por paromomicina - cultura de proliferação de calos reduzida.

Processo Janela de Tempo Cultura de IE em meio CM4 i 0-d ¥ Bombardear calos embrionários Ϊ 4-d ¥ Transferir os calos para CM4 + paromomicina a 100 mg/1 X 9-d ▼ Regenerar em meio MMS ZR/NAA.2 após 1, 2, cultura de proliferação de calos 1 ou 3 semanas de 16-d ¥ Enraizar em MMSO ϊ 37-d ¥ Transferir as plantas para o solo 72-d 30 ΡΕ0709462

Protocolo 5: O sistema de regeneração rápida para a selecção por paromomicina - cultura de proliferação de calos eliminada.

Processo Janela de Tempo Cultura de IE em meio CM4 | T5 1 o ? Bombardear calos embrionários i 4-d f Regenerar em meio MMSZR/IAA após 5 dias de espera 1 9-d f Enraizar em MMSO 1 37-d f Transferir as plantas para o solo 72-d

No meio de proliferação de calos, alguns dos calos ficaram brancos e interromperam a proliferação enquanto que algumas partes dos calos permaneceram amarelas e proliferaram. Ambos os tecidos de calos amarelos e brancos aparentam ser compactos e embriogénicos. Os tecidos bombardeados sem DNA plasmidico não proliferaram e branquearam. Quando transferidos para o meio de regeneração, os brotos verdes foram regenerados a partir dos embriões transformados, enquanto que não foram recuperados nenhuns brotos a partir de controlos bombardeados sem plasmídeos de DNA. Conseguimos recuperar brotos tolerantes à paromomicina a partir de todas as experiências. Em média, cerca de 3-4% 31 ΡΕ0709462 dos embriões bombardeados produziram plantas GUS positivas tolerantes à paromomicina (Tabela 7). 0 protocolo 4 produziu 2 e 4% de plantas GUS positivas enquanto que o protocolo 5 produziu 0,3 a 1% de plantas GUS positivas. Ambos os protocolos produziram frequências de transformação mais elevadas do que aquelas com a selecção por bialafos anteriormente descrita por outros grupos (Vasil et al. 1992, 1993; Weeks et al. 1993).

Tabela 7. Plantas seleccionadas por paromomicina recuperadas de diferentes regimes de regeneração selectiva pelo método da regeneração rápida.

Tratamento Espera Antes da Selecção Tempo de Proliferação de Calos Cone. de Paro mg/1 Expt/Trt# # IE #Plantas #gus + 7d 3 semanas 100 88-02 400 30 4 7d 3 semanas 200 88-03 400 37 3 7d 3 semanas 300 88-04 369 35 2 5d 0 100 91-01 162 52 6 5d 0 200 91-02 161 38 3 5d 1 semana 100 91-05 365 29 1 5d 2 semanas 100 91-07 364 23 4 5d 3 semanas 100 91-09 364 21 4

Total 2585 265 27

Tabela 8. Ensaio de germinação com paromomicina em progénie 32 ΡΕ0709462

Ri a partir de plantas transformadas com o gene nptll.

Linhas Avaliação Teste de Germinação transgénicas* do Marcador Tolerância Sensibilidade 3:1 prob. 88-04-01-01 Gus (+) 30 50 <0,01 88-04-02-01 Gus (-) 26 54 <0,01 88-24-06-02 Gus (+) 36 44 <0,01 88-14-04-02 Anthro (+) 37 43 <0,01 88-35-01-01 Anthro (+) 18 14 <0,01 Controlo BW nenhum 0 80 NA * Plantas transformadas quer com: pMONl947 6 (E35S/HSP70/NPTII) + pMON19468 (E35S/HSP7 0/GUS) ou pMON19476 (E35S/HSP70/NPTII) + antocianina BC17)

Tabela 9. Meio de Cultura de Tecidos para desenvolvimento de calos de trigo, e regeneração de células de planta.

Nome do Meio MS* Hidrato de carbono por litro PH Componentes Adicionais mg/1 CM4 + 40 g de maltose 5, 8 500 de glutamina 750 de MgCl 100 de caseína hidrolisada 0,5 de 2,4-D 2,2 de picloram 33 ΡΕ0709462

Tabela 9 (continuação)

Nome do Meio MS* Hidrato de carbono por litro pH Componentes Adicionais mg/1 MMSZR/IAA + 4 0 g de maltose 5, 8 500 de glutamina 750 de MgCl 100 de caseína hidrolisada 5 de Zeatina ribosídica 1 de IAA MMS2 + 4 0 g de maltose 5, 8 2 de 2,4-D MMS . 2 + 4 0 g de maltose 5, 8 0,2 de 2,4-D MMSO + 20 g de sacarose ou 40 g de maltose 00 LO *Meio MS basal descrito em (Zhou et al. 1993) 2 g/1 de gelrite utilizado para todos os meios excepto para o meio de selecção da paromomicina que contém agarose a 4 g/1.

Lisboa, 22 de Novembro de 2006

Claims (3)

1. ΡΕ0709462 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para regenerar plantas monocoti-ledóneas transformadas para DNA estranho constituído pelos passos seguintes: a) isolamento de tecido regenerável a partir das referidas plantas; b) inserção no referido tecido regenerável do referido DNA estranho onde o referido DNA estranho compreende uma sequência de DNA seleccionável, onde a referida sequência pode funcionar num tecido regenerável como um marcador seleccionável e mantendo o referido tecido regenerável durante um dia num meio não contendo qualquer composto de selecção; c) colocação do referido tecido regenerável do passo b) num meio capaz de produzir brotos a partir do referido tecido onde o referido meio contém adicionalmente um composto utilizado para seleccionar tecido regenerável contendo as referidas sequências de DNA seleccionáveis; e d) após pelo menos um broto se formar a partir do passo c), transferir o referido broto para um segundo meio capaz de produzir raízes a partir do referido broto.
2. 2. 0 método da reivindicação 1, em que o passo c) possui uma janela de tempo entre um dia e duas semanas.
3. 3. 0 método da reivindicação 1, em que o passo c) possui uma janela de tempo entre cinco dias e onze dias. 2 ΡΕ0709462 4. 0 método da reivindicação 1, em que a referida sequência de DNA seleccionável expressa uma enzima que irá conferir resistência a pelo menos uma do grupo constituído por canamicina e paromomicina à referida célula da planta. 5. 0 método da reivindicação 1, em que a referida sequência de DNA seleccionável expressa uma enzima que irá conferir resistência ao glifosato à referida célula da planta. 6. 0 método da reivindicação 1, em que a referida sequência de DNA seleccionável expressa uma enzima que irá conferir resistência ao bialafos à referida célula da planta. 7. 0 método de qualquer das reivindicações de 1 6, em que as plantas monocotiledóneas são plantas de trigo. 8. 0 método de qualquer das reivindicações de 1 6, em que as plantas monocotiledóneas são plantas de trigo, passo a) compreende o isolamento dos calos embrio-génicos das referidas plantas; e o passo b) compreende a inserção nos referidos calos do referido DNA estranho. Lisboa, 22 de Novembro de 2006