BRPI0209536B1

BRPI0209536B1 - construto de dna que codifica transportador de adenilato em plantas e método para produzir planta com sementes tendo nível aumentado de tocoferol

Info

Publication number: BRPI0209536B1
Application number: BRPI0209536A
Authority: BR
Inventors: Henry E Valentin; Thomas J Savage; Toni Voelker; Wei Zheng
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2002-05-09
Publication date: 2016-05-10
Also published as: BR0209536A; WO2002090506A3; EP1411761B1; EP1411761A4; ATE455857T1; DE60235168D1; WO2002090506A2; AU2002308633A1; EP1411761A2

Abstract

"transportadores de metabólitos". a presente invenção está dentro do campo da genética e da bioquímica de plantas. mais especificamente, a invenção refere-se a genes associados com o transporte de trifosfatos de nucleotídeos. a presente invenção proporciona e inclui moléculas de ácidos nucléicos, proteínas e anticorpos associados com os genes envolvidos no transporte de trifosfatos de nucleotídeos. a presente invenção também proporciona métodos para utilizar tais agentes, por exemplo no isolamento genético, na análise genética e na produção de plantas transgênicas. além disso, a presente invenção inclui plantas transgênicas modificadas para expressar proteínas associadas com o transporte de trifosfatos de nucleotídeos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRUTO DÊ DNA QUE CODIFICA TRANSPORTADOR DE ADENILATO EM PLANTAS E MÉTODO PARA PRODUZIR PLANTA COM SEMENTES TENDO NÍVEL AUMENTADO DE TOCOFEROL".

Campo da Invenção A presente invenção está dentro do campo da genética e da bioquímica vegetais. Mais especificamente, a invenção refere-se a genes associados com o transporte de trifosfatos de nucleotídeos. A presente invenção proporciona e inclui moléculas de ácidos nucléicos, proteínas, e anticorpos associados com os genes envolvidos no transporte de trifosfatos de nucleotídeos. A presente invenção também proporciona métodos para utilizar tais agentes, por exemplo no isolamento genético, na análise genética e na produção de plantas transgênicas. Além disso, a presente invenção inclui plantas transgênicas modificadas para expressar proteínas associadas com o transporte de trifosfatos de nucleotídeos. Antecedentes da Invenção Os tocoferóis são um componente essencial das dietas dos mamíferos. Evidência epidemiológica indica que a suplementação de tocoferol pode resultar em diminuição do risco de doença cardiovascular e câncer, pode auilixar na função imune, e está associada com a prevenção ou retar-dação de uma série de processos de doenças degenerativas nos seres humanos (Traber e Sies, Annu. Rev. Nutr. 16: 321 - 347 (1996)). O tocoferol funciona, em parte, estabilizando a camada dupla típídica das membranas biológicas (Skrypin e Kagan, Biochim. Blophys. Acta 815: 209 (1995); Ka-gan, N. Y. Acad. Sei. p. 121, (1989); Gomez-Fernandez et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. p; 109 (1989)), reduzindo radicais livres de ácidos graxos poiiinsa-turados (PUFA), produzidos por oxidação lipídica (Fukuzawa et al., Lipids 17: 511 - 513 (1982)), e extraindo radicais livres de oxigênio, radicais peróxi de lipídeos, e espécies de oxigênio unipolar (Diplock et al., Ann, N. Y. Acad. Scí. 570: 72 (1989); Fryer, Plant Cell Environ. 15 (4): 381 - 392 (1992)). α-Tocoferol, frequentemente referido como vitamina E, pertence a uma classe de antioxidantes solúveis em lipídeos que inclui α, β, y, e õ-tocoferóis e a, β, y, e δ-tocotrienóis. Embora α, β, y, e δ-tocoferóis e a, β, y, e õ-tocotrienóis sejam algumas vezes referidos coletivamente como "vitami- na E", vitamina E é mais adequadamente definida quimicamente como a-tocoferol. a-Tocoferol é importante para a saúde humana, em parte porque é prontamente absorvido e retido pelo corpo, e tem um maior grau de bioativi-dade do que outras espécies de tocoferol (Traber e Sies, Annu. Rev. Nutr. 16: 321 - 347 (1996)). No entanto, outros tocoferóis tais como β, γ, e δ-tocoferóis, também têm importantes benefícios para a saúde e nutricionais.

Os tocoferóis são essencialmente sintetizados somente pelas plantas e alguns outros organismos fotossintéticos, inclusive cianobactérias. Em conseqüência, os tocoferóis do sistema dietético dos mamíferos são obtidos quase exclusivamente a partir destas fontes. Os tecidos das plantas variam consideravelmente no teor de totoferol total e na composição do tocoferol, com α-tocoferol a espécie de tocoferol predominante encontrada em tecidos de plantas fotossintéticas, verdes. O tecido das folhas pode conter a partir de 10 - 50 pg de tocoferóis totais por grama de peso fresco, porém a maioria das safras de fibra têxtil principais no mundo (por exemplo, arroz, milho, trigo, batata) produzem níveis baixos a extremamente baixos de tocoferóis totais, dos quais somente uma pequena percentagem é a-tocoferol (Hess, Vitamin E, α-tocopherol, In Antioxidants in Hiqher Plants. R. Alscher e J. Hess, Eds., CRC Press, Boca Raton. pp. 111 - 134 (1993)). Safras de sementes oleaginosas geralmente contêm níveis muito maiores de tocoferóis totais, porém α-tocoferol está presente somente como um componente secundário (Taylor e Bames, Chemy Ind., Oct.:722 - 726 (1981)). A ingestão diária recomendada do sistema dietético de 15 - 30 mg de vitamina E é muito difícil de atingir na dieta média americana. Por exemplo, seria necessário mais de 750 gramas de folhas de espinafre, nos quais α-tocoferol compreende 60% dos tocoferóis totais, ou 200 - 400 gramas de óleo de soja para satisfazer esta ingestão diária recomendada de vitamina E. Apesar de ser possível aumentar a dieta com suplementos, a maioria destes suplementos contém essencialmente vitamina E sintética, tendo seis estereoisômeros, enquanto a vitamina E natural é composta predominantemente de somente um único isômero. Além disso, os suplementos tendem a ser relativamente onerosos, e a população geral não está inclinada a tomar suplementos vitamínicos em uma base regular. Portanto, há a necessidade na técnica de composições e métodos que ou aumentam a produção total de tocoferol ou aumentam a percentagem relativa de -tocoferol produzidos por vegetais.

Além dos benefícios de saúde dos tocoferóis, os níveis aumentados de α-tocoferol nas colheitas têm sido associados com estabilidade aumentada e aumento da vida de armazenamento de produtos vegetais (Peterson, Cereal-Chem 72(1):21 - 24 (1995); Bali, Fat-soluble vitamin as-says in food analysis. A comprehensive review, London, Elsevier Science Publishers Ltd. (1988)). Além disso, foi demonstrado que a suplementação de tocoferol de suínos, cabeças de gado, e aves domésticas aumenta significativamente a qualidade da carne e prolonga a vida de armazenamento de produtos de carne pós-processada retardando a oxidação de lipídeos do pós-processamento, que contribui para componentes indesejáveis de sabor (Sante e Lacourt, J. Sei. Food Agríc. 65(4):503 - 507 (1994); Buckley et ai, J. of Animal Science 73: 3122 - 3130 (1995)).

Biossíntese de Tocoferol Os plastídeos de plantas superiores apresentam caminhos bioquímicos interconectados levando a metabólitos secundários inclusive tocoferóis. O caminho biossintético do tocoferol em plantas superiores envolve a condensação do ácido homogentísico e fitilpirofosfato formando 2-metil-6 fitilplastoquinol (Fiedler et al., Planta 155: 511 - 515 (1982); Soll et al., Arch. Biochem. Biophys. 204: 544 - 550 (1980), Marshall et.al, Phytochem. 24: 1705 - 1711 (1985)). Este caminho do tocoferol vegetal pode ser dividido em quatro partes: 1) síntese do ácido homogentístico, o qual contribui para o anel aromático do tocoferol; 2) síntese de fitilpirofosfato, o qual contribui para a cadeia lateral do tocoferol; 3) ciclização, a qual tem um papel na quiralida-de e na subestrutura de cromanol da família da vitamina E; 4) e metilação de um anel aromático dependente de S-adenosil metionina, que afeta a abundância relativa de cada uma das espécies de tocoferol. Síntese do Ácido homogentístico Ácido homogentísico é o precursor comum tanto aos tocoferóis e plastoquinonas. Em no mínimo algumas bactérias acredita-se que a síntese do ácido homogentísico ocorra através da conversão de corismato em pre-fenato e em seguida para p-hidroxifenil-piruvato através de uma prefenato deidrogenase bifuncional. Exemplos de enzimas prefenato deidrogenases bacterianas bifuncionais incluem as proteínas codificadas pelos genes TyrA de Erwinia herbicola e Escherichia coli. O produto genético TyrA catalisa a produção de prefenato a partir de corismato, bem como a deidrogenação subseqüente de prefenato para formar p-hidroxifenilpiruvato (p-HPP), o precursor imediato do ácido homogentístico. p-HPP é em seguida convertido em ácido homogentístico por hidroxifenil-piruvato disoxigenase (HPPD). Em contraste, é relatado que plantas carecem de atividade de prefenato deidrogenase, e é além disso relatado que a síntese do ácido homogentísico a partir de corismato ocorre através da síntese e conversção do intermediário arogenato. Uma vez que os caminhos envolvidos na síntese do ácido homo-gentésico também são responsáveis pela formação de tirosina, quaisquer alterações nestes caminhos também podem resultar na alteração na síntese de tirosina e na síntese de outros aminoácidos aromáticos. Síntese de fitilpirofosfato Os tocoferóis são um membro da classe de compostos preferenciais como os isoprenóides. Outros isoprenóides incluem carotenóides, gibe-relinas, terpenos, clorofila e ácido abscísico. Um intermediário central na produção de isoprenóides é isopentenil difosfato (IPP). Foram relatados caminhos citoplásmicos e à base de plastídeos para produzir IPP. O caminhos à base de citoplasmico envolve as enzimas acetoacetil CoA tiolase, HMGCoA sintase, HMGCoA redutase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, e mevalonato pirofosfato decarboxilase.

Recentemente, surgiu evidência da existência de um caminho biossintético alternativo para isoprenóides, à base de plastídeos, a partir de estudos nos grupos de pesquisa de Rohmer e Arigoni (Eisenreich et aL, Chem. Bio., 5: R221 - R233 (1998); Rohmer, Prog. Drug. Res., 50: 135 - 154 (1998); Rohmer, Comprehensive Natural Products Chemistry, Vol. 2, pp. 45 -68, Barton e Nakanishi (eds.), Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)), que descobriram que os padrões de marcação com isótopos observados em estudos de alguns terpenóides vegetais e eubacterianos não podiam ser explicados em termos do caminho do mevalonato. Arigoni e colaboradores em seguida mostraram que 1-deoxixilulose, ou um derivado da mesma, serve como um intermediário do novo caminho, agora referido como o caminho MEP (Rohmer et aí., Biochem. J., 295: 517 - 524 (1993); Schwarz, tese de Ph.D., Eidgenossiche Technische Hochschule, Zurich, Suíça (1994)). Estudos recentes mostraram a formação de 1-deoxixilulose 5-fosfato (Broers, tese de Ph.D. (Eidgenossiche Technische Hochschule, Zurich, Suíça) (1994)) de uma molécula cada de gliceraldeído 3-fosfato (Rohmer, Com-prehensive Natural Products Chemistry, Vol. 2, pp. 45 - 68, Barton e Naka-nishi, eds., Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)) e piruvato (Eisen-reich et al., Chem. Biol., 5: R223 - R233 (1998); Schwarz supra; Rohmer et ai, J. Am. Chem. Soc., 118: 2564 - 2566 (1996); e Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 94: 12857 - 12862 (1997)) por uma enzima codificada pelo gene dxs (Lois et al., Proc. natl. Acad. Sei. EUA, 95: 2105 - 2110 (1997); e Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 95: 2100 - 2104 (1998)). 1-Deoxixilulose 5-fosfato pode ser ainda convertida em 2-C-metileritritol 4-fosfato (Arigoni et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 94: 10600 - 10605 (1997)) por uma redutoisomerase catalisada pelo gene dxr (Bouvier et al., Plant Physyol, 117: 1421 - 1431 (1998); e Rohdich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 96: 11758- 11763 (1999)).

Genes relatados no caminho MEP também incluem ygbP, o qual catalisa a conversão de 2-C-metileritritol 4-fosfato em seu derivado respectivo citidil pirofosfato e ygbB, que catalisa a conversão de 4-fosfocitidil-2C-metil-D-eritritol em 2C-metil-D-eritritol, 3, 4-ciclofosfato. Estes genes são fortemente encadeados no genoma de E. co/i (Herz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 97 (6): 2485 - 2490 (2000)).

Uma vez que IPP seja formado pelo caminho MEP, é convertido para GGDP pela GGDP sintase, e em seguida para fitilpirofosfato, que é o constituinte central da cadeia lateral do tocoferol.

Combinação e Ciclização Ácido homogentísico é combinado ou com fitil-pirofosfato ou so-lanil-pirofosfato por fitil/prenil transferase formando 2-metil-6-fitil plastoquinol ou 2-metil-6-solanil plastoquinol respectivamente. 2-metil-6-solanil plastoquinol é um precursor para a biossíntese de plastoquinonas, ao passo que 2-metil-6-fitil plastoquinol é finalmente convertido para tocoferol.

Metilação do Anel Aromático Uma diferença estrutural importante entre cada um dos subtipos de tocoferol é a posição dos grupos metila em torno do anel fenila. Tanto 2-metil-6-fitil plastoquinol e 2-metil-6-solanil plastoquinol servem como substratos para 2-metil-6-fitil platoquinol/2-metil-6-soianilplastoquinol-9-metiltransferase (Metil Trasnferase 1; MT1), a qual cataliza a formação de plastoquinol-9 e -tocoferol respectivamente, por meio da metilação da posição 7. Metilação subseqüente na posição 5 de -tocoferol por -metil-transferase produz o -tocoferol biologicamente ativo.

Requisitos de Energia A produção de tocoferol é extremamente onerosa em termos da quantidade de energia necessária para produzir níveis adequados de tocoferol. Transportadores de adenilato suprem trifosfatos de nucleotídeo (inclusive ATP e CTP) para dentro da célula ou compartimento celular para uso em processos biossintéticos ou metabólicos. Uma seqüência de transportador de adenilato putativa de Arabidopsis thaliana foi reletada na literatura (Saint Guily, et al., Plant Physiol., 100 (2): 1069 - 1071 (1992)). Há a necessidade na técnica de moléculas de ácido nucléico codificando enzimas envolvidas no transporte de trifosfato de nucleotídeos, bem como enzimas relacionadas e anticorpos para o aumento ou alteração da produção de tocoferol nas plantas. Há ainda a necessidade de organismos transgênicos que expressem as moléculas de ácido nucléico envolvidas no transporte de trifosfato de nucleotídeo, as quais sejam capazes de aumentar nutricionalmente as fontes de alimento e ração.

Sumário da Invenção A presente invenção inclui e proporciona uma molécula de ácido nucléico substancialmente purificada que codifica um transportador de ade-nilato, em que a molécula de ácido nucléico compreende a SEQ ID N2: 1. A presente invenção inclui e proporciona uma molécula de ácido nucléico a qual compreende: (A) uma região promotora a qual funciona em uma célula vegetal causando a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico estrutural exógena codificando uma proteína ou fragmento da mesma compreendendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N2: 2; e (C) uma seqüência 3' não-traduzida que funciona na célula vegetal provocando a terminação da transcrição e adição de ribonucleo-tídeos poliadenilados a um término 3' da molécula de mRNA. A presente invenção inclui e proporciona uma molécula de ácido nucléico a qual compreende uma molécula de ácido nucléico substancialmente purificada compreendendo como componentes ligados operavelmen-te: (A) uma região promotora a qual funciona em uma célula vegetal causando a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um transportador de adenilato ou um fragmento da mesma; em que a molécula de ácido nucléico purificada compreende ainda um ou mais cassetes de expressão, cada um dos quais expressa um membro selecionado entre o grupo consistindo em slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, sir 1737, e um constructo anti-sentido para disoxigenase de ácido homogentísico. A presente invenção inclui e proporciona uma planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucléico substancialmente purificada compreendendo como componentes ligados operavelmente: (A) uma região promotora a qual funciona em uma célula vegetal causando a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um transportador de adenilato ou um fragmento da mesma; em que a molécula de ácido nucléico purificada compreende ainda um ou mais cassetes de expressão, cada um dos quais expressa um membro selecionado entre o grupo consistindo em slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, sir 1737, e um constructo anti-sentido para disoxigenase de ácido homogentísico. A presente invenção inclui e proporciona uma proteína substancialmente purificada compreendendo a SEQ ID N-: 2. A presente invenção inclui e proporciona um anticorpo capaz de ligar especificamente uma proteína substancialmente purificada compreendendo a SEQ ID N9: 2. A presente invenção inclui e proporciona uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um, transportador de adenilato, em que a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nucléicos de Arabidopsis. A presente invenção inclui e proporciona uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena a qual compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica para uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N9: 2. A presente invenção inclui e proporciona uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena a qual compreende uma seqüência de ácido nucléico da SEQ ID N9: 1. A presente invenção inclui e proporciona um método para produzir uma planta tendo sementes com nível aumentado de tocoferol compreendendo: (a) transformar a planta com uma molécula de ácido nucléico que codifica um transportador de adenilato; e (b) cultivar a planta transformada. A presente invenção inclui e proporciona um método para produzir uma planta tendo sementes com nível aumentado de tocoferol compreendendo: (a) transformar a planta com uma molécula de ácido nucléico a qual compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica para uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N9: 2; e (b) cultivar a planta transformada. A presente invenção inclui e proporciona um método para produzir uma planta tendo sementes com nível aumentado de tocoferol compreendendo: (A) transformar a planta com uma molécula de ácido nucléico, em que a molécula de ácido nucléico compreende a SEQ ID N9: 1; e (b) cultivar a planta. A presente invenção inclui e proporciona uma semente derivada de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico que codifica um transportador de adeniiato, em que a semente tem um nível de to-coferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona uma semente derivada de uma planta transformada que tem uma molécula de ácido nucléico exógena a qual compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica para uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N9: 2, em que a semente tem um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona uma semente derivada de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena compreendendo a SEQ ID N9: 1, em que a semente tem um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona óleo derivado de uma semente de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um transportador de adeniiato, em que a planta transformada tem uma semente com um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona óleo derivado de uma semente de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena a qual compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica para uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N9: 2, em que a planta transformada tem uma semente com um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona óleo derivado de uma semente de uma planta transformada, em que a planta transformada contém uma molécula de ácido nucléico exógena compreendendo uma seqüência de ácido nucléico compreendendo a SEQ ID N-: 1. A presente invenção inclui e proporciona matéria-prima compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um transportador de adenilato, em que a planta transformada tem uma semente com um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona matéria-prima compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma tendo uma molécula de ácido nucléico exógena a qual compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica para uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N9: 2, em que a planta transformada tem uma semente com um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona matéria-prima compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma, em que a planta transformada tem uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo a SEQ ID N9: 1. A presente invenção inclui e proporciona um meio compreendendo material vegetal fabricado a partir de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um transportador de adenilato, em que a planta transformada tem uma semente com um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona um meio compreendendo material vegetal fabricado a partir de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena a qual compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica para uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N-. 2, em que a planta transformada tem uma semente com um nível de tocoferol aumentado com relação às sementes de uma planta tendo um antecedente genético semelhante mas carecendo da molécula de ácido nucléico exógena. A presente invenção inclui e proporciona um meio compreendendo material vegetal fabricado a partir de uma planta transformada, em que a planta transformada tem uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácido nucléico compreendendo a SEQ ID N9: 1.

Descrição das Seaüências de Ácidos Nucléicos e Aminoácidos SEQ ID N9: 1 estabelece uma seqüência de ácido nucléico de uma molécula de DNAc a qual codifica um transportador de adenilato de Arabidopsis thaliana. SEQ ID Ns: 2 estabelece uma seqüência de aminoácidos derivada de um transportador de adenilato de Arabidopsis thaliana. SEQ ID N9: 3 estabelece um iniciador para diante para amplificação do gene AANT1. SEQ ID Ns: 4 estabelece um iniciador reverso para amplificação do gene AANT 1.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um gráfico comparando os níveis totais de tocoferol das sementes (nanogramas por miligrama) para 20 linhagens de plantas expressando um gene transportador de metabólito sob controle do promotor de napin e uma planta com um vetor de controle. A Figura 2 é um esquema do constructo pCGN9979. A Figura 3 é um esquema do constructo pCGN11307. A Figura 4 é um esquema do constructo pCGN11301. A Figura 5 é um esquema do constructo pMON66454. A Figura 6 é um esquema do constructo pCGN10822. A Figura 7 é um esquema do constructo pMON36528. A Figura 8 é um esquema do constructo pMON69907. A Figura 9 é um esquema do constructo pMON69909. A Figura 10 representa o teor total de tocoferol e tocotrienol de sementes de Arabidopsis thaliana de plantas selvagens e várias linhagens de plantas transformadas separadamente com os vetores de plasmídeos pCGN 10822, pMON36528, pMON69907 e pMON69909. A Figura 11 representa uma análise do teor de tocoferol e tocotrienol de sementes de arabidopsis de linhagens de plantas transformadas com o vetor pMON69909 com relação às sementes de plantas selvagens. A Figura 12 é um gráfico padrão LC/MS. A Figura 13 é um gráfico LC/MS. A Figura 14 é uma cromatografia de HPLC. A Figura 15 é uma cromatografia de HPLC. A Figura 16 é um esquema do constructo pMON69915. A Figura 17 é um esquema do constructo pMON66919. A Figura 18 é um esquema do constructo pMON36520. A Figura 19 é um esquema do constructo pMON43853. A Figura 20 é um esquema do constructo pMON36525. A Figura 21 é um esquema do constructo pMON43861. A Figura 22 é um esquema do constructo pCGN7770. A Figura 23 é um esquema do constructo pMON69911. A Figura 24 é um esquema do constructo pCGN11301. A Figura 25 representa o teor total de tocoferol e tocotrienol de sementes de Arabidopsis de plantas selvagens e várias linhagens de plantas transformadas separadamente com o vetor de plasmídeo pMON69907. A Figura 26 representa o teor total de tocoferol de sementes de Arabidopsis de plantas selvagens e várias linhagens de plantas transformadas com o vetor de plasmídeo pMON69907. A Figura 27 mostra os níveis de tocoferol e tocotrienol bem como de HGA em linhagens selecionadas. A Figura 28 mostra os níveis de tocotrienol e 2M6PPQ em linhagens selecionadas.

Descrição Detalhda da Invenção A presente invenção fornece uma série de agentes, por exemplo, moléculas de ácidos nucléicos e proteínas associadas com translocação de adenilato, e proporciona aplicações de semelhantes agentes.

Agentes: Os agentes da invenção serão preferencialmente "biologicamente ativos" com respeito a ou um atributo estrutural, tal como a capacidade de um ácido nucléico para hibridizar a outra molécula de ácido nucléico, ou a capacidade de uma proteína para ser ligada por um anticorpo (ou para competir com outra molécula para tal ligação). Alternativamente, um tal atributo pode ser catalítico e deste modo envolver a capacidade do agente para mediar uma reação ou resposta química. Os agentes preferencialmente serão "substancialmente purificados". O termo "substancialmente purificados", como usado neste relatório, refere-se a uma molécula separada de substancialmente todas as outras moléculas normalmente associadas com esta em seu estado nativo. Mais preferencial mente uma molécula purificada é a espécie predominante em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais de 60 % livre, preferencialmente 75 % livre, mais preferencialmente 90 % livre, e ainda mais preferencialmente 95 % livre das outras moléculas (exclusive de solvente) presentes na mistura natural. O termo "essencialmente purificados" não pretende englobar moléculas presentes em seu estado natural.

Os agentes da invenção também podem ser "recombinante". Como usado neste relatório, o termo "recombinante" significa qualquer agente (por exemplo, DNA, peptídeo, etc.), que é, ou resulta de, no entanto indiretamente, manipulação humana de uma molécula de ácido nucléico.

Em algumas modalidades da presente invenção, uma célula, um organismo, ou uma planta pode ter um fenótipo que é alterado com relação a uma célula similar, um organismo, ou uma planta semelhante tendo um "antecedente genético semelhante". Em um aspecto preferencial, um "antecedente genético semelhante" é um antecedente em que os organismos que estão sendo comparados partilham 50 % ou mais de seu material genético nuclear. Em um aspecto mais preferencial, um antecedente genético semelhante é um antecedente onde os organismos que estão sendo comparados partilham 75 % ou mais, ainda mais preferencialmente 90 % ou mais, de seu material genético nuclear. Em outro aspecto ainda mais preferencial, um antecedente genético semelhante é um antecedente onde os organismos que estão sendo comparados são plantas, e as plantas são isogênicas exceto por qualquer material genético introduzido originalmente usando técnicas de transformação vegetal. É entendido que os agentes da invenção podem ser marcados com reagentes que facilitam a detecção do agente (por exemplo, marcadores fluorescentes, Prober et al., Science 238: 336 - 340 (1987); Albarella et al., EP 144914; marcadores químicos, Sheldon et al., Patente dos Estados Unidos N9 4.582.789; Albarella et al., Patente dos Estados Unidos N9 4.563.417; bases modificadas, Miyoshi et al., EP 119448). (a) Moléculas de Ácidos Nucléicos Os agentes da invenção incluem moléculas de ácidos nucléicos. Em um aspecto preferencial da presente invenção, a molécula de ácido nu-cléico compreende uma sequência de ácido nucléico a qual codifica um transportador de adenilato. Conforme usado neste relatório um "transportador de adenilato" é qualquer proteína que seja um transportador de nucleotí-deo. Um transportador de adenilato preferencial é um transportador de adenilato vegetal, mais preferencialmente um transportador de adenilato de Ara-bidopis thaliana. Um exemplo de um transportador de adenilato de Arabido-pis thaliana mais preferencial é uma proteína com o aminoácido determinado na SEQ ID N9: 2.

Em outro aspecto preferencial da presente invenção a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nucléicos da SEQ ID N9: 1, complementos da mesma, e fragmentos de cada. Em um aspecto adicional da presente invenção a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácido nucléico codificando uma seqüência de aminoáci-dos da SEQ ID N9: 2 e fragmentos da mesma. É entendido que em um aspecto adicional da presente invenção, ácidos nucléicos podem codificar uma proteína que difere de quaisquer das proteínas pelo fato de que um ou mais aminoácidos foram eliminados, substituídos, ou adicionados sem alterar a função. Por exemplo, é entendido que códons capazes de codificar para tais substituições conservadores de aminoácidos são conhecidos na técnica.

Uma subsérie das moléculas de ácido nucléico da invenção é fragmenta de moléculas de ácido nucléico. Fragmentos de moléculas de ácido nucléico podem consistir de porção ou porções significantes das, ou na verdade a maior parte das, moléculas de ácido nucléico da invenção, tais como as especificamente reveladas. Alternativamente, os fragmentos podem compreender oligonucleotídeos menores (tendo a partir de cerca de 15 a cerca de 400 resíduos nucleotídeos e mais preferencialmente, cerca de 15 a cerca de 30 resíduos nucleotídeos, ou cerca de 50 a cerca de 100 resíduos nucleotídeos, ou cerca de 100 a cerca de 200 resíduos nucleotídeos, ou cerca de 200 a cerca de 400 resíduos nucleotídeos, ou cerca de 275 a cerca de 350 resíduos nucleotídeos).

Um fragmento de molécula de ácido nucléico preferencial da presente invenção codifica, no mínimo em parte, para um peptídeo mitocon-drial ou tendo por meta plastídeo. Um fragmento de molécula de ácido nucléico mais preferencial da presente invenção codifica para um peptídeo tendo por meta plastídeo.

Um fragmento de uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção pode ser uma sonda e especificamente uma sonda de PCR. Uma sonda de PCR é uma molécula de ácido nucléico capaz de iniciar uma atividade de polimerase enquanto em uma estrutura de filamento duplo com outro ácido nucléico. Existem na técnica vários métodos para determinar a estrutura de sondas de PCR e técnicas de PCR. Pesquisas geradas por computação usando programas tais como iniciador3 (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/iniciador/primer3.cgi), STSPipeline (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline), ou GeneUp (Pesole et al., BioTechniques 25: 112 - 123 (1998)), por exemplo, podem ser usadas para identificar iniciadores de PCR potenciais.

Outra subsérie das moléculas de ácido nucléico da invenção inclui moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína ou fragmento da mesma.

Moléculas de ácido nucléico ou fragmentos da mesma da presente invenção são capazes de hibridizar especificamente a outras moléculas de ácido nucléico sob determinadas circunstâncias. As moléculas de ácido nucléico da presente invenção incluem aquelas que hibridizam especificamente as moléculas de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada entre o grupo consistindo na SEQ ID Ns: 1 e complemento da mesma.

Conforme usado neste relatório, que duas moléculas de ácido nucléico são capazes de hibridizar especificamente a uma outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de filamentos duplos e antiparalelos.

Uma molécula de ácido nucléico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se elas apresentarem completa complementaridade. Conforme usado neste relatório, diz-se que as moléculas apresentam "completa complementaridade" quando todo nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Diz-se que duas moléculas são "minimamente complementares" se elas puderem hibridizar uma à outra com suficiente estabilidade para permitir que elas permaneçam fixadas umas às outras sob no mínimo condições convencionais de "baixa estrin-gência". Do mesmo modo, diz-se que as moléculas são "complementares" se elas puderem hibridizar umas às outras com suficiente estabilidade para permitir que as mesmas permaneçam fixadas umas às outras sob condições convencionais de "alta estringência". As condições convencionais de estrin-gência são descritas por Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), e por Haymes et al., Nucleic Acid Hybrídization, A Practical Appro-ach, IRL Press, Washington, DC (1985). Portanto são desvios permissíveis da completa complementaridade, contanto que tais desvios não excluam completamente a capacidade das moléculas para formarem uma estrutura de filamento duplo. Portanto, de modo a uma molécula de ácido nucléico servir como um iniciador ou uma sonda é necessário somente ser suficientemente complementar na seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações particulares de solvente e sal empregadas.

Condições de estringência adequadas as quais estimulam a hi-bridização de DNA, por exemplo, 6,0 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 X SSC a 20 - 25°C, são de conhecimento daqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa estringência de cerca de 2,0 X SSC a 50°C até uma alta estringência de cerca de 0,2 X SSC a 65°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir das condições de baixa estringência na temperatura ambiente, cerca de 22°C, até condições de alta estringência a cerca de 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou pode ser mantida constante ou a temperatura ou a concentração de sal enquanto a outra variável é alterada.

Em uma modalidade preferencial, um ácido nucléico da presente invenção hibridizará especificamente a uma molécula de ácido nucléico tendo a SEQ ID N9: 1 ou um complemento da mesma sob condições moderadamente estringentes, por exemplo a cerca de 2,0 X SSC e cerca de 65°C.

Em uma modalidade particularmente preferencial, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção incluirá as moléculas de ácido nucléico que hibridizam especificamente a uma molécula de ácido nucléico tendo a SEQ ID N9: 1 ou o complemento da mesma sob condições de alta estringência tais como 0,2 X SSC e cerca de 65°C.

Em um aspecto da presente invenção, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção têm a SEQ ID N9: 1 ou o complemento da mesma. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção partilha entre 100 % e 90 % de identidade de seqüência com uma molécula de ácido nucléico tendo a SEQ ID Ne: 1 ou o complemento da mesma ou fragmento de uma ou outra. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção partilha entre 100 % e 95 % de identidade de seqüência com uma molécula de ácido nucléico tendo a SEQ ID N9: 1 ou o complemento da mesma ou fragmento de uma ou outra. Em um aspecto mais preferencial da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção partilha entre 100 % e 98 % de identidade de seqüência com uma molécula de ácido nucléico tendo a SEQ ID N9: 1 ou o complemento da mesma ou fragmento de uma ou outra. Em um aspecto ainda mais preferencial da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção partilha entre 100 % e 99 % de identidade de seqüência com uma molécula de ácido nucléico tendo a SEQ ID N9: 1 ou o complemento da mesma ou fragmento de uma ou outra.

Em uma modalidade preferencial os cálculos de percentagem de identidade são realizados usando o programa de suite de computação de bioinformática Megalign da LASERGENE (parâmetros default, DNASTAR Inc., Madison, Wisconsín).

Uma molécula de ácido nucléico da invenção também pode codificar uma proteína homóloga. Conforme usado neste relatório, uma proteína homóloga ou fragmento da mesma é uma molécula de proteína complementar ou fragmento da mesma em uma segunda espécie (por exemplo, transportador de adenilato de milho é um homólogo de transportador de adenilato de Arabidopsis). Um homólogo também pode ser produzido por meio de técnicas de evolução molecular ou de permuta de DNA, de modo que a molécula retenha no mínimo uma característica funcional ou estrutural da proteína original (ver, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos Ns 5.811.238).

Em outra modalidade, o homólogo é selecionado entre o grupo consistindo em alfalfa, Arabidopsis, cevada, Brassica campestrís, Brassica napus, brócolis, repolho, canola, cítricos, algodão, alho, aveia, cebola, linho, uma planta ornamental, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilhas, uva, banana, chá, ervas de turfa, girassol, soja, milho, Phaseolus, um gênero de ervas da família da mostarda (crambe), mostarda, mamona, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão, e palma oleaginosa. Mais particularmente, homólogos preferenciais são selecionados entre milho, Brassica campestris, Brassica napus, canola, soja, um gênero de ervas da família da mostarda, mostarda, mamona, amendoim, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão, palma oleaginosa, linho, e girassol. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o homólogo é selecionado entre o grupo consistindo em canola, milho, Brassica campestris, Brassica napus, soja, girassol, açafrão, palma oleaginosa, e amendoim.

Em uma modalidade preferencial, o homólogo é Brassica napus. Em outra modalidade preferencial, o homólogo é soja. Em outra modalidade preferencial, o homólogo é canola.

Em uma modalidade preferencial, moléculas de ácido nucléico tendo a SEQ ID N9: 1, o complemento da mesma, e fragmentos de cada podem ser utilizadas para obter tais homólogos.

Em outro aspecto adicional da presente invenção, moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem compreender seqüências que diferem das seqüências codificando uma proteína ou fragmento da mesma na SEQ ID N9: 2 porque as diferentes seqüências de ácidos nucléicos codificam uma proteína tendo uma ou mais alterações de aminoácidos não essenciais. É entendido que códons capazes de codificar para tais substituições de aminoácidos conservadoras são conhecidos na técnica. É de conhecimento geral na técnica que um ou mais aminoácidos em uma seqüência nativa podem ser substituídos com outro ou outros aminoácidos, cujas carga e polaridade são semelhantes as do aminoácido natural, isto é, uma substituição de aminoácido conservadora. Substitutos conservadores para um aminoácido dentro da seqüência de polipeptídeo natural podem ser selecionados entre outros membros da classe aos quais o aminoácido pertence. Os aminoácidos podem ser divididos nos quatro grupos seguintes: (1) aminoácidos acidíferos, (2) aminoácidos básicos, (3) aminoácidos polares neutros, e (4) aminoácidos não-polares neutros. Aminoáci- dos típicos dentro destes vários grupos incluem, mas sem limitação, (1) ami-noácidos acídicos (carregados negativamente) tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (carregados positivamente) tais como arginina, histidina, e lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina, e glutamina; e (4) aminoácidos polares não-neutros (hidrofóbicos) tais como alanina, leuci-na, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina.

Substituição de aminoácido conservadora dentro da seqüência de polipeptídeos nativa pode ser feita substituindo um aminoácido de dentro de um destes grupos com outro aminoácido de dentro do mesmo grupo. Em um aspecto preferencial, equivalentes biologicamente funcionais das proteínas ou fragmentos das mesmas da presente invenção podem ter dez ou menos alterações de aminoácidos conservadoras, mais preferencialmente sete ou menos alterações de aminoácidos conservadoras, e ainda mais preferencialmente cinco ou menos alterações de aminoácidos conservadoras. A seqüência codificando nucleotídeo portanto terá subnstituições de bases correspondentes, permitindo que codifique formas biologicamente funcionais equivalentes das proteínas ou fragmentos da presente invenção.

Entende-se que alguns aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura protéica sem perda apreciável da capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação de antígeno de anticorpos ou sítios de ligação sobre moléculas do substrato. Como é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que define a atividade biológica funcional da proteína, algumas substituições da seqüência de aminoácidos podem ser feitas em uma seqüência protéica e, logicamente, sua seqüência codificando DNA básico e, não obstante, uma proteína com propriedades semelhantes ainda pode ser obtida. Portanto é contemplado pelos inventores que podem ser feitas várias alterações nas seqüências peptídicas das proteínas ou fragmentos da presente invenção, ou seqüências de DNA correspondentes que codificam os referidos peptídeos, sem apreciável perda de sua utilidade ou atividade biológica. É entendido que códons capazes de codificar para tais alterações de amino- ácidos são de conhecimento na técnica.

Ao fazer tais alterações, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático dos aminoácidos ao conferir a função biológica interativa sobre uma proteína é geralmente entendido na técnica (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105- 132 (1982)). Aceita-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, o que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e semelhantes. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105 - 132 (1982)). Estes são isoleucina (+ 4,5), valina (+ 4,2), leu-cine (+ 3,8), fenilalanina (+ 2,8), cisteína/cistinae (+ 2,5), metionina (+ 1,9), alanina (+ 1,8), glicina (- 0,4), treonina (- 0,7), serina (- 0,8), triptofano (- 0,9), tirosina (- 1,3), prolina (- 1,6), histidina (- 3,2), glutamato (- 3,5), glutamina (-3,5), aspartato (- 3,5), asparagina (- 3,5), lisina (- 3,9), e arginina (- 4,5).

Ao fazer tais alterações, a substituição de aminoácidos os quais têm índices hidropáticos dentro de ± 2 é preferencial, os que têm índices hidropáticos dentro de ± 1 são particularmente preferenciais, e aqueles que têm índices hidropáticos dentro de ± 0,5 são ainda mais particularmente preferenciais.

Também é entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de modo eficaz com base na capacidade de afinidade com água. A Patente dos Estados Unidos N2 4.554.101 declara que a maior hidrofilia média local de uma proteína, conforme governado pela hidrofilia de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteína.

Como detalhado na Patente dos Estados Unidos N2 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilia foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+ 3,0), lisina (+ 3,0), aspartato (+ 3,0 ±1), glutamato (+ 3,0 ± 1), serina (+ 0,3), asparagina (+ 0,2), glutamina (+ 0,2), glicina (0), thereoni-ne (- 0,4), prolina (- 0,5 ±1), alanina (- 0,5), histidina (- 0,5), cisteína (- 1,0), metionina (- 1,3), valina (- 1,5), leucina (- 1,8), isoleucina (- 1,8), tirosina (- ^ 2,3), fenilalanina (- 2,5), e triptofano (- 3,4).

Ao fazer tais alterações, a substituição de aminoácidos os quais têm valores de hidrofilia dentro de ± 2 é preferencial, aqueles os quais têm índices hidropáticos dentro de ± 1 são particularmente preferencial, e aqueles os quais têm índices hidropáticos dentro de ± 0,5 são ainda mais particularmente preferenciais.

Em um aspecto adicional da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção diferem em seqüên-cia de ácidos nucléicos daquela para a qual uma seqüência específica é proporcionada neste relatório porque um ou mais códons foram substituídos com um códon que codifica uma substituição conservadora do aminoácido originalmente codificado. Agentes da invenção incluem moléculas de ácido nucléico que codificam no mínimo cerca de uma região de 10 aminoácidos contíguos de uma proteína da presente invenção, mais preferencialmente no mínimo cerca de uma região de 25, 40, 50, 100, ou 125 aminoácidos contíguos de uma proteína da presente invenção. (b) Proteínas e Moléculas de Peptídeos Uma classe de agentes inclui uma ou mais das proteínas ou fragmentos das mesmas ou moléculas de peptídeos codificadas por um agente de ácido nucléico da invenção. Um transportador de adenilato preferencial é um transportador de adenilato vegetal, mais preferencialmente um transportador de adenilato de Arabidopis thaliana. Um exemplo de um transportador de adenilato de Arabidopis thaliana mais preferencial é uma proteína com a seqüência de aminoácidos determinada na SEQ ID Ne: 2. Transportadores de adenilato preferenciais da presente invenção compreendem um peptídeo mitocondrial ou tendo por alvo plastídeo. Em uma modalidade mais preferencial, um transportador de adenilato da presente invenção compreende um peptídeo que tem por alvo plastídeo.

Conforme usado neste relatório, o termo "proteína" ou "molécula de peptídeo" inclui qualquer molécula que compreende cinco ou mais aminoácidos. É de conhecimento geral na técnia que as proteínas podem sofrer modificação, inclusive modificações pós-translacionais, tais como, porém sem limitação, formação de pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Portanto, conforme usado neste relatório, o termo "proteína" ou "molécula de peptídeo" inclui qualquer proteína que seja modificada por qualquer processo biológico ou não-biológico. Os termos “aminoácido" e "aminoácidos" referem-se a todos os L-aminoácidos que ocorrem naturalmente. Esta definição pretende incluir norleucina, norvalina, ornitina, homo-cisteína, e homoserina.

Uma ou mais das proteínas ou fragmentos das mesmas ou moléculas de peptídeos podem ser produzidos por meio de síntese química, ou mais preferencialmente, por meio de expressão em um hospedeiro bacteria-no ou eucariótico adequado. Métodos adequados para expressão são descritos por Sambrook et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spríng Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ou textos semelhantes.

Um "fragmento protéico" é uma molécula de peptídeo ou polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos compreende uma subsérie da seqüência de aminoácidos daquela proteína. Uma proteína ou fragmento da mesma que compreende uma ou mais regiões peptídicas adicionais não derivadas daquela proteína é uma proteína de "fusão". Tais moléculas podem ser derivadas para conterem carboidrato ou outras porções (tais como hemocianina de lapa "keyhole"). Proteínas de fusão ou moléculas de peptídeo da invenção são preferencialmente produzidas por meio de técnicas recombinantes.

Outra classe de agentes compreende uma proteína ou moléculas de peptídeo ou fragmentos ou fusões dos mesmos compreendendo a SEQ ID Na: 2 e fragmentos das mesmas nos quais resíduos aminoácidos conservadores, não-essenciais, ou não-relevantes foram adicionados, substituídos, ou eliminados. Uma classe particularmente preferencial de proteínas são proteínas nas quais resíduos aminoácidos conservadores, não-essenciais, ou não-relevantes foram adicionados, substituídos, ou eliminados. Meios computadorizados para designar modificações na estrutura protéica são conhecidos na técnica (Dahiyat e Mayo, Science 278: 82 - 87 (1997)).

Uma proteína da invenção também pode ser uma proteína homóloga. Conforme usado neste relatório, uma proteína homóloga ou fragmento da mesma é uma proteína ou fragmento da mesma complementar em uma segunda espécie. Um homólogo também pode ser produzido por meio de técnicas de evolução molecular ou de permuta de DNA, de modo que a molécula retenha no mínimo uma característica funcional ou estrutural da original (ver, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N2 5.811.238).

Em outra modalidade, o homólogo é selecionado entre o grupo consistindo em alfalfa, Arabidopsis, cevada, Brassica campestris, Brassica napus, brócolis, repolho, canola, cítricos, algodão, alho, aveia, cebola, linho, uma planta ornamental, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilhas, uva, banana, chá, ervas de turfa, girassol, soja, milho, Phaseolus, um gênero de ervas da família da mostarda, mostarda, mamona, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão, e palma oleaginosa. Mais particularmente, homólogos preferenciais são selecionados entre milho, Brassica campestris, Brassica napus, canola, soja, um gênero de ervas da família da mostarda, mostarda, mamona, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão, palma oleaginosa, linho e girassol. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o homólogo é selecionado entre o grupo consistindo em canola, milho, Brassica campestris, Brassica napus, soja, girassol, açafrão, palma oleaginosa, e amendoim.

Em uma modalidade preferencial, as moléculas de ácido nucléi-co da presente invenção ou complementos e fragmentos de cada podem ser utilizados para obter tais homólogos. Agentes da invenção incluem proteínas e fragmentos das mesmas compreendendo no mínimo cerca de uma região de 10 aminoácidos contíguos, preferencialmente compreendendo no mínimo cerca de uma região de 20 aminoácidos contíguos, ainda mais preferencialmente compreendendo no mínimo uma região de 25, 35, 50, 75 ou 100 ami- noácidos contíguos de uma proteína da presente invenção. Em outra modalidade preferencial, as proteínas da presente invenção incluem entre cerca de uma região de 10 e cerca de uma região de 25 aminoácidos contíguos, mais preferencialmente entre cerca de uma região de 20 e cerca de uma região de 50 aminoácidos contíguos, e ainda mais preferencial mente entre cerca de uma região de 40 e cerca de uma região de 80 aminoácidos contíguos. (c) Constructos Vegetais e Mutantes Vegetais Uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas na transformação ou transfecção de plantas. Material genético exógeno pode ser transferido para uma célula vegetal e a célula vegetal regenerada para uma planta sadia, fértil ou estéril. Material genético exógeno é qualquer material genético, quer de ocorrência natural ou de outro modo, de qualquer fonte que seja capaz de ser inserido em qualquer organismo. Em uma modalidade preferencial, o material genético exógeno codifica um transportador de adenilato vegetal, mais preferencialmente um transportador de adenilato de Arabidopsis thaliana. Os transportadores de adenilato preferenciais da presente invenção compreendem um peptídeo mito-condrial ou que tem por alvo plastídeo. Em uma modalidade mais preferencial, um transportador de adenilato da presente invenção compreende uma seqüência que tem por alvo plastídeo.

Em outra modalidade preferencial, o material genético exógeno inclui uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, preferencialmente uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ ID Ne: 1 ou complemento da mesma ou fragmento de uma ou outra. Uma classe adicional preferencial de material genético exógeno são moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína ou fragmento da mesma tendo um ami-noácido da SEQ ID Ne: 2 ou fragmento da mesma.

Em uma modalidade da presente invenção, material genético exógeno compreendendo um transportador de adenilato homólogo ou fragmento da mesma é introduzido em uma planta com um ou mais dos genes adicionais. Em uma modalidade, combinações de genes preferenciais inclu- em dois ou mais dos seguintes genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico (Kridl et a!., Seed Sei. Res. 1:209:219 (1991); Keegstra, Ce//56(2): 247 - 53 (1989); Nawrath, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 12760- 12764 (1994); Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309 - 1316 (1992); Cyanobase www.kazusa.or.jp/cyanobase; Lois et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (5): 2105 - 2110 (1998); Takahashi et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (17), 9879 - 9884 (1998); Norris et al., Plant Physiol. 117: 1317 - 1323 (1998); Bartley and Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469 - 1470 (1994), Smith et ai, Plant J. 11: 83 - 92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily, et ai, Plant Physiol., 100(2): 1069 - 1071 (1992); Sato et ai, J. DNA Res. 7 (1): 31 - 63 (2000)). Em tais combinações, um ou mais dos produtos genéticos podem ser orientados para o plastídeo por meio do uso de uma sequência que tem por alvo plastídeo. Alternativamente, um ou mais dos produtos genéticos podem ser localizados no citoplasma. Tais genes podem ser introduzidos, por exemplo, com o transportador de adenilato homólogo ou fragmento do mesmo e um ou mais genes adicionais sobre um único constructo, ou com o transportador de adenilato homólogo ou fragmento do mesmo e um ou mais genes adicionais introduzidos sobre diferentes constructos mas com o mesmo evento de transformação, ou introduzidos em plantas isoladas seguidos por um ou mais cruzamentos para produzir a combinação de genes desejada. Em tais combinações, um promotor preferencial é um promotor napin e uma seqüência que tem por alvo plastídeo preferencial é uma seqüência CTP1.

Em outra modalidade, constructos de DNA podem ser gerados como "constructos genéticos múltiplos". Em uma modalidade, os constructos genéticos múltiplos contêm múltiplos genes cada um sob o controle de um promotor separado, por exemplo um promotor específico de semente tal como o promotor napin, arcelin 5 ou promotor 7S. Os produtos de cada um dos genes podem ser orientados individualmente para o plastídeo por meio de um peptídeo codificado para orientar para plastídeo. O constructo ou os constructos genéticos múltiplos podem ter um ou mais dos seguintes genes além de AANT1: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, AANT1, sir 1737, MT1, TMT2, e um constructo anti-sentido para disoxigena-se do ácido homogentísico. O material genético referido pode ser transferido para ou mono-cotiledôneas ou dicotiledôneas incluindo, mas sem limitação, milho, soja, canola, Arabidopsis, phaseolus, amendoim, alfalfa, trigo, arroz, aveia, sorgo, cevada, tritórdeo, milheto, festuca, raigrás perene, cana-de-açúcar, uva-do-monte, papaia, banana, açafrão, palma oleaginosa, linho, "muslanelon", maçã, pepino, dendróbio, gladíolo, crisântemo, liliácea, algodão, eucalipto, girassol, Brassica campestris, Brassica napus, erva de turfa, beterraba sacarina, café, e dioscórea (Christou, Em: Particle Bombardment for Genetic En-gineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit. Academic Press, San Diego, Califórnia (1996)), com canola, milho, Brassica campestris, Brassica napus, soja, um gênero de ervas da família da mostarda, mostarda, mamo-na, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão, palma oleaginosa, linho, e girassol preferenciais, e canola, milho, Brassica campestris, Brassica napus, soja, girassol, açafrão, palma oleaginosa, e amendoim mais preferenciais. Em uma modalidade mais preferencial, o material genético é transferido para soja. Em outra modalidade mais preferencial, o material genético é transferido para canola. Em outra modalidade mais preferencial, o material genético é transferido para Brassica napus. A transferência de um ácido nucléico que codifica uma proteína pode resultar na expressão ou na superexpressão daquela proteína em uma célula transformada ou planta transgênica. Uma ou mais das proteínas ou fragmentos das mesmas codificados por moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser superexpressos em uma célula transformada ou planta transformada. Tal expressão ou superexpressão pode ser o resultado da transferência transitória ou estável do material genético exógeno.

Em uma modalidade preferencial, a expressão ou superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumenta- do de tocoferóis.

Em uma modalidade preferencial, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de a-tocoferóis.

Em uma modalidade preferencial, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de γ-tocoferóis.

Em outra modalidade, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de ácido homogentísico.

Em outra modalidade, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de ácido fitilpirofosfato.

Em outra modalidade preferencial, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta transformada pode proporcionar tolerância a uma variedade de estressores, por exemplo tolerância ao estresse oxidativo tal como o oxigênio ou ozônio, tolerância a UV, tolerância ao frio, ou tolerância a patógenos fúngi-cos/microbianos.

Conforme usado neste relatório em um aspecto preferencial, uma tolerância ou resistência ao estresse é determinada pela capacidade de uma planta, quando estimulada por um estressor tal como frio, a produzir uma planta tendo uma maior produção do que uma planta sem tal tolerância ou resistência ao estresse. Em um aspecto particularmente preferencial da presente invenção, a tolerância ou resistência ao estresse é medida com relação a uma planta com um antecedente genético semelhante à planta tolerante ou resistente exceto que a planta expressa ou superexpressa uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção.

Material genético exógeno pode ser transferido para uma célula hospedeira por meio do uso de um vetor de DNA ou constructo designado para um tal fim. O desenho de um tal vetor está geralmente dentro do conhecimento da técnica (Ver, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, New York (1997)). Em algumas modalidades desta invenção, constructos de vetores de DNA podem ser constructos genéticos múltiplos que compreendem um cassete de expressão para o transportador de adenilato ou um fragmento do mesmo e uma ou mais das seqüências genéticas selecionadas entre o grupo consistindo em tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico, de tal modo que a transformação com um único constructo de vetor de DNA resultará na expressão das duas ou mais das seqüências genéticas.

Um constructo ou vetor pode incluir um promotor vegetal para expressar a proteína ou fragmento protéico de escolha. Uma série de promotores que são ativos em células vegetais foram descritos na literatura. Estes incluem o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 84: 5745 - 5749 (1987)), o promotor de octopina sintase (OCS) (o qual é carregado sobre plasmídeos de Agrobacterium tumefaciens indutores de tumor), os promotores de caulimovírus tais como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 19S (Lawton et ai, Plant Moi Biol. 9: 315 - 324 (1987)), o promotor CaMV 35S (Odell et ai, Nature 313: 810-812 (1985)), o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária, que é o promotor foto-indutível da pequena subunidade de ribulose-1,5-bis-fosfato car-boxilase (ssRUBISCO), o promotor Adh (Walker et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 84: 6624 - 6628 (1987)), o promotor da sacarose sintase (Yang et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 87: 4144 - 4148 (1990)), o promotor do complexo genético R (Chandler et al., The Plant Cell 1: 1175 - 1183 (1989)), o promotor do gene protéico de ligação de clorofila a/b, etc. Estes promotores têm sido usados para criar constructos de DNA que foram expressos nas plantas; ver, por exemplo, a publicação internacional PCT N9 WO 84/02913. Os promotores CaMV 35S são preferenciais para uso em plantas. Podem ser usados na invenção promotores conhecidos ou que se descobriu que causam transcrição de DNA em células vegetais.

Para os fins de expressão em tecidos originais da planta, tais como as folhas, as sementes, a raiz ou o caule, é preferencial que os promotores utilizados tenham expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. A expressão tecidual específica de uma proteína da presente invenção é uma modalidade particularmente preferencial. Para estes fins, pode-se escolher entre uma série de promotores para genes com expressão tecidual- ou celular-específica ou -reforçada. Exemplos de tais promotores relatados na literatura incluem o promotor da glutamina sintetase GS2 do cloroplasto da ervilha (Edwards et al.t Proc. Natf. Acad. Sei. (U.S.A.) 87: 3459 - 3463 (1990)), o promotor da frutose-1,6-bifosfatase (FBPase) do cloroplasto do trigo (Lloyd et ai, Mol. Gen. Genet. 225: 209 - 216 (1991)), o promotor fotossintético ST-LS1 nuclear da batata (Stockhaus et aí., EMBO J. 8: 2445 - 2451 (1989)), o promotor da serina/treonina quinase (PAL) e o promotor da glicoamilase (CHS) de Arabidopsis thaliana. Além disso são relatados como sendo ativos em tecidos fotossinteticamente ativos o promotor da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS) do lariço oriental (Larix laricina), o promotor para o gene cab, cab6, do pinheiro (Yamamoto et aí., Plant Cell Physiol. 35: 773 - 778 (1994)), o promotor para o gene Cab-1 do trigo (Fejes et aí., Plant Moí. Biof. 15: 921 - 932 (1990)), o promotor para o gene CAB-1 do espinafre (Lubberstedt et aí., Plant Physiol. 104: 997 - 1006 (1994)), o promotor para o gene cab1R do arroz (Luan et al., Plant Cell. 4: 971 - 981 (1992)), o promotor do piruvato, ortofosfato diquinase (PPDK) do milho (Matsuoka et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 90: 9586 - 9590 (1993)), o promotor para o gene Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan et al., Plant Mol. Biol. 33: 245 - 255 (1997)), o promotor SUC2 sacarose-H+ simporter da Arabidopsis thaliana (Truernit et al., Planta. 196: 564 - 570 (1995)) e o promotor para as proteínas das membranas tilacóides do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores para as proteínas de ligação a/b da clorofila também podem ser utilizados na invenção, tais como os promotores para o gene LhcB e o gene PsbP da mostarda branca (Sinapis alba; Kretsch et ai, Plant Mol. Biol. 28; 219 - 229 (1995)).

Para os fins de expressão em tecidos do antro da planta, tais como o tubérculo da planta de batata, o fruto do tomate, ou a semente do milho, do trigo, do arroz e da cevada, é preferencial que os promotores utilizados na invenção tenham expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. Uma série de promotores para genes com expressão específica nos tubérculos ou reforçada nos tubérculos são conhecidos, inclusive o promotor de patatina classe I (Bevan et ai, EMBO J. 8: 1899 - 1906 (1986); Je-fferson et ai, Plant Mol. Biol. 14: 995 - 1006 (1990)), o promotor para os genes ADPGPP do tubérculo da batata, tanto as subunidades pequenas quanto grandes, o promotor da sacarose sintase (Salanoubat e Belliard, Gene 60: 47 - 56 (1987), Salanoubat e Belliard, Gene 84: 181 - 185 (1989)), o promotor para as principais proteínas de tubérculos inclusive os complexos protéicos de 22 kd e inibidores da protease (Hannapel, Plant Physiol. 101: 703 - 704 (1993)), o promotor para o gene da sintase do amido ligada aos grânulos (GBSS) (Visser et ai, Plant Mol. Biol. 17: 691 - 699 (1991)), e outros promotores de patatina classe I e II (Koster-Topfer et ai, Mol Gen Ge-net. 219: 390 - 396 (1989); Mignery et ai, Gene. 62: 27 - 44 (1988)).

Outros promotores também podem ser usados para expressar uma proteína ou fragmento da mesma em tecidos específicos, tais como sementes ou frutos. Na verdade, em uma modalidade preferencial, o promotor usado é um promotor específico de sementes. Exemplos de tais promotores incluem as regiões regulatórias 5' de genes tais como napin (Kridl et ai, Seed Sei. Res. 1:209:219 (1991)), faseolina (Bustos, et ai, Plant Cell, 1(9): 839 - 853 (1989)), inibidor de tripsina da soja (Riggs, et ai, Plant Cell 1(6): 609 - 621 (1989)), ACP (Baerson, ef ai, Plant Mol. Biol., 22(2): 255 -267 (1993)), estearoil-ACP desaturase (Slocombe, et ai, Plant Physiol. 104(4): 167- 176 (1994)), subunidade a' de β-conglicinina da soja (soja 7S, (Chen et ai, Proc. Natl. Acad. Sei., 83: 8560 - 8564 (1986))), e oleosina (ver, por exemplo, Hong, et ai, Plant Mol. Biol., 34(3): 549 - 555 (1997)). Exemplos adicionais incluem o promotor para β-conglicinina (Chen et ai, Dev. Genet. 10: 112 - 122 (1989)). Um promotor preferencial adicional é o pro- motor de arcelina 5 (Arc5) (Goossens et al., Píant Physiol. 120: 1095 - 1104 (1999), e como revelado no Requerimento dos Estados Unidos S/N 60/255.879, arquivado em December 18, 2000 e no Requerimento dos Estados Unidos S/N 10/015.637, arquivado em 17 de dezembro de 2001 ambos os quais são incorporados a este relatório por meio de referência em sua totalidade)). Além disso são incluídas as zeínas, as quais são um grupo de proteínas de armazenamento encontradas no endosperma do milho. Clones genômicos para genes de zeína foram isolados (Pedersen et al., Cell 29: 1015 - 1026 (1982), e Russell et al., Transgenic Res. 6(2): 157 - 168) e os promotores destes clones, inclusive os de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e genes, também podem ser usados. Outros promotores que se sabe que funcionam, por exemplo, no milho incluem os promotores para os seguintes genes: Waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas de Ramificação I e II, sintases de amido, enzimas de desramificação, oleosinas, glutelinas e sacarose sintases. Um promotor particularmente preferencial para expressão no endosperma do milho é o promotor para o gene glutelina do arroz, mais particularmente o promotor Osgt-1 (Zheng et ai, Mol. Cell Biol. 13: 5829 - 5842 (1993)). Exemplos de promotores adequados para expressão no trigo incluem os promotores para as subunidades de ADPglicose pirossintase (ADPGPP), a sintase ligada a grânulos e outras de amido, as enzimas de ramificação e desramificação, as proteínas abundantes na embriogênese, as gliadinas e as gluteninas. Exemplos de tais promotores no arroz incluem os promotores para as subunidades ADPGPP, a sintase ligada a grânulos e outras de amido, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sacarose sintases e as glutelinas. Um promotor particularmente preferencial é o promotor para glutelina do arroz, Osgt-1. Exemplos de tais promotores para cevada incluem os para as subunidades ADPGPP, a sintase ligada a grânulos e outras de amido, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sacarose sintases, as hordeínas, as globulinas de embriões e as proteínas aleurona-específicas. Um promotor preferencial para expressão nas sementes é um promotor napin.

Promotores específicos das raízes também podem ser usados.

Um exemplo de um promotor semelhante é o promotor para o gene da quiti-nase ácida (Samac et al., Plant Mol. Biof. 25: 587 - 596 (1994)). A expressão em tecido das raízes também pode ser realizada utilizando os subdomínios específicos das raízes do promotor CaMV35S que foram identificados (Lam et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 86: 7890 - 7894 (1989)). Outros promotores específicos de células das raízes incluem os relatados por Conkling et al. (Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203 -1211 (1990)).

Promotores adicionais que podem ser utilizados são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.378.619; 5.391.725; 5.428.147; 5.447.858; 5.608.144; 5.608.144; 5.614.399; 5.633.441; 5.633.435; e 4.633.436. Além disso, pode ser usado um reforçador tecidual específico (Fromm et al., The Plant Cell 1: 977 - 984 (1989)).

Constructos ou vetores também podem incluir, com a região de codificação de interesse, uma sequência de ácidos nucléicos que age, no todo ou em parte, terminando a transcrição daquela região. Uma série de tais seqüências foram isoladas, inclusive a seqüência Tr7 3' e a sequência NOS 3' (Ingelbrecht et al., The Plant Cell 1: 671 - 680 (1989); Bevan et al., Nucleic Acids Res. 11: 369 - 385 (1983)). Do mesmo modo regiões de terminação dos transcriptos regulatórias podem ser proporcionadas em constructos de expressão vegetal desta invenção. Regiões de terminação dos transcriptos podem ser proporcionadas pela sequência de DNA codificando o gene de interesse ou uma região de terminação de transcrição conveniente derivada de uma fonte genética diferente, por exemplo, a região de terminação dos transcriptos a qual está associada naturalmente com a região de iniciação do transcripto. O técnio versado reconhecerá que qualquer região de terminação do transcripto conveniente a qual seja capaz de terminar a transcrição em uma célula vegetal pode ser empregada nos constructos da presente invenção.

Um vetor ou constructo também pode incluir elementos reguladores. Exemplos de tais incluem o Adh íntron 1 (Callis et al·, Genes and De-ve/op. 1: 1183 - 1200 (1987)), o íntron da sacarose sintase (Vasil et al·, Plant Physiol· 91: 1575 - 1579 (1989)), e o elemento TMV ômega (Gallic et al·, The Plant Cell 1: 301 - 311 (1989)). Estes e outros elementos reguladores podem ser incluídos quando adequado.

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador sele-cionável. Marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionarem para plantas ou células de plantas que contenham o material genético exógeno. Exemplos de tais incluem, porém sem limitação: um gene neo (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183- 188 (1985)) o qual codifica para resistência a canamicina e pode ser selecionado para usar canamicina, Rptll, G418, hpt, etc.; um gene bar o qual codifica para resistência a bialafos; um gene de EPSP sintase mutante (Hinchee et ai, Bio/Technology 6: 915 -922 (1988); Reynaerts et ai, Selectable and Screenable Markers. In Gelvin and Schilperoort. Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988); Reynaerts et ai, Selectable and screenable markers. In Gelvin and Schilperoort. Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988)), aadA (Jo-nes et ai, Mol. Gen. Genet. (1987)) o qual codifica resistência a glifosato; o nitrilase gene o qual confere resistência a bromoxinil (Stalker et ai, J. Biol. Chem. 263: 6310 - 6314 (1988)); um gene de acetolactato sintase mutante (ALS) o qual confere resistência à imidazolinona ou sulfoniluréia (Requerimento de Patente Européia 154.204 (Sept. 11, 1985)); ALS (D'Halluin et ai, Bio/Technology 10: 309 - 314 (1992)); e um gene DHFR resistente a me-totrexato (Thillet et ai, J. Biol. Chem. 263: 12500 - 12508 (1988)).

Um vetor ou constructo também pode incluir um peptídeo de trânsito. Também pode ser empregada a incorporação de um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado (Requerimento de Patente Européia Publicação Número 0218571). Reforçadores translacionais também podem ser incorporados como parte do DNA vetorial. Constructos de DNA podem conter uma ou mais seqüências líder não-traduzidas 5' as quais podem servir para reforçar a expressão dos produtos genéticos dos transcritos de mRNA resultantes. Tais seqüências podem ser derivadas do promotor selecionado para expressar o gene ou podem ser especificamente modificadas para aumentar a translação do mRNA. Tais regiões também podem ser obtidas a partir de RNAs virais, a partir de genes eucarióticos adequados, ou a partir de uma seqüência genética sintética. Para uma revisão da otimização da expressão de transgenes, ver Koziel et ai, Plant Mol. Biof. 32: 393 - 405 (1996). Uma seqüência de peptídeos de trânsito de plastídeos preferencial é CTP1.

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador triá-vel. Marcadores triáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Marcadores triáveis típicos incluem: uma β-glucuronidase ou gene uidA (GUS) o qual codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5: 387 - 405 (1987); Jefferson etal., EMBO J. 6: 3901 - 3907 (1987)); um gene do locus-R, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) nos tecidos das plantas -(Dellaporta et ai, Stadler Symposium 11: 263 - 282 (1988)); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 75: 3737 - 3741 (1978)), um gene o qual codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et a/., Science 234: 856 - 859 (1986)); um gene xylE (Zukowsky et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 80: 1101 - 1105 (1983)) o qual codifica uma catecol diso-xigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de a-amilase (Ikatu et al., Bio/Technol. 8: 241 - 242 (1990)); um gene de tirosinase (Katz et a!., J. Gen. Microbiol. 129: 2703 - 2714 (1983)) o qual codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa em melanina; e uma α-galactosidase a qual se tornará um substrato de α-galactose cromogênica.

Incluídos dentro dos termos "genes marcadores selecionáveis ou triáveis" são também genes os quais codificam um marcador secretável cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificação ou seleção para as células transformadas. Exemplos incluem marcadores os quais codificam um antígeno secretável que pode ser identificado por meio de interação com anticorpos, ou ainda enzimas secretáveis as quais podem ser detectadas cataiiticamente. Proteínas secretáveis estão dentro de uma série de classes, inclusive proteínas pequenas, difundíveis, as quais são detectáveis, (por exemplo, por meio de ELISA), pequenas enzimas ativas as quais são detectáveis em solução extracelular (por exemplo, a-amilase, β-lactamase, fosfinotricina transferase), ou proteínas as quais são inseridas ou retidas na parede celular (tais como proteínas as quais incluem uma sequência líder tal como a encontrada na unidade de expressão de extensão ou tabaco PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis e/ou triáveis possíveis serão evidentes para os versados na técnica.

Existem muitos métodos para introduzir moléculas de ácido nu-cléico mutantes em células vegetais. Acredita-se que os métodos adequados incluam virtualmente qualquer método por meio do qual moléculas de ácido nucléico possam ser introduzidas em uma célula, tal como por infecção por Agrobacterium ou liberação direta de moléculas de ácido nucléico tal como, por exemplo, por meio de transformação mediada por PEG, por meio de eletroporação, por meio de aceleração de partículas revestidas com DNA, etc. (Potrykus, Artn. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 - 225 (1991); Vasil, Plant Mol. Biol. 25: 925 - 937 (1994)). Por exemplo, a eletroporação tem sido usada para transformar protoplastos de milho (Fromm et ai, Nature 312: 791 - 793(1986)).

Outros sistemas de vetores adequados para introduzir DNA mutante em uma célula vegetai hospedeira incluem, porém sem limitação, vetores de cromossomo artificial binário (BIBAC) (Hamilton et al., Gene 200: 107- 116 (1997)); e transfecção com vetores de RNA viral (Della-Cioppa et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. (1996), 792 (Engineering Plants for Commercial Products and Applications), 57-61). Sistemas de vetores adicionais também incluem vetores YAC selecionáveis para plantas tais como os descritos em Mullen et ai, Molecular Breeding 4: 449 -457 (1988). A tecnologia para a introdução de DNA em células é de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Foram descritos quatro métodos gerais para liberar um gene em células : (1) métodos químicos (Graham e van der Eb, Virology 54: 536 - 539 (1973)); (2) métodos físicos tais como microinjeção (Capecchi, Cell 22: 479 - 488 (1980)), eletroporação (Wong e Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584 - 587 (1982); Fromm et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 82: 5824 - 5828 (1985); Patente dos Estados Unidos N9 5.384.253), a pistola genética (Johnston e Tang, Methods Cell Biol. 43: 353 - 365 (1994)), e infiltração a vácuo (Bechtold et ai, C.R. Acad. Sei. Paris, Life Sei. 316: 1194 - 1199 (1993)); (3) vetores virais (Clapp, Clin. Perinatoi. 20: 155 - 168 (1993); Lu et ai., J. Exp. Med. 178: 2089 - 2096 (1993), Eglitis e Anderson, Biotechniques 6: 608 - 614 (1988)); e (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel ef ai., Hum. Gen. Ther. 3: 147 - 154 (1992), Wagner et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 89: 6099 - 6103 (1992)). Métodos de aceleração que podem ser usados incluem, por exemplo, bombardeamento de microprojéteis e semelhantes. Um exemplo de um método para liberar moléculas de ácido nucléico mutantes em células vegetais é bombardeamento de microprojéteis. Este método foi revisado por Yang e Christou (eds.), Particle Bombardment Technology for Gene Trans-fer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994), Partículas não-biológicas (microprojéteis) podem ser revestidas com ácidos nucléicos e liberadas nas células por meio de uma força propelente. Partículas típicas incluem as compostas de tungstênio, ouro, platina e semelhantes.

Uma vantagem particular do bombardeamento de microprojéteis, além de ser um meio eficaz de transformar monocotiledôneas de modo re-produzível, é que não é necessário nem o isolamento de protoplastos (Cris-tou et al·, Plant Physiol. 87: 671 - 674 (1988)) nem a suscetibilidade para infecção por Agrobacterium. Uma modalidade ilustrativa de um método para liberar DNA emj células de milho por meio de aceleração é um sistema de liberação de partículas α biolísticas, o qual pode ser usado para impulsionar partículas revestidas com DNA através de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. Gordon-Kamm et al., descreve o procedimento básico para revestir partículas de tungstênio com DNA (Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603 - 618 (1990)). A tela dispersa as partículas de ácido nucléico do tungstênio de modo que elas não são liberadas para as células recipientes em grandes agregados. Um sistema de liberação de partículas adequado para uso com a invenção é a pistola de aceleração de hélio PDS-1000/He, a qual está disponível nos Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad, Hercules, Califórnia)(Sanford etal., Technique 3: 3-16 (1991)).

Para o bombardeamento, células em suspensão podem ser concentradas sobre filtros. Filtros contendo as células a serem bombardeadas são posicionados em uma distância adequada abaixo da lâmina de parada do microprojétil. Caso desejado, uma ou mais telas também são posicionadas entre a pistola e as células a serem bombardeadas.

Alternativamente, embriões imaturos ou outras células alvo podem ser dispostos sobre meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas em uma distância adequada abaixo da lâmina de parada do microprojétil. Caso desejado, uma ou mais telas também são posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Através do uso de técnicas determinadas neste relatório pode-se obter 1000 ou mais locos de células expressando transitoriamente um gene marcador. O número de células em um foco o qual expressa o produto genético exógeno, 48 horas após bombardeamento, freqüentemente varia de um a dez, e em média é de um a três.

Na transformação por bombardeamento, pode-se otimizar as condições de cultura pré-bombardeamento e os parâmetros de bombardeamento para produzir os números máximos de mutantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos quanto biológicos para bombardeamento são importantes nesta tecnologia. Fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação do precipitado de DNA/microprojétil ou aqueles que afetam a trajetória e a velocidade seja dos macro- ou dos microprojéteis. Fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente depois do bombardeamento, o ajuste osmótico de células alvo para ajudar a aliviar o trauma associado com o bombardeamento, e a natureza do DNA mutante, tal como DNA linearizado ou plasmídeos superenrolados intactos. Acredita-se que manipulações pré-bombardeamento sejam especialmente importantes para transformação com êxito de embriões imaturos.

Em outra modalidade alternativa, plastídeos podem ser transformados de modo estável. Os métodos revelados para transformação de plastídeos em plantas superiores incluem a liberação de D NA por pistola de partículas contendo um marcador selecionável e orientação do DNA para o genoma do plastídeo através de recombinação homóloga (Svab et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 87: 8526 - 8530 (1990); Svab and Maliga, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 90: 913 - 917 (1993); Staub e Maliga, EMBO J. 12: 601 - 606 (1993); as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.451.513 e 5.545.818).

Por conseguinte, é contemplado que pode-se desejar ajustar vários aspectos dos parâmetros de bombardeamento em estudos de pequena escala para otimizar totalmente as condições. Pode-se particularmente desejar ajustar os parâmetros físicos tais como distância da abertura, distância da trajetória, distância do tecido e pressão do hélio. Pode-se também minimizar os fatores de redução do trauma modificando as condições que influenciem o estado fisiológico das células recipientes e as quais podem portanto influenciar a eficácia de transformação e de integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação do tecido, e o estágio de subeultura ou ciclo celular das células recipientes pode ser ajustado para transformação ótima. A execução de outros ajustes de rotina será de conhecimento daqueles de conhecimento da técnica à luz da presente revelação. A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema amplamente aplicável para a introdução de genes em céluals vegetais porque o DNA pode ser introduzido em tecidos de plantas sadias, deste modo contornando a necessidade da regeneração de uma planta intacta de um proto-plasto. O uso de vetores integrando plantas mediadas por Agrobacterium para introduzir DNA em células vegetais é de conhecimento geral na técnica. Ver, por exemplo os métodos descritos por Fraley et ai, Bio/Technology 3: 629 - 635 (1985) e Rogers et al., Methods Enzymoi 153: 253 - 277 (1987). Além disso, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso resultando em poucas reordenações. A região do DNA a ser transferida é definida pelas seqüências de limite e o DNA intermediário é geralmente inserido no genoma da planta conforme descrito (Spielmann et ai., Moi Gen. Genet. 205: 34 (1986)).

Os vetores modernos de transformação de Agrobacterium são capazes de replicação em E. coli bem como Agrobacterium, possibilitando manipulações convenientes conforme descrito (Klee et a!., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn e Schell (eds.), Springer-Verlag, New York, pp. 179 -203 (1985)). Além disso, os avanços tecnológicos em vetores para transferência genética mediada por Agrobacterium têm melhorado a disposição dos genes e os sítios de restrição nos vetores facilitando a construção de vetores capazes de expressar vários genes codificando polipeptídeos. Os vetores descritos têm regiões multiencadeadores convenientes flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para expressão direta de genes codificando polipeptídeos inseridos e são adequados para os presentes fins (Ro-gers et a!., Methods Enzymol. 153: 253 - 277 (1987)). Além disso, Agrobacterium contendo tanto genes Ti armados quanto desarmados podem ser usados para as transformações. Nas cepas de plantas onde a transformação mediada por Agrobacterium é eficaz, é o método de escolha devido à natureza fácil e definida da transferência genética.

Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação por Agrobacterium tipicamente contém um único gene em um cromossomo. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo hete-rozigóticas para o gene adicionado. Mais preferencial é uma planta transgênica que é homozigótica para o gene estrutural adicionado; isto é, uma planta transgênica que contenha dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigótica pode ser obtida reproduzindo sexualmente (incul-cando) um segregante independente, planta transgênica que contém um único gene adicionado, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes produzidas para o gene de interesse.

Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser cruzadas para produzir prole que contenha dois genes exógenos, independentemente segregantes. A auto-inseminação de progênie adequada pode produzir plantas que sejam homozigóticas para ambos os genes exógenos adicionados que codificam um polipeptídeo de interesse. Também são contemplados "back-crossing" (cruzamento da primeira geração híbrida com um de seus antecedentes ou com um indivíduo da mesma composição genética que o antecedente) para uma planta pa-rental e "outcrossing" (acasalamento de indivíduos da mesma raça, mas sem parentesco entre si) com uma planta não-transgênica, uma vez que é propagação vegetativa. A transformação dos protoplastos das plantas pode ser obtida usando métodos à base de precipitação de fosfato de cálcio, tratamento com polietileno glicol, eletroporação e combinações destes tratamentos (Ver, por exemplo, Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193 - 200 (1986); Lorz et aí., Mol. Gen. Genet. 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature 319: 791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet. 204: 204 (1986); Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988)). A aplicação destes sistemas para cepas de plantas diferentes depende da capacidade para regenerar aquela cepa de planta, em particular, a partir de protoplastos. São descritos métodos ilustrativos para a regeneração de cereais a partir de protoplastos (Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters 2: 74 (1985); Toriyama et ai, Theor Appl. Genet. 205: 34 (1986); Yamada et ai, Plant Cell Rep. 4: 85 (1986); Abdullah et ai, Biote-chnology 4: 1087 (1986)).

Para transformar cepas de plantas que não podem ser regeneradas com êxito a partir de protoplastos, podem ser utilizados outros modos para introduzir DNA em células ou tecidos intactos. Por exemplo, a regeneração de cereais a partir de embriões imaturos ou explantes pode ser realizada conforme descrito (Vasil, Biotechnology 6: 397 (1988)). Além disso, pode ser utilizada tecnologia de "pistola de partículas" ou de microprojéteis de alta velocidade (Vasil et ai, Bio/Technology 10: 667 (1992)).

Usando a última tecnologia, DNA é carregado através da parede celular e para dentro do citoplasma sobre a superfície de pequenas partículas de metal conforme descrito (Klein et ai, Nature 328:70 (1987); Klein et ai, Proc. Nati Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 8502 - 8505 (1988); McCabe et ai, Bio/Technology 6: 923 (1988)). As partículas de metal penetram através de várias camadas de células e deste modo possibilitam a transformação de células dentro de explantes de tecidos.

Outros métodos de transformação celular também podem ser usados e incluem, porém sem limitação, a introdução de DNA em plantas por meio da transferência direta de DNA para o pólen (Hess et ai., Intern Rev. Cytol. 107: 367 (1987); Luo et a/., Plant Mol Biol. Repórter 6: 165 (1988)), por meio de injeção direta de DNA em órgãos reprodutivos de uma planta (Pena et al., Nature 325: 274 (1987)), ou por meio de injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos seguida pela reidratação de embriões dessecados (Neuhaus etal., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987)). A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de mutantes de protoplastos de plantas únicas ou de vários explantes transformados é de conhecimento geral na técnica (Weissbach e Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA, (1988)). Este processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas e cultivar estas células individualizadas através dos estágios habituais de desenvolvimento embriônico através do estágio da plântula enraizada. Embriões e sementes transgênicos são regenerados de modo semelhante. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois disso plantados em um meio para crescimento vegetal adequado tal como terra. O desenvolvimento ou a regeneração de plantas contendo o gene exógeno estranho que codifica uma proteína de interesse é de conhecimento geral na técnica. De modo preferencial, as plantas regeneradas são autopolinizadas para proporcionarem plantas transgênicas homozigóticas. De outro modo, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas a partir de sementes de linhagens agronomicamente importantes. Ao invés, o pólen de plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada usando métodos de conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica. Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas de tecido vegetal. O método de regeneração em particular dependerá do tecido da planta inicial e da espécie de planta em particular a ser regenerada. Métodos para transformação de dicotiledôneas, essencialmente por meio do uso de Agrobacteriurn tumefaciens e obtendo plantas transgêni-cas foram publicados para algodão (Patente dos Estados Unidos N9 5.004.863; Patente dos Estados Unidos N- 5.159.135; Patente dos Estados Unidos Ns 5.518.908); soja (Patente dos Estados Unidos N9 5.569.834; Patente dos Estados Unidos N9 5.416.011; McCabe et. al., Biotechnology 6:923 (1988); Christou et ai, P/ant Physiol. 87: 671 - 674 (1988)); Brassica (Patente dos Estados Unidos N9 5.463.174); amendoim (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653 - 657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14: 699 - 703 (1995)); papaia; ervilha (Grant et al., Plant Cell Rep. 15: 254 - 258 (1995)); e Arabidopsis thaliana (Bechtold et al., C.R. Acad. Sei. Paris, Life Sei. 316: 1194-1199 (1993)). O último método para transformção de Arabidopsis thaliana é denominado comumente "imersão" ou infiltração a vácuo ou transformação de idioplasma. A transformação de monocotiledôneas usando eletroporação, bombardeamento de partículas e Agrobacteriurn também foi relatada. Transformação e regeneração de plantas foram conseguidas no aspargo (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 84: 5354 (1987)); na cevada (Wan and Lemaux, Plant Physiol 104: 37 (1994)); no milho (Rhodes et al·, Science 240: 204 (1988); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603 - 618 (1990); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990); Koziel et al., Bio/Technology 11: 194 (1993); Armstrong et al., Crop Science 35: 550 - 557 (1995)); na aveia (Somers et al., Bio/Technology 10: 1589 (1992)); grama pé-de-galinha (Dactilis glomerata) (Hom et al., Plant Cell Rep. 7: 469 (1988)); no arroz (Toriyama et al., Theor Appl. Genet. 205:34 (1986); Part et ai, Plant Mol. Biol. 32: 1135 - 1148 (1996); Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24: 133 - 141 (1997); Zhang e Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988); Zhang et al·, Plant Cell Rep. 7: 379 (1988); Battraw e Hall, Plant Sei. 86: 191 - 202 (1992); Christou et al·, Bio/Technology 9: 957 (1991)); na ce- vada (De Ia Pena et al., Nature 325: 274 (1987)); na cana-de-açúcar (Bower e Birch, Plant J. 2: 409 (1992)); festuca grande (Wang et ai, Bio/Technology 10: 691 (1992)); e no trigo (Vasil et al., Bio/Technology 10: 667 (1992); Patente dos Estados Unidos N2 5.631.152).

Testes para expressão genética à base da expressão transitória de constructos de ácidos nucléicos clonados foram desenvolvidos introduzindo as moléculas de ácido nucléico em células vegetais por meio de tratamento com polietileno glicol, eletroporação ou bombardeamento de partículas (Marcotte et ai, Nature 335: 454 - 457 (1988); Marcotte et ai, Plant Cell 1: 523 - 532 (1989); McCarty et al., Cell 66: 895 - 905 (1991); Hattori et ai, Genes Dev. 6: 609 - 618 (1992); Goff et ai, EMBO J. 9: 2517 - 2522 (1990)). Sistemas de expressão transitória podem ser usados para funcionalmente dissecar constructos genéticos (ver de modo geral, Mailga et ai, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)).

Quaisquer das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser introduzidas em uma célula vegetal de um modo permanente ou transitório em combinação com outros elementos genéticos tais como vetores, promotores, reforçadores, etc. Além disso, quaisquer das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser introduzidas em uma célula vegetal em um modo que permita a expressão ou a superexpressão da proteína ou fragmento da mesma codificada pela molécula de ácido nucléico.

Co-supressão é a redução dos níveis de expressão, geralmente no nível de RNA, de um gene endógeno em particular ou família de genes por meio da expressão de um constructo de sentido homólogo que seja capaz de transcrever o mRNA da mesma filamentação que o transcripto do gene endógeno (Napoli et ai, Plant Cell 2: 279 - 289 (1990); van der Krol et ai, Plant Cell 2: 291 - 299 (1990)). A co-supressão pode resultar de transformação estável com uma única cópia de molécula de ácido nucléico que seja homóloga a uma sequência de ácidos nucléicos encontrados dentro da célula (Prolls e Meyer, Plant J. 2: 465 - 475 (1992)) ou com múltiplas cópias de uma molécula de ácido nucléico que seja homóloga a uma seqüência de ácidos nucléicos encontrados dentro da célula (Mittlesten et ai, Moi Gen.

Genet. 244: 325 - 330 (1994)). Genes, muito embora diferentes, ligados a promotores homólogos podem resultar na co-supressão dos genes ligados (Vaucheret, C.R. Acad. Sei. III 316: 1471 - 1483 (1993); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 91: 3490 - 3496 (1994); van Blokland et ai, Plant J. 6: 861 - 877 (1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8: 340 - 344 (1990); Meins e Kunz, In: Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants, Paszkowski (ed.), pp. 335 - 348, Kluwer Academic, Países Baixos (1994)). É entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser introduzidos em uma célula vegetal e transcritos usando um promotor adequado com tal transcrição resultando na co-supressão de uma proteína endógena.

Abordagens anti-sentido são um modo para evitar ou reduzir a função genética que tem por alvo o material genético (Mol et ai., FEBS Lett. 268: 427 - 430 (1990)). O objetivo da abordagem anti-sentido é usar uma seqüência complementar ao gene alvo para bloquear sua expressão e criar linhagem celular ou organismo mutantes nos quais o nível de uma única proteína escolhida seja seletivamente reduzido ou abolido. As técnicas anti-sentido têm várias vantagens sobre outras abordagens 'genéticas reversas1. O sítio de inativação e seu efeito evolucionário podem ser manipulados por meio da escolha do promotor para genes anti-sentido ou pelo timing da aplicação externa ou microinjeção. As técnicas anti-sentido podem manipular sua especificidade por meio da seleção de ou regiões únicas do gene alvo ou regiões onde partilhe homologia com outros genes relacionados (Hiatt et a!., In: Genetic Engineering, Setlow (ed.), Vol. 11, New York: Plenum 49 - 63 (1989)). Técnicas de RNA anti-sentido envolvem a introdução de RNA que seja complementar ao mRNA alvo nas células, o que resulta em duple-xes RNA : RNA específicos sendo formados pelo pareamento de bases entre o substrato anti-sentido e o mRNA alvo (Green et ai, Annu. Rev. Bio-chem. 55: 569 - 597 (1986)). Em uma modalidade, o processo envolve a introdução e a expressão de uma seqüência genética anti-sentido. Uma tal seqüência é uma seqüência na qual parte ou todas as seqüências genéticas normais são dispostas sob um promotor em orientação invertida de modo que o filamento 'errado' ou complementar seja transcrito em um RNA anti-sentido não codificante que hibridiza com o mRNA alvo e interfere com sua expressão (Takayama e Inouye, Crít. Rev. Biochem. Mof. Biol. 25: 155 - 184 (1990)). Um vetor anti-sentido é construído por meio de procedimentos de rotina e introduzido nas células por meio de transformação, transfecção, ele-troporação, microinjeção, infecção, etc. O tipo de transformação e escolha do vetor vão determinar se a expressão é transitória ou estável. O promotor usado para o gene anti-sentido pode influenciar o nível, o timing, o tecido, a especificidade, ou a indutibilidade da inibição anti-sentido. É entendido que a atividade de uma proteína em uma célula vegetal pode ser reduzida ou diminuída cultivando uma célula vegetal transformada contendo uma molécula de ácido nucléico cujo filamento não transcrito codifica uma proteína ou fragmento da mesma. O silenciamento genético pós-transcripcional (PTGS) pode resultar em imunidade viral ou silenciamento genético em plantas. PTGS é induzido por dsRNA e é mediado por uma RNA polimerase RNA-dependente, presente no citoplasma, que requer um modelo de dsRNA. O dsRNA é formado por meio de hibridização de RNAms de transgene complementares ou regiões complementares do mesmo transcripto. A formação de duplex pode ser realizada usando transcriptos de um gene de sentido e um gene anti-sentido colocados no genoma da planta, um único transcripto que tenha auto-complementaridade, ou transcriptos de sentido e anti-sentido de genes unidos por meio de cruzamento. A RNA polimerase dsRNA-dependente faz um filamento complementar das moléculas mRNA e RNAse do transgene ligar a este filamento complementar (cRNA). Estas moléculas cRNA-RNase hibridizam ao mRNA do endogene e clivam o RNA de filamento único adjacente ao híbrido. Os RNAs de filamento único clivados são adicionalmente degradados por outras RNAses do hospedeiro porque uma carecerá de uma extemidade 5' capeada e a outra carecerá de uma cauda poli(A) (Waterhouse et a!., PCS 95: 13959 - 13964 (1998)). É entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser introduzidos em uma célula vegetal e transcritos usando um promotor adequado com tal transcrição resultante no silenciamento genético pós-transcripcional de um transcripto endógeno.

Foram expressos anticorpos em plantas (Hiatt et al., Nature 342: 76 - 78 (1989); Conrad e Fielder, Plant Mol. Biol. 26: 1023 - 1030 (1994)). Foi relatado que a expressão citoplásmica de um scFv (anticorpo Fv de cadeia única) retarda a infecção pelo vírus da dobra mosqueada alcachofra. Plantas transgênicas que expressam anticorpos orientados contra proteínas endó-genas podem apresentar um efeito fisiológico (Philips et aL, EMBO J. 16: 4489 - 4496 (1997); Marion-Poll, Trends in Plant Science 2: 447 - 448 (1997)). Por exemplo, foi relatado que anticorpos antiabscísicos expressos resultam em uma perturbação geral do desenvolvimento das sementes (Philips et al., EMBO J. 16: 4489 - 4496 (1997)).

Anticorpos que são catalíticos também podem ser expressos em plantas (abzimas). O princípio por trás das abzimas é que como os anticorpos podem ser criados contra muitas moléculas, esta capacidade de reconhecimento pode ser orientada para produzir anticorpos que liguem estados de transição para forçar uma reação química radical (Persidas, Nature Biote-chnology 15: 1313 - 1315 (1997); Baca et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 461 - 493 (1997)). As capacidades catalíticas das abzimas pode ser reforçada por meio de mutagênese sítio-dirigida. Exemplos de abzimas são, por exemplo, determinados na Patente dos Estados Unidos No: 5.658.753; na Patente dos Estados Unidos N9 5.632.990; na Patente dos Estados Unidos Ns 5.631.137; na Patente dos Estados Unidos 5.602.015; na Patente dos Estados Unidos N- 5.559.538; na Patente dos Estados Unidos N9 5.576.174; na Patente dos Estados Unidos N9 5.500.358; na Patente dos Estados Unidos 5.318.897; a Patente dos Estados Unidos N9 5.298.409; na Patente dos Estados Unidos N9 5.258.289 e na Patente dos Estados Unidos N9 5.194.585. É entendido que quaisquer dos anticorpos da invenção podem ser expressos em plantas e que tal expressão pode resultar em um efeito fisiológico. Também é entendido que quaisquer dos anticorpos expressos podem ser catalíticos. A presente invenção também proporciona partes das plantas, particularmente partes reprodutivas ou de armazenamento. Partes de plantas, sem limitação, incluem sementes, endosperma, óvulo, e pólen. Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, a parte da planta é uma semente. Em uma modalidade a semente é um constituinte da ração animal.

Em outra modalidade, a parte da planta é um fruto, mais preferencialmente um fruto com aumentada vida de armazenamento. Em outra modalidade preferencial, o fruto tem níveis aumentados de tocoferol. A presente invenção também proporciona um recipiente de no mínimo cerca de 10.000, mais preferencialmente no mínimo cerca de 20.000, e ainda mais preferencialmente no mínimo cerca de 40.000 sementes onde no mínimo cerca de 10 %, mais preferencialmente no mínimo cerca de 25 %, mais preferencialmente no mínimo cerca de 50 % mais preferencialmente no mínimo cerca de 75 % e ainda mais preferencial mente no mínimo cerca de 90 % das sementes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção. A presente invenção também proporciona um recipiente de no mínimo cerca de 10 kg, mais preferencialmente no mínimo cerca de 25 kg, e ainda mais preferencial mente no mínimo cerca de 50 kg de sementes onde no mínimo cerca de 10 %, mais preferencialmente no mínimo cerca de 25 %, mais preferencialmente no mínimo cerca de 50 %, mais preferencialmente no mínimo cerca de 75 %, e ainda mais preferencialmente no mínimo cerca de 90 % das sementes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção.

Quaisquer das plantas ou partes das mesmas da presente invenção podem ser processadas para produzir uma ração, uma refeição, uma proteína, ou uma preparação de óleo. Uma parte de planta particularmente preferencial para este fim é uma semente. Em uma modalidade preferencial a ração, a refeição, a proteína, ou a preparação de óleo é designada para animais ruminantes. Os métodos para produzir ração, refeição, proteína, e preparações de óleo são de conhecimento na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.957.748, 5.100.679, 5.219.596, 5.936.069, 6.005.976, 6.146.669, e 6.156.227. Em uma modalidade preferencial, a preparação protéica é uma preparação de proteína superior. Uma preparação de proteína superior semelhante preferencialmente tem um teor protéico de no mínimo cerca de 5 % de peso/vol, mais preferencialmente no mínimo cerca de 10 % de peso/vol, e ainda mais preferencialmente no mínimo cerca de 15 % de peso/vol. Em uma preparação de óleo preferencial, a preparação de óleo é uma preparação de óleo superior com um teor de óleo derivado de uma planta ou parte da mesma da presente invenção de no mínimo cerca de 5 % de peso/vol, mais preferencialmente no mínimo cerca de 10 % de peso/vol, e ainda mais preferencialmente no mínimo cerca de 15 % de peso/vol. Em uma modalidade preferencial a preparação de óleo é um líquido e tem um volume maior do que 1,5, 10 ou 50 litros. A presente invenção proporciona óleo produzido a partir das plantas da presente invenção ou produzidos por meio de um método da presente invenção. Um tal óleo pode ser um componente secundário ou principal de qualquer produto resultante. Além disso, um tal óleo pode ser misturado com outros óleos. Em uma modalidade preferencial, o óleo produzido a partir das plantas da presente invenção ou produzido por meio de um método da presente invenção constitui mais de 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, ou 90 % por volume ou peso do componente de óleo de qualquer produto. Em outra modalidade, a preparação de óleo pode ser misturada e pode constituir mais de 10 %, 25 %, 35 %, 50 %, ou 75 % da mistura por volume. O óleo produzido a partir de uma planta da presente invenção pode ser misturado com um ou mais solventes orgânicos ou destilados de petróleo.

As plantas da presente invenção podem ser parte de ou produzidas a partir de um programa de reprodução. A escolha do método de reprodução depende do modo de reprodução da planta, da hereditariedade da característica(s) que está sendo aperfeiçoada, e do tipo de cultivar usado comercialmente (por exemplo, cultivar de híbrido Fi, cultivar de linhagem pura, etc). Abordagens selecionadas, não limitantes para reprodução das plantas da presente invenção são determinadas abaixo. Um programa de reprodução pode ser reforçado usando seleção auxiliada por marcador da progênie de qualquer cruzamento. É ainda entendido que podem ser utilizados quaisquer cultivares comerciais e não comerciais em um programa de reprodução. Fatores tais como, por exemplo, vigor da emergência emergen-ce, vigor vegetativo, tolerância a estresse, resistência à doença, ramificação, floração, conjunto de sementes, tamanho da semente, densidade da semente, resistibilidade, debulhabilidade, etc. de modo geral orientarão a escolha.

Para características altamente hereditárias, uma escolha de plantas individuais superiores avaliada em uma única localização será eficaz, ao passo que a seleção para características com baixa hereditaditarie-dade deve ser baseada em valores médios obtidos de avaliações em repli-cata de famílias de plantas relacionadas. Métodos de seleção popular co-mumente incluem seleção de pedigree, seleção de pedigree modificado, seleção de massa, e seleção recorrente. Em uma modalidade preferencial é empreendido um "backcross'1 ou um programa de reprodução recorrente. A complexidade da hereditariedade influencia a escolha do método de reprodução. "Backcross" pode ser usado para transferir um ou uns poucos genes favoráveis por uma característica altamente hereditária para um cultivar desejável. Esta abordagem tem sido usada extensivamente para reprodução de cultivares resistentes a doenças. Várias técnicas de seleção recorrente são usadas para melhorar quantitativamente as características herdadas controladas por numerosos genes. O uso de seleção recorrente em safras autopolinizantes depende da facilidade de polinização, da fre-qüência de híbridos bem sucedidos de cada polinização, e do número da prole híbrida de cada cruzamento bem sucedido.

Linhagens de reprodução podem ser testadas e comparadas com padrões adequados em ambientes típicos da área ou áreas alvos comerciais por duas ou mais gerações. As melhores linhagens são candidatas para novos cultivares comerciais; Aqueles ainda deficientes em características podem ser usados como plantas-mães para produzir novas populações para seleção posterior.

Um método para identificar uma planta superior é observar sua performance com relação a outras plantas experimentais e com relação a um cultivar padrão amplamente desenvolvido. Se uma única observação for inconclusiva, observações em replicata podem proporcionar uma melhor estimativa de sua importância genética. Um criador pode selecionar e cruzar duas ou mais linhagens parentais, seguida por auto-inseminação e seleção repetidas, produzindo muitas novas combinações genéticas. O desenvolvimento de novos cultivares requer o desenvolvimento e a seleção de variedades, o cruzamento destas variedades, e a seleção de cruzamentos híbridos superiores. A semente híbrida pode ser produzida por cruzamentos manuais entre plantas-mães férteis machos selecionadas ou usando sistemas de esterilidade masculina. Os híbridos são selecionados para determinadas características de único gene tais como cor da vagem, cor das flores, produção de sementes, cor da pubescência, ou resistência a herbicida, os quais indicam que a semente é verdadeiramente um híbrido. Dados adicionais sobre linhagens parentais, bem como o fenótipo do híbrido, influenciam a decisão dos criadores quanto a continuar com o cruzamento de híbridos específicos.

Podem ser usados métodos de reprodução do pedigree e reprodução por seleção recorrente para desenvolver cultivares a partir da reprodução de populações. Programas de reprodução combinam características desejáveis de um ou mais cultivares ou várias plantas-mães de base ampla em grupos de reprodução a partir dos quais os cultivares são desenvolvidos por auto-inseminação e seleção de fenótipos desejados. Novos cultivares podem ser avaliados para determinar quais têm potencial comercial. A reprodução do pedigree é usada comumente para a melhora de safras autopolinizantes. Duas plantas-mães (plantas das quais outras provêem) que possuam características favoráveis e complementares são cruzadas para produzir uma população Uma população F2 é produzida por auto-inseminação de um ou vários membros da população Fi. É feita a seleção dos melhores indivíduos das melhores famílias. A experimentação em replicata das família pode se iniciar na geração F4 para melhorar a eficácia da seleção para características com baixa hereditabilidade. Em um estágio avançado de procriação por endogamia (isto é, F6 e F7), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente semelhantes são testadas para liberação potencial como novos cultivares. "Backcross" tem sido usada para transferir genes para uma característica altamente hereditária herdada simplesmente, para um cultivar homozigótico desejável ou linhagem natural, que é a planta-mãe recorrente. A origem da característica a ser transferida é chamada de planta-mãe doa-dora. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos da planta-mãe recorrente (por exemplo, cultivar) e as característica desejáveis transferidas da planta-mãe doadora. Após o cruzamento inicial, indivíduos possuindo o fenótipo da planta-mãe doadora são selecionados e repetidamente cruzados (cruzamento reverso) com a planta-mãe recorrente. Espera-se que a planta-mãe resultante tenha os atributos da planta-mãe recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida da planta-mãe doadora. O procedimento de descendência de semente única no sentido rigoroso se refere a plantar uma população segregante, colher uma amostra de uma semente por planta, e usar a amostra de uma semente para plantar a próxima geração. Quando a população tiver avançado do nível F2 para o nível desejado de procriação por endogamia, as plantas destas linhagens são derivadas cada uma traçará para diferentes indivíduos F2. O número de plantas em uma população declina a cada geração devido ao insucesso de algumas sementes para germinar ou de algumas plantas para produzirem no mínimo uma semente. Em conseqüência, nem todas as plantas F2 originalmente amostradas na população serão representadas por uma progênie quanto for completado o avanço das gerações.

Em um procedimento de múltiplas sementes, os criadores co-mumente colhem uma ou mais vagens de cada planta em uma população e debulhar as mesmas juntas para formar um monte. Parte do monte é usada para plantar a próxima geração e parte é reservada. O procedimento tem sido referido como um descendente de única semente modificado ou a téc- nica de monte de vagem. O procedimento de múltiplas sementes tem sido usado para economizar trabalho na colheita. É consideravelmente mais rápido debulhar vagens com uma máquina do que remover uma semente de cada manualmente para o procedimento de única semente. O procedimento de múltiplas sementes também torna possível plantar o mesmo número de sementes de uma população durante cada geração da procriação por endogamia.

As descrições de outros métodos de reprodução que são comu-mente usados para diferentes características e colheitas podem ser encontrados em um dos vários livros de referência (por exemplo Fehr, Principies of Cultivar Development Vol. 1, pp. 2 - 3 (1987)).

Uma planta transgênica da presente invenção também pode ser reproduzida usando apomixia. Apomixia é um método geneticamente controlado de reprodução em plantas onde o embrião é formado sem união de um óvulo e um espermatozóide. Há três tipos básicos de reprodução apo-míctica: 1) aposporia onde o embrião se desenvolve a partir de um ovo cro-mossomicamente não reduzido em um saco embrionário derivado do nucelo, 2) diplosporia onde o embrião se desenvolve a partir de um ovo não reduzido em um saco embrionário derivado da célula mãe megaesporo, e 3) em-brionia adventícia onde o embrião se desenvolve diretamente a partir de uma célula somática. Na maioria das formas de apomixia, pseudogamia ou fertilização dos núcleos polares para produzir endosperma é necessário para viabilidade das sementes. Na aposporia, um cultivar guia pode ser usado como uma fonte de pólen para formação de endosperma nas sementes. O cultivar guia não afeta a genética do cultivar apomíctico aposporoso uma vez que o ovo não reduzido do cultivar se desenvolve partenogeneticamente, mas torna possível a produção de endosperma. A apomixia é economicamente importante, especialmente em plantas transgênicas, porque faz com que qualquer genótipo, não importa quão heterozigótico, seja verdadeiramente reproduzido. Portanto, com reprodução apomíctica, plantas transgênicas heterozigóticas podem manter sua fidelidade genética através de repetidos ciclos de vidas. Os métodos para a produção de plantas apomícticas são de conhecimento na técnica. Ver, a Patente dos Estados Unidos N9 5.811.636. (d) Outros Organismos Um ácido nucléico da presente invenção pode ser introduzido em qualquer célula ou organismo tal como uma célula de mamífero, um mamífero, uma célula de peixe, um peixe, uma célula de pássaro, um pássaro, uma célula de alga, uma alga, uma célula fúngica, fungos, ou uma célula bacteriana. Uma proteína da presente invenção pode ser produzida em uma célula ou organismo adequados. Hospedeiros e transformantes preferenciais incluem: células fúngicas tais como Aspergillus, leveduras, mamíferos, particularmente bovino e porcino, insetos, bactérias, e algas. Os métodos para transformar tais células ou organismos são de conhecimento na técnia (EP 0 238 023; Yelton et ai., Proc. Natf. Acad. Sei. (U.S.A.), 81: 1470 - 1474 (1984); Malardier et al., Gene, 78: 147 - 156 (1989); Becker e Guarente, In: Abelson e Simon (eds.), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Method Enzymoi, Vol. 194, pp. 182 - 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., J. Bacteriology, 153:163 (1983) Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.), 75:1920 (1978); Bennett e LaSure (eds.), More Gene Manipualtio-nins In Fungi, Academic Press, CA (1991)). Os métodos para produzir as proteínas da presente invenção também são conhecidos (Kudla et al., EM-BO, 9: 1355 - 1364 (1990); Jarai e Buxton, Current Genetics, 26: 2238 - 2244 (1994); Verdier, Yeast, 6:271 -297 (1990); MacKenzieetal., Journal of Gen. Microbiol., 139: 2295 - 2307 (1993); Hartl et al., TIBS, 19: 20 - 25 (1994); Bergenron et ai, TIBS, 19: 124 - 128 (1994); Demolder et ai, J. Biotechnolo-gy, 32: 179 - 189 (1994); Craig, Science, 260: 1902 - 1903 (1993); Gething e Sambrook, Nature, 355: 33 - 45 (1992); Puig e Gilbert, J. Biol. Chem., 269: 7764 - 7771 (1994); Wang e Tsou, FASEB Journal, 7: 1515 - 1517 (1993); Robinson et ai, Bio/Technology, 1: 381 - 384 (1994); Enderlin e Ogrydziak, Yeast, 10: 67 - 79 (1994); Fuller et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.), 86: 1434 - 1438 (1989); Julius et ai, Cell, 37: 1075 - 1089 (1984); Julius et ai, Cell 32: 839 - 852 (1983)).

Em uma modalidade preferencial, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou ~ em um organismo proporciona naquela célula ou naquele organismo, com relação a uma célula não-transformada ou organismo com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de tocoferóis.

Em uma modalidade preferencial, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou em um organismo proporciona naquela célula ou naquele organismo, com relação a uma célula não-transformada ou organismo com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de a-tocoferóis.

Em uma modalidade preferencial, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou em um organismo proporciona naquela célula ou naquele organismo, com relação a uma célula não-transformada ou organismo com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de γ-tocoferóis.

Em outra modalidade, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou em um organismo proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de ácido homogentísico.

Em outra modalidade, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou em um organismo proporciona naquela planta, com relação a uma planta não-transformada com um antecedente genético semelhante, um nível aumentado de ácido fitilpirofosfato. (e) Anticorpos Um aspecto da invenção diz respeito a anticorpos, moléculas de ligação de antígenos de cadeia única, ou outas proteínas que ligam especificamente a uma ou mais das proteínas ou moléculas de peptídeo da invenção e seus homólodos, fusões, ou fragmentos. Em uma modalidade particularmente preferencial, o anticorpo especificamente liga-se a uma proteína tendo a sequência de aminoácidos determinada na SEQ ID N-: 2. Tais anticorpos podem ser usados para detectar quantitativamente ou qualitativa- mente a proteína ou moléculas de peptídeo da invenção. Conforme usado neste relatório, diz-se que um anticorpo ou peptídeo "liga-se especificamen-te" a uma proteína ou molécula peptídica da invenção se tal ligação não for inibida competitivamente pela presença de moléculas não relacionadas.

Moléculas de ácidos nucléicos que codificam toda ou parte da proteína da invenção podem ser expressas, através de meios recombinan-tes, para produzirem proteína ou peptídeos que podem ser usados por sua vez para obter anticorpos que são capazes de ligar a proteína ou peptídeo expressos. Tais anticorpos podem ser usados em imunoensaios para aquela proteína. Tais moléculas codificando proteína, ou seus fragmentos, podem ser uma molécula "de fusão" (Isto é, uma parte de uma molécula de ácido nucléico maior) tal que, na expressão, seja produzida uma proteína de fusão. É entendido que quaisquer das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser expressas, através de meios recombinantes, para produzirem proteínas ou peptídeos codificados por estas moléculas de ácido nucléico.

Os anticorpos que ligam especificamente proteínas e fragmentos protéicos da invenção podem ser policlonais ou monocionais e podem compreender imunoglobulinas intactas, ou porções de ligação de antígeno de fragmentos de imunoglobulinas (tais como (F(ab‘), F(ab')2), ou imunoglobulinas de cadeia única produzíveis, por exemplo, através de meios recombinantes. É entendido que os profissionais estão familiarizados com os materiais de recursos de rotina os quais descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, a manipulação, e o isolamentos de anticorpos (ver, por exemplo, Harlow e Lane, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)).

Conforme descrito abaixo, tais moléculas de anticorpos ou seus fragmentos podem ser usados para fins diagnósticos. Onde os anticorpos são pretendidos para fins diagnósticos, pode ser desejável derivar os mesmos, por exemplo com um grupamento ligante (tal como biotina) ou um grupamento de marcador detectável (tal como um grupamento fluorescente, um radioisótopo, ou uma enzima). A capacidade para produzir anticorpos que ligam a proteína ou as moléculas de peptídeo da invenção permite a identificação de compostos miméticos derivados daquelas moléculas. Estes compostos miméticos podem conter um fragmento da proteína ou peptídeo ou simplesmente uma região estruturalmente semelhante e não obstante apresenta uma capacidade de ligar especificamente a anticorpos orientados contra aquele composto. Aplicações Típicas Moléculas de ácido nucléico e fragmentos das mesmas da invenção podem ser empregadas para obter outras moléculas de ácido nucléico da mesma espécie (moléculas de ácido nucléico de milho podem ser utilizadas para obter outras moléculas de ácido nucléico de milho). Tais moléculas de ácido nucléico incluem as moléculas de ácido nucléico que codificam a seqüência codificante completa de uma proteína e promotores e sequências de flanqueamento de tais moléculas. Além disso, as moléculas de ácido nucléico referidas incluem moléculas de ácido nucléico que codificam outras isozimas ou membros da família genética. Tais moléculas podem ser prontamente obtidas usando as moléculas de ácido nucléico descritas acima ou fragmentos das mesmas para triar bibliotecas genômicas ou de DNAc. Os métodos para formar tais bibliotecas são de conhecimento geral na técnica.

As moléculas de ácido nucléico e fragmentos das mesmas da invenção também podem ser empregados para obter homólogos de ácido nucléico. Tais homólogos incluem as moléculas de ácido nucléico de outras plantas ou outros organismos (por exemplo, alfalfa, Arabidopsis, cevada, Brassica, brócolis, repolho, canola, cítricos, algodão, alho, aveia, colza de semente oleaginosa, cebola, Brassica campestris, Brassica napus, linho, uma planta ornamental, ervilha, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilhas, uva, banana, chá, ervas de turfa, girassol, palma oleaginosa, milho, soja, Phaseolus, etc.) inclusive as moléculas de ácido nucléico que codificam, no todo ou em parte, homólogos protéicos de outras espécies de plantas ou outros organismos e sequências de elementos genéticos, tais como elementos promotores e reguladores transcripcionais. Plantas particularmente preferenciais são selecionadas en- tre o grupo consistindo em canona, milho, Brassica campestris, Brassica na-pus, soja, um gênero de ervas da família da mostarda, mostarda, mamona, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão, palma oleaginosa, linho e girassol. Tais moléculas podem ser prontamente obtidas usando as moléculas de ácido nucléico descritas acima ou fragmentos das mesmas para triar bibliotecas genômicas ou de DNAc obtidas de tais espécies vegetais. Métodos para formar tais bibliotecas são de conhecimento geral na técnica. Tais moléculas homólogas podem diferir em suas seqüências de nu-cleotídeos daquelas encontradas na SEQ ID Νδ: 1 ou complementos da mesma porque não é necessária complementaridade completa para hibridi-zação estável. As moléculas de ácido nucléico da invenção portanto também incluem moléculas que, embora capazes de hibridizar especificamente com as moléculas de ácido nucléico, podem carecer de "completa complementaridade." Pode ser usado qualquer um de uma variedade de métodos para obter uma ou mais das moléculas de ácido nucléico descritas acima {Zame-chik et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 83: 4143 - 4146 (1986); Goodchild et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 5507 - 5511 (1988); Wickstrom et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 1028 - 1032 (1988); Holt et aí., Molec. Cell. Biol. 8: 963 - 973 (1988); Gerwirtz et ai, Science 242: 1303 - 1306 (1988); Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 86: 3379 - 3383 (1989); Becker et al., EMBO J. 8: 3685 - 3691 (1989)). Podem ser empregados sin-tetizadores automáticos de ácido nucléico para este fim. Ao invés de tal síntese, as moléculas de ácido nucléico descritas podem ser usadas para definir um par de iniciadores que podem ser usados com a reação de cadeia polimerase (Mullis et al., Coid Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 -273 (1986); Erlich et al., Patente Européia N9 50.424; Patente Européia NQ 84.796; Patente Européia N9 258.017; Patente Européia Ns 237.362; Mullis, Patente Européia N9 201.184; Mullis et al., Patente dos Estados Unidos N9 4.683.202; Erlich, Patente dos Estados Unidos N9 4.582.788; e Saiki et al., Patente dos Estados Unidos N9 4.683.194) para amplificar e obter qualquer molécula de ácido nucléico ou fragmento desejados.

Seqüências promotoras e outros elementos genéticos, incluindo mas sem limitação a, seqüências flanqueadoras reguladoras transcripcio-nais, associadas com uma ou mais das seqüências de ácidos nucléicos descritas também podem ser obtidas usando as seqüências de ácidos nucléicos descritas proporcionadas neste relatório. Em uma modalidade, tais seqüências são obtidas incubando moléculas de ácido nucléico da presente invenção com membros de bibliotecas genômicas e recuperando clones que hi-bridizam a tais moléculas de ácido nucléico das mesmas. Em uma segunda modalidade, métodos de "chromosome walking," ou PCR inversa podem ser usados para obter tais seqüências (Frohman et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 8998 - 9002 (1988); Ohara et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 86: 5673 - 5677 (1989); Pang et aí., Biotechniques 22: 1046 - 1048 (1977); Huang et ai, Methods Mol. Biol. 69: 89 - 96 (1997); Huang et ai., Method Mol. Biol. 67: 287 - 294 (1997); Benkef et a!., Genet. Anal. 13: 123 - 127 (1996); Hartl et ai, Methods Mol. Biol. 58: 293 - 301 (1996)). O termo "chromosome walking" significa um processo para prolongar um mapa genético por meio de etapas de hibridização sucessivas.

As moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas para isolar promotores de perfis de expressão reforçados por células, de células específicas, reforçados por tecidos, de tecidos específicos, regulados de modo relativo ao desenvolvimento, ou regulados ambientalmente. O isolamento e a análise funcional das seqüências promotoras de flanqueamento 5' destes genes de bibliotecas genômicas, por exemplo, usando métodos de triagem genômica e técnicas de PCR, resultariam no isolamento de elementos úteis promotores e reguladores transcripcionais. Estes métodos são de conhecimento daqueles versados na técnica e foram descritos (Ver, por exemplo, Birren et ai, Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Promotores obtidos utilizando as moléculas de ácido nucléico da invenção também podem ser modificados para afetar suas características de controle. Exemplos de tais modificações incluiriam, porém sem limitação, seqüências reforçadoras. Tais elementos genéticos podem ser usados para reforçar a expressão ge- nética de características novas e existentes para melhorar a safra.

Outra subsérie das moléculas de ácido nucléico da invenção inclui moléculas de ácido nucléico que são marcadores. Os marcadores podem ser usados em uma série de modos convencionais no campo da genética molecular. Tais marcadores incluem moléculas de ácido nucléico da SEQ ID Ne: 1, e complementos da mesma e fragmentos de cada que podem agir como marcadores e outras moléculas de ácido nucléico da presente invenção que podem agir como marcadores.

Marcadores genéticos da invenção incluem marcadores "dominantes" ou "co-dominantes". "Marcadores co-dominantes" descrevem a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diplóide) em um locus. "Marcadores dominantes" descrevem a presença de somente um único alelo por locus. A presença do fenótipo marcador dominante (por exemplo, uma banda de DNA) é uma indicação de que um alelo está ou na condição ho-mozigótica ou heterozigótica. A ausência do fenótipo marcador dominante (por exemplo, ausência de uma banda de DNA) é simplesmente evidência de que "algum outro" alelo indefinido está presente. No caso de populações onde os indivíduos são predominantemente homozigotos e os loci são predominantemente dimórficos, marcadores dominantes e co-dominantes podem ser igualmente úteis. À medida que as populações se tornam mais he-terozigóticas e multialélicas, os marcadores co-dominantes freqüentemente se tornam mais informativos do genótipo do que os marcadores dominantes. Moléculas marcadoras podem ser, por exemplo, capazes de detectar poli-morfismos tais como polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs).

Os genomas de animais e plantas naturalment sofrem mutação espontânea no curso de sua evolução contínua (Gusella, Ann. Rev. Bio-chem. 55: 831 - 854 (1986)). Um "polimorfismo" é uma variação ou diferença na seqüência do gene ou suas regiões flanqueadoras que surgem em alguns dos mesmbros de uma espécie. A seqüência variante e a seqüência "original" coexistem na população da espécie. Em alguns casos, tal coexistência é em equilíbrio estável ou quase-estável.

Diz-se portanto que um polimorfismo é "alélico," pelo fato de que, devido à existência do polimorfismo, alguns membros de uma população podem ter a sequência original (isto é, o "alelo" original) ao passo que outros membros podem ter a seqüência variante (isto é, o "alelo" variante). No caso mais simples, somente pode existir uma seqüência variante e portanto se diz que o polimorfismo é dialélico. Em outros casos, a população da espécie pode conter múltiplos alelos e o polimorfismo é denominado trialéli-co, etc. Um único gene pode ter polimorfismos múltiplos diferentes não relacionados. Por exemplo, pode ter um polimorfismo dialélico em um sftio e um polimorfismo multialélico em outro sítio. A variação que define o polimorfismo pode variar a partir de uma variação de único nucleotídeo até a inserção ou eliminação de regiões prolongadas dentro de um gene. Em alguns casos, as variações das seqüên-cias de DNA são em regiões do genoma que se caracterizam por repetições em série curtas (STRs) que incluem motivos repetidos de nucleotídeos em séries de di- ou trinucleotídeos. Polimorfismos caracterizados por tais repetições tandem são referidos como polimorfismos de "repetição tandem de número variável" ("VNTR"). VNTRs têm sido usados em análise de identidade (Weber, Patente dos Estados Unidos 5.075.217; Armour et ai, FEBS Lett. 307: 113- 115 (1992); Jones et ai, Eur. J. Haematoi 39: 144- 147 (1987); Horn et ai, Pedido de Patente PCT Ns WO 91/14003; Jeffeys, Pedido de Patente Européia N9 370.719; Jeffreys, Patente dos Estados Unidos N9 5.175.082; Jeffreys et al., Amer. J. Hum. Genet. 39: 11 -24 (1986); Jeffreys et ai, Nature 316: 76 - 79 (1985); Gray et ai, Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243: 241 - 253 (1991); Moore et ai, Genomics 10: 654 - 660 (1991); Jeffreys et ai, Anim. Genet. 18: 1 - 15 (1987); Hillel et ai, Anim. Genet. 20: 145 - 155 (1989); Hillel et ai, Genet. 124: 783 - 789 (1990)). A detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácido nucléico. Tais métodos especificamente aumentam a concentração de polinucleotí-deos que se estendem sobre o sítio polimórfico, ou incluem este sítio e as seqüências localizadas ou distais ou proximais a este. Tais moléculas amplificadas podem ser prontamente detectadas por eletroforese por gel ou ou- tros meios.

Em uma modalidade alternativa, tais polimorfismos podem ser detectados através do uso de uma molécula de ácido nucléico marcador que esteja ligada fisicamente a tal polimorfismo ou tais polimorfismos. Para este fim, podem ser empregadas moléculas de ácido nucléico marcador compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo localizado dentro de 1 mb do(s) polimorfismo(s) e mais preferencialmente dentro de 100 kb do(s) polimorfismo(s) e ainda mais preferencialmente dentro de 10 kb do(s) polimorfismo(s). A identificação de um polimorfismo pode ser determinada em uma variedade de modos. Correlacionando a presença ou a ausência do polimorfismo em uma planta com a presença ou a ausência de um fenótipo, é possível prever o fenótipo daquela planta. Se um polimorfismo cria ou destrói um sítio de divagem de endonuclease de restrição, ou se ele resulta na perda no na inserção de DNA (por exemplo, um polimorfismo VNTR), alterará o tamanho ou o perfil dos fragmentos de DNA que são gerados por digestão com aquela endonuclease de restrição. Do mesmo modo, organismos que possuam uma seqüência variante podem ser diferenciados daqueles que têm a seqüência original por meio de análise de fragmento de restrição. Polimorfismos que podem ser identificados deste modo são denominados "polimorfismos de extensão de fragmento de restrição" ("RFLPs") (Glassberg, Pedido de Patente do Reino Unido N- 2135774; Skolnick et al., Cytogen. Cell Genet. 32: 58 - 67 (1982); Botstein et al., Ann. J. Hum. Genet. 32: 314 - 331 (1980); Fischer et ai, (Pedido PCT N9 WO 90/13668; Uhlen, Pedido PCT N9 WO 90/11369).

Os polimorfismos também podem ser identificados por meio da análise do Polimorfismo de Conformação de Filamento Único (SSCP) (Elles, Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press (1996); Orita et al., Genomics 5: 874 - 879 (1989)). Foi descrita uma série de protocolos para SSCP incluindo, sem limitação, Lee et al., Anal. Biochem. 205: 289 - 293 (1992); Suzuki et al·, Anal· Biochem. 192:82 -84 (1991); Lo et al., Nucleic Acids Research 20: 1005 - 1009 (1992); Sarkar et ai, Genomics 13: 441 - 443 (1992). É entendido que uma ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser utilizados como marcadores ou sondas para detectar polimorfismos por meio de análise de SSCP.

Também podem ser encontrados polimorfismos usando uma técnica de impressão digital de DNA denominada polimorfismo de extensão de fragmento amplificado (AFLP), a qual se baseia na amplificação por PCR seletivo de fragmentos de restrição de uma digestão total de DNA genômico para recortar aquele DNA (Vos et ai, Nucleic Acids Res. 23: 4407 - 4414 (1995)). Este método possibilita a co-amplificação específica de números elevados de fragmentos de restrição, os quais podem ser visualizados por PCR sem conhecimento da seqüência de ácidos nucléicos. É entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser utilizados como um marcador ou um sonda para detectar polimorfismos por meio de análise de AFLP ou para impressão digital de RNA.

Também podem ser encontrados polimorfismos usando DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD) (Williams et ai, Nuci Acids Res. 18: 6531 - 6535 (1990)) e sequências polimórficas amplificadas cliváveis (CAPS) (Lyamichev et ai, Science 260: 778 - 783 (1993)). É entendido que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser utilizadas como marcadores ou sondas para detectar polimorfismos por meio de análise de RAPD ou de CAPS.

Polimorfismos de Único Nucleotídeo (SNPs) geralmente ocorrem em uma maior freqüéncia do que outros marcadores polimórficos e são espaçados com uma maior uniformidade através de um genoma do que outras formas relatadas de polimorfismo. A maior frequência e uniformidade de SNPs significa que há maior probabilidade de que um tal polimorfismo será encontrado próximo ou em um locus genético de interesse do que seria o caso para outros polimorfismos. SNPs estão localizados em regiões codifi-cantes de proteína e regiões não codificantes de um genoma. Alguns destes SNPs podem resultar em expressão de proteína defeituosa ou variante (por exemplo, como um resultado de mutações ou junção defeituosa). A análise (genotipagem) de SNPs caracterizados pode requerer somente um teste mais/menos ao invés de uma medição de extensão, permitindo automação mais fácil. SNPs podem ser characterizados usando qualquer um de uma variedade de métodos. Tais métodos incluem o seqüenciamento direto ou indireto do sítio, o uso de enzimas de restrição (Botstein et ai, Am. J. Hum. Genet. 32: 314 - 331 (1980); Konieczny e Ausubel, Plant J. 4: 403 - 410 (1993)), ensaios enzimáticos e de incompatibilidade química (Myers et a/., Nature 313: 495 - 498 (1985)), PCR alelo-específica (Newton et aí., Nucl. Acids Res. 17: 2503 - 2516 (1989); Wu et aí., Proc. Natf. Acad. Sei. EUA 86: 2757 - 2760 (1989)), reação de cadeia ligase (Barany, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88; 189 - 193 (1991)), análise de polimorfismo de conformação de filamento único (Labrune et ai., Am. J. Hum. Genet. 48: 1115 - 1120 (1991)), extensão de iniciador de base única (Kuppuswamy et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88: 1143 - 1147 (1991), Goelet US 6.004.744; Godet 5.888.819), ensaios de ligação de oligonucleotídeos à base de ELISA de fase sólida (Nikiforov et ai, Nucl. Acids Res. 22: 4167 - 4175 (1994), impressão digital dideóxi (Sarkar et ai, Genomics 13: 441 - 443 (1992)), ensaios de extinção por fluorescência de oligonucleotídeos (Livak et ai, PCR Methods Appl. 4: 357 - 362 (1995a)), ensaio TaqMan® de hibridização alelo-específica de 5'-nuclease (Livak et ai, Nature Genet. 9: 341 - 342 (1995)), ensaio de incorporação de corante-terminador orientado por template (TDI) (Chen e Kwok, Nucl. Acids Res. 25: 347 - 353 (1997)), ensaio de sinal molecular alelo-específico (Tyagi et ai, Nature Biotech. 16: 49 - 53 (1998)), ensaio PinPoint (Haff e Smirnov, Genome Res. 7: 378 - 388 (1997)), análise dCAPS (Neff et ai, Plant J. 14: 387 - 392 (1998)), piro-seqüenciamento (Ronaghi et al, Analytical Biochemistry 267: 65 - 71 (1999); Ronaghi et a! Pedido PCT NQ WO 98/13523; Nyren et a! Pedido PCT NQ WO 98/28440; www.pyrosequencing.com), espectrometria de massa, por exemplo o sistema Masscode® (Howbert et aI WO 99/05319; Howber et al WO 97/27331; www.rapigene.com; Becker et al Pedido PCT NQ WO 98/26095; Becker et al Pedido PCT NO. WO 98/12355; Becker et al Requerimento PCT NQ WO 97/33000; Monforte et al US 5.965.363), divagem invasiva de sondas de oligonucleotídeo (Lyamichev et al Nature Biotechnotogy 17: 292 - 296; www.twt.com), e séries de oligonucleotídeo de alta densidade (Hacia et al Nature Genetics 22: 164 -167; www.affymetrix.com).

Polimorfismos também podem ser detectados usando oligonu-cleotídeos alelo-específicos (ASO), os quais podem ser, por exemplo, usados em combinação com tecnologia à base de hibridização inclusive hibridi-zações Southern, Northern, e de dot blot, hibridizações de dot blot reversas e hibridizações realizadas em microsséries e tecnologia relacionada. A estringência da hibridização para detecção de polimorfismo é altamente dependente de uma variedade de fatores, inclusive a extensão do oligonucleotídeo alelo-específico, da composição da seqüência, do grau de complementaridade (isto é, presença ou ausência de incompatibilidades de bases), concentração de sais e outros fatores tais como formamida e temperatura. Estes fatores são importantes tanto durante a própria hibridização quanto durante subseqüentes lavagens. realizadas para remover polinucleotídeos alvo que não são especificamente hibridizados. Na prática, as condições da lavagem final, mais estringente são mais críticas. Além disso, a quantidade de polinucleotídeo alvo que é capaz de hibridizar ao oligonucleotídeo alelo-específico também é governada por fatores semelhantes como a concentração tanto do ASO quanto do polinucleotídeo alvo, a presença e a concentração de fatores que agem para "obstruir" moléculas de água de modo a concentrar de modo eficaz os reagentes (por exemplo, PEG, dextrano, sulfato de dextrano, etc.) quer os ácidos nucléicos estejam imobilizados ou em solução, e a duração das etapas de hibridização e lavagem.

Hibridizações são preferencialmente realizadas abaixo da temperatura de fusão (Tm) do ASO. Quanto mais próximas forem a etapa de hibridização e/ou lavagem para a Tm, maior a estringência. Tm para um oligonucleotídeo pode ser aproximada, por exemplo, de acordo com a seguinte fórmula: T = 81,5 + 16,6 x (log10[Na+]) + 0,41 x (%G + C) - 675/n; onde [Na+] é a concentração de sal molar de Na+ ou qualquer outro cátion adequado e n = número de bases no oligonucleotídeo. Outras fórmulas para aproximar Tm estão disponíveis e são conhecidas daqueles versados. A estringência é preferencial mente ajustada de modo a permitir que um dado ASO hibridize diferencialmente a um polinucleotídeo alvo do alelo correto e um polinucleotídeo alvo do alelo incorreto. Preferencialmente, haverá no mínimo um diferencial de duas vezes entre o sinal produzido pelo ASO hibridizando a um polinucleotídeo alvo do alelo correto e o nível do sinal produzido pelo ASO por hibridização cruzada com um polinucleotídeo alvo do alelo incorreto (por exemplo, um ASO específico para um alelo mutante por hibridização cruzada com um alelo selvagem). Em modalidades mais preferenciais da presente invenção, há no mínimo um sinal diferencial de cinco vezes. Em modalidades altamente preferenciais da presente invenção, há no mínimo uma ordem de magnitude de sinal diferencial entre o ASO hibridizado a um polinucleotídeo alvo do alelo correto e o nível do sinal produzido pelo ASO por hibridização cruzada com um polinucleotídeo alvo do alelo incorreto.

Apesar de alguns métodos para detectar polimorfismos serem descritos neste relatório, outras metodologias de detecção podem ser utilizadas. Por exemplo, metodologias adicionais são conhecidas e estabelecidas, em Birren et al·, Genome Anafysis, 4: 135 - 186, A Laboratory Manual. Mapping Genomes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har-bor, NY (1999); Maliga et ai, Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1995); Paterson, Biotechnology Intelligence Unit: Genome Mapping in Plants, R.G. Landes Co., Georgetown, TX, and Academic Press, San Die-go, CA (1996); The Maize Handbook, Freeling and Walbot, eds., Springer-Verlag, New York, NY (1994); Methods in Molecular Medicine: Molecular Di-agnosis of Genetic Diseases, Elles, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1996); Clark, ed., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, ed., Sprin-ger-Verlag, Berlin, Alemanha (1997).

As exigêncisa para seleção assistida por marcador em um pro-gram de reprodução vegetal são: (1) o(s) marcador(es) deve(m) co-segregar ou estar intimamente ligado(s) com a característica desejada; (2) deve estar disponível um meio eficaz de triar grandes populações para o marcador(s) molecular; e (3) a técnica de triagem deve ter alta reprodutibilidade entre os laboratórios e preferencial mente deve ser econômica de usar e amigável para o usuário. A ligação genética de moléculas marcadoras pode ser estabelecida por um modelo de mapeamento genético tal como, sem limitação, o modelo de marcador flanqueante relatado por Lander e Botstein, Genetics 121: 185 - 199 (1989) e o mapeamento de intervalo, com base em métodos de probabilidade máxima descritos por Lander e Botstein, Genetics 121: 185 - 199 (1989) e implementados no pacote do software MAPMAKER/QTL (Lincoln e Lander, Mapping Genes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990). Software adicional inclui Qgene, Versão 2.23 (1996), Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY). A aplicação do software Qgene é uma abordagem particularmente preferencial.

Uma estimativa da probabilidade máxima (MLE) para a presença de um marcador é calculada, junto com um MLE presumindo nenhum efeito Qtl, para evitar falsos positivos. Um log10 de uma proporção da diferença (LOD) é então calculado como: LOD = logio (MLE para a presença de uma Qtl/mle dada sem Qtl ligado). O registro LOD indica essencial mente quanto mais provavelmente os dados teriam surgido, presumindo a presença de um Qtl ao invés de sua ausência. O valor de limite LOD para evitar um falso positivo com uma dada confiança, digamos 95 %, depende do número de marcadores e da extensão do genoma. Gráficos indicando limites LOD são determinados em Lander e Botstein, Genetics 121: 185 - 199 (1989) e descritos adicioal-mente por Arús e Moreno-Gonzalez, Plant Breeding, Hayward et ai., (eds.) Chapman & Hall, Londres, pp. 314 - 331 (1993).

Em uma modalidade preferencial da presente invenção o marcador de ácido nucléico apresenta um score LOD de mais de 2,0, mais preferencialmente mais de 2,5, ainda mais preferencialmente mais de 3,0 ou 4,0 com a característica ou fenótipo de interesse. Em uma modalidade preferencial, a característica de interesse é em níveis ou composições alterados de tocoferol.

Podem ser usados modelos adicionais. Muitas modificações e abordagens alternativas para mapeamento de intervalo foram relatadas, inclusive o uso de métodos não-paramétricos (Kruglyak e Lander, Genetics 139: 1421 - 1428 (1995)). Métodos ou modelos de regressão múltipla também podem ser usados nos quais a característica é retrocedida sobre um grande número de marcadores (Jansen, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen e Jansen (eds.), Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Países Baixos, pp. 116 - 124 (1994); Weber e Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlin, 16 (1994)). Procedimentos combinando mapeamento de intervalo com análise de regressão, por meio do que o fenótipo é retrocedido sobre um único Qtl puta-tivo em um dado intervalo do marcador e ao mesmo tempo sobre uma série de marcadores que servem como 'cofatores', foram relatados por Jansen e Stam, Genetics 136: 1447 - 1455 (1994), e Zeng, Genetics 136: 1457 - 1468 (1994). De modo geral, o uso de cofatores reduz a tendência e erro da amostragem das posições Qtl estimadas (Utz e Melchinger, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen e Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Países Baixos, pp.195 - 204 (1994)), deste modo aumentando a precisão e a eficácia do mapeamento Qtl (Zeng, Genetics 136: 1457 - 1468 (1994). Estes modelos podem ser estendidos para experimentos multiambiente para analisar interações genótipo-ambiente (Jansen etal., Theo. Appl. Genet. 91: 33 - 37 (1995)). É entendido que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas como marcadores moleculares. Além disso é entendido que uma ou mais das moléculas protéicas da invenção podem ser usadas como marcadores moleculares.

Em uma modalidade preferencial, o polimorfismo está presente e é triado em um mapeamento da população, por exemplo uma coleção de plantas capazes de serem usadas com marcadores tais como marcadores polimórficos para mapear a posição genética das características. A escolha de um mapeamento da população adequado frequentemente depende do tipo de sistemas de marcadores empregados (Tanksley et aí., J.P. Gustafson and R. Appels (eds.). Plenum Press, New York, pp. 157 - 173 (1988)). Deve-se considerar a origem das plantas-mães (adaptadas vs. exóticas) usadas no mapeamento da população. Os índices de recombinação e pareamento de cromossomo podem ser gravemente alterados (suprimidos) em cruzamentos amplos (adaptados x exóticos) e geralmente produzem distâncias de ligação muito reduzidas. Cruzamentos amplos geralmente proporcionarão segregamento de populações com um número relativamente grande de po-limorfismos quando comparados com progênie em um cruzamento limitado (adaptados x adaptados).

Uma população F2 é a primeira geração de auto-inseminação (autopolinização) depois da semente híbrida ser produzida. Geralmente uma única planta Fi é auto-inseminada para gerar uma população segregante para todos os genes no padrão Mendeliano (1 : 2 : 1). É obtida máxima informação genética a de uma população F2 classificada completamente usando um sistema de marcadores co-dominantes (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen e Co., (1938)). No caso de marcadores dominantes, testes da progênie (por exemplo, F3, BCF2) são necessários para identificar os heterozigotos de modo a classificar a população. No entanto, este procedimento é muitas vezes proibitivo devido ao custo e ao tempo envolvido na experimentação da progênie. A experimentação da progênie de indivíduos F2 é freqüentemente usada na construção de mapas onde os fe-nótipos não refletem o genótipo de modo consistente (por exemplo resistência a doenças) ou onde a expressão característica é controlada por um Qtl. Dados de segregação de populações de teste da progênie (por exemplo, F3 ou BCF2) podem ser usados na construção de mapas. Pode ser então aplicada seleção assistida por marcadores para cruzar progênie com base em associações de mapas marcador-característica (F2, F3), onde grupamentos de ligação não foram completamente dissociados por eventos de recombinação (isto é, desequilíbrio máximo).

Linhagens procriadas por endogamia recombinantes (RIL) (linhagens geneticamente relacionadas; geralmente > F5, desenvolvidas a partir de auto-inseminação contínua de linhagens F2 para homozigosidade) podem ser usadas como populações de mapeamento. Informação obtida de marcadores dominantes pode ser maximizada usando RILs porque todos os loci são homozigóticos ou quase. Sob condições de forte ligação (isto é, cerca de < 10 % de recombinação), marcadores dominantes e co-dominantes avaliados em populações RIL proporcionam mais informação por indivíduo do que qualquer tipo de marcador em populações de cruzamento reverso (Reiter. Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 89: 1477 -1481 (1992)). No entanto, à medida que a distância entre os marcadores se torna maior (isto é, os loci se tornam mais independentes), a informação em populações RIL diminui dramaticamente quando comparada com marcadores co-dominantes.

Populações de cruzamento reverso (por exemplo, geradas de um cruzamento entre uma variedade bem sucedida (planta-mãe recorrente) e outra variedade (planta-mãe doadora) portando uma característica não presente no anterior) podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. Pode ser feita uma série de cruzamentos reversos para a planta-mãe recorrente para recuperar a maior parte de suas características desejáveis. Portanto, uma população é criada consistindo em indivíduos quase semelhantes à planta-mãe recorrente mas cada indivíduo carrega quantidades variáveis ou um mosaico de regiões genômicas da planta-mãe doadora. Populações de cruzamento reverso podem ser úteis para mapear marcadores dominantes se todos os loci na planta-mãe recorrente forem homozigóticos e a planta-mãe doadora e a planta-mãe recorrente tiverem alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 89: 1477 -1481 (1992)). Informação obtida de populações de cruzamento reverso usando ou marcadores co-dominantes ou dominantes é menor do que a obtida de populações F2 porque é amostrado por planta um gameta recom-binante, ao invés de dois. No entanto, populações de cruzamento reverso são mais informativas (em baixa saturação de marcador) quando comparadas com RILs à medida que a distância entre loci ligados aumenta em po- pulações RIL (isto é, cerca de 15 % de recombinação). O aumento da re-combinação pode ser benéfico para resolução de ligações firmes, mas pode ser indesejável na construção de mapas com baixa saturação de marcador.

Linhagens quase-isogênicas (NIL) (criadas por muitos cruzamentos reversos para produzir uma coleção de indivíduos que é quase idêntica na composição genética exceto pela característica ou região genômica sob interrogação) podem ser usadas como populações de mapeamento. Em mapeamento com NILs, espera-se que somente uma porção dos loci poli-mórficos mapeie para uma região selecionada.

Análise de segregante em série (BSA) é um método desenvolvido para a rápida identificação de ligação entre marcadores e características de interesse (Michelmore et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 9828 - 9832 (1991)). Em BSA, duas amostras de séries de DNA são extraídas de uma população segregante originada de um único cruzamento. Estas séries contêm indivíduos que são idênticos para uma característica particular (resistentes ou suscetíveis a doença particular) ou região genômica mas arbitrários em regiões não ligadas (isto é, heterozigóticas). Regiões não ligadas à região alvo não diferirão entre as amostras em série de muitos indivíduos em BSA.

Em um aspecto da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção são usadas para determinar o nível (isto é, a concentração de mRNA em uma amostra, etc.) em uma planta (preferencialmente canola, milho, Brassica campestrís, Brassica na-pus, soja, um gênero de ervas da família da mostarda, mostarda, mamona, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão, palma oleaginosa, linho ou girassol) ou padrão (isto é, a cinética de expressão, índice de decomposição, perfil de estabilidade, etc.) da expressão de uma proteína codificada em parte ou no todo por uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção (coletivamente, a "Resposta de Expressão" de uma célula ou tecido).

Conforme usado neste relatório, diz-se que a Resposta de Expressão manifestada por uma célula ou um tecido está "alterada" caso seja diferente da Resposta de Expressão de células ou tecidos de plantas que não apresentem o fenótipo. Para determinar se uma Resposta de Expressão está alterada, a Resposta de Expressão manifestada pela célula ou pelo tecido da planta que apresenta o fenótipo é comparada com a de uma amostra de célula ou tecido semelhante de uma planta que não apresenta o fenótipo. Conforme será reconhecido, não é necessário determinar novamente a Resposta de Expressão da amostra de célula ou tecido de plantas que não apresentem o fenótipo a cada vez que seja feita tal comparação; ao invés, a Resposta de Expressão de uma planta em particular pode ser comparada com valores obtidos previamente de plantas normais. Conforme usado neste relatório, o fenótipo do organismo é qualquer um de uma ou mais características de um organismo (por exemplo, resistência a doença, tolerância a pestes, tolerância ambiental tal como tolerância a estresse abiótico, esterilidade masculina, melhora da qualidade, produção, etc.). Uma alteração no genótipo ou no fenótipo pode ser transitória ou permanente. Além disso, conforme usado neste relatório, uma amostra de tecido é qualquer amostra que compreende mais de uma célula. Em um aspecto preferencial, uma amostra de tecido compreende células que partilham uma característica em comum (por exemplo, derivadas de raiz, semente, flor, folha, caule, pólen, etc.).

Em um aspecto da presente invenção, uma avaliação pode ser conduzida para determinar se uma molécula de mRNA em particular está presente. Uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção são utilizadas para detectar a presença ou a quantidade da espécie de mRNA. Tais moléculas são então incubadas com extratos de células ou de tecido de uma planta sob condições suficientes para permitir hibridização do ácido nucléico. A detecção de moléculas híbridas sonda-mRNA de filamento duplo é indicativa da presença do mRNA; a quantidade de tal híbrido formado é proporcional à quantidade de mRNA. Portanto, tais sondas podem ser usadas para determinar o nível e a extensão da produção de mRNA nas células ou tecidos de uma planta. Tal hibridização de ácido nucléico pode ser conduzida sob condições quantitativas (deste modo proporcionando um va- lor numérico da quantidade do mRNA presente). Aiternativamente, o teste -pode ser conduzido como um teste qualitativo que indica ou que o mRNA está presente, ou que seu nível excede um valor pré-definido, estabelecido pelo usuário.

Pode ser usada uma série de métodos para comparar a resposta de expressão entre duas ou mais amostras de células ou tecidos. Estes métodos incluem testes de hibridização, tais como hibridização Northern, testes de proteção de RNAse, e hibridização in situ. Alternativamente, os métodos incluem testes do tipo PCR. Em um método preferencial, a resposta de expressão é comparada hibridizando ácidos nucléicos de duas ou mais amostras para uma série de ácidos nucléicos. A série contém uma pluralidade de sequências suspeitas conhecidas ou suspeitas de estarem presentes nas células ou no tecido das amostras.

Uma vantagem da hibridização in situ versus técnicas mais convencionais para a detecção de ácidos nucléicos é que esta permite a um investigador determinar a população espacial precisa (Angerer et ai, Dev. Biol. 101: 477 - 484 (1984); Angerer et ai., Dev. Biof. 112: 157 - 166 (1985); Dixon et ai, EMBO J. 10: 1317 - 1324 (1991)). Pode ser usada hibridização in situ para medir o nível em estado estacionário do acúmulo de RNA (Har-din et ai., J. Mol. Biol. 202: 417 - 431 (1989)). Uma série de protocolos foram planejados para hibridização in situ, cada um com condições de preparação de tecido, de hibridização, e de lavagem (Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 242 - 250 (1987); Cox e Goldberg, In: Piant Molecular Biology: A Practical Approach, Shaw (ed.), pp. 1 - 35, IRL Press, Oxford (1988); Raikhel et ai, In situ RNA hybridization in plant tissues, In: Plant Molecular Biology Manual, vol. B9: 1 - 32, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Bélgica (1989)). A hibridização in situ também possibilita a localização de proteínas dentro de um tecido ou uma célula (Wilkinson, In Situ Hybridization, Oxford University Press, Oxford (1992); Langdale, In Situ Hybridization In: The Maize Handbook, Freeling e Walbot (eds.), pp. 165 - 179, Springer-Verlag, New York (1994)). É entendido que uma ou mais das moléculas da invenção, preferencialmente uma ou mais das moléculas de ácido nucléico ou fragmentos da mesma da invenção, ou um ou mais dos anticorpos da invenção, podem ser utilizados para detectar o nível ou o padrão de uma proteína ou mRNA da mesma por meio de hibridização in situ. A hibridização in situ fluorescente possibilita a localização de uma seqüência de DNA particular ao longo de um cromossomo, o que é útil, entre outras aplicações, para mapeamento genético, para seguir cromossomos em linhagens híbridas, ou para detectar cromossomos com transloca-ções, transverções ou eliminações. A hibridização in situ foi usada para identificar cromossomos em várias espécies de plantas (Griffor et a!., Plant Mol. Biol. 17: 101 - 109 (1991); Gustafson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 87: 1899 - 1902 (1990); Mukai e Gill, Genome 34: 448 - 452 (1991); Schwarzacher e Heslop-Harrison, Genome 34: 317 - 323 (1991); Wang et al., Jpn. J. Genet. 66: 313 -316 (1991); Parra e Windle, Nature Genetics 5: 17 - 21 (1993)). É entendido que as moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas como sondas ou marcadores para localizar seqüências ao longo de um cromossomo.

Outro método para localizar a expressão de uma molécula é impressão tecidual. Impressão tecidual proporciona um modo para triar, ao mesmo tempo e na mesma membrana, muitas seções de tecido de diferentes plantas ou em estágios de desenvolvimento diferentes (Yomo e Taylor, Planta 112: 35-43 (1973); Harris e Chrispeels, Plant Physiol. 56: 292 - 299 (1975); Cassab e Varner, J. Cell. Biol. 105: 2581 - 2588 (1987); Spruce et al., Phytochemistry 26: 2901 - 2903 (1987); Barres et al., Neuron 5: 527 - 544 (1990); Reid e Pont-Lezica, Tissue Printing: Tools for the Study of Anatomy, Histochemistry and Gene Expression, Academic Press, New York, New York (1992); Reid et al., Plant Physiol. 93: 160- 165 (1990); Ye et al., Plant J. 1: 175- 183(1991)).

Uma pessoa versada na técnica pode consultar textos de referência gerais para descrições detalhadas de técnicas conhecidas discutidas neste relatório ou técnicas equivalentes. Estes textos incluem Current Proto-cols in Molecular Biology Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, N. Y. (1989), e suplementos em setembro (1998), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, 2"d Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), Genome Analysis: A Laboratory Manual 1: Analyzing DNA, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1997); Genome Analysis: A Laboratory Manual 2: Detecting Genes, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1998); Genome Analysis: A Laboratory Manual 3: Cloning Systems, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1999); Genome Analysis: A Laboratory Manual 4: Mapping Genomes, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1999); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Springer-Verlag, Berlin, (1997), Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1995). Estes textos, logicamente, podem ser referidos também ao fazer ou usar um aspecto da invenção. É entendido que quaisquer dos agentes da invenção podem ser substancialmente purificados e/ou ser biologicamente ativos e/ou recombinantes.

Tendo agora descrito a invenção de modo geral, a mesma será mais prontamente entendida através de referência aos seguintes exemplos os quais são proporcionados a título de ilustração e não pretendem ser limi-tantes para a presente invenção a menos que especificado.

Cada periódico, patente, e outro documento ou referência citado neste relatório é incorporado a este relatório por meio de referência em sua totalidade.

Exemplo 1 Uma sequência parcial publicada de um AANT1 putativo (Saint-Guily et al., Plant Physiol. 100(2), 1069 - 1071 (1992)) é usada para pesquisar um banco de dados EST, e são identificados três clones de extensão total: LIB3176-057-P1 -K1 -B12, L1B3234-001-P1-K1-G3, e LIB3176-083-P1-K1-F2. Uma região de codificação AANT1 é amplificada por PCR usando o iniciador para diante AANT1F 5‘- GGA TCC GCG GCC GCA CCA TGG TTG ATC AAG TTC AGC A (SEQ ID N9: 3) e o iniciador reverso AANT1R 5-GAG CTC CTG CAG GAA GCT TTT AGG CAC CTC CTG ATC CGT-3' (SEQ ID N9: 4). O iniciador AANT1F contém um sítio Notl (sublinhado) a montante do códon de partida (em itálico) enquanto que o iniciador AANT1R contém um sítio Sse8387l (sublinhado) a jusante do códon de parada (em itálico). Um produto de PCR é gerado e clonado em pCR2.1, e a inserção é verificada por meio de seqüenciamento de ambos os filamentos.

Exemplo 2 O fragmento Notl/Sse8387l do exemplo 1 é inserido nos sítios Notl/Sse8387l dos cassetes de expressão napin em pCGN9979, o qual é apresentado na Figura 2, e pCGN11307, o qual é apresentado na Figura 3. pCGN9979 é designado para uso em Arabidopsis e pCGN11307 é designado para uso em Brassica. Tanto pCGN9979 quanto pCGN11307 contêm um cassete de expressão específico para sementes usando o promotor genético (napin) protéico de armazenagem de sementes de Brassica (Kridl et ai, Se-ed Sei. Res. 1: 209 - 219 (1991)). Os plasmídeos resultantes são pCGN11301 (para pCGN9979) e pMON66454 (para pCGN11207), os quais são apresentados nas Figuras 4 e 5, respectivamente.

Exemplo 3 Plantas de Arabidopsis são cultivadas para transformação com pCGN11301. Potes Kord de 11,43 cm (4,5 polegadas) são enchidos com terra Metro Mix 200. Os potes são colocados dentro de caixas verdes Kord 1040 com orifícios, as quais são colocadas dentro de caixas brancas Kord 1040 sem orifícios. As caixas são enchidas com 2,54 cm (1") de água de osmose reversa e uma cúpula para umididade é disposta sobre cada uma das caixas. Os potes são deixados para absorverem água por várias horas durante a noite até o solo estar completamente úmido. Telas de fibra-de-vidro de 20,32 (oito polegadas) são colocadas sobre o solo e firmadas e as sementes são plantadas. As caixas são colocadas dentro de uma câmara a 22°C por um fotoperíodo de 16/8 a 55 % de umidade relativa e 234 μΜοΙ/s/m2. Após germinação as cúpulas são elevadas ligeiramente e em seguida removidas depois de três dias. As plantas são aguadas pelo fundo conforme necessário com Plantex 15-15-18 a 50 PPM N. As plantas são desbastadas para 7 plantas por pote 3 semanas depois da semeadura. Os feixes primários na base da planta são podados para estimular crescimento secundário. As plantas são aguadas pelo fundo para saturar o solo antes da transformação. As plantas estão prontas para transformação quando feixes secundários estão surgindo (para transformação por infiltração a vácuo) ou quando os feixes têm 2 - 10 cm (para o método de transformação por imersão).

Para transformar as plantas que estão prontas para transformação, 6 ml de LB (75 mg/l de espectinomicina, 50 mg/l de canamicina, e 25 mg/l de cloranfenicol) é inoculado com uma única colônia de Agrobacterium contendo pCGN11301 e incubada a 200 rpm e 30°C por cerca de 24 horas.

Os 6 ml de cultura são então adicionados a 300 ml do mesmo meio dentro de um frasco Erlenmeyer de 1 litro e a cultura é incubada nas mesmas condições por cerca de 18 horas.

Os potes contendo as plantas a serem transformadas são imersos em água por cerca de 30 minutos antes da imersão. A cultura de Agrobacterium é centrifugada a 5000 x g por 12 minutos a 15°C, e o pélete é ressuspenso em 300 ml de solução a 5 % de sa-carose em água. Alíquotas de cinqüenta ml desta suspensão são colocadas dentro de 200 ml de solução a 5 % de sacarose, à qual 125 μΙ de Silwet L-77 (Lehle Seeds) foi adicionado. Esta mistura é vertida em um prato de plástico de cerca de 14 cm de diâmetro, com uma capacidade de cerca de 850 ml. A porção das plantas acima do solo é imersa na solução de Agrobacterium por 2-5 segundos, com suave agitação. O excesso da solução de Agrobacterium é absorvido com toalhas de papel. As plantas imersas são colocadas sobre suas laterais com os feixes por cima de toalhas de papel, e em seguida são colocadas dentro de uma caixa e cobertas com uma cúpula de plástico. A tampa é mantida no local por 16 a 25 horas para manter a umidade elevada.

Os potes não são aguados por cerca de 5 dias depois da imersão. Depois de 5 dias, os potes são providos com água e as plantas são cultivadas sob condições normais. A rega é interrompida quando as sementes se tornam maduras (em cerca de 4 semanas) e a semente seca é colhida. A seleção envolve regar as sementes Ti transformadas diretamente sobre o solo e em seguida vemalizando as mesmas a 4°C em 8 horas de luz, 16 horas de escuridão por 4 - 7 dias. As sementes são em seguida transferidas para 22°C em 16 horas de luz e pulverizadas com uma diluição de 1 : 200 de Finale (Basta) em 7 dias e novamente em 14 dias.

Exemplo 4 - Transformação de Canola com pMON66454.

Neste exemplo, todo o tecido é manuseado assepticamente dentro de um capuz de circulação laminar (ver Radke SE et al·, Plant Cell Reports 11: 499 - 505 (1992)).

Cepas de Agrobacteríum ABI, EHA105, e EHA101 podem ser usadas para transformação de canola. Pode ser usado o cultivar de canola Ebony.

Para o procedimento seguinte, as prateleiras do ambiente de cultura são iluminadas por duas lâmpadas fluorescentes Cool White HO, e uma lâmpada Gro-Lux HO (ou equivalente), por prateleira. A temperatura dos ambientes de cultura é de 22°C.

As sementes são esterilizadas superficialmente em um coador de chá de tela metálica, por 2 minutos em 95 % de etanol ou 70 % de iso-propanol, seguido por 30 minutos em 20 % de solução alvejante (1 % de NaOCI) com uma gota de Tween 20 por 100 ml. As sementes são em seguida enxaguadas 4 vezes com água de osmose reversa esterilizada. A semente esterilizada é laminada sobre meio 1/10X MS modificado (1/10X meio orgânico mínimo MS (Gibco 510 - 1118; sacarose final a 0,3 %), piridoxina 50 ug/l, ácido nicotínico 50 ug/l, glicina 200 ug/l, Phytagar (Gibco) 6 g/l, pH 5,8; 20 caixas por litro) a 25 sementes por caixa Magenta. A semente é mantida a 24°C por 16 horas de luz/dia e 15-35 uE/m2/seg na sombra. Pode ser usada escuridão completa durante as últimas 24 horas para aumentar a etiolação.

Placas alimentadoras de Brassica napus são preparadas 1 dia antes do corte dos explantes. 0,5 ml de uma suspensão celular de Brassica napus (10 ml) que foi subcultivada em 100 ml de meio KCMS 0/0,2/0,1 (sais de MS (Gibco 500 - 1117), KH2P04 200 mg/l, inositol 100 mg/l, tiamina-HCI 1,3 mg/l, 2,4-D 0,2 mg/l (Sigma D8407), quinetina 0,1 mg/l (Sigma K0753), sacarose a 3 %, pH 5,5; 100 ml por frasco Erlenmeyer de 500 ml), a 25°C com luz contínua a 90 rpm é espalhada sobre cada placa de meio MS 0/1/0 e as placas são empilhadas dentro de uma luva plástica vedada e incubadas a 24°C em luz contínua indireta.

Segmentos de hipocótilo (2 - 4 mm) são excisados de mudas etioladas de uma semana de idade (4 a 14 dias de idade). Os segmentos são cortados em um prato de Petri com vários ml de água para evitar desidratação. Os explantes são dispostos sobre um papel filtro (Whatman 1001-082) e deixados sobre as células alimentadoras de tabaco sobre meio de co-cultura MS 0/1/0 (sais de MS (Gibco 500 - 1117), mío-inositol 100 mg/l, tia-mina-HCI 1,3 mg/l, KH2P04 200 mg/l, 2,4-D1 mg/l, sacarose a 3 %, Phytagar 6 g/l, pH 5,8; 30 placas por litro) a 50 explantes por placa (100 x 15 mm) e as placas são empilhadas em uma luva plástica vedada e incubadas por 18-24 horas a 24°C em luz contínua indireta.

Uma única colônia de Agrobacterium contendo pMON66454 é cultivada durante a noite em 5 ml de caldo MG/L (Manitol 5 g/l, ácido L-glutâmico 1 g/l, KH2P04 250 mg/l, NaCI 100 mg/l, MgSO4.7h20 100 mg/l, biotina 1 ug/l, triptona 5 g/l, extrato de levedura 2,5 g/l, pH 7,0) dentro de um tubo de cultura grande, a 30°C, no escuro, a 200 rpm. A suspensão OD de Agrobacterium é medida a 550 nm em um espectrofotômetro. A cultura durante a noite é diluída com caldo MG/L para 0,05 OD (equivalente a cerca de 1 x 108 bacteria/ml). Os explantes pré-incubados são inoculados por 10 minutos em 1 x 108 bactérias/ml; 200 - 400 explantes por 10 ml de inóculo. Os explantes inoculados são bem-drenados, retomados para as placas alimentadoras, e co-cultivados com Agrobacterium por 2 dias. As placas são empilhadas dentro de uma luva plástica vedada e incubadas a 24°C em luz contínua indireta.

Explantes co-cultivados são transferidos para meio de indução de calo B5 0/1/0 (sais B5 (Gibco 85-5068), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, 1 mg/l de 2,4-D, sacarose a 3 %, 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de Timentin, 6 g/l de Phytagar, pH 5,8, 30 placas por litro) suplementado com 500 mg/l de carbenicilina e 50 mg/l de Timentin para inibir o Agrobacte-rium. Há cerca de 40 - 50 explantes por placa (100 x 15 mm). As placas são vedadas com Parafilm. Os explantes permanecem em B5 0/1/0 por 7 dias (para obter um total de cerca de 10 dias de exposição a 2,4-D) a 24°C em luz contínua a 85 uE/m2/s.

Os explantes são transferidos para meio de regeneração de broto B5BZ (sais B5 (Gibco 85-5068), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotíni-co, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, BAP 3 mg/l (Sigma B3408), zeatina 1 mg/l (Sigma Z0164), sacarose a 1 %, Phytagar 6 mg/l, pH 5,8; 25 placas por litro, nitrato de prata (3 mg/l) é incluído durante as primeiras duas semanas em meio B5BZ) contendo 500 mg/l de carbenicilina com 45 mg/l de glifosato. As placas (100 x 25 mm) são vedadas com Parafilm e incubadas a 24°C em luz contínua a 85 uE/m2/s. Os explantes são transferidos para meio fresco a cada segunda semana e a densidade do revestimento é reduzida para 20 - 25 explantes depois de duas semanas em B5BZ. Os brotos regeneram de calos selecionados de canami-cina 5 a 9 semanas depois do início da cultura.

Brotos verdes selecionados com glifosato são transferidos para meio de maturação de broto B5 sem hormônios (sais B5 (Gibco 85-5068) vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, sacarose a 1 %, Phytagar 6 g/l, pH 5,8; 25 placas por litro) contendo 300 mg/l de carbenicilina e 45 mg/l de glifosato. Múltiplos brotos de um único calo são mantidos juntos como um evento com 9 eventos por placa. As placas são vedadas com parafilme e os brotos permanecem no meio de maturação por 7-14 dias a 24°C por 16 horas de luz/dia a 85 uE/m2/s.

Os brotos que permanecem verdes no meio de maturação são podados para um ou dois nós e são transferidos para meio de indução de raiz B5 (sais B5 (Gibco 85-5068), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, IBA 2 mg/l, sacarose a 1 %, Phytagar 6 g/l, pH 5,8; 20 caixas por litro) contendo 45 mg/l de glifosato com 5 eventos por caixa Magenta a 24°C por 16 horas de luz/8 horas de escuridão a 85 uE/m2/s. As raízes se desenvolvem por um período de 4 - 6 semanas e os caules são cortados novamente para estimular enraizamento, conforme necessário.

Exemplo 5 Plantas de Arabidopsis resistentes a Basta representando 20 eventos de transformação independentes são cultivadas e as sementes são colhidas para produzir sementes T2. As sementes T2 são colhidas e testadas para níveis de tocoferol. A Figura 1 mostra o nível total de tocoferol das sementes (nanogramas por miligrama) para 20 linhagens de plantas. Os níveis de tocoferol são determinados adicionando 10 a 15 mg de semente de Arabidopsis em um microtubo de 2 ml_. Uma massa de 1 g de microcontas de 0,5 mm (Biospecifics Technologies Corp., Lynbrook, NY) e 500 μΙ de piroga-lol a 1 % (Sigma Chem, St. Louis, MO) em etanol contendo 5 pg/mL de tocol, são adicionados ao tubo. A amostra é agitada duas vezes por 45 segundos em um FastPrep (Bio 101/Savant) em uma velocidade de 6,5. O extrato é filtrado (acrodisco Gelman PTFE de 0,2 pm, filtros de seringa de 13 mm, Pall Gelman Laboratory Inc, Ann Arbor, Ml) para dentro de um tubo de auto-amostra. É feita HPLC em uma coluna de HPLC de sílica Zorbax, 4,6 mm x 250 mm (5 pm) com uma detecção fluorescente usando um Hewlett Packard HPLC (Agilent Technologies, Paio Alto CA). É feita excitação da amostra a 290 nm, e a emissão é monitorada a 336 nm. Os tocoferóis são separados com um gradiente de éter metil-t-butílico de hexano usando um volume de injeção de 20 pl, um índice de fluxo de 1,5 ml/min, e um tempo de operação de 12 min (40°C). A concentração e a composição do tocoferol é calculada com base em curvas padrões para α, β, δ, e γ-tocoferol usando o software Chemstation (Agilent Technologies, Paio Alto CA).

Exemplo 6 Plantas de canola, Brassica napus e de soja são transformadas com uma variedade de constructos de DNA usando uma abordagem de bombardeamento de partículas essencialmente conforme determinado em Christou, In Particle Bombardment forthe Genetic Engineering of Plants, Bi-otechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, Califórnia (1996) ou usando transformação mediada por Agrobacterium. São produzidas duas séries de constructos de DNA. A primeira série de constructos são "cons-tructos de único gene." Cada um dos seguintes genes é inserido em um constructo de DNA vegetal isolado sob o controle de um promotor napin (Kridl et ai, Seed Sei. Res. 1: 209 : 219 (1991)) e os produtos dos genes podem ser alvejados para o plastídeo por um peptídeo para alvejar plastí-deos codificados tal como CTP1 (Keegstra, Ce// 56(2): 247 - 53 (1989); Nawrath, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 12760 - 12764 (1994)): um gene fyrA de E. herbicola (Xia et ai, J. Gen. Microbiof. 138: 1309 - 1316 (1992)), um gene slr1736 de planta (em Cyanobase (www.kazusa.or.jp/cyanobase)), um gene ATPT2 de planta (Smith et al., P/ant J. 11: 83 - 92 (1997)), um gene dxs de E. coli (Lois et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (5): 2105 - 2110 (1998)), um gene dxr (Takahashi et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (17), 9879 - 9884 (1998)), um gene HPPD de Arabidopsis tha/iana (Norris et ai, Plant Physioi 117: 1317 - 1323 (1998)), um gene GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley e Scolnik, Plant Physioi 104: 1469 - 1470 (1994)), um gene AANT1 (Saint Guily, et al., Plant Physioi, 100(2): 1069 - 1071 (1992)), um gene GMT (WO 00/32757, WO 00/10380), um gene slr1737 (em Cyanobase (www.kazusa.or.jp/cyanobase), um gene MT 1 (A seqüência de MT 1 de Synechocystis (NCBI Número Identificador Geral 1653572) foi usada como uma pesquisa de ferrugem das plantas contra ESTs da Anabaena sp. cepa PCC 7120 (Kaneko 2001) e uma seqüência com substancial homologia para ο MT1 de Synechocystis foi encontrada em uma pesquisa de ferrugem das plantas contra ESTs da Anabaena sp. cepa PCC 7120 (Kaneko et al., DNA Research 8(5): 205 - 213 (2001)), um gene TMT2 (conforme revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos S/N 60/330.563, arquivado em 25 de outubro de 2001, o qual é incorporado a este relatório por meio de referência em sua totalidade), e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico (Sato et ai, J. DNA Res. 7 (1): 31 - 63 (2000)). Cada constructo é transformado para pelo menos uma planta de canola, Brassica napus, e de soja. Plantas expressando cada um destes genes são selecionadas para participarem em cruzamentos adicionais. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. São realizados cruzamentos para cada espécie para gerar plantas transgênicas tendo uma ou mais das seguintes combinações de genes introduzidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, AANT1, sir 1737, MT1, TMT2, e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentí-sico. A composição e o nível de tocoferol em cada planta gerada pelos cruzamentos (inclusive todos os cruzamentos intermediários) também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. A progênie dos mutantes destes constructos será cruzada uma com a outra para juntar os genes adicionais para atingir o nível desejado de tocoferol.

Uma segunda série de constructos de DNA é gerada e referida como os "constructos de múltiplos genes". Os constructos de múltiplos genes contêm múltiplos genes cada um sob o controle de um promotor napin (Kridl et ai, Seed Sei. Res. 1: 209 : 219 (1991)) e os produtos de cada um dos genes são orientados para o plastídeo por meio de um peptídeo orientado para plastídeo codificado. O constructo de múltiplos genes pode ter dois ou mais dos seguintes genes: tyrA, sir1736, ATPT2, dxs, dxr; GGPPS, HPPD, GMT, AANT1, sir 1737, MT1, TMT2, e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico.

Cada constructo é então transformado para pelo menos uma planta de canola, Brassica napus e de soja. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. A progênie dos mutantes destes constructos será cruzada uma com a outra para juntar os genes adicionais para atingir o nível desejado de tocoferol.

Exemplo 7 - Transformação de Canola com pMON66454 e medição da composição total de tocoferol.

Plantas de canola são transformadas usando Agrobacterium como no Exemplo 4 com o vetor pMON66454 (descrito no Exmeplo 2) o qual contém uma região de codificação para AANT1. As plantas são cultivadas, e as sementes são colhidas e testadas para os níveis de tocoferol essencialmente como descrito no Exemplo 5 para sementes de Arabidopsis. A Tabela 1 mostra o nível total de tocoferol das sementes para as plantas de controle e várias plantas produzidas a partir de eventos de transformação isolados (dados em nanogramas por miligrama de semente). Os níveis médios de tocoferol expressos na semente de controle são de 325 +/- 36 ng/mg de semente, e os níveis médios de tocoferol para semente das plantas R1 portando o vetor pMON66454 são de 338 +/- 36 ng/mg de semente.

Tabela 1 Tabela 1 - (continuação) Exemplo 8 Plantas Transformadas com AANT1 e outros genes da biossínte-se do tocoferol.

Plantas de canola, Brassica napus, Arabidopsis, e de soja são transformadas com uma variedade de constructos de DNA usando uma abordagem de bombardeamento de partículas essencialmente conforme determinado em Christou, In Particle Bombardment forthe Genetic Enginee-ríng of Plants, Biotechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, Califórnia (1996) ou usando transformação mediada por Agrobacterium. São produzidas duas séries de constructos de DNA. A primeira série de constructos são "constructos de gene único". Cada um dos seguintes genes é inserido em um constructo de DNA vegetal separado sob o controle de um promotor napin (Kridl et al., Seed Sei. Res. 1 : 209 : 219 (1991)) e os produtos dos genes podem ser orientados para o plastídeo por meio de um peptí-deo tendo como alvo plastídeo codificado tal como CTP1 (Keegstra, Cell 56(2): 247 - 53 (1989); Nawrath, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 12760 - 12764 (1994)) ou CTP2): um gene fyrA de E. herbicola (Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309 - 1316 (1992)), um gene slr1736 (em Cyanobase no site da Internet: kazusa.or.jp/cyanobase), um gene ATPT2 de planta (Smith et al., Plant J. 11: 83 - 92 (1997)), um gene dxs (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (5): 2105-2110 (1998)), um gene dxr (Takahashi et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (17), 9879 - 9884 (1998)), um gene HPPD de Arabidopsis tha/iana (Norris et al., Plant Physiol. 117: 1317 - 1323 (1998)), um gene GGH (Keller et al., Eur. J. Biochem. 251:413-417 (1998)), um gene GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley e Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469 - 1470 (1994)), um gene AANT1 (Saint Guily, et al., Plant Physiol., 100(2): 1069 - 1071 (1992)), um gene MT1 (A seqüência do MT1 de Syne-chocystis (NCBI Número Identificador Geral 1653572) foi usada em uma pesquisa de ferrugem das plantas contra ESTs da Anabaena sp. cepa PCC 7120 (Kaneko 2001). Uma seqüência com homologia substancial para o MT1 de Synechocystis foi encontrada em uma pesquisa de ferrugem das plantas contra ESTs da Anabaena sp. cepa PCC 7120 (Kaneko et al., DNA Research 8(5): 205 - 213 (2001)), um gene TMT2 (conforme revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos S/N 60/330.563, arquivado em 25 de outubro de 2001, o qual é incorporado a este relatório por meio de referência em sua totalidade), um gene GMT (conforme revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos S/N 60/312.758, arquivado em 17 de agosto de 2001, o qual é incorporado a este relatório por meio de referência em sua totalidade e WO 00/32757, WO 00/10380), e um gene slr1737 (em Cyanobase (na Internet em kazusa.or.jp/cyanobase), e um constructo anti-sentido para disoxi-genase do ácido homogentísico (Sato et al., J. DNA Res. 7 (1): 31 - 63 (2000))). Cada constructo é transformado para no mínimo uma planta de canola, Brassica napus, Arabidposis e soja. Plantas expressando cada um destes genes são selecionadas para participarem de cruzamentos adicionais. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. São realizados cruzamentos para cada espécie, para gerar plantas transgênicas tendo uma ou mais das seguintes combinações de genes introduzidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico. A composição e o nível de tocoferol em cada planta gerada pelos cruzamentos (inclusive todos os cruzamentos intermediários) também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. As progênies dos mutantes destes constructos são cruzadas umas com as outras para juntar os genes adicionais para atingir o nível desejado de tocoferol.

Uma segunda série de constructos de DNA é gerada e referida como os "constructos de múltiplos genes." Os constructos de múltiplos genes contêm múltiplos genes cada um sob o controle de um promotor napin (Kridl et ai, Seed Sei. Res. 1 : 209 : 219 (1991)) e os produtos de, cada um dos genes são alvejados para o plastídeo por um peptídeo codificado para alvejar plastídeo. O constructo de múltiplos genes pode ter dois ou mais dos seguintes genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico.

Cada constructo é então transformado para no mínimo uma planta de canola, Brassica napus, Arabidopsis, e de soja. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. A progênie dos mutantes destes constructos são cruzadas umas com as outras para juntar os genes adicionais para atingir o nível desejado de tocoferol.

Exemplo 9 Plantas de Arabidopsis transformadas com AANT1 e outros genes da biossíntese do tocoferol São preparados constructos de expressão pCGN 10822, pMON36528, pMON69907 e pMON69909, apresentados nas figuras 10-13 respectivamente. Plantas de Arabidopsis são transformadas com os vetores indicados usando as técnicas de transformação descritas no Exemplo 8. Os mutantes são isolados e cultivados em linhagens individuais por auto polinização e as sementes de cada linhagem são colhidas. A composição total de tocoferol e de tocotrienol das sementes de cada linhagem são analisadas usando o método determinado no Exemplo 5. A Figura 10 mostra os níveis totais de tocoferol e de tocotrienol para linhagens de plantas portando os contrutos descritos ou um controle. Uma análise de sementes T2 de linhagens de plantas derivadas por meio de transformação com o vetor pMON69909 relativo ao tipo selvagem é mostrada na figura 11. Linhagens de plantas transformadas com pMON69909 demonstram um aumento substancial de tocoferóis totais e de tocotrienóis totais, com os maiores aumentos no delta tocoferol, alfa tocotrieneol, delta tocotrienol, e gama tocotri-enol. Algumas sementes de plantas portando o vetor pMON69909 apresentam uma coioração escura em conseqüência do acúmulo do ácido homo-gentísico, o que é confirmado por meio de análise LC/MS (ver as Figuras 12 e 13). A expressão heteróloga de tyrA em sementes de plantas trarts-gênicas de Arabidopsis produz um aumento de 1,6 vez nos níveis de tocoferol das sementes comparadas com linhagens de controle. Outra enzima chave essencial para a biossíntese do tocoferol é HPT, a qual está envolvida na condensação de fitil pirofosfato (PPP) e homogentisado (HGA) para 2-metii-6-fitilplastoquinol produzido (2M6PPQ), um precursor para a síntese de quatro isoformas diferentes de tocoferóis. A superexpressão de HPT^aò/dops/s (ATPT2) e a HPTsynechocystis (slr1736) de modo independente em sementes de A. thaliana transgênica resulta em um aumento de 1,6 vez nos tocoferóis das sementes. É mostrado que um transportador de adenilato putativo de A. thaliana (AANT1) expresso como um único gene aumenta os níveis de tocoferol das sementes para 1,4 vez em A. thaliana. Para testar se uma combinação destes genes resultaria em efeito sínérgico sobre a biossíntese do tocoferol, são testadas várias combinações em A. thaliana.

Sementes de Arabidopsis T2 portando os constructos genéticos duplos ATPT2 e tyrA double gene constructs (pMON69907), os constructos genéticos triplos ATPT2, tyrA, e HPPD (pMON69909), os constructos genéticos triplos ATPT2, tyrA, e GGPPS (pMON69915 (Figura 16)), e os constructos genéticos triplos ATPT2, tyrA, e AANT1 (pMON69919 (Figura 17)), são analisadas para teor e composição de tocoferol das sementes. O teor total de tocoferol e tocotrienol das sementes aumenta para aproximadamente 2,4 vezes em linhagens transformadas com pMON69907 (vetor genético duplo) e até 5 vezes nas linhagens portando o vetor genético triplo (pMON69909) (Veras Figuras 10 e 11). HPPD expresso como um único gene em A. thaliana resulta em um aumento mal detectável dos níveis de tocoferol. A combinação de HPPD com ATPT2 não resulta em um aumento adicional dos níveis de tocoferol comparado com linhagens portanto somente ATPT2 (dados não apresentados). Em contraste, quando HPPD é combinado com tyrA e ATPT2, os níveis de tocoferol e de tocotrienol dobram comparados com a combinação tyrA, ATPT2. Sementes portando o cons-tructo genético triplo pMON69909 parecem de cor muito mais escura do que as sementes de controle. Além disso, é de conhecimento geral que plantas dicotiledôneas selvagens não acumulam tocotrienóis. No entanto, as sementes de A. thaliana transgênica portanto todos os quatro constructos acumulam níveis substanciais de tocotrienóis (confirmado por HPLC, e por amostras selecionadas por LC-MS, (Ver as Figuras 12, 13, 14, e 15). Os teores de tocoferol e de tocotrienol das sementes portando o constructo de expressão genética tripla, pMON69909, consistem em 60 % de tocotrienois e de 40 % de tocoferóis. Quando as disponibilidade de HGA endógeno está elevada por superexpressão das enzimas biossintéticas HGA (tyrA e HPPD) junto com HPT, o HPT utilizaria geranilgeranil pirofosfato (GGPP) e HGA para produzir tocotrienóis ao invés de tocoferóis sob condições limitadas pela disponibilidade do nível endógeno de geranilgeranil redutase (GGH). As funções de GGH sobre a hidrogenação do GGPP para PPP, um substrato para HPT na síntese de tocoferol. Portanto, o aumento de acúmulo de tocotrienóis observado nos constructos testados pode ser superado pela superexpressão de GGH em combinação com tyrA, HPPD, e HPT.

Exemplo 10 Plantas transformadas com AANT1 e outros genes da biossín-tese do tocoferol.

As plantas são transformadas com os constructos de DNA apresentados nas tabelas 2 e 3 abaixo, empregando as técnicas descritas no Exemplo 8. Os constructos contêm um ou mais genes sob o controle de um promotor napin (Kridl et a!., Seed Sei. Res. 1 : 209 : 219 (1991)), o promotor 7S' (Chen et al., PNAS 83(22): 8560 - 8564 (1998)) ou o promotor Arcelin 5 (Arc5) (Goossens et al., Plant Physioi. 120: 1095 - 1104 (1999), e conforme revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos S/N 60/255.879, arquivado em 18 de dezembro de 2000 e no Pedido de Patente dos Estados Unidos S/N 10/015.637, arquivado em 17 de dezembro de 2001 ambos os quais são incorporados a este relatório por meio de referência em sua totalidade)). Os produtos dos genes podem ser orientados para o plastídeo por meio de um peptídeo com orientação para plastídeo codificado tal como CTP1 (Ke-egstra, Cell 56(2): 247 - 53 (1989); Nawrath, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 12760 - 12764 (1994)) ou CTP2. Um ou mais dos seguintes genes são usados; um gene tyrA de E. herbicola (Xia et ai., J. Gen. Microbiol. 138: 1309 - 1316 (1992)), um gene slr1736 (em Cyanobase no site da Internet: kazusa.org.jp/cyanobase), um gene ATPT2 (Smith et al., Plant J. 11: 83 - 92 (1997)), um gene dxs de E. coli (Lois et al·, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (5): 2105-2110 (1998)), um gene dxr (Takahashí et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (17), 9879 - 9884 (1998)), um gene HPPD (Norris et al., Plant Physioi. 117: 1317 - 1323 (1998)), um gene GGH (Keller et al., Eur. J. Bio-chem. 251: 413 - 417 (1998)), um gene GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley e Scolnik, Plant Physioi 104: 1469 - 1470 (1994)), um gene AANT1 (Saint Guily, et ai, Plant Physioi, 100(2): 1069 - 1071 (1992)), um gene MT1 (como acima para o Exemplo 8), um gene TMT2 (como acima para o exemplo 8), um gene GMT (como acima para o exemplo 8, e WO 00/32757, WO 00/10380), um gene slr1737 (em Cyanobase no site da Internet em kazu-sa.org.jp/cyanobase), e um constructo de anti-sentido para disoxigenase do ácido homogentísico (denominado HGDas) (Sato et ai, J. DNA Res. 7 (1): 31 - 63 (2000)). Cada constructo é transformado em pelo menos uma planta de canola, Brassica napus, Arabidposis, e de soja. A composição e o nível de tocoíerol em cada planta também são analisados usando o método determinado no exemplo 5. Exemplos de plantas transformadas com tyrA e outros genes da biossíntese do tocoferol incluem plantas de Arabidopsis transformadas com os constructos determinados na Tabela 2 e plantas de soja transformadas com os constructos da Tabela 3.

Plantas com características desejadas são submetidas a cruzamentos adicionais para produzirem plantas transgênicas tendo uma ou mais das seguintes combinações de genes introduzidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo de anti-sentido para disoxigenase de ácido homogentísico. Alternativamente, as plantas são cruzadas para juntar cópias múltiplas de um ou mais dos genes supracitados em uma planta transgênica.

Tabela 2 Tabela 3 Exemplo 11 Construção de vetores codificando múltiplas enzimas Este exemplo determina o uso de uma prefenato desidrogenase (tyrA), tal como a Erwinia herbicola tyrA, em combinação com outras enzimas no caminho biossintético do tocoferol para aumentar a produção de to-coferol em sementes de plantas transgênicas, tais como sementes de Arabi-dopsis thaliana. As enzimas combinadas com tyrA incluem ATPT2, p-hidroxifenilpiruvato disoxigenase (HPPDArabidopsis), e geranilgeranilpirofosfato sintase (GGPPSArabidopsis) de Arabidopsis thaliana. Além disso, tyrA também é testada em combinação com ATPT2 e um transportador de adenilato (AANT1 Arabidopsis) de Arabidopsis thaliana. A construção de um vetor genético duplo portando cassetes de expressão tyrA e ATPT2 específicos para sementes é realizada como se segue. DNA de plasmídeo purificado de pMON36520 (Figura 18) é submetido a uma digestão parcial por Kpnl e ligado com um fragmento Κρη I purificado com gel de 4,2 kbp isolado de pMON43853 (Figura 19). A inserção de 4,2 kb de pMON43853 contém o cassete de expressão do gene PPT (pNa-pin::ATPT2::Napin 3'). O vetor binário de planta resultante pMON69907 (Figura 8) é usado para transformação de Arabidopsis thaliana para testar o efeito combinatorial da expressão de tyrA e ATPT2 específica para sementes.

Para aumentar mais a biossíntese de tocoferol, o HPPDArabidopsis é expresso além de tyrA e ATPT2 em sementes de Arabidopsis thaliana. Isto é realizado adicionando um cassete de expressão específico para sementes para HPPDArabidopsis para pMON69907 resultando na formação de pMON69909. O vetor binário pMON69909 é construído digerindo parcialmente pMON69907 com Kpnl. O único pMON69907 cortado por Kpnl é purificado por gel e ligado com uma inserção de 4,6 kb Kpnl/Kpnl isolada de pMON36525 (Figura 20). A inserção de 4,6 kb Kpnl/Kpnl de pMON36525 contém o cassete de expressão do gene HPPD, pNa-pin::CTP2::HPPDArabidopsis::Napin 3' para orientar a expressão de HPPD alvejada por plastídeo específico de sementes. O CTP2 é um sinal de cloro-plasto-alvo do gene 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) de Arabidopsis. O vetor binário pMON69915 (Figura 16) é construído para testar o efeito de três combinações genéticas, tyrA, ATPT2, e GGPPS^awdops/s sobre a produção de tocoferol das sementes. O vetor pMON69907 é digerido parcialmente com Kpnl. pMON69907 cortado por Kpnl único é purificado com gel e ligado com um fragmento Kpnl/Kpnl de 4,3 kb purificado com gel de pMON43861 (Figura 21) para criar pMON69915. O fragmento Kpnl de pMON43861 contém o cassete de expressão do gene para a geranilgeranil-difosfato sintase de Arabidopsis de Arabidopsis tha/iana (pNa-pin::GGPPSArabidopsis::Napin 3'). O cDNA de GGPPS é identificado como um clone EST pesquisando um banco de dados EST com informação de se-qüências disponíveis na literatura (Okada et al., Plant Physiof. 122: 1045 -1056 (2000)). O clone EST é digerido com Ncol e tornado cego enchendo a projeção 5' com o fragmento Klenow. Em seguida, o clone é digerido com BamHI e para excisar o fragmento de cDNA. O fragmento de cDNA Ba-mHI/cego purificado com gel é ligado com Bglll/Sall digerido e (Sall de extremidade cega) vetor pCGN7770 (Figura 22) para criar pMON43861. O vetor binário de planta pMON69919 (Figura 17) é construído para testar a expressão combinada de tyrA, ATPT2, e AANT1 Arabidopsis sobre os níveis de tocoferol das sementes. Para produzir este vetor, pMON69907 é parcialmente digerido com Kpnl. Kpnl-cutpMON69907 único é purificado por gel, e ligado com um fragmento Kpnl/Kpnl de 4,2 kb purificado por gel de pMON69911 (Figura 23). O fragmento de 4,2 kb contém um cassete de expressão específico para sementes para o transportador de adenilato AANT1 de Arabidopsis (pNapin::AANTlArabidopsis-napin 3'). pMON69911 é produzido excisando o fragmento AANT1 de pCGN11301 (Figura 24) com Sall e Pstl (o sítio Pstl é tomado cego removendo a projeção 3’ com Klenow) e em seguida ligado a pCGN7770 digerido com Sall/Xhol (Xhol de extremidade cega).

Usando a sequência parcial publicada de AANT1 (Saint-Guily et al., Plant Physiol. 100(2): 1069 - 1071 (1992)) vários clones de extensão total são identificados em bancos de dados EST. A região de codificação AANT1 é amplificada por PCR usando iniciadores, AANT 1F 5‘- GGATCCGCGGCCGCACCATGGTTGATCAAGTTCAGCA (SEQ ID N9: 11) e AANT1R 5'-GAGCTCCTGCAGGAAGCTTTTAGGCACCTCCTGATCCGT-3' (SEQ ID N9: 12). O sítio Notl (sublinhado) é disposto acima do códon de partida (em itálico) no iniciador AANT1F enquanto o sítio Sse8387l (sublinhado) é disposto abaixo do códon de parada (em itálico) em AANT1R. Os produtos de PCR são primeiro clonados em pCR2.1 e as inserções são verificadas por meio de seqüenciamento de ambos os filamentos. Subsequentemente, os fragmentos Notl/Sse8387l são inseridos nos sítios No-tl/Sse8387l do cassete de expressão napin em pCGN9979 em orientação de sentido com relação ao promotor napin para gerar pCGN11301. Os cons-tructos de expressão de planta são usados para transformação de Arabidop-sis thaliana por meio de transformação mediada por Agrobacterium conforme descrito acima.

Exemplo 12 Expressão de vetores codificando enzimas múltiplas em plantas Usando a técnica de transformação dada no Exemplo 8, plantas de Arabidopsis thaliana são transformadas com os vetores do Exemplo 11. Os resultados para pMON69909 são dados nas Figuras 25, 26, 10 - 15. Os resultados adicionais são dados na Tabela 4, e nas Figuras 27 e 28, as quais apresentam os níveis de tocoferol, tocotrienol, homogentisado e 2-metilfitilplastoquinol para plantas transformadas tendo pMON69909.

Tabela 4

Claims

1. Construto de DNA recombinante que codifica um transportador de adenilato, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID N°: 1, em que o referido construto de DNA é ligado operacional mente a um promotor heterólogo.

2. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína compreendendo a SEQ ID N°: 2.

3. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor específico de sementes.

4. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido promotor específico de sementes é um promotor napin ou um promotor 7S.

5. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor proporciona expressão tecidual-específica, celular-específica ou reforçada.

6. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido tecido é selecionado entre o grupo consistindo em tubérculo, fruto, folha, semente, endosperma, óvulo, pólen, aleuro-na, raiz e caule.

7. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado entre o grupo consistindo do promotor de nopalina sintase, promotor de octopina sintase, promotor do vírus do mosaico da couve-flor 19S, promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S, promotor do vírus do mosaico da escrofulária 35S, promotor Adh, promotor da sacarose sintase, promotor do complexo genético R, promotor protéico de ligação a/b da clorofila, promotor da glutamina sinte-tase GS2, promotor frutose-1,6-bifosfatase (FBPase), promotor ST-LS1, promotor da serina/treonina cinase, promotor da glucoamilase, promotor da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS), promotor do gene cab, promotor Cab-1 do trigo, promotor CAB-1 do espinafre, promotor cab1 R do arroz, do piruvato, promotor da ortofosfato dicinase (PPDK), promotor Lhcb1*2, pro- motor SUC2 sacarose-H+ simporter, promotor LhcB, promotor PsbP, um promotor de patatina classe I, um promotor de patatina classe II, promotor do tubérculo da batata ADPGPP, um promotor protéico de ligação a/b da clorofila, um promotor protéico da membrana tilacóide, promotor da sacarose sin-tase, promotor do complexo protéico de 22 kd dos tubérculos, promotores inibidores da protease dos tubérculos, promotor da sintase do amido ligada a grânulos, promotor napin, promotor faseolina, promotor inibidor da tripsina da soja, promotor ACP, promotor estearoíla-ACP desaturase, promotor 7S da soja, promotor de oleosina, promotor de β-conglicinina, promotores de zeína, promotor do gene seroso (Waxy), promotor do gene delicado (Brittle), promotor do gene contraído (shrunken) 2, promotor de enzimas de ramificação I, promotor de enzimas de ramificação II, promotores da sintase do amido, promotores de enzimas de desramificação, promotores de oleosina, promotores de glutelina, promotores de gliadina, promotores de glutenina, promotores da sacarose sintase, promotor Osgt-1, promotores para subuni-dades de ADPglicose pirossintase, promotores protéicos abundantes na em-briogênese, promotores de hordeína, promotores da globulina do embrião, promotores protéicos específicos da aleurona, arcelina 5, promotor napin, promotor da quitinase ácida e os subdomínios específicos de raízes do promotor CaMV35S.

8. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência 3' não-traduzida que funciona em uma célula de planta provocando a terminação da transcrição e adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3' da molécula de mRNA.

9. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor funciona em uma célula de planta causando a produção de uma molécula de mRNA.

10. Método para produzir uma planta tendo sementes com um nível aumentado de tocoferol, caracterizado pelo fato de que compreende: (A) transformar a referida planta com uma molécula de ácido nucléico, em que a referida molécula de ácido nucléico compreende a SEQ ID N°: 1; e (B) cultivar a referida planta.

11. Método para produzir uma planta de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada entre o grupo consistindo em alfafa, Arabidopsis, cevada, Brassica campestris, Brassi-ca napus, brócolis, repolho, canola, cítricos, algodão, alho, aveia, cebola, linho, uma planta ornamental, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilhas, uva, banana, chá, ervas de turfa, girassol, soja, milho, Phaseolus, Crambe, mostarda, mamona, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão e palma oleaginosa.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada entre o grupo consistindo em canola, milho, Brassica campestris, Brassica napus, soja, Crambe, mostarda, mamona, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafrão, palma oleaginosa, trigo e girassol.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta é canola.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta é Brassica napus.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta é soja.

16. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta produz sementes, em que o referido nível de tocoferol está aumentado em pelo menos 10% com relação a plantas com antecedente genético semelhante mas carecendo da referida molécula de ácido nucléico.

17. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta produz sementes, em que o referido nível de tocoferol está aumentado em pelo menos 20% com relação a plantas com antecedente genético semelhante mas carecendo da referida molécula de ácido nucléico.

18. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- Io fato de que a referida planta produz sementes, em que o referido nível de tocoferol está aumentado em pelo menos 30% com relação a plantas com antecedente genético semelhante mas carecendo da referida molécula de ácido nucléico.

19. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida planta produz sementes, em que o referido nível de tocoferol está aumentado em pelo menos 40% com relação a plantas com antecedente genético semelhante mas carecendo da referida molécula de ácido nucléico.

20. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico compreende ainda um ácido nucléico codificando um membro selecionado do grupo consistindo em slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, slr1737 e um constructo de anti-sentido para dioxigenase de ácido homogentísico.