CN111848804A - 玉米淀粉合成酶ssⅲ的多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米淀粉合成酶SSⅢ多克隆抗体的的制备方法，用SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白免疫动物，然后从动物体内分离得到多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与玉米淀粉合成酶SSⅢ发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高。本发明制备的多克隆抗体，可对玉米在不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行检测，可以在玉米一切与淀粉合成酶SSⅢ蛋白作用相关的研究中得到应用，为SSⅢ蛋白的功能和作用机理提供了检测与验证技术支持，从而为解析淀粉的合成和调控机制有重要意义。

Description

玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种利用玉米淀粉合成酶SSⅢC端序列制备多克隆抗体的方法。
背景技术
淀粉生物合成是一个高度复杂的代谢过程，需要多种酶的协同作用。这些酶包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(DBE)等。淀粉合成关键酶被组装成良好的机械复合物，其中SSⅢ与其他酶的物理缔合在调节相互作用中起关键作用。淀粉合成酶(starch synthase,SS)主要存在于可溶性的质体基质中，催化形成α-1,4糖苷键，进而形成直链淀粉或延伸支链淀粉的分支链,主要负责合成支链淀粉。在正在发育的玉米或水稻胚乳中,淀粉合成酶总活性中占28％，其活性水平仅次于SSI，是第二大主要SS同工酶。
前人的研究表明，SSIII是淀粉正常结晶和防止植物糖原积累所必需的，主要作用是催化形成高度有序的支链淀粉。对水稻和大麦SSⅢa缺失突变体研究发现，SSⅢa催化中长链合成支链淀粉聚合度大于30的长链。玉米SSIII的缺失突变体表面颜色暗沉、内核缩小且半透明，冠部呈现比野生型更深的橙色，腹部表现出特征性的小凹痕。因而，SSⅢ突变会影响支链淀粉的合成，使淀粉的合成量减少，结构发生改变，影响籽粒重量，并使淀粉中的直链淀粉比率上升。SSⅢ除具有酶促功能外，还被认为是淀粉生物合成的“调节剂”，与其他SS同工酶的活性和表达水平有关。例如，玉米SSⅢa突变体的内源SSⅠ活性高于野生型。SSIII和异淀粉酶型DBE协同作用，以使葡聚糖聚合物正常结晶。目前已证实SSⅢ能通过蛋白-蛋白相互作用来影响淀粉代谢途径中其它关键酶活性，且与多种淀粉生物合成酶的功能相协调。因玉米淀粉合成酶SSIII分子量较大且缺乏相应特异性抗体，国内外对玉米淀粉合成酶SSIII相关研究还存在较大空白。因此制备SSIII特异性抗体具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供了一种利用玉米淀粉合成酶SSⅢC端序列制备多克隆抗体的方法。
本发明的技术方案为：
用于制备玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的制备方法，用SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白免疫动物，然后从动物体内分离得到多克隆抗体。
进一步地，上述所述的玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：
(1)目的核酸片段的扩增：提取玉米胚乳RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，以SEQID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对为引物进行PCR扩增，得到玉米淀粉合成酶SSⅢC段1200位-1675位氨基酸对应的核酸片段，所述核酸片段序列如SEQ ID No.4所示；
(2)原核表达载体的构建；
(3)重组表达菌株的构建；
(4)蛋白的诱导表达及纯化；
(5)动物的免疫和血清的分离。
进一步地，步骤(1)中，PCR扩增的体系为：
Figure BDA0002586516870000021
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，34个循环；72℃后延伸10min，12℃，2min。
进一步地，步骤(2)中，原核表达载体的构建的具体方法为：将步骤(1)得到的核酸片段与T载体连接，得到原核表达载体。
进一步地，步骤(5)中，蛋白的诱导表达及纯化的具体步骤为：将步骤(4)纯化后的蛋白与佐剂混合，200μg蛋白与佐剂混合乳化到1mL，免疫新西兰大白兔，每隔2周免疫1次，连续免疫四次，分离血清，所述纯化后的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与玉米淀粉合成酶SSⅢ发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高。本发明制备的多克隆抗体，可对玉米在不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行检测，可以在玉米一切与淀粉合成酶SSⅢ蛋白作用相关的研究中得到应用，为SSⅢ蛋白的功能和作用机理提供了检测与验证技术支持，从而为解析淀粉的合成和调控机制有重要意义。
附图说明
图1为SSⅢC端序列扩增图，基因克隆时，PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，34个循环；72℃后延伸10min，12℃，2min。
图2为重组原核表达质粒鉴定结果图，pMD19-T-SSⅢ-C与表达载体pGEX-6t-1连接，将连接产物进行转化，挑单克隆摇菌后，提取质粒，进行电泳检测。在1、3、5号泳道处可见约5000bp的特异性条带，与正确质粒大小相符；在点样为质粒的PCR的2、4、6号泳道处跑出约1500bp的条带，大小与理论值(1425bp)相符。
图3为SSⅢ-C蛋白原核表达产物SDS-PAGE分析图，构建好的原核表达载体转化到感受态中并进行诱导表达。在未诱导前，加IPTG诱导1h，2h，3h，4h，5h，6h的时候分别取样进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果表明在75KD处有明显的条带(1号泳道为未加IPTG诱导的对照，2～7号泳道为加IPTG诱导1-6h的样品)。
图4为玉米胚乳内源性抗体SSⅢ的检测。
图5为玉米不同授粉阶段胚乳SSⅢ含量鉴定。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
一种利用玉米淀粉合成酶SSⅢC端序列制备多克隆抗体的方法，步骤包括：
1.目的片段PCR扩增
提取玉米胚乳RNA，反转录成cDNA，上游引物序列为：‘5-GAATTCGGTGGAATTTATGATAACAG-3’(SEQ ID No.2)，下游引物序列为：‘5-GTCGACTTACAATTTGGACGCTGAAC-3’(SEQ ID No.3)，然后进行PCR扩增：
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0002586516870000031
Figure BDA0002586516870000041
(1)PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸5min，34个循环；72℃后延伸5min，12℃，2min。跑电泳之前取5μL PCR产物加入0.5μL LoadingBuffer后进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，以检测是否有适当大小的条带。确定条带大小合适后，将剩余的PCR产物全部通过1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收，将回收产物于4℃保存。
(2)电泳检测：一、1％琼脂糖凝胶的配制：称取0.25g琼脂糖(Agarose)，倒入烧杯，加入25mL 1×TBE溶液，将烧杯置于微波炉中，加热，待其完全溶解后，取出。待凝胶冷却至60℃左右时，加入1μL EB(溴化乙锭)，迅速摇匀，然后将凝胶完全倒入模具内，挑出气泡，插好栅栏。二、加样电泳：待凝胶完成冷凝后，取出，置于电泳槽内，并确认电泳液完全覆盖胶面，点样。调整好电压150V，确认正负极，盖上电泳槽盖子，通电电泳，电泳槽两端电极处有大量气泡产生即代表电泳开始进行。三、照胶：待上样缓冲液泳动至1/2～2/3胶长位置时，取出凝胶，退下支撑板，将凝胶置于照胶仪内。打开软件ImagLab，进行成像，成像完毕后，做好注释，命名并保存图像文件。并取出凝胶块，放置于规定回收位置。
(3)胶回收：将所需回收的胶切割好，并装入1.5mL EP管中，加入500μL BindingBuffer，于37℃摇床中，直至凝胶完成溶解。完全溶解的胶冷却后，加入到干净的吸附柱中，静置3～5min，后以12000rpm离心1min，离心完成后弃废液。加入700μL SPW wash Buffer，以12000rpm离心1min，离心完成后弃废液。再加入600μL SPW wash Buffer，以12000rpm离心1min，离心完成后弃废液。等2～3min，13000rpm，空转2min。以干净的1.5mL EP管替换收集管，打开分离柱盖子，37℃下放置15～20min，直至酒精气味完全散去。加入35μL dH2O，静置10～20min，13000rpm离心2min，EP管内溶液即胶回收产物，置于4℃下保存。
(4)测定核酸浓度：通过NanoDrop2000超微量分光光度计测定。用滴管取2μLdH2O，滴于中央小孔上，反复润洗3～4次，调零。将回收后基因吸取2μL滴加于中央小孔，读取读数并记录。
(5)连接T载：在微量离心管中配置下列DNA溶液，全量为5μL试剂使用量，加入5μL(等量的)Solution I，16℃反应4～6h。
表2 连接T载体系
Figure BDA0002586516870000051
(6)连接产物转化大肠杆菌及涂板培养：全量(10μL)连接产物加入到在冰上解冻的感受态细胞中，冰上放置30min。然后42℃水浴90s，冰上放置2min。加入800μL LB液体培养液(不含Amp)，混匀后37℃摇箱振荡培养1h。将所有连接产物转化至大肠杆菌感受态中，涂板37℃培养箱过夜培养。
(7)挑菌单克隆：将实验所需器材置于超净工作台上，紫外灭菌30min，然后关紫外灯，通风。用酒精喷壶给手消毒，点燃酒精灯，打开LB培养基瓶口，瓶口过火焰。吸1mL LB培养液于1.5mL EP管内，再加入1μL Amp，吹打混匀。用200μL枪头轻吸合适的菌落，伸入培养基液面下轻轻搅动，反复吹打。将EP管置于37℃恒温摇床中培养4～6h。
(8)菌液PCR检测：菌液PCR检测采用20μL体系。PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，34个循环，72℃后延伸10min；12℃，2min。再进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表3 菌液PCR检测体系
Figure BDA0002586516870000052
(9)接菌：将实验所需器材置于超净工作台上，紫外灭菌30min，然后关紫外灯，通风。往锥形瓶中依次加入20mL LB培养液，20μLAMP，200μL菌液，之后封好口。将锥形瓶放入37℃摇箱，培养8h以上。
(10)质粒提取：采用OMEGA公司的质粒提取纯化试剂盒中的方法提取重组质粒。
(11)酶切鉴定：采用30μL体系，反应条件为37℃水浴反应过夜，加入10×HBuffer。将酶切完成后产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
表4 酶切鉴定
Figure BDA0002586516870000053
Figure BDA0002586516870000061
(12)测序鉴定：将酶切鉴定结果正确的质粒做胶回收，并送往擎科公司测序。
2.构建pGEX-GST-6T-1-SSⅢ质粒
(1)连接pMD19-T Vector的SSⅢ基因和pGEX-GST-6t-1-SSⅢ载体通过相同的EcoRI和XhoI酶切后产生相同的粘性末端，使用T4 DNA连接酶能够将两者有效的连接在一起。
(2)pGEX-GST-6t-1-SSⅢ表达载体的酶切与目的基因的酶切保持一致。
(3)重组质粒载体的鉴定。
3.重组蛋白在Coli strain BL21(DE3)中的诱导表达
(1)将质粒转化入Coli strain BL21(DE3)，在含抗生素50μg/ml kanamycin和75μg/ml spectinomycin的双抗Kornberg平板上培养过夜筛选。
(2)挑取单克隆，进入100ml的LB培养基中(包含50μg/ml kanamycin和75μg/mlspectinomycin)，37℃，250rpm过夜培养。
(3)按照1:100的比例将菌液接种于1L的LB培养基中(包含50μg/mL kanamycin和75μg/mLspectinomycin)，37℃，250rpm培养，直到OD600＝0.5-0.6(大约2.5小时)，加入0.2mM isopropyl-D-thiogalactoside(IPTG)和0.02mg/mLnalidixic acid,在23℃，250rpm诱导培养6.5小时；6℃，5000g,离心10minutes收集菌，存于-80℃。
4.粗蛋白的制备与纯化
(1)将存于-80℃的细胞放于冰上解冻，每1L菌中加入8mL HQ-A buffer(50mMKH2PO4 PH7，5mMMgCl2,0.5mMEDTA)和0.0143g蛋白抑制剂。
(2)用涡旋震荡器震荡，在使用French Press破菌之前，保证所有细胞都被悬浮；将破碎的菌液16,000rpm，4℃离心20分钟；转移上清至一个50-150m的烧杯，放在磁力搅拌器上。
(3)取出10μL，将样品稀释1000倍，使用Bio-rad蛋白浓度测定试剂，用BSA做蛋白浓度标准曲线，测定其蛋白浓度，同时测定其活性。
(4)通过加入适量的HQ-A buffer,调整蛋白浓度，使其为30mg/mL(蛋白浓度对后面的盐析的成功非常重要)；加入0.3倍体积的硫酸鱼精蛋白溶液，轻轻的搅拌20分钟，然后16,000rpm，4℃离心20分钟。
(5)转移上清至一个干净的烧杯，取出10μL，稀释50倍，测定其浓度和活性，大约获得粗蛋白的50～60％；加入硫酸铵至45％的饱和度(25.8g/100mL溶液)，轻轻搅拌20分钟，16,000rpm，4℃离心20分钟。
(6)丢掉上清，将沉淀悬浮于1mL的HQ-A buffer中，取出10μL稀释100倍，测定其浓度和活性，大约能获得粗蛋白的10-15％；将样品存于-80℃。
5.蛋白SDS-PAGE电泳：
表5 SDS-PAGE凝胶配制
Figure BDA0002586516870000071
(1)制备聚丙烯酰胺凝胶：将玻璃板洗净，水不挂壁为准，晾干，底边和两侧对齐，两侧加紧，立于制胶架上。根据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶，沿玻璃板上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中，待分离胶聚合、凝固后，将浓缩胶溶液也沿玻璃板左上角注入后立即插入梳子。
(2)蛋白样品的处理:将待分离的蛋白样品与样品缓冲液按4:1比例混合(50～100μg蛋白)，沸水煮沸10min，立即插入碎冰中备用。
(3)上样及电泳：将制备好的凝胶(带着梳子)小心从制胶架上取下，放置于电泳槽槽中，将电泳缓冲液注入电泳槽中，缓慢拔出梳子。吸取处理好的蛋白样品20～30μL点样。
(4)打开电源，选择稳压模式电泳(也可选择恒流电泳)，100～150V工作电压。待溴酚蓝到达分离胶底部时(约1h后)停止电泳。
6.制备并纯化抗体
将纯化好的蛋白完全佐剂混合乳化，使目的蛋白浓度为1g/L，作为免疫原，按每只新西兰大白兔每次1mL剂量，背部脊柱两侧6点以及腹股沟注射，共8点，首次免疫皮内注射，以后皮下注射，每次间隔14天，每次剂量与第一次相同，与弗氏不完全佐剂混合乳化，共加强免疫5次。第3次免疫后进行试血，于第5次免疫后第8天颈动脉插管收集全血，分离血清，补体灭活，加入叠氮钠分装，-80℃冷冻保存。
(1)制备SSⅢ抗体：将纯化好的SSⅢ蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化，使SSⅢ蛋白浓度为1g/L，作为免疫原，按每只兔每次1mL剂量，背部脊柱两侧6点以及腹股沟注射，共8点，首次免疫皮内注射，以后皮下注射，每次间隔14天，每次剂量与第一次相同，与弗氏不完全佐剂混合乳化，共加强免疫3次。第2次免疫后进行试血，于第3次免疫后第3天左右颈动脉插管收集全血，分离血清，补体灭活，加入叠氮钠分装，-80℃冷冻保存。
(2)纯化SSⅢ抗体：制备抗体吸附用的大肠杆菌全菌蛋白；诱导含有pGEX、2TGST表达载体的工程菌3h，于4℃以5 000r/min离心10min，回收菌体后用PBS重悬浮菌体，溶菌裂菌，超声裂菌。加入丙酮，室温静置30min沉淀蛋白，4℃，4 000r离心20min，回收蛋白质沉淀后加入100mmol/L NaCl重悬蛋白质沉淀，丙酮重复沉淀蛋白质1次，4℃，4000r/min离心20min，回收蛋白质沉淀37℃约24～48h直至蛋白质干燥。
(3)将蛋白质研磨成粉状，10mL PBS洗2次，回收蛋白质沉淀，加入PBS混悬蛋白质沉淀使每毫升混悬液含有0.1g蛋白质，分装并储存于-20℃。
(4)将l mL的多克隆抗血清与等体积的上述蛋白质混悬液混合，室温振荡3h后，12000r/min离心10min，收集上清，-80℃保存备用。
7.检验抗体特异性
采用western blot检测。提取不同授粉时间的胚乳15D、20D、25D的蛋白，进行western blot杂交实验，进一步验证抗体的特异性。
(1)SDS-PAGE电泳：将玻璃板洗净,底边和两侧对齐，两侧加紧,立于制胶架上，根据配方配制分离胶,沿玻璃板上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中,待分离胶聚合、凝固后,将浓缩胶溶液也沿玻璃板左上角注入后立即插入梳子；按照所需蛋白总量40μg和玉米胚乳蛋白浓度计算所需品胚乳蛋白体积，加入2μL Loading Buffer，添加PBS至10μL,放入沸水中煮10min，离心机10000r/min，5min；将制备好的凝胶(带着梳子)从制胶架上取下,缓慢拔出梳子,置于电泳槽槽中,将电泳缓冲液注入电泳槽中。吸取处理好的蛋白样品10μL和1.5μL的180广谱蛋白进行点样，打开电源,设置电流为30mA，电压90v电泳。待蛋白条带到达分离胶底部时停止电泳。
(2)转膜：将10X的转膜液稀释10倍于干净的盆中，把滤纸板、nc膜、海绵浸泡其中，取出PAGE胶裁至与nc膜大小相适(小于或等于nc膜)，依次放置，排除气泡，放入转膜仪，向仪器中加满转膜液；取足量冰块铺于转膜仪四周及底面，调电流为200mA开始转膜。
(3)封闭液孵育：配制封闭液(0.5g奶粉+10mLTBST放在常温慢速摇床上摇10min)，取出nc膜，先用TBST清洗，置于常温慢速摇床5min，以封闭液孵育1h，回收封闭液，再以TBST清洗nc膜2至3次。
(4)一、二抗孵育及成像：配制一抗，按照封闭液/兔血清＝5000/1至500/1的比例，在4度摇床上过夜孵育nc膜，取出后以TBST清洗2至3次，回收一抗；配制二抗，封闭液/鼠抗＝10000/1的比例，在常温摇床上慢速孵育1h，取出，以TBST清洗2至3次，回收二抗；加入显影液，充分浸湿nc膜，利用照胶仪显影成像。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 474
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 1
Gly Gly Ile Tyr Asp Asn Arg Asn Gly Leu Asp Tyr His Ile Pro Val
1 5 10 15
Phe Gly Ser Ile Ala Lys Glu Pro Pro Met His Ile Val His Ile Ala
20 25 30
Val Glu Met Ala Pro Ile Ala Lys Val Gly Gly Leu Gly Asp Val Val
35 40 45
Thr Ser Leu Ser Arg Ala Val Gln Asp Leu Gly His Asn Val Glu Val
50 55 60
Ile Leu Pro Lys Tyr Gly Cys Leu Asn Leu Ser Asn Val Lys Asn Leu
65 70 75 80
His Ile His Gln Ser Phe Ser Trp Gly Gly Ser Glu Ile Lys Val Trp
85 90 95
Arg Gly Leu Val Glu Gly Leu Cys Val Tyr Phe Leu Glu Pro Gln Asn
100 105 110
Gly Met Phe Gly Val Gly Tyr Val Tyr Gly Arg Asp Asp Asp Arg Arg
115 120 125
Phe Gly Phe Phe Cys Arg Ser Ala Leu Glu Phe Leu Leu Gln Ser Gly
130 135 140
Ser Ser Pro Asn Ile Ile His Cys His Asp Trp Ser Ser Ala Pro Val
145 150 155 160
Ala Trp Leu His Lys Glu Asn Tyr Ala Lys Ser Ser Leu Ala Asn Ala
165 170 175
Arg Val Val Phe Thr Ile His Asn Leu Glu Phe Gly Ala His His Ile
180 185 190
Gly Lys Ala Met Arg Tyr Cys Asp Lys Ala Thr Thr Val Ser Asn Thr
195 200 205
Tyr Ser Lys Glu Val Ser Gly His Gly Ala Ile Val Pro His Leu Gly
210 215 220
Lys Phe Tyr Gly Ile Leu Asn Gly Ile Asp Pro Asp Ile Trp Asp Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Asp Asn Phe Ile Pro Val His Tyr Thr Cys Glu Asn Val Val
245 250 255
Glu Gly Lys Arg Ala Ala Lys Arg Ala Leu Gln Gln Lys Phe Gly Leu
260 265 270
Gln Gln Ile Asp Val Pro Val Val Gly Ile Val Thr Arg Leu Thr Ala
275 280 285
Gln Lys Gly Ile His Leu Ile Lys His Ala Ile His Arg Thr Leu Glu
290 295 300
Arg Asn Gly Gln Val Val Leu Leu Gly Ser Ala Pro Asp Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gln Ala Asp Phe Val Asn Leu Ala Asn Lys Leu His Gly Val Asn His
325 330 335
Gly Gln Val Arg Leu Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Pro Leu Ser His Leu
340 345 350
Ile Tyr Ala Gly Ser Asp Phe Ile Leu Val Pro Ser Ile Phe Glu Pro
355 360 365
Cys Gly Leu Thr Gln Leu Val Ala Met Arg Tyr Gly Thr Ile Pro Ile
370 375 380
Val Arg Lys Thr Gly Gly Leu Phe Asp Thr Val Phe Asp Val Asp Asn
385 390 395 400
Asp Lys Glu Arg Ala Arg Asp Arg Gly Leu Glu Pro Asn Gly Phe Ser
405 410 415
Phe Asp Gly Ala Asp Ser Asn Gly Val Asp Tyr Ala Leu Asn Arg Ala
420 425 430
Ile Ser Ala Trp Phe Asp Ala Arg Ser Trp Phe His Ser Leu Cys Lys
435 440 445
Arg Val Met Glu Gln Asp Trp Ser Trp Asn Arg Pro Ala Leu Asp Tyr
450 455 460
Ile Glu Leu Tyr Arg Ser Ala Ser Lys Leu
465 470
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaattcggtg gaatttatga taacag 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgacttac aatttggacg ctgaac 26
<210> 4
<211> 1425
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 4
ggtggaattt atgataacag aaatgggtta gactatcata ttcctgtttt tgggtcaatt 60
gcaaaggaac cacctatgca cattgtccac atcgctgttg agatggcacc aatcgcaaag 120
gttggaggtc ttggtgatgt tgtcactagt ctttcacgtg ctgtgcaaga tttaggacac 180
aatgtggagg ttattcttcc aaagtacggt tgcttgaatc taagcaatgt caagaatcta 240
cacatccatc agagtttttc ttggggtggt tctgaaataa aagtgtggcg tggactagtc 300
gaaggccttt gtgtttactt cctggaacct caaaatggga tgtttggagt cggatatgta 360
tatggcaggg acgatgaccg ccgatttggc ttcttctgtc gttctgctct agagtttctc 420
ctccaaagtg gatcttctcc taacataata cattgccatg attggtcaag tgctcctgtt 480
gcctggctac acaaggaaaa ctacgcgaag tctagcttgg caaatgcacg ggtggtattc 540
accatccaca atcttgaatt tggagcgcat catattggca aagcaatgag atattgtgat 600
aaagccacaa ctgtctctaa tacatattca aaggaagtgt caggtcatgg tgccatcgtt 660
cctcatcttg ggaaattcta tggcattctc aatggaattg atccggatat atgggatccg 720
tacaatgaca actttatccc ggtccactac acttgtgaga atgtggttga aggcaagagg 780
gctgctaaga gggcactgca gcagaagttt gggttacagc aaattgatgt ccccgtcgta 840
ggaatcgtca ctcgcctgac agcccaaaag gggatccacc tgatcaagca tgcgattcac 900
cgtacactcg aacggaacgg acaggtggtt ttgcttggtt cagcgccgga ctctcgaatc 960
caagctgatt ttgtcaacct ggcgaataag ctccacggcg taaaccatgg gcaagtgagg 1020
ctttccttga cctacgacga gcctctctcg catctgatat acgctggctc tgacttcatt 1080
ctggtcccat ctatatttga gccttgcggc ctaactcagc tcgtcgccat gcggtatggg 1140
accatcccga ttgtccgcaa gactggaggg ctcttcgaca ctgtcttcga tgtggacaat 1200
gacaaggaac gagcccgaga tcgaggcctt gagcccaacg ggtttagctt tgacggagct 1260
gatagcaacg gtgttgacta cgcgctgaac agggcgatct cagcttggtt cgatgcccgg 1320
agctggttcc actccctttg caagagagtc atggagcagg actggtcgtg gaaccgacct 1380
gccctcgact acatcgagct ctaccgttca gcgtccaaat tgtaa 1425

Claims (6)

1.用于制备玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，用SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白免疫动物，然后从动物体内分离得到多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的玉米淀粉合成酶SSⅢ的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)目的核酸片段的扩增：提取玉米胚乳RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，以SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示的引物对为引物进行PCR扩增，得到玉米淀粉合成酶SSⅢC段1200位-1675位氨基酸对应的核酸片段，所述核酸片段序列如SEQ ID No.4所示；
(2)原核表达载体的构建；
(3)重组表达菌株的构建；
(4)蛋白的诱导表达及纯化；
(5)动物的免疫和血清的分离。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增的体系为：
Figure FDA0002586516860000011
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，34个循环；72℃后延伸10min，12℃，2min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，原核表达载体的构建的具体方法为：将步骤(1)得到的核酸片段与T载体连接，得到原核表达载体。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，蛋白的诱导表达及纯化的具体步骤为：将步骤(4)纯化后的蛋白与佐剂混合，200μg蛋白与佐剂混合乳化到1mL，免疫新西兰大白兔，每隔2周免疫1次，连续免疫四次，分离血清，所述纯化后的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
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