CN114606171A

CN114606171A - 一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN114606171A
Application number: CN202210300902.1A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 石书琪; 陈勇; 孙文俊; 李国雄; 赵伟; 陈天鹏; 余斌
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-03-24
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明公开了一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，本发明通过敲除bluR基因，解除了蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，同时对菌株的生长能力、发酵能力没有产生影响，并将蓝光影响生物膜形成相关基因进行验证。探究其在生物膜形成中的应用，为后续光遗传学工具的利用奠定了基础。

Description

一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

苏氨酸(L-threonine)是人体所必需的八种氨基酸中的之一。苏氨酸在人体内和动物体内不能合成，但是在生命过程中发挥重要的作用。现如今，L-苏氨酸已经成为了继甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸以外第四种重要的氨基酸。在食品产业、医疗制药行业和化妆品行业中L-苏氨酸已被广泛应用，需求量逐年增加。在食品行业中，L-苏氨酸作为一种食品添加剂，主要用作食品强化剂，提高食品中的营养成分，补充被破坏的营养元素，同时，L-苏氨酸用于人们常食用的糕点、乳化食品和牛奶之中，发挥抗氧化作用，并且L-苏氨酸与葡萄糖可以发生反应产生巧克力香味和焦香味道，可以用作食品的增香剂。L-苏氨酸在医疗行业领域中可以存进T淋巴细胞成熟发育，也可以提高人体免疫功能。L-苏氨酸除了是重要的食品强化剂外，也是一种重要的饲料添加剂，主要添加到家禽和猪饲料之中。

光对大肠杆菌生物膜的形成是有影响的。环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中形成的第二信使，参与大肠杆菌运动性、生物膜形成、毒力、细胞周期等有关。c-di-GMP由双鸟苷酸环化酶合成，并被磷酸二酯酶降解.这两种酶分别含有GGDEF(Gly-Gly-Asp-Glu-Phe)和EAL(Glu-Ala-Leu)结构域。除了LOV蛋白是蓝光感受器外，还包括光活性黄色蛋白(PYP)和FAD(BLUF)结构域蛋白的蓝光感应器。其中BLUF-EAL蛋白BluF(YcgF)与是大肠杆菌的感知蓝光蛋白，能够直接拮抗另一蓝光感应蛋白BluR(YcgE)，在蓝光的作用下，通过双组分信号通路，不仅控制调节大肠杆生物膜调节器CsgD，调节卷曲菌毛的合成，还通过Ymg/Rcs途径控制糖类表面成分colanic acid，调控生物膜的形成和功能。因此，BLUR蛋白在大肠杆菌中，通过蓝光调节转录因子活性，控制大肠杆菌生物膜的形成。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述敲除bluR基因的重组大肠杆菌的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌，在出发菌中敲除bluR基因。

其中，所述bluR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种发酵产L-苏氨酸的方法，利用上述重组大肠杆菌发酵产L-苏氨酸。

其中，所述重组大肠杆菌按照8％～12％的体积比接入到发酵培养基中。

其中，所述发酵的发酵培养基为30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/L KH₂PO₄，22g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L MnSO₄·5H₂O，0.02g/L FeSO₄·7H₂O。

其中，所述发酵为游离发酵。

其中，所述发酵的温度为30～44℃。

其中，所述发酵为在黑暗中进行发酵或在蓝光的条件下进行发酵。

其中，所述蓝光的波长为450～480nm。

其中，所述蓝光的光照度为500～1300lux。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

L-苏氨酸是人体最重要的氨基酸之一，它的需求是由于其在食品，化学和制药行业的广泛应用而急剧增加。目前，微生物发酵已广泛用于工业以大肠杆菌为最佳候选菌株生产L-苏氨酸。微生物的发酵过程与生物膜的形成密切相关。近年来，有研究人员发现，光对大多数微生物的生活方式存在影响，光遗传学工具的有效使用也成为微生物研究中的一大热点。然而，蓝光对大肠杆菌生物膜的形成存在抑制作用，进而减少大肠杆菌的发酵产量。本发明通过敲除bluR基因，解除了蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，同时对菌株的生长能力、发酵能力没有产生影响，并将蓝光影响生物膜形成相关基因进行验证。探究其在生物膜形成中的应用，为后续光遗传学工具的利用奠定了基础。。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为sgRNA与Donor DNA的构建。

图2为大肠杆菌w1688-pCas构建。

图3为bluR敲除的电泳结果。

图4为菌株在无抗LB固体培养基与含有Kan的LB固体培养基中划线培养的结果。

图5为结晶紫染色。

图6为结晶紫染色读数。

图7为Swarming。

图8为原始菌对应的RT-qPCR。

图9为发酵性能比较。

图10为构建pTarget突变质粒。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1构建bluR敲除菌株

1、提取质粒

(1)将E.coli DH5α甘油菌(含质粒pTarget与pCas)接于液体LB(卡那抗性浓度：50μg/mL)，37℃培养12小时。

(2)收集上一步骤所培养的细胞，离心，去上清。

(3)依照Takara试剂盒(9760)质粒提取试剂盒，提取出质粒pTarget与pCas。

2、制备W1688化学感受态

(1)将大肠杆菌W1688划线培养后，在液体LB中进行活化。

(2)取活化好的菌液1mL转接100mL液体LB，培养至OD600约为0.6后，分装菌液，冷却至0℃，离心，弃上清。

(4)每管加入预冷的0.1M的氯化钙5mL重悬细胞，插入冰中冷却20min，然后4℃、4000rpm离心10min，弃去上清。

(5)重复步骤(4)，插入冰中静置30min。

(6)加入2.5mL 0.1M预冷的氯化钙和2.5mL 30％预冷的甘油轻轻重悬细胞后置于冰上5min。

(7)分装至无菌的1.5mL离心管，每管100μL。

3、将pCas质粒导入大肠杆菌W1688

(1)取10μL pCas质粒加入到100μL冰上解冻的大肠杆菌W1688化学感受态中，混匀后于冰上静置30min。

(2)42℃水浴热激90s，冰中冷却2min。

(3)加入900μL无抗液体LB，30℃摇菌1h。

(4)5000rpm离心6min，弃800μL上清，剩余液体重悬菌体，涂于LB固体平板(Kan 50μg/mL)，30℃倒置培养12h。

(5)挑取单菌落提质粒并酶切验证，酶切体系：1μL XbaI、1μL XhoI、7μL质粒、1μL10×QuickCut Buffer，37℃反应1h。

(6)验证正确后保藏带有pCas质粒的大肠杆菌W1688-pCas。

4、制备W1688-pCas的电转感受态

(1)将大肠杆菌W1688-pCas涂布于LB固体平板上(Kan 50μg/mL)，30℃培养12h。

(2)挑取单菌落与含有相应抗性的液体LB中30℃培养12h，并取5mL活化后的菌液接于50mL含有相应抗性的培养基中培养至OD600约为0.2后，加入1M的L-阿拉伯糖1.5mL，继续培养至OD600约为0.6后，将培养液转入50mL离心管中，每管装25mL，插入冰中冷却20min。

(3)4℃下5000rpm离心10min，收集细胞；弃上清，用25mL预冷的无菌水重悬细胞；重复一遍该步骤。

(4)弃上清，用20mL预冷的10％甘油重悬，4℃下5000rpm离心10min；

(5)弃上清，用初始菌液体积的3‰预冷的10％甘油重悬细胞，以每管50μL分装于预冷的1.5mL离心管中，-80℃保存。

5、构建突变pTarget质粒

(1)找出待敲除基因的N20序列(不在上下同源臂内)，设计的引物序列包含需要突变的20bp，然后对整个pTarget质粒进行PCR，将整个环状质粒PCR成线性。PCR引物序列、测序验证序列如表1所示；

表1用于构建突变pTarget质粒的引物序列

(2)PCR结束之后，用DpnI对产物进行消化，37℃反应2h。消化体系：QuickCut DpnI1μL、10×QuickCut Buffer 1μL、无菌水1μL、步骤1中PCR产物7μL。

(3)冰上解冻E.coli T1感受态细胞，取10μL反应物至100μL感受态，混匀，插入冰中20min。

(4)于水浴锅中42℃热激90秒，立刻置于冰中冷却，2min；加入900μL LB。37℃培养1h.

(5)5000rpm离心4min，去除800μL培养基，剩余培养基重悬菌体后，涂布于含40μg/mL链霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。

(7)挑取(6)中的单一菌落于含有相应抗性液体LB中活化后提质粒送测序，测序引物见上表1。若质粒突变，则构建成功。

6、构建Donor DNA

选取待敲除基因两端基因作为上下同源臂(不少于500bp，中间少去的部分即为敲除的基因)，设计引物分别将上下同源臂PCR，所需引物如表2所示。PCR体系为10×PCRbuffer 100μL，dNTPs 40μL，无菌水40μL，上游引物6μL，下游引物6μL，基因组模板4μL，KOD酶4μL。PCR的条件为：变性温度98℃，时长2min；退火温度60℃，时长30s；延伸温度68℃，1min/1kb，35个循环。胶回收后使用Overlap PCR将上下游同源臂连接起来即得到用于修复的Donor DNA片段。Overlap PCR结束后进行胶回收得到Donor DNA片段。sgRNA与DonorDNA的构建见图1。

表2用于构建Donor DNA的引物序列

7、基因敲除

(1)冰上融化W1688-pCas电转感受态细胞

(2)将10pTarget和Donor DNA片段(Donor DNA：pTarget＝5:1pTarget＝100ng/μL)加入到上述感受态，混匀，置于冰上1min；放入预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min。

(4)将电转仪的电压设为2500V，电击5-6ms，加入1ml LB培养基，在30℃、250rpm条件下培养2h后，涂布至含50μg/mL Kan和40μg/mL S的双抗LB平板上并于30℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，验证引物如表3所示，若敲除成功，则应该出现和Donor DNA条带大小一样的片段。将片段送去测序，若和Donor一样，则确定敲除成功。

表3用于验证的引物序列

(6)将步骤(5)中验证正确的菌株于无抗液体LB中30℃培养，培养至对数期后加入IPTG，使其终浓度为0.5mM，30℃诱导10h，pTarget质粒丢失。此时菌株可在含Kan的LB中生长，不可在同时含Kan和S的LB中生长则pTarget成功丢失。接着将pTarget成功丢失的菌株于LB培养基37℃过夜培养后同时涂布于无抗LB和含Kan的LB平板，此时大肠杆菌在无抗平板上生长，含Kan的平板上不生长则pCas质粒丢失成功。此时得到完全不留痕迹的重组菌株，进行保菌。

结果：

将质粒pCas热激转化到大肠杆菌W1688感受态中，30℃培养，挑取Kan平板上的单菌落培养后提质粒。然后经过XbaI、XhoI双酶切验证，pCas质粒12545bp，质粒条带大小正确，大肠杆菌W1688-pCas菌株构建成功。pCas电泳如图2，第一泳道为10000kb DNA marker，第二、三泳道为pCas质粒。

pTarget质粒大小为2118bp，设计引物对其进行PCR，将环状质粒PCR成线性后，再经过DpnI对产物进行消化，主要是消除质粒模板。然后将消化产物转入E.coli T1感受态细胞环化后提质粒验证，如图10所示，质粒提取成功，送去测序，证明pTarget质粒构建成功。第1条带为5000DNA marker，第2.3条带为突变pTarget条带2118bp(含有bluR基因N20片段)。

如图3，第1泳道为2000bp DNA marker，第2泳道为5000bp DNA marker.，基因bluR敲除成功后长度为1200bp，对应第3-8泳道亮带，原始菌为1932bp；由此可见bluR敲除成功，可以进行下一步实验。

如图4，将菌株在无抗LB固体培养基与含有Kan(50μg/mL)的LB固体培养基中划线培养37℃过夜培养，以丢失质粒pCas。左图为无抗LB平板，在该平板上菌株能够生长；右图为含有Kan(50μg/mL)的LB平板，在该平板上菌株不生长，证明pCas质粒成功丢失。·

实施例2生物膜表征

1. 96孔板结晶紫染色

本实验采用结晶紫染色法对比2株目的菌在蓝光与黑暗条件下的生物膜相对表达。因此，我们在96孔板中，对这2株菌株进行成膜验证。

(1)把2株菌在37℃、200rpm培养至对数期(OD600约为0.6)。

(2)将菌液稀释至OD600为0.1，96孔板中加入180μL的LB液体培养基，然后将20μL稀释后菌液接入到培养基中，37℃下分别与蓝光与黑暗中静置培养24h，使大肠杆菌在96孔板底部成膜。

(3)倒掉LB液体培养基，用PBS冲洗2-3遍后，用多聚甲醇固定生物膜15分钟后，倒掉甲醇，加入0.1％的结晶紫染色20分钟。

(4)倒掉结晶紫，用PBS冲洗，加入33％的冰醋酸并于振荡器轻微震荡30分钟，使结晶紫脱色溶解。

(5)利用酶标仪在OD570下进行读数。

2.swarming平板泳动

将过夜培养的菌株稀释到OD600＝1后点swarming泳动平板，此平板包含20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20g/L氯化钠，0.3％的琼脂粉，点好后的平板于37℃静置培养12h后取出观察。

3.RT-qPCR

(1)将W1688菌株在LB培养基中37℃，200rpm培养至对数生长期，取200μL菌液及1800μL LB培养基至24孔板中，分别于蓝光与黑暗条件下，37℃静置培养24h。

(2)洗去孔板中的菌液，4℃，12000rpm，离心2min，收集菌体，去上清。提取RNA根据天根细菌RNA提取试剂盒(DP430)中的革兰氏阴性细菌的提取步骤进行操作，将RNA提取完成后，进行跑胶验证。

(3)验证成功后使用诺唯赞公司的

II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(R223-01)，将RNA逆转录成为cDNA。以W1688菌株在黑暗条件与蓝光条件下的cDNA为模板，16s RNA为内参基因，使用诺唯赞公司的

qPCR

GreenMaster Mix(Q141-02)酶进行qPCR操作。

4.结果分析

图5和图6结晶紫结果表明，在黑暗条件下，两株菌的成膜量大致相同，在蓝光条件下原始菌W1688的成膜量减少了64.82％，△bluR则并无明显改变。图7可以观察到在蓝光条件下原始菌浮游能力减弱，改造菌没有改变，这些都是改造菌株解除了蓝光对生物膜形成抑制的表现。图8中RT-qPCR结果表明，蓝光抑制了原始菌株W1688中与生物膜形成相关基因的表达，说明了蓝光对大肠杆菌的生物膜的形成确实存在抑制作用。

实施例3目的菌株发酵产L-苏氨酸性能研究

1.恢复菌株活力

取保菌管，置于冰盒中等待解冻，解冻后，取适量菌液接入LB摇管，37℃恒温培养。

2.接发酵液

(1)在100mL摇瓶中加入已经恢复活力的菌液1mL，放入37℃培养箱恒温培养12h。

(2)将100mL发酵培养基倒入500mL三角烧瓶中，取10mL步骤1中培养完成的菌液接入三角烧瓶中。

(3)于37℃的摇床中进行恒温发酵，每6小时检测发酵液中的残余葡萄糖量和L-苏氨酸产量；其中，所述发酵为在黑暗中发酵，或是在蓝光(波长450nm，光强500lux)的条件下发酵。

其中，所述发酵培养基各组分为：30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/L KH₂PO₄，22g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L MnSO₄·5H₂O，0.02g/L FeSO₄·7H₂O。

3.测定葡萄糖含量

取不同时间段的发酵液各2ml，离心，取上清液，稀释相应倍数后用测糖仪进行葡萄糖含量测定

4.L-苏氨酸产量测定

HPLC法测L-苏氨酸产量，使用Agilent 1260仪器，色谱柱使用Sepax AAA(4.6*250mm)，参数如下表4。

表4液相色谱参数

5.结果分析

表5

利用原始菌和本发明构建的重组菌通过一系列表征实验，最后进行发酵性能比较实验，从图9、表3、表4可以观察到，将bluR基因敲除后，菌株的发酵产量与发酵周期基本没有发生改变。综上，将bluR基因敲除后，不仅解除了蓝光对大肠杆菌生物膜形成的抑制，还对菌株的生长能力及发酵性能没有产生影响，为后续光遗传学工具的应用奠定了基础。

本发明提供了一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> bluR

<400> 1

gtggcttatt acagcattgg tgatgttgct gaacgttgcg ggattaatcc tgtcactctc 60

cgggcctggc aacgccgcta cggtttgtta aaaccacagc gcagtgaagg cggacaccga 120

ctctttgatg aagaagacat acaacgcatc gaagagatca agcgttggat aagtaatggc 180

gtccctgtag gcaaagttaa agcattactg gaaaccacca gccaggatac ggaagatgac 240

tggagccgcc tgcaagaaga gatgatgtca attcttcgca tggctaatcc tgccaaacta 300

cgcgcgagaa ttatttcact gggtcgagag tacccagtag atcaattgat taatcatgtt 360

taccttcctg ttcgccagcg tctcgtgctt gatcacaaca cctcccgcat tatgagcagt 420

atgtttgacg gcgcattaat tgaatacgca gcaacctcgc ttttcgaaat gcgccgtaag 480

cccggtaaag aagccattct gatggcgtgg aatgttgaag agagagcacg attgtggctg 540

gaagcatggc gtttatcatt gtcaggatgg cacatttctg ttcttgctga tcccattgaa 600

tcgccgcgcc cggaactgtt cccgacgcaa acattgattg tctggacagg catggcacca 660

acgagaaggc aaaacgaact tttacaacac tggggtgagc aaggttataa agtcatcttt 720

catgccccct aa 732

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> bluR-sg-F

<400> 2

aacgaacttt tacaacactg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagt 59

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> bluR-sg-R

<400> 3

cagtgttgta aaagttcgtt actagtatta tacctaggac tgagctagct g 51

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> bluR-up-F

<400> 4

attttggcgc aggttttgct 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> bluR-up-R

<400> 5

aattcctcct tgcggtcaca aatc 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> bluR-dn-F

<400> 6

tttcaccttt atcccgcccc t 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> bluR-dn-R

<400> 7

cgcctgccag tgttgaaca 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> bluR check-F

<400> 8

atgctctggt gcctgaacaa at 22

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> bluR check-R

<400> 9

attatcaatg gcgtagtaac tgcgtt 26

Claims

1.一株敲除bluR基因的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌中敲除bluR基因。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述bluR基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

3.一种发酵产L-苏氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求2所述重组大肠杆菌发酵产L-苏氨酸。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌按照8％～12％的体积比接入到发酵培养基中。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基为30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/L KH₂PO₄，22g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L MnSO₄·5H₂O，0.02g/LFeSO₄·7H₂O。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～44℃。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述发酵为在黑暗中进行发酵。

8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述发酵为在蓝光的条件下进行发酵。

9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述蓝光的波长为450～480nm。

10.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述蓝光的光照度为500～1300lux。