CN111491945A

CN111491945A - cAMP受体蛋白变体和使用其生产L-氨基酸的方法

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Publication number: CN111491945A
Application number: CN201980004431.6A
Authority: CN
Inventors: 丁起龙; 柳慧连; 徐昌一; 李在旼; 曹承铉
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2039-07-25
Also published as: RU2746860C1; EP3686214A4; JP6940690B2; ZA202000594B; WO2020111436A1; MX2021004704A; CN111491945B; EP3686214A1; PH12020500115A1; MY202137A; KR101996767B1; US11512331B2; BR112020002107A2; JP2021509574A; US20210388402A1

Abstract

提供了cAMP受体蛋白变体、包括该变体的微生物以及使用该变体生产L‑氨基酸的方法。

Description

cAMP受体蛋白变体和使用其生产L-氨基酸的方法

技术领域

本公开内容涉及cAMP受体蛋白变体、包括其的微生物以及使用其生产L-氨基酸的方法。

背景技术

CRP(环AMP受体蛋白)，也称为CAP(分解代谢物激活蛋白)，是大肠杆菌中最知名的转录调节子。CRP的特征在于具有碳源依赖性调节机制，其以“分解代谢物抑制”为代表。此作用由细胞内的环AMP(在下文中，称为“cAMP”)浓度触发。在优选碳源例如葡萄糖的存在下，腺苷酸环化酶的活性被抑制以降低cAMP，并且该信号抑制分解代谢基因的表达。在相反的情况下，腺苷酸环化酶的活性增加，结果是，阻遏物被抑制并且分解代谢基因的表达开始。此外，已知CRP起到多种作用，例如通过cAMP的细胞内信号传导、渗透调节、对细胞紧急情况的应答、生物膜生成、固氮、铁转运等。

据报道，已知大肠杆菌的418个基因受CRP调控，但是相应的机制尚未清楚地揭示(J Biol Eng.(2009)24；3：13)。拥有如此广泛的调节能力，CRP有可能通过突变显示多种表型。由于其优点，已经研究了CRP作为适合在细胞水平上重新设计菌株的靶标，其适用于多种环境。近来，已经进行了多种实验，例如通过生物信息学选择的CRP的氨基酸变体改变DNA结合的程度以调节改变基因表达的方法(Nucleic Acids Research，(2009)37：2493-2503)，通过使用由锌指DNA结合位点和CRP融合制备的人工转录因子(ATF)选择耐热、耐渗透和耐低温的大肠杆菌的方法(Nucleic Acids Research，(2008)36：e102)，等等。换句话说，由于CRP表达的变化促进下游基因表达的多种多样的变化，因此CRP可能是用于制备具有有用性状的微生物的良好工具。

发明内容

技术问题

本发明人已经开发出一种新颖的蛋白变体，其包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，并且他们发现该蛋白变体可以提高L-氨基酸的生产率，从而完成本公开内容。

技术方案

本公开内容的目的是提供cAMP受体蛋白变体。

本公开内容的另一个目的是提供编码cAMP受体蛋白变体的多核苷酸。

本公开内容的甚至另一个目的是提供包括所述多核苷酸的载体。

本公开内容的甚至另一个目的是提供包括所述变体的埃希氏菌属的微生物。

本公开内容的甚至另一个目的是提供生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养埃希氏菌属的微生物。

本公开内容的甚至另一个目的是提供所述变体或包括所述变体的埃希氏菌属的微生物在L-氨基酸生产中的用途。

有利效果

当培养生产L-氨基酸的埃希氏菌属的微生物——该微生物包括本公开内容的cAMP受体蛋白变体——时，有可能高产量地生产L-氨基酸。因此，在工业方面，可以预期生产成本的降低以及生产的便利。

具体实施方式

以下将详细描述本公开内容。同时，在本公开内容中公开的每个描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。就是说，本公开内容中公开的多种元素的所有组合都落入本公开内容的范围内。进一步地，本公开内容的范围不受限于以下描述的具体描述。

为了实现以上目的，本公开内容的一个方面提供了cAMP受体蛋白变体，其包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。具体地，本公开内容提供了cAMP受体蛋白变体，其包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，其中该氨基酸取代包括赖氨酸取代从N-末端第33位上的氨基酸。更具体地，本公开内容提供了cAMP受体蛋白变体，其包括赖氨酸取代SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。

如本文所用，术语“cAMP受体蛋白(CRP)”是大肠杆菌中最知名的转录调节子，并且CRP也被称为“双重调节子”，因为CRP本身同时具有激活剂和抑制剂的功能。CRP通常与具有结构基因上游的22个碱基的对称DNA序列结合以诱导DNA弯曲，并且CRP通过允许C-末端的第一个活性位点和N-末端的第二个活性位点与负责转录的RNA聚合酶相互作用来充当激活剂，并且其通过提前占据位置来阻止活性蛋白与活性位点结合，或者通过结合活性蛋白以使结构转变为不与活性位点结合的结构来充当抑制剂。cAMP受体蛋白是由crp基因编码的cAMP受体蛋白。

本公开内容的“cAMP受体蛋白(环AMP受体蛋白，CRP)”可以与分解代谢物激活蛋白(CAP)、CRP蛋白、CAP蛋白等互换使用。

在本公开内容中，可以从NCBI的已知数据库GenBank中获得CRP的序列。例如，CRP可以是来源于埃希氏菌属(Escherichia sp.)的CRP，更具体地，是包括由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的多肽/蛋白质，但不限于此。进一步地，包括而不限于具有与上述氨基酸序列相同活性的序列。进一步地，可以包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有80％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，氨基酸可包括SEQ ID NO：1的氨基酸和具有与SEQ ID NO：1至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性的氨基酸。进一步地，很明显，具有其一部分被缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质可以在本公开内容的范围内，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性，并显示出与上述蛋白质相应的功效。

如本文所用，术语“变体”是指多肽，其中一个或多个氨基酸在保守的取代和/或修饰方面不同于所列举的序列，但保留了蛋白质的功能或性质。变体多肽通过几个氨基酸的取代、缺失或添加而不同于确定的序列。通常可以通过修饰上述多肽序列之一并评估修饰的多肽的性质来确定该变体。换句话说，与天然蛋白质的能力相比，变体的能力可以增加、不变或降低。通常可以通过修饰上述多肽序列之一并评估修饰的多肽的反应性来确定该变体。进一步地，一些变体可以包括其中已去除一个或多个部分例如N-末端前导序列或跨膜结构域的那些变体。其他变体可以包括其中已从成熟蛋白的N-和/或C-末端去除一部分的变体。

如本文所用，术语“保守取代”是指一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸所取代。该变体可以具有例如一种或多种保守取代，同时保留一种或多种生物学活性。这样的氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸。

进一步地，变体可以包括对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以在蛋白质的N-末端缀合至信号(或前导)序列，其共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。多肽也可以与其他序列或接头缀合，用于多肽的鉴定、纯化或合成。

如本文所用，术语“cAMP受体蛋白变体”是这样的cAMP受体蛋白变体，其包括在具有cAMP受体蛋白活性的多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，其中该氨基酸取代包括以另一个氨基酸取代N-末端第33位上的氨基酸。具体地，该变体可以包括这样的蛋白变体，其中另一个氨基酸取代了具有AMP受体蛋白活性的多肽的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。例如，蛋白变体可以包括这样的蛋白变体，其中变体发生在从SEQ ID NO：1的氨基酸序列N-末端的第33位上。更具体地，蛋白变体可以是这样的蛋白质，其中另一个氨基酸取代SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。“另一个氨基酸”不受限制，只要它是作为在第33位上的氨基酸的L-谷氨酰胺以外的氨基酸。具体地，变体可以是这样的蛋白质，其中碱性氨基酸取代了SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。该碱性氨基酸可以是L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸中的一种。更具体地，变体可以是这样的蛋白质，其中赖氨酸取代了SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸，但不限于此。

进一步地，变体是指这样的变体，其具有在上述SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列中从N-末端的第33位上的氨基酸的变异。

如本文所用，术语“cAMP受体蛋白变体”可以与变体CRP蛋白、CRP变体、变体cAMP受体蛋白、变体CAP蛋白、CAP变体、变体分解代谢物激活蛋白、分解代谢物激活蛋白变体等互换使用。

关于本公开内容的目的，与不包括cAMP受体蛋白变体的微生物相比，包括cAMP受体蛋白变体的微生物的特征在于具有高L-氨基酸生产率。与天然野生型或非变体cAMP受体蛋白相比，CRP变体的特征在于具有基因调节活性以增加L-氨基酸的生产率。这是有意义的，因为通过本公开内容的引入CRP变体的微生物可提高L-氨基酸的生产率。具体地，L-氨基酸可以是L-苏氨酸或L-色氨酸。然而，可以包括但不限于任何L-氨基酸，只要其可以通过引入或包括所述变体cAMP受体蛋白来生产。

cAMP受体蛋白变体可以是例如包括氨基酸序列的变体，其中另一个氨基酸取代了SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中第33位上的氨基酸——由SEQ ID NO：3组成的变体。其中赖氨酸取代SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中第33位上的氨基酸的变体可以由SEQ ID NO：3组成，但不限于此。进一步地，CRP变体可以包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与其具有80％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开内容的CRP变体可以包括具有SEQ ID NO：3的蛋白质和与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性的蛋白质。进一步地，很明显，具有除了在第33位上的氨基酸序列以外其一部分也缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质可以在本公开内容的范围内，只要氨基酸序列具有上述的同源性或同一性，并且显示出与上述蛋白质相应的功效。

换句话说，即使在本文中描述了“具有具体SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质”，很明显，具有其部分被缺失、修饰、取代、保守取代、或添加的氨基酸序列的蛋白质可以在本公开内容中使用，只要其具有与由相应SEQ ID NO.的氨基酸序列组成的蛋白质相同的活性或相对应的活性。例如，只要蛋白质具有与变体蛋白的活性相同或相对应的活性，则不排除在所述氨基酸序列之前和之后添加不改变蛋白质功能的序列、自然发生的突变、沉默突变或其保守取代。显然，即使该蛋白质具有这样的序列添加或突变，其也落入本公开内容的范围内。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指介于两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以用百分比表示。

术语“同源性”和“同一性”通常可以互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以与所用程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，同源的或同一的序列可以在中等或高度严格的条件下杂交，致使该序列的全长或至少约50％、60％、70％、80％或90％或更高的全长可以杂交。而且，考虑了在杂交中包含简并密码子代替密码子的多核苷酸。

可以使用已知的计算机算法例如“FASTA”程序，使用例如在Pearson等(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444中的默认参数，或使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277)(5.0.0版本或更高)(包括GCG程序软件包(Devereux,J.，等，Nucleic Acids Research 12：387(1984))的Needleman程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48：443-453)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，[S.][F.,][ET AL,J MOLECBIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，[ED.,]学术出版社，圣地亚哥，1994，和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)，测定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性。例如，可以使用美国生物技术信息数据库国家中心的BLAST或者ClustalW测定同源性、相似性或同一性。

如Smith和Waterman Adv.Appl.Math(1981)2：482所公开的，多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以例如通过使用GAP电脑程序(例如Needleman等(1970),J MolBiol.48:443)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的对齐符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者的符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(其包含用于同一性的值1，用于非同一性的值0)和Gribskov等(1986)Nucl.Acad Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编辑的Atlas Of ProteinSequence And Structure，美国国家生物医学研究基金会，pp.353-358(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)中所公开的；(2)对每个空位3.0的罚分，对每个空位的每个符号额外0.10的罚分(或空位开放罚分10，空位扩展罚分0.5)；(3)对于末端空位不罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”表示序列之间的相关性。

本公开内容的另一方面提供了编码CRP变体的多核苷酸，或包括所述多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有预定长度或更长的DNA或RNA链，其是通过经由共价键连接核苷酸单体而形成核苷酸的长链聚合物。更具体地，所述多核苷酸是指编码所述变体蛋白的多核苷酸片段。

编码本公开内容的CRP变体的多核苷酸可包括任何多核苷酸序列而没有限制，只要它是编码本公开内容的cAMP受体蛋白变体的多核苷酸序列。编码CRP变体的多核苷酸可包括任何序列而没有限制，只要它是编码所述变体蛋白的序列，其中另一个氨基酸取代了SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。具体地，多核苷酸可以是编码变体的多核苷酸序列，该变体中的赖氨酸取代了SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第33位上的氨基酸。例如，编码本公开内容的CRP变体的多核苷酸可以是编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多核苷酸序列，但不限于此。更具体地，多核苷酸可以由SEQ ID NO：4的多核苷酸序列组成，但不限于此。在多核苷酸中，由于密码子简并性或考虑到其中表达蛋白质的生物优选的密码子，可以在编码区进行多种修饰，条件是它们不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，很显然，由于密码子简并性，也可以包括这样的多核苷酸，该多核苷酸可翻译成由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽或与其具有同源性或同一性的多肽。

进一步地，也可以包括但不限于可以由已知的核苷酸序列生产的探针，例如，在严格条件下与互补序列杂交至全部或部分核苷酸序列的序列，以编码CRP变体，该变体中另一个氨基酸取代了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。

术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。此类条件在文献中有详细描述(例如，J.Sambrook等，见上文)。例如，严格条件可以包括，例如，具有高同源性或同一性、80％或更高、85％或更高、具体90％或更高、更具体95％或更高、更具体得多97％或更高、尤其具体99％或更高的同源性或同一性的基因彼此杂交，并且具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因不彼此杂交的条件，或Southern杂交的常规洗涤条件，即洗涤一次，具体地，在盐浓度和温度对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS的情况下，洗涤两次或三次，具体地，60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，和更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％SDS。

尽管由于杂交的严格性可能在核苷酸之间发生错配，但是需要两个核酸具有互补序列。术语“互补的”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开内容不仅可以包括基本上相似的核酸序列，而且包括与整个序列互补的分离的核酸片段。

具体地，可以使用杂交条件检测具有同源性或同一性的多核苷酸，该杂交条件包括在55℃的Tm值下的杂交和以上描述的条件。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以根据目的由本领域普通技术人员适当地控制。

多核苷酸杂交的适当严格性依赖于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域众所周知的(见Sambrook等，见上文，9.50-9.51，11.7-11.8)。

如本文所用，术语“载体”是指DNA构建体，其包括编码靶变体蛋白的多核苷酸的核苷酸序列，该靶变体蛋白可操作性地连接至适合的调控序列以使靶变体蛋白在适合的宿主细胞中表达。调节序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调节这种转录的任何操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列以及调节转录和翻译终止的序列。将载体转化入适合的宿主细胞后，它可以独立于宿主基因组复制或起作用，并可以整合到基因组自身中。

本公开内容中使用的载体没有具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、和pET型等。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

例如，可以使用用于细胞内染色体插入的载体，通过突变的多核苷酸代替在染色体中编码靶变体蛋白的多核苷酸。可以通过本领域已知的任何方法，例如同源重组，但不限于此，进行多核苷酸的染色体插入。可以进一步包括选择标记以确认染色体插入。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即，确认期望多核苷酸的插入，并且选择标记可以包括提供可选表型的标记，例如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒剂的抗性或表面修饰蛋白质的表达。由于仅有表达选择标记的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或表现出不同的表型，因此可以选择转化的细胞。作为本公开内容的甚至另一方面，本公开内容提供了生产L-氨基酸的微生物，该微生物包括所述变体蛋白或编码所述变体蛋白的多核苷酸。具体地，包括所述变体蛋白和/或编码所述变体蛋白的多核苷酸的微生物可以是通过用载体转化包括编码所述变体蛋白的多核苷酸而制备的微生物，但不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，以这种方式使由多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，它就可以整合并放置于宿主细胞的染色体中，或者它可以在染色体外存在，或者与其无关。进一步地，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。可以以任何形式引入多核苷酸，只要可以将其引入宿主细胞并在其中表达。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入宿主细胞，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是自我复制的表达载体的形式。此外，可以将多核苷酸原样引入宿主细胞中并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指编码本公开内容期望的变体蛋白的多核苷酸序列与启动和介导多核苷酸序列转录的启动子序列之间的功能性连接。

本公开内容的甚至另一方面提供了包括cAMP受体蛋白变体的埃希氏菌属(Escherichia sp.)的微生物。

如本文所用，术语“包括CRP变体的微生物”可以指表达本公开内容的CRP变体的重组微生物。例如，微生物是指这样的宿主细胞或微生物，其能够通过包括编码CRP变体的多核苷酸或通过以包括编码CRP变体的多核苷酸的载体转化而表达变体。关于本公开内容的目的，微生物是表达cAMP受体蛋白变体的微生物，该cAMP受体蛋白变体包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，并且微生物可以是表达具有cAMP受体蛋白质活性的变体蛋白的微生物，其中氨基酸取代是赖氨酸取代从N-末端第33位上的氨基酸，但不限于此。

包括CRP变体的微生物可以是任何微生物，只要它包括表达L-氨基酸的CRP变体，例如L-苏氨酸或L-色氨酸，但不限于此。例如，包括CRP变体的微生物可以是具有增加的L-氨基酸生产率的重组微生物，其通过在天然野生型微生物或生产L-氨基酸的微生物中表达CRP变体来制备。具有增加的L-氨基酸生产率的重组微生物可以是与天然野生型微生物或非修饰的微生物相比具有增加的L-氨基酸生产率的微生物，其中L-氨基酸可以是L-苏氨酸或L-色氨酸，但不限于此。

如本文所用，术语“生产L-氨基酸的微生物”包括野生型微生物或其中发生天然或人工遗传修饰的微生物，并且其可以是由于外源基因的插入或由于内源基因活性增强或失活而具有特别减弱或增强机制的微生物，该微生物中遗传变异发生或活性被增强以生产期望的L-氨基酸。关于本公开内容的目的，生产L-氨基酸的微生物可包括所述变体蛋白以具有期望的L-氨基酸增加的生产率。具体地，在本公开内容中生产L-氨基酸的微生物或具有L-氨基酸生产率的微生物可以是这样的微生物，其中涉及L-氨基酸生物合成途径的部分基因被增强或减弱、或者涉及L-氨基酸降解途径的部分基因增强或减弱。

“未修饰的微生物”是指原样的天然菌株、或不包括CRP变体的微生物、或未被包括编码CRP变体的多核苷酸的载体转化的微生物。“微生物”可以包括原核微生物和真核微生物中的任何一种，只要它能够生产L-氨基酸。例如，微生物可以包括埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗维登西亚菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的微生物。具体地，微生物可以是埃希氏菌属的微生物，和更具体地是大肠杆菌的微生物，但不限于此。

本公开内容的甚至另一方面提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养埃希氏菌属的微生物，生产L-氨基酸和包括cAMP受体蛋白变体的微生物。

术语“cAMP受体蛋白变体”和“L-氨基酸”与上述相同。

在方法中，培养微生物可以但不具体限于通过已知的分批培养、连续培养、分批补料培养等进行。在这方面，培养条件没有具体限制，但是可以通过使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)来维持最佳pH(例如pH 5至9，具体是pH 6至8，最具体是pH 6.8)。此外，可通过将氧气或含氧气体混合物引入细胞培养物中来维持有氧条件。培养温度可以保持在20℃至45℃，并且具体地在25℃至40℃。培养可以进行约10小时至约160小时，但不限于此。由上述培养物生产的L-氨基酸可被排泄到培养基中或保留在细胞内。

此外，作为碳源使用的培养基可以包括单独或组合的糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、葵花籽、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)，但不限于此。作为氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，但不限于此。作为磷源，可以单独或组合使用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及其相应的钠盐，但不限于此。进一步地，培养基可包括必需的刺激生长的物质，包括其他金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。

方法可进一步包括从微生物或培养基中收集L-氨基酸。

在本公开内容的培养中生产的L-氨基酸的收集方法可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液中收集期望的L-氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中收集期望的L-氨基酸。

进一步，收集可以包括纯化方法，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，要收集的L-氨基酸可以是包括L-氨基酸的微生物的纯化形式或发酵液(Introductionto Biotechnology and Genetic Engineering，A.J.Nair.，2008)。

本公开内容的甚至另一方面提供了cAMP受体蛋白变体在L-氨基酸生产中的用途，该cAMP受体蛋白变体包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。

本公开内容的甚至另一方面提供了埃希氏菌属微生物在L-氨基酸生产中的用途，该埃希氏菌属微生物包括cAMP受体蛋白变体。

术语“cAMP受体蛋白变体”和“L-氨基酸”与上述相同。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开内容。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅用于说明性的，并且本公开内容的范围并不旨在被这些实施例所限制。

实施例1.重组载体pCC1BAC-crp的制备

1-1.crp基因片段的制备

为了获得约0.96kb的包括crp基因和表达调控区的SEQ ID NO：5的DNA片段，使用Qiagen(公司)的Genomic-tip系统提取野生型大肠杆菌W3110的基因组DNA(gDNA)，使用gDNA为模板和PCR HL预混试剂盒(BIONEER公司制造，在下文中同样适用)进行PCR(聚合酶链式反应)。使用SEQ ID NOS：6和7的引物进行用于crp基因片段扩增的PCR，持续27个循环，该循环由95℃变性30秒、56℃退火30秒和72℃延伸2分钟组成。

用EcoR I消化PCR产物，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳和进行洗脱以获得0.96Kb的DNA片段(在下文中称为“crp片段”)。

[表1]

SEQ ID NO.	引物名称	序列(5’-3’)
			6	crp-F	CACGAATTCTTTGCTACTCCACTGCGTCA
7	crp-R	ACACGAATTCTTAACGAGTGCCGTAAACG

1-2.重组载体pCC1BAC-crp的制备

用EcoR I处理复制对照pCC1BAC载体(EPICENTRE，USA)，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳和进行洗脱以获得产物，然后将其与实施例1-1中获得的crp片段连接，从而制备pCC1BAC-crp质粒。

实施例2.重组载体pCC1BAC-crp变体文库的制备

2-1.通过易错PCR制备突变体crp片段

使用野生型大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板和clonetech的多样化PCR随机诱变试剂盒(目录号：K1830-1，表III，诱变反应4)进行PCR。详细地，使用实施例1-1中使用的SEQ ID NOS：6和7的引物进行PCR，持续27个循环，该循环由94℃变性30秒和在68℃延伸1分钟组成。

用EcoR I消化PCR产物，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳和进行洗脱以获得0.96Kb的突变的crp片段(在下文中，称为“crp^m片段”)。

2-2.重组载体pCC1BAC-crp变体文库的制备

用限制酶EcoR I处理载体pCC1BAC，然后用碱性磷酸酶(NEB)处理。将制备的载体与实施例2-1中获得的crp^m片段连接，并通过电泳将连接产物转化到TransforMax EPI300电感受态大肠杆菌(EPICENTRE，USA)中。将转化菌株在含有氯霉素的LB固体培养基(15ug/ml)上培养以选择菌落。收集由此获得的菌落并进行质粒制备，从而制备pCC1BAC-crp^m文库。

实施例3.将crp变体文库引入生产苏氨酸的菌株并选择生长改良菌株

3-1.将pCC1BAC-crp^m文库引入生产苏氨酸的菌株

通过电穿孔将实施例2中获得的pCC1BAC-crp^m文库转化到KCCM10541的电感受态细胞，KCCM10541是生产苏氨酸的微生物。在本实施例中使用的大肠杆菌KCCM10541(韩国专利号10-0576342)是通过灭活生产L-苏氨酸的大肠杆菌KFCC10718(韩国专利号10-0058286)中的galR基因而制备的大肠杆菌。

作为引入pCC1BAC-crp^m文库的微生物的对照组，以与上述相同的方式将pCC1BAC-crp转化到KCCM10541中以制备KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)。

3-2.重组微生物生长速率的比较

将包含1％葡萄糖和0.2g/L酵母提取物的M9基本培养基分配到深孔微板中，然后分别将实施例3-1中制备的转化子和对照菌株接种到其中。使用HTS(高通量筛选)方法，在37℃和200rpm的条件下，使用微型恒温培养摇床(日本TAITEC)对菌株培养20小时，并选择生长改良的菌株。其中，最后选择一种菌株(表2)。

与引入野生型crp的菌株相比，引入野生型crp基因的KCCM10541菌株由于额外引入了crp显示出OD值的略有增加，而在相同的培养时间后，生长改良的转化子显示出较高的OD值。进一步地，对所选择的crp变体进行质粒小量制备，然后进行测序分析。在表2中总结结果。

[表2]

将crp^m文库引入生产苏氨酸的菌株后生长改良转化子的信息

菌株	OD600	变体
			KCCM10541/pCC1BAC	2.3	-
KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)	2.8	-
			KCCM10541/pCC1BAC-crpTM3	3.9	Q33K

3-3.重组微生物苏氨酸滴定的比较

为了测量实施例3-2中选择的重组微生物的苏氨酸滴定，将重组微生物在按下表3的组合物制备的苏氨酸滴定培养基中培养以检查L-苏氨酸生产率的改良。

[表3]

苏氨酸滴定培养基的组合物

详细地，将在33℃的培养箱中于LB固体培养基中培养过夜的大肠杆菌KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)和大肠杆菌KCCM10541/pCC1BAC-crpTM3的每个铂环分别接种在25mL表3的滴定培养基中，然后在33℃和200rpm的培养箱中培养48小时，以比较糖消耗速率和苏氨酸浓度。

结果，如下表4所述，作为对照组的KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)菌株在24小时显示26.1g/L的糖消耗，而与母本菌株和引入野生型crp的菌株相比，引入突变体crpTM3的菌株在糖消耗率上分别显示约21％和16％的改良。

进一步地，当培养48小时时，引入野生型crp的菌株显示出29.0g/L的L-苏氨酸生产，而即便提高了培养速度，以上获得的突变体菌株的L-苏氨酸的生产增加到高达32.5g/L，与母本菌株和引入野生型crp的菌株相比，分别显示了在浓度上约13％和12％的改良。

由于crp变体的引入增加了菌株的产量和糖消耗，因此它似乎是良好的变体性状，这可能极大地促进发酵过程中生产效率的改良。

[表4]

含crp变体的苏氨酸菌株的滴定比较

*24小时测量值

**48小时测量值

实施例4.将pCC1BAC-crpTM3变体引入生产色氨酸的菌株

4-1.将pCC1BAC-crpTM3引入筛选菌株

通过电穿孔将实施例3中获得的pCC1BAC-crpTM3转化到生产色氨酸的菌株KCCM11166P的电感受态细胞。在该实施例中使用的KCCM11166P是生产L-色氨酸的大肠杆菌，其中删除了tehB基因并且增强了NAD激酶活性(韩国专利号10-1261147)。

作为引入pCC1BAC-crpTM3的微生物的对照组，以与上述相同的方式将pCC1BAC-crp(WT)转化到KCCM11166P，以制备KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)。

4-2.重组微生物生长速率的比较

将包含1％葡萄糖和0.2g/L酵母提取物的M9基本培养基分配到深孔微板中，然后分别将如实施例4-1中制备的转化子和对照菌株接种其中。使用HTS(高通量筛选)方法，在37℃和200rpm的条件下，使用微型恒温培养摇床(日本TAITEC)培养菌株16小时，以确认KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3转化子(表5)。

在相同的培养时间之后，引入野生型crp基因的KCCM11166P菌株由于额外引入了crp而显示出相同水平的OD，而与野生型crp相比，经生长改良的转化子显示出高OD值。

[表5]

将crpTM3引入生产色氨酸的菌株后生长改良转化子的信息

菌株	OD600	变异
			KCCM11166P/pCC1BAC	3.4	-
KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)	3.5	-
			KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3	3.9	Q33K

4-3.重组微生物色氨酸滴定的比较

为了测量在实施例4-2中制备的重组微生物的色氨酸滴定，将重组微生物在按下表6的组合物制备的色氨酸滴定培养基中培养以检查L-色氨酸生产率的改良。

[表6]

色氨酸滴定培养基的组成

详细地，将在37℃培养箱中于LB固体培养基上培养过夜的大肠杆菌KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)和大肠杆菌KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3的每个铂环分别接种在25mL表6的滴定培养基中，然后在37℃和200rpm的培养箱中培养48小时，以比较糖消耗速率和色氨酸浓度。结果，如下表7所述，作为对照组的KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)菌株在22小时显示30.2g/L的糖消耗，而与母本菌株和引入野生型crp的菌株相比，引入突变体crpTM3的菌株分别显示约12％和8％的改良。

当培养48小时时，引入野生型crp的菌株显示出8.4g/L的L-色氨酸产量，而即使培养速度增加，以上获得的突变菌株的L-色氨酸生产增加到9.0g/L，与母本菌株和引入野生型crp的菌株相比，在浓度上分别显示出约7％和10％的改良。

由于引入crp变体增加了菌株的糖消耗和产量，因此这似乎是良好的变体性状，其可极大地有助于发酵过程中生产效率的改良。

[表7]

包括crp变体的色氨酸菌株的滴定比较

*22小时测量值

**48小时测量值

实施例5.将有效的crp变体内源载体引入到野生型大肠杆菌

5-1.将有效的pCC1BAC-crp变体引入野生型生来源的生产苏氨酸的菌株

为了检查在实施例3中筛选的包含crp变体的载体是否在野生型菌株中也表现出相同的作用，分别将pCC1BAC-crp(WT)或pCC1BAC-crpTM3载体通过电穿孔转化到能够生产苏氨酸的野生型菌株中。进一步地，制备了引入pCC1BAC-crp(WT)的菌株作为对照组。

在本实施例中使用的能够生产苏氨酸的野生型来源菌株是W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC。W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC是一种菌株，其中将染色体上编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因的天然启动子替换为cysK基因的启动子，并以载体的形式引入了苏氨酸生物合成操纵子基因以增加拷贝数，从而提高苏氨酸生产率。详细地，使用pUCpcycKmloxP以与韩国专利号10-0966324中描述的相同的方式制备W3110::PcycK-ppc菌株，并且通过电穿孔将pACYC184-thrABC(韩国专利号10-1865998)转化到该菌株。

将所制备的菌株在按以下表8的组合物制备的苏氨酸测试培养基中培养，并比较其生长速率和L-苏氨酸生产率。

[表8]

苏氨酸测试培养基的组合物

详细地，将在33℃的培养箱中于LB固体培养基上培养过夜的W3110和各个菌株的每个铂环分别接种在25mL的表8的滴定培养基中，然后在33℃和200rpm的培养箱中培养48小时。其结果在下表9中显示。如以下结果所示，在本公开内容中选择的变体蛋白也能够在野生型菌株中以高产量高效地生产苏氨酸。

[表9]

野生型来源菌株测试生长和苏氨酸生产率的结果

5-2.将有效的pCC1BAC-crp变体引入野生型来源的生产色氨酸的菌株

为了检查在实施例4中筛选的包括crp变体的载体是否在野生型菌株中也表现出相同的作用，分别将pCC1BAC-crp(WT)或pCC1BAC-crpTM3载体转化到能够生产色氨酸的野生型菌株。

本实施例中使用的能够生产色氨酸的野生型来源菌株为W3110trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA。W3110trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA是用载体引入的菌株，其中释放色氨酸操纵子调节区的调节机制并且增强色氨酸操纵子表达以过表达色氨酸(韩国专利号10-1532129)。将引入载体的菌株在按下表10的组合物制备的色氨酸测试培养基中培养，并比较其L-色氨酸的生产率。

[表10]

色氨酸测试培养基的组合物

详细地，将在37℃的培养箱中于LB固体培养基上培养过夜的菌株的每个铂环接种在25mL表9的测试培养基中，然后在37℃和200rpm的培养箱中培养48小时。比较OD值和色氨酸浓度，并在表11中显示。如以下结果所示，在本公开内容中选择的变体蛋白也能够在野生型菌株中以高产量有效地生产色氨酸。

[表11]

野生型来源菌株的测试生长和色氨酸生产率的结果

本发明人指定以基于KCCM11166P、具有改进的色氨酸生产率和糖消耗率的引入pCC1BAC-crpTM3的菌株(KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3)为“CA04-2807”，并然后将菌株保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，KCCM是布达佩斯条约下的国际保藏机构，于2018年11月7日具有登记号KCCM12373P。

这些结果表明，在本公开内容的埃希氏菌属的引入crp变体的微生物中，改良了糖消耗率，并且提高了L-氨基酸生产率，因此，与未修饰的菌株相比，提高了L-氨基酸生产率。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，可以以不同的具体形式来实施本发明，而不改变其技术精神或基本特征。因此，应当理解，上述实施例不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本发明的范围由所附权利要求书而不是由其之前的描述限定，并且因此，落入权利要求书的界限之内的所有改变和修改、或此类界限的等同物因此旨在被所附权利要求书所包含。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> cAMP受体蛋白变体和使用其生产L-氨基酸的方法

<130> OPA19116-PCT

<150> KR 10-2018-0150875

<151> 2018-11-29

<160> 7

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 210

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CRP

<400> 1

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Lys Leu Ile His

20 25 30

Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 2

<211> 633

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> crp

<400> 2

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 3

<211> 210

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 修饰的CRP

<400> 3

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Lys Leu Ile His

20 25 30

Lys Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 4

<211> 633

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 修饰的crp

<400> 4

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcacaagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 5

<211> 933

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> crp和表达控制区

<400> 5

tttgctactc cactgcgtca attttcctga cagagtacgc gtactaacca aatcgcgcaa 60

cggaaggcga cctgggtcat gctgaagcga gacaccagga gacacaaagc gaaagctatg 120

ctaaaacagt caggatgcta cagtaataca ttgatgtact gcatgtatgc aaaggacgtc 180

acattaccgt gcagtacagt tgatagcccc ttcccaggta gcgggaagca tatttcggca 240

atccagagac agcggcgtta tctggctctg gagaaagctt ataacagagg ataaccgcgc 300

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 360

attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 420

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 480

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 540

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 600

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 660

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 720

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 780

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 840

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 900

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 933

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crp-F

<400> 6

cacgaattct ttgctactcc actgcgtca 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crp-R

<400> 7

acacgaattc ttaacgagtg ccgtaaacg 29

Claims

1.一种cAMP受体蛋白变体，其中赖氨酸取代了在SEQ ID NO：1氨基酸序列中第33位上的氨基酸。

2.一种编码权利要求1所述的cAMP受体蛋白变体的多核苷酸。

3.一种载体，其包括编码权利要求1所述的cAMP受体蛋白变体的多核苷酸。

4.一种埃希氏菌属(Escherichia sp.)的微生物，其包括cAMP受体蛋白变体，其中赖氨酸取代了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。

5.根据权利要求4所述的埃希氏菌属的微生物，其中所述埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。

6.根据权利要求4所述的埃希氏菌属的微生物，其中所述埃希氏菌属的微生物生产L-氨基酸。

7.根据权利要求6所述的埃希氏菌属的微生物，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸或L-色氨酸。

8.一种生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：

在培养基中培养埃希氏菌属的微生物，所述微生物包括cAMP受体蛋白变体，其中赖氨酸取代了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括从所述微生物或所述培养基中收集所述L-氨基酸。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸或L-色氨酸。

11.cAMP受体蛋白变体或包括所述变体的所述埃希氏菌属的微生物在L-氨基酸生产中的用途，在所述cAMP受体蛋白变体中赖氨酸取代了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第33位上的氨基酸。