KR20200081281A

KR20200081281A - 오르니틴 탈탄산 효소 변이형 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법

Info

Publication number: KR20200081281A
Application number: KR1020190174139A
Authority: KR
Inventors: 이재헌; 문희수; 전애지; 양영렬; 김병기; 홍은영
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-07-07
Also published as: WO2020138919A1; US20230287382A1

Abstract

본 출원은 오르니틴 탈탄산 효소 또는 단백질 변이형, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 퓨트레신 생산성, 생산 효율 또는 생산 선택성을 증대시키고, 부반응을 억제하여, 퓨트레신 정제시의 비용을 감소시키는 효과를 달성한다.

Description

오르니틴 탈탄산 효소 변이형 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법{Ornithine Decarboxylase Variants and Methods for Producing Putrescine Using The Same}

본 출원은 오르니틴 탈탄산 효소 변이형, 오르니틴 탈탄산 효소 변이형을 암호화하는 유전자, 오르니틴 탈탄산 효소 변이형을 포함하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 합성에 관한 것이다.

본 출원은 2018.12.27자로 출원된 PCT 국제특허출원 PCT/KR2018/016764 호 및 2018.12.28자로 출원된 대만특허출원 제 107147749 호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

퓨트레신 (putrescine; 1,4-diamino-butane)은 부패된 유기체로부터 발생되는 악취를 유발하는 물질이지만, 4,6-나일론 합성에 활용될 수 있다는 점에서 공업적으로 생산되고 있다. 현재 퓨트레신은 석유자원에 의하여 연당 10,000톤 이상이 생산되고 있으나, 석유 가격의 잦은 변동으로 인하여 원료 수급이 불안정하다는 문제점이 있다. 또한, 생산 과정에서 생성되는 다량의 독성물질로 인하여 환경오염을 유발할 수 있다는 문제점이 있다.

이러한 문제점들을 해결하기 위해, 최근 바이오 유래 퓨트레신 합성에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들면, 바이오 유래 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성하거나, 당을 이용하여 미생물로부터 퓨트레신을 대량으로 생산하는 방법에 관한 연구가 진행되고 있다.

미생물로부터 퓨트레신을 생산하는 방법에 있어서, 퓨트레신 생산량을 증가시키기 위한 다양한 생물학적 엔지니어링 방법들이 사용되어 왔다. 상기 방법들은, 예를 들면, 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소의 활성을 프로모터로 조절하거나, 퓨트레신이 세포 밖으로 방출이 용이하도록 역수송체를 과발현 하거나, 퓨트레신을 분해하는 경로를 차단하는 것일 수 있다. 이 중에서도, 미생물 내 퓨트레신 생합성에 관여하는 효소의 활성을 조절하는 것이 퓨트레신 생산량 증가에 크게 기여할 수 있는 것으로 알려져 있다.

오르니틴 탈탄산 효소는 오르니틴의 말단 카르복실기를 절단하여 퓨트레신을 합성하는 효소로서, 퓨트레신 생합성에서 중요한 역할을 수행하는 효소들 중 하나이다. 하지만, 오르니틴 탈탄산 효소는 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성할 뿐만 아니라, 라이신으로부터 카다베린(1,5-diamino-pentane)으로 합성하는 활성 (부반응)을 동시에 갖기 때문에, 이의 활성을 높이는 경우 퓨트레신과 함께 카다베린이 함께 생성되어 퓨트레신의 생산량을 저하시킬 수 있다. 상기 카다베린은 퓨트레신 정제시에도 많은 문제점을 초래할 수 있다. 구체적으로는, 미생물 배양액을 증류방법으로 정제하는 과정에서 퓨트레신 (H₂N(CH₂)₄NH₂)과 카다베린 (H₂N(CH₂)₅NH₂)의 구조가 매우 유사하기 때문에, 이를 선택적으로 정제하기 위하여 많은 비용 및 시간이 소요되고 있다.

따라서, 오르니틴 탈탄산 효소의 활성을 조절하고자 하는 경우, 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성하는 활성은 유지하면서, 라이신으로부터 카다베린으로 합성하는 활성 (부반응)은 저하시키는 것이 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 신규한 오르니틴 탈탄산 효소를 발굴하였으며, 상기 오르니틴 탈탄산 효소는 카다베린의 합성 활성은 낮고 퓨트레신의 합성 활성은 높다는 것을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

본 출원은 오르니틴 탈탄산 효소 또는 이의 변이형을 제공한다.

본 출원은 또한 상기 오르니틴 탈탄산 효소 또는 이의 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 출원은 상기 오르니틴 탈탄산 효소 또는 이의 변이형을 포함하는 퓨트레신을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신의 순도를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린에 대한 퓨트레신의 비율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 출원의 또 다른 목적은 상기 퓨트레신의 폴리아미드 계 고분자 합성 용도를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 퓨트레신 생산 활성을 가지는, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 제공한다.

구체적으로, 본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 i) 713번째 아미노산인 알라닌이 다른 아미노산으로 치환, 및/또는 ⅱ) 698번째 아미노산인 글루탐산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질의 변이형을 제공한다. 상기 아미노산 치환은 i) 713번째 아미노산인 알라닌이 루신, 이소루신, 발린, 아르기닌, 아스파르트산, 트립토판 및 글루타민으로부터 선택되는 아미노산으로 치환, 및/또는 ⅱ) 698번째 아미노산인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환되는 것을 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어, "퓨트레신"은 오르니틴의 디카복실화 반응이나 아그마틴의 가수분해에 의해 생성되는 물질로, 부패물에도 존재하나 생체에 정상적인 성분으로 널리 분포한다. 폴리아민의 일종으로 리보솜을 구성하고, 세포의 생장을 촉진하거나 RNA 합성을 촉진하는 기능을 가진다. 특히, 산업적으로는 나일론 4, 6을 포함하는 폴리아미드 4, 6의 생산을 위한 중요한 원료물질에 해당하며, 대량 생산을 위한 연구의 필요성이 계속되고 있는 물질이다.

퓨트레신은 오르니틴을 기질로 사용하는 방법으로 생산할 수 있다. 또한, 오르니틴의 전구체가 되는 물질을 기질로 사용하여 오르니틴을 합성한 후, 이로부터 퓨트레신을 생산할 수 있다. 오르니틴의 합성은, 당업자가 용이하게 선택할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 출원에서 용어, "오르니틴"은 오르니틴 회로에서 중요한 역할을 하는 염기성 아미노산으로, 특히 L-오르니틴은 식물, 동물, 미생물에서 널리 발견된다. 일반적으로 오르니틴 회로를 가진 생체 내에서는 요소 생산과 관계하여 대사상 중요한 역할을 한다. 또한, 생체 내에서 아르기닌, 글루탐산, 프롤린과 서로 변환될 수 있으며, 케톤산, 글리옥살산과 아미노기 전달을 한다. 오르니틴 탈탄산 효소에 의해서 아민(퓨트레신)을 생성하는 기질로 이를 통해 폴리아민으로까지 합성된다. 본 발명에서는 특히 오르니틴 탈탄산 효소의 기질로써 사용될 수 있는 L-오르니틴일 수 있다.

본 출원에서 용어, "오르니틴 탈탄산 효소(ornithine decarboxylase, ODC)"는 폴리 아민을 합성하는데 있어 최초 단계이자 퓨트레신(putrescine) 생산 경로 중 마지막 단계인 하기 반응식을 촉매하는 효소이다. 본 출원에서 오르니틴 탈탄산 효소는 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase)로 혼용되어 사용될 수 있다. ODC는 L-오르니틴을 기질로 하여 퓨트레신을 생산하는데, 피리독살인산(Pyridoxal phosphate, PLP)이 보조인자(co-factor)로 작용한다.

[반응식]

L-오르니틴 <=> 퓨트레신 + CO₂

도 1에는 오르니틴 탈탄산 효소를 이용하여 오르니틴을 기질로 퓨트레신을 합성하는 과정의 화학 반응식을 나타내었다. 또한, 억제해야 할 오르니틴 탈탄산 효소의 부반응인 카다베린(cadaverine) 합성 경로를 나타내었다.

본 출원에 있어서, ODC(ornithine decarboxylase)를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 미생물에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 서열번호 1은 퓨트레신 생산 활성을 갖는 오르니틴 탈탄산 효소의 아미노산 서열을 의미한다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 오르니틴 탈탄산 효소는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 또는 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래일 수 있고, 구체적으로 락토바실러스 새림네리(Lactobacillus saerimneri) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동일한 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 출원에서의 퓨트레신 생산 활성을 갖는 오르니틴 탈탄산 효소로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 기재하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 퓨트레신 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 퓨트레신 생산 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 서열번호 1에 상응하는 서열이거나, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 서열인 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.

본 출원에서 용어, "변이형(variant)"은 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이형은 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이형의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다. 다른 변이형은 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이형"은 변이체, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 변이형은 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 변이형은 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트될 수 있다.

본 출원의 단백질 변이형은 오르니틴 탈탄산 효소 변이형일 수 있다. 본 출원에서 용어, "오르니틴 탈탄산 효소 변이형"는 '변이형 ODC 단백질, ODC 변이형, 변이형 오르니틴 탈탄산 효소, 변이형 오르니틴 디카복실레이즈, 변이형 ODC 단백질, ODC 변이형, 변이형 ODC 효소 단백질, 변이형 ODC 효소' 등과 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 변이형은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 713번째 및 698번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열의 713번째 아미노산인 알라닌이 알라닌 이외의 소수성 아미노산, 염기성 아미노산, 산성 아미노산, 중성 아미노산 또는 방향족성 아미노산으로 치환되는 것을 포함할 수 있다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열의 713번째 아미노산인 알라닌이 알라닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 698번째 아미노산인 글루탐산이 글루탐산 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.

구체적으로, 상기 변이형은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 ⅰ) 713번째 아미노산인 알라닌이 다른 아미노산으로 치환, 및/또는 ⅱ) 698번째 아미노산인 글루탐산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형일 수 있다. 상기 다른 아미노산으로의 치환은 i) 713번째 아미노산인 알라닌이 루신, 이소루신, 발린, 아르기닌, 아스파르트산, 트립토판 및 글루타민으로부터 선택되는 아미노산으로 치환, 및/또는 ii) 698번째 아미노산인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변이형은 i) 713번째 아미노산인 알라닌이 루신, 이소루신, 발린, 아르기닌, 아스파르트산, 트립토판 및 글루타민으로부터 선택되는 아미노산으로 치환, 및/또는 ii) 698번째 아미노산인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 변이형일 수 있다.

서열번호 1의 아미노산 서열에서 ⅰ) 713번째 아미노산인 알라닌이 루신, 이소루신, 발린, 아르기닌, 아스파르트산, 트립토판 및 글루타민으로부터 선택되는 아미노산으로 치환, 및/또는 ⅱ) 698번째 아미노산인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 변이형은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 19 내지 23 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 변이형은 서열번호 1의 713번째 및/또는 698번째 위치에 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지며, 퓨트레신 생산 활성을 가지는 것일 수 있다.

또한, 상기 변이형은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 출원의 변이형은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 713번째 또는 698번째 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들 간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 출원에서 용어, "오르니틴 탈탄산 효소의 변이형"은 퓨트레신 생산능을 가지는 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형 폴리펩티드, 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형, 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형 폴리펩티드, 오르니틴 탈탄산 효소 변이형 폴리펩티드, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이체, 오르니틴 탈탈산 효소 단백질의 변이체, 변이형 오르니틴 탈탄산 효소, 변이형 오르니틴 탈탄산 효소 단백질 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 또한 상기 오르니틴 탈탄산 효소는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 또는 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 713번째 및/또는 698번째 위치에서 변이를 포함할 수 있으며, 서열번호 1에 아미노산이 부가, 결실된 아미노산 서열이라고 해도 서열번호 1의 N-말단으로부터 713번 및/또는 698번 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산이 치환된 변이형이면 본 출원의 범위에 포함된다.

아미노산 잔기 위치와 관련하여 본 출원에 기재된 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 단백질 또는 펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사한 위치를 지칭한다.

상기 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 713번째 및/또는 698번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 야생형 미생물 유래 변이 전 오르니틴 탈탄산 효소에 비하여 강화된 활성을 갖는 변이형 오르니틴 탈탄산 효소 단백질일 수 있다. 이와 같은 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형은 상기에서 설명한 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산에서 서열번호 1의 713번째 또는 698번째에 상응하는 위치의 아미노산이 변이된 것을 의미한다.

상기 713번째 및/또는 698번째 아미노산 변이는 i) 713번째 아미노산인 알라닌이 루신, 이소루신, 발린, 아르기닌, 아스파르트산, 트립토판 또는 글루타민으로 치환, 및/또는 ⅱ) 698번째 아미노산인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 ⅰ) 713번째 아미노산인 알라닌이 루신, 이소루신, 발린, 아르기닌, 아스파르트산, 트립토판 또는 글루타민으로 치환, 및/또는 ⅱ) 698번째 아미노산인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 것일 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 야생형 미생물 유래 변이 전 오르니틴 탈탄산 효소 단백질에 비하여 강화된 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 출원의 목적상 상기 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형을 포함하는 미생물의 경우, 퓨트레신 생산량이 증가하거나, 퓨트레신 순도가 증가하거나, 퓨트레신 생산의 선택성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 본 출원의 단백질 변이형은 천연의 야생형 또는 비변이 오르니틴 탈탄산 효소에 비하여 퓨트레신 생산능, 퓨트레신 순도 또는 퓨트레신 생산의 선택성이 증가되도록 유전자 조절 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 출원의 단백질 변이형이 도입된 미생물을 통해 오르니틴 탈탄산 효소의 부반응 중 하나인 카다베린(cadaverine)의 합성을 저해하고 퓨트레신 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 오르니틴 탈탄산 효소 단백질 및 이의 변이형에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원의 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 퓨트레신 생산 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 예를 들어 speC, odc, spe1 또는 speF 유전자일 수 있고, 상기 유전자는 락토바실러스 속, 사카로마이세스 속, 또는 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유전자는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 24 내지 28 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 713번째 및/또는 698번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 713번째 및/또는 698번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 퓨트레신 생산 활성을 갖는 오르니틴 탈탄산 효소 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원의 다른 하나의 양태는 오르니틴 탈탄산 효소 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 오르니틴 탈탄산 효소, 이의 변이형 및 상기 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 오르니틴 탈탄산 효소 또는 이의 변이형을 포함하거나, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 퓨트레신을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어 "변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물", 또는 "오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 포함하는 미생물"이란, 본 출원의 단백질 변이형을 포함하여 퓨트레신을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 출원의 단백질 변이형을 포함하는 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 퓨트레신을 생산하는 미생물에 본 출원의 단백질 변이형이 발현되어, 퓨트레신 생산능, 퓨트레신 생산 순도 또는 퓨트레신 생산의 선택성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다. 상기 재조합 미생물은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물에 비하여 퓨트레신 생산능, 생산 순도 또는 퓨트레신 생산의 선택성이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 발현하는 미생물로서, 상기 아미노산 변이는 N-말단으로부터 713번째 및/또는 698번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 713번째 또는 698번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 퓨트레신 생산 활성을 갖는, 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 퓨트레신, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 오르니틴 탈탄산 효소 단백질 및 이의 변이형에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 단백질이 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다. 본 출원의 목적상 "목적 단백질"은 전술한 퓨트레신 생산능을 갖는 오르니틴 탈탄산 효소 단백질의 변이형일 수 있다.

구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타내는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 또한, "활성의 강화"는 미생물이 가진 특정 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.

구체적으로, 본 출원의 활성 강화는 본 출원의 단백질 변이형을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질 변이형을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 오르니틴 탈탄산 효소 단백질 변이형을 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 염색체 상의 오르니틴 탈탄산 효소의 야생형 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 단백질 변이형을 암호화하는 유전자로 대체하는 방법, 상기 단백질 변이형의 활성이 강화되도록 상기 오르니틴 탈탄산 효소 단백질을 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법, 및 미생물에 단백질 변이형을 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(대한민국 등록특허 제 10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 상기 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 포함하거나, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 용어, "비변형 미생물"은 천연형 균주 자체이거나, 본 출원의 단백질 변이형을 포함하지 않는 미생물, 또는 본 출원의 단백질 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.

본 출원의 '미생물'은 퓨트레신을 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다.

본 출원에서 용어, "퓨트레신을 생산하는 미생물"은 자연적으로 퓨트레신 생산능을 가지고 있는 야생형 미생물이나, 퓨트레신 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 야생형 또는 변이형 도입을 통해 퓨트레신 생산능을 가지고 있는 미생물을 의미한다. 구체적으로, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하여, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 퓨트레신 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상 본 출원의 미생물은 본 출원의 단백질 변이형을 포함하여, 목적하는 퓨트레신의 생산능, 생산 순도 또는 퓨트레신 생산의 선택성이 증가된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미생물은, 퓨트레신 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 퓨트레신 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상 퓨트레신을 생산하는 미생물은 상기 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 포함하여, 배지 중의 탄소원으로부터 목적하는 퓨트레신을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 퓨트레신 생산량이 증가하거나, 퓨트레신 순도가 증가하거나, 퓨트레신 생산의 선택성이 증가하는 것을 특징으로 하는 미생물을 의미할 수 있다. 본 출원에서 상기 "퓨트레신을 생산하는 미생물"은 "퓨트레신 생산능을 갖는 미생물" 또는 "퓨트레신 생산 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 전술한 바와 같다.

상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 퓨트레신을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있고, 보다 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다.

보다 더욱 구체적으로는, 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens) 등일 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 오르니틴 탈탄산 효소 단백질이 도입 또는 강화되어 퓨트레신 생산량이 증가되거나, 퓨트레신 순도가 증가되거나, 퓨트레신 생산의 선택성이 증가될 수 있는 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원에서 오르니틴 탈탄산 효소 단백질 또는 상기 단백질의 변이형이 발현되도록 변형된 퓨트레신을 생산하는 미생물의 모균주는 퓨트레신을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다.

코리네박테리움 속 미생물에는 퓨트레신 생합성 경로가 없지만 외부로부터 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)를 도입하면 퓨트레신이 합성될 수 있다.

또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 추가적으로 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)이 불활성화된 것일 수 있다.

또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 글루타메이트에서 오르니틴까지의 생합성 경로를 강화하기 위해 글루타메이트를 아세틸글루타메이트 (N-acetylglutamate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트를 아세틸글루타밀 포스페이트 (N-acetylglutamyl phosphate)로 전환하는 아세틸글 루타메이트 키나제 (ArgB), 아세틸글루타밀 포스페이트를 아세틸글루타메이트 세미알데히드 (N-acetylglutamate semialdehyde)로 전환하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제 (ArgC), 아세틸글루타메이트 세미알데히드를 아세틸오르니틴 (N-acetylornithine)으로 전환하는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제 (ArgD)의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어 퓨트레신의 생합성 원료로서 사용되는 오르니틴의 생산성이 향상된 것일 수 있다.

또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 추가적으로 퓨트레신 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 약화된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 아울러, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 퓨트레신 배출단백질의 활성이 강화된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서, 용어 "강화/증가"는 내재적 활성에 비하여 활성이 증가되는 것을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 유전자 활성의 강화 또는 증가는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 유전자의 세포 내 카피수 증가; 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 유전자의 활성이 강화되도록 해당 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법; 및 미생물에 외래 유전자를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "불활성화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 약화되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 유전자 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 유전자의 활성이 제거된 경우를 포함하여 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 해당 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법); 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 퓨트레신의 생산 방법을 제공한다.

상기 퓨트레신, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 오르니틴 탈탄산 효소, 이의 변이형, 단백질의 발현, 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절 할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 퓨트레신을 회수할 수 있다. 상기 퓨트레신을 회수하는 방법은, 정제단계를 추가 적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 퓨트레신의 순도를 높이는 방법을 제공한다. 또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린에 대한 퓨트레신의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 퓨트레신 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배양하여 제조된, 퓨트레신의 폴리아미드 제조를 위한 용도를 제공한다. 또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물을 포함하는 폴리아미드 제조용 조성물을 제공한다. 상기 퓨트레신 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은 서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 포함한다. 또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배양하는 단계는 서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.

상기 폴리아미드는, 다양한 소재에 활용되는 물질로서, 아미드 결합 간의 수소결합으로 인하여, 내열성, 내약품성 등이 우수하여, 다양한 소재의 재료로 개발되고 있다. 예를 들면, 상기 폴리아미드는 섬유 원료일 수 있으며, 구체적으로는 나일론의 원료 일 수 있다. 폴리아미드 섬유는 고강도, 내마모성, 소프트성, 광택 특성, 염색 선명성 등에 있어서 우수한 특징을 갖고 있어, 팬티 스타킹 등의 레그 웨어(leg wear), 이너 웨어(inner wear), 스포츠 웨어(sports wear) 등의 의류 제품에 사용될 수 있다. 또한, 상기 폴리아미드는 의약품, 계면활성제, 필름, 플라스틱 등의 원료 일 수 있다. 예를 들면, 폴리아미드를 이용하여 필름을 제조하는 경우, 우수한 광학적 물성 및 기계적 물성을 구현할 수 있는 동시에, 유연성까지 구비하게 되어, 다양한 성형품의 재료로 사용될 수 있으며, 상기 폴리아미드 필름은 디스플레이용 기판, 디스플레이용 보호 필름, 터치 패널, 폴더블 기기의 윈도우 커버 등에 적용될 수 있다.

본 출원의 오르니틴 탈탄산 효소는, 퓨트레신 생산성 또는 생산 효율을 증대시키고, 부반응을 억제하는 효과가 있다. 특히, 본 출원은 오르니틴 탈탄산 효소의 부반응 중 하나인 카다베린의 합성을 저해하는 효과가 있어, 퓨트레신 정제/분리 공정의 간편화 및 생산 비용 절감의 효과를 달성한다.

또한, 본 출원은, 퓨트레신 대량생산을 통해 고분자 전구체, 의약품, 화학 첨가제 등의 다양한 활용이 가능하다.

도 1은 본 출원에서 오르니틴을 기질로 하여 오르니틴 탈탄산 효소를 이용한 퓨트레신 합성 도식도를 나타낸다. 또한 억제해야 할 오르니틴 탈탄산 효소의 부반응인 카다베린 합성 경로를 나타낸다.
도 2는 다양한 유래의 오르니틴 탈탄산 효소 활성을 확인한 것으로, 오르니틴을 기질로 사용하였을 때의 반응성 및 라이신을 기질로 사용하였을 때의 반응성(부반응)의 상대적인 활성도를 나타낸다. ODC_Lb 는 Lactobacillus saerimneri (inducible)로부터, ODC_Sc 는 saccharomyces cerevisiae (inducible) 로부터, ODC_Ec는 E.coli (constitutive) 로부터, ODC_Ef 는 E.coli (inducible) 로부터 유래된다.
도 3은 정제된 락토바실러스 유래의 야생형 오르니틴 탈탄산 효소와, 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 696 번째의 알라닌이 글루탐산으로(A696E), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 702 번째의 발린이 글라이신으로(V702G), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로(A713L), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 696 번째 알라닌과 713번째의 알라닌이 글루탐산과 루신으로(A696E/A713L), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 702 번째의 발린과 713번째의 알라닌이 글라이신과 루신으로(V702G/A713L), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 696 번째 알라닌과 702 번째의 발린과 713번째의 알라닌이 글루탐산과 글라이신과 루신으로(A696E/V702G/A713L), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 698 번째의 글루탐산이 아스파르트산으로(E698D), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 698 번째의 글루탐산과 713번째의 알라닌이 아스파르트산과 루신으로 치환된 변이형(E698D/A713L)를 이용하여, (가) 오르니틴 고유 활성도와 (나) 라이신 고유 활성도 각각을 정량 후 비교한 도면이다.
도 4는 정제된 락토바실러스 유래의 야생형 오르니틴 탈탄산 효소와 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 698 번째의 글루탐산이 아스파르트산으로(E698D), 야생형 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로(A713L), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 698 번째의 글루탐산과 713번째의 알라닌이 아스파르트산과 루신으로 치환된 변이형(E698D/A713L)을 이용하여 라이신과 오르니틴에 대한 동력학적 계수를 비교한 도면이다.
도 5는 다양한 조건에서 생전환 반응을 비교한 도면이다. (가) 오르니틴 기질로 퓨트레신 합성을 정량하였고, 정제된 락토바실러스 유래의 야생형 오르니틴 탈탄산 효소를 0.37 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (● 참조), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로 치환된 변이형을 0.37 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (○ 참조), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소를 0.1 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (◆ 참조), 야생형 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로 치환된 변이형을 0.1 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (◇ 참조)의 도면이다. (나) 라이신을 기질로 카다베린 합성을 정량하였고, 정제된 락토바실러스 유래의 야생형 오르니틴 탈탄산 효소를 0.37 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (● 참조), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로 치환된 변이형을 0.37 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (○ 참조), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소를 0.1 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (◆ 참조), 야생형 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로 치환된 변이형을 0.1 M 농도 버퍼에서 반응했을 때 (◇ 참조)의 도면이다.
도 6은 4가지 균주로부터 유래된 재조합 오르니틴 탈탄산 효소 유전자의 발현량을 나타낸 것이다. ODC_e.coli_SpeC는 E.coli (constitutive) 로부터, ODC_e.coli_SpeF는 E.coli (inducible)로부터, ODC_Lactobacillus는 Lactobacillus saerimneri (inducible)로부터, ODC_ saccharomyces cerevisiae는 saccharomyces cerevisiae(inducible)로부터 유래된다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1. 다양한 유래의 오르니틴 탈탄산 효소의 활성 비교 수행

네 가지 미생물로부터 유래하는 오르니틴 탈탄산 효소의 기질 반응성을 비교하였다. 락토바실러스 새림네리(Lactobacillus saerimneri (inducible)), 사카로마이세스 세레비제(saccharomyces cerevisiae (inducible)), 이콜라이(E.coli (constitutive)), 이콜라이(E.coli (inducible))로부터 유래된 야생형의 오르니틴 탈탄산 효소를 대상으로 하였으며, 이를 각각 ODC_Lb, ODC_Sc, ODC_Ec, ODC_Ef 로 표기하였다. 상기 효소에 해당하는 유전자를 pET24ma 벡터에 삽입 후, 대장균 BL21 (DE3)을 이용하여 0.1 mM IPTG 및 18℃ 조건에서 단백질을 발현하였다. 이후 10% 세포 추출물을 이용하여 45℃에서 초기 반응 속도를 비교하였다. 기질로 4 mM 오르니틴을 사용한 경우와 4 mM 라이신을 사용한 경우를 각각 비교하였다.

도 2에 상기 네 가지 미생물 유래의 ODC 효소의 활성을 나타내었다. 구체적으로, 오르니틴을 기질로 사용하여 퓨트레신을 생산한 것인 오르니틴 탈탄산 효소 활성과, 라이신을 기질로 사용하여 카다베린을 생산한 것인 라이신 탈탄산 효소 활성을 나타내었다. 라이신 탈탄산 효소 활성은 모두 비슷하였으나, 오르니틴 탈탄산 효소 활성은 락토바실러스 유래의 오르니틴 탈탄산 효소(ODC_Lb)가 가장 우수하였다. 즉, ODC_Lb에 있어서, 오르니틴 탈탄산 효소 활성에 대한 라이신 탈탄산 효소 활성, 즉 부반응의 생성 비율이 가장 낮게 나타나므로, 이와 같은 내용을 바탕으로 변이형 제작을 수행하였다.

실시예 2. 오르니틴 탈탄산 효소의 변이 위치의 선택

락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소는 결정구조가 알려져 있고, 구조분석을 통하여 기질이 효소에 들어가고 나오는 터널 예측이 가능하다. 예측된 터널 부분 중, 포화 변이를 수행할 기능적 잔기(functional residues)를 선택하기 위해서, 생물정보학의 서열정보를 이용한 다수 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 수행하였으며, 본 발명에서 이용하는 오르니틴 탈탄산 효소 아미노산 서열의 N 말단으로부터 A696, V702, A713, E698의 위치를 변이 위치로 선정하였다.

단백질 구조 내에 특정 위치의 아미노산 잔기를 보존하고 있는 잔기는 그 단백질에 있어서 구조와 기능상 매우 중요한 역할을 하고, 특히 촉매과정에 있어서 직접적인 역할을 할 가능성이 높기 때문에, 이들은 변이 잔기로서 배제하였다.

실시예 3. 오르니틴 탈탄산 효소의 기능적 잔기에 대한 포화 변이 수행 및 변이형 탐색

포화 변이(saturation mutagenesis)는 유전자의 지정된 위치에 다양한 염기배열의 변화를 도입하는 것을 말한다. 포화 변이는 주형가닥에 결합하는 상보적인 서열의 프라이머(primer) 상에, 변이시키고자 하는 서열대신 NNK 코돈(codon)을 삽입하여 PCR을 통해 변이를 삽입시키는 것을 말한다. 이 때, NNK 코돈에서 N은 뉴클레오티드의 A, T, G, C를 의미하며 K는 T, G를 의미한다.

선택된 기능적 잔기들에 대해 NNK 코돈을 사용하여 포화 변이를 수행한 후, 변이형 라이브러리에 대해 스크리닝을 수행하였다. 모든 라이브러리는 1차 및 2차 스크리닝을 전세포 반응을 통해 진행하였다. 상기 전세포 반응은 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 이용하거나 또는 효소를 분리 정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미한다. 1차 스크리닝은 오르니틴 전세포 반응을 통해 진행되었으며 야생형과 비교했을 때, 비슷하거나 더 빠른 활성을 보이는 변이형들을 흡광도의 변화로 선택하였다. 2차 스크리닝은 라이신 전세포 반응을 통해 진행되었고, 1차에서 선별된 변이형들에 대해, 라이신에 대한 반응성이 야생형보다 낮으면 선택하였다.

선별된 변이형 효소에 대하여, 오르니틴 또는 라이신을 기질로 사용하였을 때의 고유 활성도를 측정하였다. 고유 활성도(specific activity)는 효소정제를 통해 불순물 및 다른 단백질을 제거한 순수한 단백질의 단위량당 활성을 나타내는 것으로 보통 1분간에 1 μmol의 기질 변화를 촉매하는 효소의 양을 1단위로 하여 1 mg당 단위수로 표시한다. 구체적으로, 락토바실러스 유래 야생형 및 변이형의 오르니틴 탈탄산 효소를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 50 mL의 배양 부피로 인듀서인 IPTG를 이용하여 발현한 이후, Ni-NTA 컬럼을 이용하여 순수 단백질만을 정제하였다. 먼저 단백질 발현 이후, 음파 파쇄기로 세포를 파쇄하고, 원심분리 후 세포 추출액을 얻었다. 300 mM 염화나트륨이 첨가된 50 mM 포스페이트(phosphate) 완충용액(pH8.0)으로 평형화 시킨 컬럼에 세포 추출액을 넣어 0℃에서 1 시간 동안 니켈 수지(resin)와 결합을 시켰다. 이후 수지에 결합하지 못한 단백질을 흘려버리고 50 mM 이미다졸이 포함된 트리스 완충용액으로 비특이적으로 결합된 다른 단백질들을 제거하였다. 마지막으로 250 mM 이미다졸이 포함된 트리스 완충용액으로 원하는 단백질만을 용출하였다. 용출된 단백질에서 이미다졸을 제거하기 위해 여과 컬럼을 이용한 탈염과정을 수행하여 최종적으로 활성 있는 단백질만을 얻었다. 이후 브래드포드 (Bradford) 단백질 정량 키트를 사용하여 단백질량을 측정하고 동일한 양의 단백질을 사용하여 고유 활성도를 측정하였다.

오르니틴 또는 라이신을 기질로 사용하였을 때의 락토바실러스 유래 야생형 및 변이형의 오르니틴 탈탄산 효소의 고유 활성도는 HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석기법을 통해 측정하였다. 반응은 50℃에서 30분 내지 300분간 수행하여 세 번의 실험의 평균값으로 구하였다. 10% 내지 25%의 전환 수율을 나타냈을 때의 초기 반응속도를 측정하였다. 양이온 교환 컬럼을 사용하였고 이동상은 0.6 g/L 시트르산, 4 g/L 타르타르산, 1.4 g/L 에틸다이아민, 5% 메탄올 및 95% 물로 구성하였다. 사용된 pH의 버퍼 용액은 pH 5.0의 경우 시트레이트 완충액 (citric-sodium citrate buffer)를 사용하였다. 야생형 및 변이형의 오르니틴 탈탄산 효소의 고유 활성도는 도 3에 나타내었다.

도 3(a) 및 도 3(b)에 나타나 있는 바와 같이, 야생형 및, 변이형(A696E, V702G, A713L, A696E/A713L, V702G/A713L, A696E/V702G/A713L, E698D 및 E698D/A713L) 효소의 고유 활성도를 확인한 결과, 상기 기능적 잔기들(A696, V702, A713, E698)은 모두 활성부위 (active site) 또는 기질 접근 터널에 위치하는 것을 확인하였다.

구체적으로, 오르니틴을 기질로 사용하였을 때, 변이형(A696E, V702G, A713L, A696E/A713L, V702G/A713L, A696E/V702G/A713L, E698D, E698D/A713L)의 고유 활성도는 야생형의 고유 활성도에 대하여 각각 19.9%, 4.3%, 89.4%, 12.8%, 4.9%, 0.1%, 75.6%, 74.4%로 확인되었다(도 3의 (가)).

라이신을 기질로 사용하였을 때, 변이형(A696E, V702G, A713L, A696E/A713L, V702G/A713L, A696E/V702G/A713L, E698D, E698D/A713L) 효소의 고유 활성도는 야생형 효소의 고유 활성도에 대하여 각각 16.9%, 0.6%, 42.4%, 4.4%, 0.9%, 0.7%, 50.8%, 29.2%로, 부반응이 억제되는 것을 확인하였다(도 3의 (나)).

실시예 4. 오르니틴 탈탄산 효소의 기능적 잔기에 대한 동력학적 계수 확인

상기 실시예 3에서 사용된 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형 중, 70% 이상의 고유 활성도를 갖는 변이형인 A713L, E698D, 및 E698D/A713L의 특성을 더 면밀하게 확인하고자 하였다. 상기 변이형 및 야생형의 동력학적 계수(Kinetic parameter)를 비교하기 위해서 다양한 농도 조건의 라이신을 이용하였다. 동력학적 계수는 서로 다른 농도를 지닌 기질용액을 이용하여 효소의 기질 친화도 및 기질 전환 능력 수치를 나타낸다.

구체적으로, 단백질 정제를 마친 야생형 및 변이형의 오르니틴 탈탄산 효소의 라이신에 대한 동력학적 계수를 확인하기 위해 0.45 mM 내지 140 mM의 라이신 농도를 사용하였다. pH의 버퍼 용액은 pH 5.0 시트레이트 완충액(citric-sodium citrate buffer)을 사용하였고, 반응 부피는 200 ㎕에서 진행하였다. 분석은 상기 명시된 HPLC 분석 방법을 통해 진행하였으며, 세 번의 실험의 평균값으로 구하였다. 야생형 및 변이형의 라이신 탈탄산 효소의 동력학적 계수는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형에 비하여 변이형(A713L)의 라이신에 대한 k _cat 값이 2.16 배 낮아진 것을 확인하였다. k _cat 값의 감소로 인하여 변이형(A713L)의 라이신에 대한 k _cat / K _M 값이 야생형에 비하여 1.93 배 줄어든 것을 확인하였다. 결론적으로 변이형(A713L)이 라이신 탈탄산 효소 활성을 줄일 수 있음을 확인하였다. 변이형 E698D 및 E698D/A713L 역시 야생형에 비하여 라이신에 대한 k _cat 값이 2.08 배와 2.59 배로 각각 줄어드는 것을 확인하였으며, 라이신에 대한 k _cat / K _M 값이 1.28 배 및 1.67 배 감소되는 것을 확인하였다. 즉, 상기 변이형들은 부반응을 저감시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 변이형 오르니틴 탈탄산 효소의 특성 분석

변이형 중, 가장 높은 오르니틴 고유 활성도를 가지는 변이형인 오르니틴 탈탄산 효소(A713L)가 퓨트레신 또는 카다베린 생성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 높은 농도 51.5 g/L (0.39 M)의 오르니틴을 기질로서 사용한 경우와, 농도 2.57 g/L (17.6 mM)의 라이신을 기질로서 사용한 경우를 각각 진행하였다. 두 가지 기질 조건에서 반응을 진행함에 있어 알맞은 반응 조건을 잡기 위해, pH 를 적정해주는 버퍼 농도를 두 가지 조건(0.1 M 또는 0.37 M)에서 진행하였다.

구체적으로, 단백질 정제를 마친 야생형 및 변이형 효소 0.1 mg을 반응에 사용하였다. 기질로서 0.39 M의 오르니틴 또는 17.6 mM의 라이신을 사용하였고, 버퍼로서 0.1 또는 0.37 M의 시트레이트 완충액 (citric-sodium citrate buffer, pH 5.0)을 사용하였다. 0.1 mM PLP 조효소가 사용되었고, 반응은 50℃에서 진행되었으며, 반응 부피는 2 mL로 진행하였다. 이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5의 (가)는 51.5 g/L (0.39 M)의 오르니틴을 기질로 사용한 경우이다. 오르니틴을 퓨트레신으로 변환하는 경우 0.37 M의 버퍼를 사용하였을 때(도 5의 (가)의 ● 및 ○ 참조), 4시간 이후 야생형 및 변이형(A713L)에서 퓨트레신을 각각 33.0 g/L 및 31.6 g/L 생성하였다. 또한, 낮은 농도의 버퍼(0.1 M)를 사용하였을 때(도 5의 (가)의 ◆ 및 ◇ 참조), 7시간 후 야생형 및 변이형(A713L)은 각각 퓨트레신을 20.2 g/L 및 20.7 g/L 생성하였다. 야생형 및 변이형(A713L)의 퓨트레신 생산 능력이 비슷한 것을 확인하였고, 고농도 버퍼(0.37 M)를 사용하는 것이 반응성에 유익한 것을 확인하였다.

도 5의 (나)는 2.57 g/L (17.6 mM)의 라이신을 기질로 사용한 경우이다. 라이신을 카다베린으로 변환하는 경우 0.37 M의 버퍼를 사용하였을 때(도 5의 (나)의 ● 및 ○ 참조), 4시간 후 야생형 및 변이형(A713L)에서 각각 0.03 g/L 및 0.007 g/L의 카다베린을 생성하였다. 또한, 0.1 M의 버퍼를 사용하였을 때(도 5의 (나)의 ◆ 및 ◇ 참조), 카다베린이 생성되는 부반응이 증가하였고, 7시간 후 야생형 및 변이형(A713L)에서 각각 0.59 g/L 및 0.38 g/L의 카다베린을 부반응으로 생성하였다. 이로써 변이형(A713L)에서 카다베린을 생성하는 부반응이 억제되는 것을 확인하였고, 이 부반응 억제 효과는 높은 농도의 버퍼(0.37 M)를 사용할 때 더 두드러지는 것을 확인하였다.

실시예 6. 코리네 균주에서 재조합 ODC 유전자들의 발현량 비교 측정

실시예 1에서 언급된 네 가지 미생물 유래 오르니틴 탈탄산 효소 ODC_Lb, ODC_Sc, ODC_Ec, ODC_Ef를 발현시키기 위한 재조합 유전자의 제작 방법은 다음과 같다.

구체적으로, Lactobacillus saerimneri (ACCESSION no. P43099), Saccharomyces cerevisiae (ACCESSION no. J02777.1), 및 Escherichia coli str. K-12 (ACCESSION no.BAA35349) 유전체 정보를 이용하여 오르니틴 탈탄산 효소 유전자들을 표 1에 명기된 유전자 서열로 PCR에 의한 유전자 코딩 영역 증폭 후, PCR 생성물에 제한 효소를 처리하여 플라스미드에 삽입하였다.

재조합된 유전자들은 단백질 C-말단에 His-tag을 추가 번역할 수 있도록 제작하였다. 대장균 DH5 alpha를 DNA 조작을 위한 숙주 균주로 사용하였고, 대장균 BL21 (DE3)을 C-말단 His6- 태그 ODC 유전자 발현을 위한 숙주 균주로 사용하였다. 재조합 대장균 BL21을 50 mg/mL의 카나마이신을 함유하는 50mL LB 배지에서 37℃에서 성장시켰다. 배양액이 OD₆₀₀조건에서 0.8에 도달했을 때, 0.2 mM IPTG를 배양액에 첨가하였다. 18 - 30℃에서 단백질 발현을 유도한 후, 세포를 수확하였다. 세포를 용해 완충액에 재현탁하고 초음파 처리하여 세포를 파괴시켰다. 얻어진 재조합 ODC들을 4℃에서 Quiagen (Hilden, Germany)의 Ni-NTA 아가로스 수지로 정제하였다. 재조합 단백질들은 100 kDa의 분자 질량 컷오프(cut off)와 함께 Centriplus YM-30(Millipore, Bedford, MA)을 사용하여 수득하였다. 발현 결과는 도 6과 같다.

SDS-PAGE gel상에서 30℃ 발현 유도 조건의 결과를 분석하면 재조합 ODC_Lb와 ODC_Ec의 발현량이 ODC_Sc, ODC_Ef 대비 높은 것을 확인할 수 있다. 다만 ODC_Ec의 경우 중온 조건 발현 시 가용성 단백질량이 현저히 떨어지는 것이 확인되었다. 추가적으로, 37℃ 발현을 진행하였을 때, ODC_Ec의 가용성 단백질량은 더욱 감소하였다.

코리네 균주에서 ODC_Lb와 ODC_Ec 유전자를 발현시켜서 가용성 단백질로 발현되는 양을 비교 평가하고자 하였다. ODC_Lb 유전자 및 ODC_Ec 유전자의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터(KCCM10617, 대한민국 등록특허 제10-0620092호)를 도입하였다. 우선 CJ7 프로모터 서열을 포함하는 유전자를 얻기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 표 2의 명기된 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하여 실시하였다.

1.5% 아가로즈젤을 이용하여 전기영동 후 400 basepair (bp)의 크기를 가지는 PCR 핵산 결과물을 확인하였다. 얻어진 PCR 결과물은 PCR prep kit (GeneAll, 서울)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물과 pSCEC 벡터 용액 샘플에 BamHI과 XbaI 을 넣고 37℃, 4시간 반응으로 제한효소 처리하고 1.5% 아가로즈젤을 이용하여 전기영동 후 400 bp의 크기를 가지는 PCR 핵산 산물 밴드와 벡터 사이즈의 밴드를 cutting 후 Gel prep kit (GeneAll, 서울)를 이용하여 핵산 단편들을 수득하였다. 정제된 각 1 mg의 CJ7 프로모터 단편과 벡터를 T4 ligase를 이용하여 ligation 후 E. coli DH5 alpha 균주에 일렉트로포레이션 (electrophoration) 하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 50 ㎍/L 스펙티노마이신(spectinomycin)을 포함한 LB 평판배지에 도말하여 37℃에서 1일 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 18개의 균주를 선별하여 서열번호 9 및 10으로 콜로니 PCR 후 400bp 의 크기를 가지는 PCR 결과물을 확인할 수 있었다. 콜로니 PCR 결과로부터 CJ7 프로모터를 가지는 pSCEC_cj7의 제작을 확인하였다.

얻어진 pSCEC_cj7 벡터를 기반으로 표 3에 명기된 프라이머를 이용하여 ODC_Lb와 ODC_Ec 2개의 유전자를 PCR을 통해서 증폭하였다.

상기 얻어진 PCR 산물 및 pSCEC_cj7 벡터를 제한 효소 XbaI과 SalI으로 처리하였다. 제한 효소 처리된 핵산들을 gel prep 하여 ODC_Lb, ODC_Ec 그리고 pSCEC_cj7 핵산 단편을 ligation 하고 E. coli DH5 alpha 균주에 삽입하였다. 삽입이 확인된 선별된 균주로부터 pSCEC_cj7_ODC_Lb 및 pSCEC_cj7_ODC_Ec를 각각 수득하고 퓨트레신 생산 코리네박테리움 속 미생물 KCCM11240P에 2500V로 각각 일렉트로포레이션(electrophoration) 하였다.

50 ㎍/L 스펙티노마이신(spectinomycin)을 포함한 BHIS 평판 배지(Braine heart infusion 37 g/l, 소르비톨 91 g/l, 한천 2%)에 상기 균주를 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 상기 선별된 균주가 50 ㎍/L 스펙티노마이신(spectinomycin)을 포함한 CM 배지(glucose 10 g/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, beef extract 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, Urea 2 g/L, pH 6.8)에서 진탕배양이 가능함을 확인하였다. 제작된 2종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 3 mL 배양 후, 원심분리하여 균체를 확보하였다. 얻어진 균체를 초음파 처리 방법으로 세포 파쇄 후 원심분리하여 가용성 단백질이 포함된 용액을 확보하였다.

Ni-NTA Spin Columns(Hilden, Germany)을 이용하여 His-tag이 포함된 ODC_Lb, ODC_Ec 단백질을 각각 정제하였다. Nano drop을 이용하여 수득하여 단백질의 농도를 측정하였다. 측정값 기반으로 계산된 재조합 단백질 농도는 각각 ODC_Lb: 1.282g/L, ODC_Ec: 0.039 g/L로, 코리네 균주에서 ODC_Ec에 비하여 ODC_Lb가 30배 이상의 가용성 단백질을 확보하는 것을 확인하였다.

ODC_Lb는 중온 조건에서 대장균과 코리네 균주를 숙주로 사용하여 발현시킬 때 높은 발현량과 정상적인 단백질 접힘으로 높은 가용성 단백질 생산이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 변이형 오르니틴 탈탄산 효소가 도입된 코리네형 퓨트레신 생산 균주 제조 및 퓨트레신 생산능 측정

본 출원의 오르니틴 탈탄산 효소 변이형이 퓨트레신 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물에 상기 오르니틴 탈탄산 효소 변이형을 도입한 균주를 제작하였다.

구체적으로, 상기 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물로, 특허출원 (한국특허공개 제 2013-0082478호)에 개시된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11240P)이 사용되었다. 상기 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11240P)은, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 으로부터 제조된 미생물 (ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec): KCCM11138P (한국특허공개 제2012-0064046호)) 내 NCgl1469가 결손된 미생물이다.

상기 퓨트레신 생산 미생물 내 오르니틴 탈산산 효소를 상기 락토바실러스 유래의 락토바실러스 유래의 오르니틴 탈탄산 효소 변이형으로 치환하기 위한 벡터를 제작하였다. 보다 구제적으로는, 상기 실시예 1 및 3에서 제작한 락토바실러스 유래의 오르니틴 탈탄산 효소 변이형의 DNA를 하기 표 4에 개시한 ODC_Lb_start (EcoRV)_5, ODC_Lb_stop (MfeI)_3 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 구체적으로는, 상기 제작한 pET24ma 벡터에 야생형 및 변이형(E698D, A713L)의 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소를 삽입하여 이를 각각 주형으로 하고, 하기 표 4에 개시한 L-odc_start (EcoRV)_5, L-odc_stop (MfeI)_3 두 개의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 증폭을 통해 얻은 유전자 단편들은 EcoRV와 MfeI 제한효소로 처리(37℃, 3시간)하고, 특허공개 제2012-0064046호에 개시된 방법과 동일한 방법을 이용하여 제작한 pDZ-bioAD-P(CJ7) 벡터에 락토바실러스 유래 야생형 및 변이형 (E698D, A713L) 오르니틴 탈탄산 효소들의 유전자 단편을 삽입하였다. 상기 방법에는 EcoRV와 MfeI 제한효소가 사용되었다. 상기 방법으로 제작된 염색체 삽입용 재조합 벡터(pDZ-ODC_Lb, pDZ-ODC_Lb_E698D, pDZ-ODC_Lb_A713L)는 서열분석으로 확인하였다.

락토바실러스 유래 야생형 및 변이형 오르니틴 탈탄산 효소들이 염색체 내에 삽입된 코리네 균주를 얻기 위해, 상기에서 제작된 pDZ-ODC_Lb, pDZ-ODC_Lb_E698D, pDZ-ODC_Lb_A713L 재조합 벡터 각각을 KCCM11240P 균주에 전기 천공법을 이용하여 형질주입한 뒤 BHIS 평판배지(brainheart infusion 37 g/l, sorbitol 91 g/l, agar 2%, 1L 기준 +kanamycin 25 ug/ml)에 도말하였다.

성공적인 벡터의 염색체 내 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체 배지에서 푸른색을 나타내는가의 여부로 판별하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 serial dilution하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띠는 반면에 낮은 비율로 백색의 콜로니를 선별할 수 있었고, 선별한 콜로니는 2차 교차 (cross over)에 의해 최종 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소 변이형들이 염색체에 도입된 균주를 얻을 수 있었다. 최종적으로 균주는 변이형들의 서열분석에 의해 확인하였다. 확인된 균주를 KCCM11240P::ODC_Lb, KCCM11240P::ODC_Lb_E698D, KCCM11240P::ODC_Lb_A713L 로 명명하였다.

락토바실러스 유래 야생형 및 변이형 오르니틴 탈탄산 효소 도입으로 인한 퓨트레신 생산 균주의 퓨트레신 생산능의 영향을 확인하기 위하여, 퓨트레신 생산능을 평가하였다.

구체적으로, 상기에서 제작된 균주들을 1 mM 아르기닌이 포함된 CM 평판배지 (포도당 1%, polypeptone 1%, 효모추출물 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100ul, agar 2%, pH 6.8, 1L 기준)에서 30℃로 16시간 배양한 후, 하기 표 5의 조성을 가지는 25 ml 역가배지에 한 백금이 정도 접종한 다음, 이를 30℃에서 200 rpm으로 24시간 동안 진탕배양 하였다. 제작된 모든 균주에 대하여 발효시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하여 배양하였다.

그 결과 표 6에서 보는 바와 같이, 배양 12시간 후 락토바실러스 유래 변이형(A713L) 오르니틴 탈탄산 효소를 도입한 균주에서, 대장균 오르니틴 탈탄산 효소를 갖는 균주(KCCM11240P) 대비 퓨트레신 생산량이 약 115%P만큼 증가하였다. 또한, A713L 오르니틴 탈탄산 효소를 도입한 균주에서 락토바실러스 유래 야생형 오르니틴 탈탄산 효소를 갖는 균주(KCCM11240P::ODC_Lb) 대비 약 40%P 증가하는 양상을 보였다.

또한, A713L 오르니틴 탈탄산 효소를 도입한 균주(KCCM11240P::ODC_Lb_A713L)는 KCCM11240P 대비, 퓨트레신 생산시 부반응으로 인한 카다베린 생산이 약 48%P 감소하고 배양액 내 잔류 포도당 농도로 미루어보아 동일 시간 내 당 소모량이 증가하여 생산성이 함께 증가함을 알 수 있다.

상기와 같은 결과는 락토바실러스 유래 변이형 오르니틴 탈탄산 효소가 도입됨으로 인해 퓨트레신 생산균주에서 당 소모 대비 기존보다 높은 농도의 퓨트레신을 생산을 할 수 있을 뿐만 아니라, 카다베린 저감 및 생산성 향상의 효과를 가짐을 보여준다.

실시예 8. 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째 아미노산 잔기에 대한 포화 변이 영향성 예측

선택된 변이 중 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 루신으로 치환된 기능적 잔기 (A713L)에 대하여 알라닌 및 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환한 후 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P에 도입하여 퓨트레신 생산에 미치는 영향을 알아보았다.

구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, N-말단으로부터 713번째 아미노산을 소수성 아미노산을 포함한 다른 아미노산으로 치환한 형태의 변이형을 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11240P)의 염색체 내 대장균 유래 야생형 오르니틴 탈탄산 효소 대신 치환시킨 변이균주를 제작하였다. 더욱 구체적으로 소수성 아미노산 중 하나인 발린, 염기성 아미노산 중 하나인 아르기닌, 산성 아미노산 중 하나인 아스파르트산, 중성 아미노산 중 하나인 글루타민, 방향족성 아미노산 중 하나인 트립토판으로 치환하는 벡터를 각각 제작하기 위하여, 실시예 7에서 제작한 pDZ-ODC_Lb 벡터를 주형으로 하여 상기 표 4와 하기 표 7에 개시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 1차로는 변이를 일으키고자 하는 부위를 중심으로 앞쪽 부분(5') 과 뒷쪽 부분(3')에 대하여 각각 PCR을 진행한 다음, 2차로 두 개의 PCR 단편을 합치는 PCR을 수행하였다. 예를 들어, 713번째 아미노산을 알라닌에서 발린으로 치환하는 변이 (A713V)의 경우, 앞쪽 부분 ODC_Lb_start (EcoRV)_5와 ODC_Lb_A713V_3 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, 뒤쪽 부분은 ODC_Lb_A713V_5와 ODC_Lb_stop (MfeI)_3 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 1차 PCR을 통하여 얻은 두 개의 PCR 단편을 2차 PCR의 주형으로 사용하고, ODC_Lb_start (EcoRV)_5와 ODC_Lb_stop (MfeI)_3 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하였다. 최종적으로 얻어진 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형 A713V 유전자 단편은 실시예 7과 동일한 방법으로 pDZ-bioAD-P(CJ7) 벡터에 삽입하였다. 그 외 나머지 변이형 A713R, A713D, A713W, A713Q도 표 7에 개시된 프라이머들을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 진행하여 pDZ-bioAD-P(CJ7) 벡터에 삽입하였다. 제작된 염색체 삽입용 재조합 벡터(pDZ-ODC_Lb_A713V, pDZ-ODC_Lb_A713R, pDZ-ODC_Lb_A713D, pDZ-ODC_Lb_A713W, pDZ-ODC_Lb_A713Q)는 서열분석으로 확인하였다.

락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 소수성 아미노산을 포함한 다른 아미노산으로 치환한 형태의 변이형들이 염색체 내에 삽입된 균주를 얻기 위해, 상기에서 제작된 pDZ-ODC_Lb_A713V, pDZ-ODC_Lb_A713R, pDZ-ODC_Lb_A713D, pDZ-ODC_Lb_A713W, pDZ-ODC_Lb_A713Q 재조합 벡터 각각을 실시예 7과 같은 방법으로 KCCM11240P 균주에 형질주입하고 선별하여 최종 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소 변이형들이 염색체에 도입된 균주를 얻을 수 있었다. 최종적으로 균주는 변이형들의 서열분석에 의해 확인되었다. 확인된 균주를 KCCM11240P::ODC_Lb_ A713V, KCCM11240P::ODC_Lb_ A713R, KCCM11240P::ODC_Lb_A713D, KCCM11240P::ODC_Lb_A713Q, KCCM11240P::ODC_Lb_A713W 로 명명하였다.

락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째의 알라닌이 소수성 아미노산을 포함한 다른 아미노산으로 치환된 형태의 변이형 도입으로 인한 퓨트레신 생산 균주의 퓨트레신 생산능의 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 7과 같은 방법으로 퓨트레신 생산능을 평가하였다.

그 결과 표 8에서 보는 바와 같이, 소수성을 포함한 다른 아미노산으로 치환한 형태의 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소 변이형을 도입한 균주 또한, 배양 12시간 후 대장균 유래 야생형의 오르니틴 탈탄산 효소를 갖는 균주(KCCM11240P) 대비 퓨트레신 생산량이 평균 약 86%P 만큼 증가하였다. 또한, 락토바실러스 유래 야생형의 오르니틴 탈탄산 효소를 갖는 균주 대비 평균 약 21%P 증가하는 양상을 보였다.

또한 퓨트레신 생산시 부반응으로 인한 카다베린 생산이 약 41%P 감소하고 배양액 내 잔류 포도당 농도로 미루어보아 동일 시간 내 당 소모량이 증가하여 생산성이 함께 증가함을 알 수 있다.

상기와 같은 결과는 락토바실러스 오르니틴 탈탄산 효소의 713번째 알라닌이 루신으로 치환된 변이형 외에도 다른 소수성 아미노산 중 하나인 발린, 염기성 아미노산 중 하나인 아르기닌, 산성 아미노산 중 하나인 아스파르트산, 중성 아미노산 중 하나인 글루타민, 방향족성 아미노산 중 하나인 트립토판으로 치환됨으로 인해 퓨트레신 생산균주에서 당 소모 대비 기존보다 높은 농도의 퓨트레신을 생산을 할 수 있을 뿐만 아니라, 카다베린 저감 및 생산성 향상의 효과를 가짐을 보여준다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

[서열목록]

한국미생물보존센터

KCCM11240P

20111226

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Ornithine Decarboxylase Variants and Methods for Producing Putrescine Using The Same <130> OPA-1648-PCT-T1 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 731 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ORNITHINE DECARBOXYLASE <400> 1 Met Ser Ser Ser Leu Lys Ile Ala Ser Thr Gln Glu Ala Arg Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Asp Thr Asp Arg Val Val Val Asp Ala Val Gly Ser Asp Phe Thr 20 25 30 Asp Val Gly Ala Val Ile Ala Met Asp Tyr Glu Thr Asp Val Ile Asp 35 40 45 Ala Ala Asp Ala Thr Lys Phe Gly Ile Pro Val Phe Ala Val Thr Lys 50 55 60 Asp Ala Gln Ala Ile Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys Ile Phe His Ile 65 70 75 80 Ile Asp Leu Glu Asn Lys Phe Asp Ala Thr Val Asn Ala Arg Glu Ile 85 90 95 Glu Thr Ala Val Asn Asn Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Pro Pro Phe Phe 100 105 110 Lys Ser Leu Lys Glu Tyr Val Ser Arg Gly Leu Ile Gln Phe Asp Cys 115 120 125 Pro Gly His Gln Gly Gly Gln Tyr Tyr Arg Lys His Pro Ala Gly Arg 130 135 140 Glu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Glu Thr Val Phe Arg Ala Asp Leu Cys 145 150 155 160 Asn Ala Asp Val Ala Leu Gly Asp Leu Leu Ile His Glu Gly Pro Ala 165 170 175 Val Ala Ala Glu Lys His Ala Ala Arg Val Tyr Asn Ala Asp Lys Thr 180 185 190 Tyr Phe Val Leu Gly Gly Ser Ser Asn Ala Asn Asn Thr Val Thr Ser 195 200 205 Ala Leu Val Ser Asn Gly Asp Leu Val Leu Phe Asp Arg Asn Asn His 210 215 220 Lys Ser Val Tyr Asn Ser Ala Leu Ala Met Ala Gly Gly Arg Pro Val 225 230 235 240 Tyr Leu Gln Thr Asn Arg Asn Pro Tyr Gly Phe Ile Gly Gly Ile Tyr 245 250 255 Asp Ser Asp Phe Asp Glu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Ala Ala Lys Val 260 265 270 Asp Pro Glu Arg Ala Lys Trp Lys Arg Pro Phe Arg Leu Ala Val Ile 275 280 285 Gln Leu Gly Thr Tyr Asp Gly Thr Ile Tyr Asn Ala His Glu Val Val 290 295 300 Lys Arg Ile Gly His Leu Cys Asp Tyr Ile Glu Phe Asp Ser Ala Trp 305 310 315 320 Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro Met Met Arg Asn Ser Ser Pro Leu 325 330 335 Leu Ile Asp Asp Leu Gly Pro Glu Asp Pro Gly Ile Ile Val Val Gln 340 345 350 Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe Ser Gln Thr Ser Gln 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taccctccag gagtattctg tgtagcacca ggtgaaaagt ggtcagaaac tgctgttaag 2040 tacttcacta tcttacaaga tggtatcaac aacttccctg gattcgctcc agaaatccaa 2100 ggtgtatact tcaagcaaga aggcgacaag gttgttgctt acggtgaagt ttacgatgca 2160 gaagttgcta agaacgatga tcgttacaac aactaa 2196 <210> 11 <211> 2196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO.2 <400> 11 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag 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2196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO.3 <400> 12 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg 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cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 cgtccattcc gtctggctgt tatccaatta ggtacttacg atggtactat ctacaacgca 900 cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga cgttaacgct gctatgcaag aaggcgaagc aggtcgcaag 1260 ttatggcatg accttctgat tactaccatt gaagctcgta agaagttgat caaggctggc 1320 tcaatgttcc gtccattcgt tccacctgtt gttaacggca agaagtggga agatggcgac 1380 actgaagata tggctaacaa cattgactac tggcgctttg aaaagggtgc taagtggcat 1440 gcttacgaag gctacggcga caaccaatac tacgttgatc caaacaagtt catgttaact 1500 acacctggta tcaacccaga aactggtgac tacgaagact tcggtgttcc agctactatc 1560 gttgctaact acttacgtga ccacggtatc atccctgaaa agtctgactt gaactctatc 1620 ttgttcttga tgactccagc tgaaactcca gctaagatga acaacctgat cactcaactt 1680 cttcaattac aacgcttgat cgaagaagat gctccattga agcaagttct tccttcaatc 1740 tacgctgcta acgaagaacg ttacaatggc tacactatcc gtgaactttg ccaagaattg 1800 cacgacttct acaagaacaa caacacgttc acataccaga agcgtctctt cttacgtgaa 1860 ttcttcccag aacaaggtat gcttccatac gaagctcgtc aagaattcat ccgcaaccac 1920 aacaagcttg ttccattgaa caagatcgaa ggcgaaatcg ccctcgaagg tgctcttcca 1980 taccctccag gagtattctg tgtagcacca ggtgaaaagt ggtcagaaac tgctgttaag 2040 tacttcacta tcttacaaga tggtatcaac aacttccctg gattcgctcc agaaatccaa 2100 ggtgtatact tcaagcaaga aggcgacaag gttgttcttt acggtgaagt ttacgatgca 2160 gaagttgcta agaacgatga tcgttacaac aactaa 2196 <210> 14 <211> 2196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO.5 <400> 14 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 cgtccattcc gtctggctgt tatccaatta ggtacttacg atggtactat ctacaacgca 900 cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga 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aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 cgtccattcc gtctggctgt tatccaatta ggtacttacg atggtactat ctacaacgca 900 cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga cgttaacgct gctatgcaag aaggcgaagc aggtcgcaag 1260 ttatggcatg accttctgat tactaccatt gaagctcgta agaagttgat caaggctggc 1320 tcaatgttcc gtccattcgt tccacctgtt gttaacggca agaagtggga agatggcgac 1380 actgaagata tggctaacaa cattgactac tggcgctttg aaaagggtgc taagtggcat 1440 gcttacgaag 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ID NO.7 <400> 16 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 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ccgcaaccac 1920 aacaagcttg ttccattgaa caagatcgaa ggcgaaatcg ccctcgaagg tgctcttcca 1980 taccctccag gagtattctg tgtagcacca ggtgaaaagt ggtcagaaac tgctgttaag 2040 tacttcacta tcttacaaga tggtatcaac aacttccctg gattcgctcc agatatccaa 2100 ggtgtatact tcaagcaaga aggcgacaag gttgttgctt acggtgaagt ttacgatgca 2160 gaagttgcta agaacgatga tcgttacaac aactaa 2196 <210> 18 <211> 2196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO.9 <400> 18 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc 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cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga cgttaacgct gctatgcaag aaggcgaagc aggtcgcaag 1260 ttatggcatg accttctgat tactaccatt gaagctcgta agaagttgat caaggctggc 1320 tcaatgttcc gtccattcgt tccacctgtt gttaacggca agaagtggga agatggcgac 1380 actgaagata tggctaacaa cattgactac tggcgctttg aaaagggtgc taagtggcat 1440 gcttacgaag gctacggcga caaccaatac tacgttgatc caaacaagtt catgttaact 1500 acacctggta tcaacccaga aactggtgac tacgaagact tcggtgttcc agctactatc 1560 gttgctaact acttacgtga ccacggtatc atccctgaaa agtctgactt gaactctatc 1620 ttgttcttga tgactccagc tgaaactcca gctaagatga acaacctgat cactcaactt 1680 cttcaattac aacgcttgat cgaagaagat gctccattga agcaagttct tccttcaatc 1740 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gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 cgtccattcc gtctggctgt tatccaatta ggtacttacg atggtactat ctacaacgca 900 cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga cgttaacgct gctatgcaag aaggcgaagc aggtcgcaag 1260 ttatggcatg accttctgat tactaccatt gaagctcgta agaagttgat caaggctggc 1320 tcaatgttcc gtccattcgt tccacctgtt gttaacggca agaagtggga agatggcgac 1380 actgaagata tggctaacaa cattgactac tggcgctttg aaaagggtgc taagtggcat 1440 gcttacgaag gctacggcga caaccaatac tacgttgatc caaacaagtt catgttaact 1500 acacctggta tcaacccaga aactggtgac tacgaagact tcggtgttcc agctactatc 1560 gttgctaact acttacgtga ccacggtatc atccctgaaa agtctgactt gaactctatc 1620 ttgttcttga tgactccagc tgaaactcca gctaagatga acaacctgat cactcaactt 1680 cttcaattac aacgcttgat cgaagaagat gctccattga agcaagttct tccttcaatc 1740 tacgctgcta acgaagaacg ttacaatggc tacactatcc gtgaactttg ccaagaattg 1800 cacgacttct acaagaacaa caacacgttc acataccaga agcgtctctt cttacgtgaa 1860 ttcttcccag aacaaggtat gcttccatac gaagctcgtc aagaattcat ccgcaaccac 1920 aacaagcttg ttccattgaa caagatcgaa ggcgaaatcg ccctcgaagg tgctcttcca 1980 taccctccag gagtattctg tgtagcacca ggtgaaaagt ggtcagaaac tgctgttaag 2040 tacttcacta tcttacaaga tggtatcaac aacttccctg gattcgctcc agaaatccaa 2100 ggtgtatact tcaagcaaga aggcgacaag gttgttgact acggtgaagt ttacgatgca 2160 gaagttgcta agaacgatga tcgttacaac aactaa 2196 <210> 27 <211> 2196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO.22 <400> 27 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 cgtccattcc gtctggctgt tatccaatta ggtacttacg atggtactat ctacaacgca 900 cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga cgttaacgct gctatgcaag aaggcgaagc aggtcgcaag 1260 ttatggcatg accttctgat tactaccatt gaagctcgta agaagttgat caaggctggc 1320 tcaatgttcc gtccattcgt tccacctgtt gttaacggca agaagtggga agatggcgac 1380 actgaagata tggctaacaa cattgactac tggcgctttg aaaagggtgc taagtggcat 1440 gcttacgaag gctacggcga caaccaatac tacgttgatc caaacaagtt catgttaact 1500 acacctggta tcaacccaga aactggtgac tacgaagact tcggtgttcc agctactatc 1560 gttgctaact acttacgtga ccacggtatc atccctgaaa agtctgactt gaactctatc 1620 ttgttcttga tgactccagc tgaaactcca gctaagatga acaacctgat cactcaactt 1680 cttcaattac aacgcttgat cgaagaagat gctccattga agcaagttct tccttcaatc 1740 tacgctgcta acgaagaacg ttacaatggc tacactatcc gtgaactttg ccaagaattg 1800 cacgacttct acaagaacaa caacacgttc acataccaga agcgtctctt cttacgtgaa 1860 ttcttcccag aacaaggtat gcttccatac gaagctcgtc aagaattcat ccgcaaccac 1920 aacaagcttg ttccattgaa caagatcgaa ggcgaaatcg ccctcgaagg tgctcttcca 1980 taccctccag gagtattctg tgtagcacca ggtgaaaagt ggtcagaaac tgctgttaag 2040 tacttcacta tcttacaaga tggtatcaac aacttccctg gattcgctcc agaaatccaa 2100 ggtgtatact tcaagcaaga aggcgacaag gttgtttggt acggtgaagt ttacgatgca 2160 gaagttgcta agaacgatga tcgttacaac aactaa 2196 <210> 28 <211> 2196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A DNA encoding a amino acid sequences of SEQ ID NO.23 <400> 28 atgagttctt ctcttaaaat tgcttcgact caagaagcgc gtcaatattt cgatactgac 60 cgcgttgttg tcgatgctgt aggctctgat tttactgatg tcggtgctgt tatcgcaatg 120 gattacgaaa cagatgtcat cgacgctgct gatgcaacta agtttggtat tcctgttttt 180 gccgtaacta aggatgccca agctatcagt gctgatgagc tgaagaagat tttccacatc 240 attgatttgg aaaacaaatt tgatgctact gttaacgctc gtgaaatcga aactgctgtt 300 aacaactacg aagacagcat tttaccacca ttcttcaagt cattgaaaga atacgttagc 360 cgtggtttaa tccaattcga ctgcccaggt caccaaggtg gtcaatacta cagaaagcac 420 ccagctggtc gtgaattcta cgacttcttc ggcgaaactg tcttccgtgc agacttatgt 480 aacgctgacg ttgccttggg tgacttgctg atccacgaag gtcctgctgt tgctgctgaa 540 aagcatgctg cacgtgttta caacgctgac aagacttact tcgttttagg tggttcttcc 600 aacgctaaca acactgtaac atctgcttta gtttctaacg gcgacttggt attgttcgac 660 cggaacaacc acaagtccgt ttacaactca gctttagcta tggctggtgg ccgtcctgtt 720 tacctccaaa caaaccgtaa cccatacggc ttcatcggtg gtatctacga cagcgacttc 780 gatgaaaaga agatccgtga actggcagct aaggttgacc cagaacgtgc taagtggaag 840 cgtccattcc gtctggctgt tatccaatta ggtacttacg atggtactat ctacaacgca 900 cacgaagttg taaagcgtat cggtcacctt tgtgattaca tcgaattcga ctctgcttgg 960 gtaggttacg aacaattcat tcctatgatg cgtaactctt caccattatt gattgatgac 1020 cttggtccag aagatcctgg tatcattgtt gttcaatcag ttcacaagca acaagccggc 1080 ttctcacaaa cttcacaaat ccacaagaag gatagccaca tcaagggtca attacgttac 1140 tgtgaccaca agcactttaa caactccttc aacttgttca tgtctacttc accattctac 1200 ccaatgtatg cagcattaga cgttaacgct gctatgcaag aaggcgaagc aggtcgcaag 1260 ttatggcatg accttctgat tactaccatt gaagctcgta agaagttgat caaggctggc 1320 tcaatgttcc gtccattcgt tccacctgtt gttaacggca agaagtggga agatggcgac 1380 actgaagata tggctaacaa cattgactac tggcgctttg aaaagggtgc taagtggcat 1440 gcttacgaag gctacggcga caaccaatac tacgttgatc caaacaagtt catgttaact 1500 acacctggta tcaacccaga aactggtgac tacgaagact tcggtgttcc agctactatc 1560 gttgctaact acttacgtga ccacggtatc atccctgaaa agtctgactt gaactctatc 1620 ttgttcttga tgactccagc tgaaactcca gctaagatga acaacctgat cactcaactt 1680 cttcaattac aacgcttgat cgaagaagat gctccattga agcaagttct tccttcaatc 1740 tacgctgcta acgaagaacg ttacaatggc tacactatcc gtgaactttg ccaagaattg 1800 cacgacttct acaagaacaa caacacgttc acataccaga agcgtctctt cttacgtgaa 1860 ttcttcccag aacaaggtat gcttccatac gaagctcgtc aagaattcat ccgcaaccac 1920 aacaagcttg ttccattgaa caagatcgaa ggcgaaatcg ccctcgaagg tgctcttcca 1980 taccctccag gagtattctg tgtagcacca ggtgaaaagt ggtcagaaac tgctgttaag 2040 tacttcacta tcttacaaga tggtatcaac aacttccctg gattcgctcc agaaatccaa 2100 ggtgtatact tcaagcaaga aggcgacaag gttgttcaat acggtgaagt ttacgatgca 2160 gaagttgcta agaacgatga tcgttacaac aactaa 2196

Claims

서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는, 오르니틴 탈탄산효소 변이형.
제1항에 있어서, 상기 713번째 위치의 아미노산 치환은, 알라닌을 제외한 소수성 아미노산, 염기성 아미노산, 산성 아미노산, 중성 아미노산, 또는 방향족성 아미노산으로의 치환인, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형.
제1항에 있어서, 상기 713번째 위치의 아미노산 치환은, A713L, A713I, A713V, A713R, A713D, A713W, 또는 A713Q 인, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형.
제1항에 있어서, 상기 698번째 위치의 아미노산 치환은, E698D인, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형.
제1항에 있어서, 상기 713번째 위치의 아미노산 치환은, A713L, A713I, A713V, A713R, A713D, A713W, 또는 A713Q이고, 상기 698번째 위치의 아미노산 치환은, E698D인, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형.
제1항에 있어서, 상기 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 19 내지 23 중에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인, 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 오르니틴 탈탄산 효소의 변이형을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물.
제8항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 인, 미생물.
서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산방법.
제10항에 있어서, 배지 내 퓨트레신을 축적하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산방법.
제10항에 있어서, 배양된 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산방법.
서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 퓨트레신의 순도를 증가시키는 방법.
서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린에 대한 퓨트레신의 비율을 증가시키는 방법.
퓨트레신으로 폴리아미드를 제조하는 방법으로서, 상기 퓨트레신은 서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 배양하여 제조된 것인, 폴리아미드 제조 방법.
서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 서열번호 1의 a) 713번째, b) 698번째, 또는 c) 713 및 698번째에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 서열번호 1의 폴리펩티드에 적어도 80% 이상, 100 % 미만의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 오르니틴 탈탄산효소를 포함하는 미생물을 포함하는 폴리아미드 제조용 조성물.