BR112020002107A2 - Variante da proteína do receptor camp, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero escherichia, método de produzir um l-aminoácido, uso de uma variante da proteína do receptor camp - Google Patents
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Abstract
variante da proteína do receptor camp, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo do gênero escherichia, método de produzir um l-aminoácido, uso de uma variante da proteína do receptor camp. trata-se de uma variante de proteína do receptor camp, um micro-organismo incluindo o mesmo, e um método de produzir um l-aminoácido usando o mesmo.
Description
1 / 30 VARIANTE DA PROTEÍNA DO RECEPTOR cAMP, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA, MÉTODO DE PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO, USO DE UMA VARIANTE DA PROTEÍNA DO RECEPTOR cAMP [CAMPO DA TÉCNICA]
[001] A presente divulgação refere-se a uma variante da proteína do receptor cAMP, um micro-organismo incluindo o mesmo, e um método de produzir um L-aminoácido usando o mesmo. [FUNDAMENTOS DA TÉCNICA]
[002] A PCR (proteína do receptor AMP cíclica), também chamada CAP (proteína ativadora de catabolito), é o regulador de transcrição mais conhecido em E. coli. A PCR é caracterizada por ter um mecanismo de regulação dependente da fonte de carbono, representado pela “repressão por catabolito”. Esta ação é desencadeada por uma concentração intracelular de AMP cíclico (daqui em diante, denominado como “cAMP”). Na presença de uma fonte de carbono preferível, como a glicose, a atividade do adenilato ciclase é inibida para diminuir o cAMP, e esse sinal inibe a expressão de genes catabólicos. No caso oposto, a atividade do adenilato ciclase é aumentada e, como resultado, os repressores são suprimidos e a expressão dos genes catabólicos é iniciada. Além disso, sabe-se que a PCR desempenha vários papéis, como transdução de sinal intracelular através de cAMP, regulação osmótica, respostas a situações urgentes de células, geração de biofilme, fixação de nitrogênio, transporte de ferro, etc.
[003] Supostamente, 418 genes de E. coli são regulados pela PCR, mas os mecanismos correspondentes ainda não foram claramente revelados (J Biol Eng. (2009) 24; 3:13). Com uma gama tão ampla de habilidades regulatórias, a PCR tem o potencial de mostrar uma variedade de fenótipos por mutações. Devido às suas vantagens, a PCR foi estudada como um alvo adequado para o redesenho de cepas no nível celular, aplicáveis a vários
2 / 30 ambientes. Recentemente, várias experiências foram conduzidas, como um método para alterar a expressão de genes a serem regulados, alterando o grau de ligação ao DNA pela variação de aminoácidos da PCR selecionada pela bioinformática (Nucleic Acids Research, (2009) 37:2493-2503), um método de seleção de E. coli resistente ao calor, osmose e baixa temperatura usando um fator de transcrição artificial (ATF) preparado pela fusão de um local de ligação ao DNA do dedo de zinco e da PCR (Nucleic Acids Research, (2008) 36:e102), etc. Por outras palavras, uma vez que as alterações na expressão de CRP promovem uma ampla gama de alterações na expressão dos genes a jusante, é provável que a CRP seja uma boa ferramenta para preparar micro- organismos com características úteis. [DIVULGAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]
[004] Os presentes inventores desenvolveram uma nova variante de proteína incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e descobriram que essa variante de proteína pode aumentar a produtividade de L-aminoácidos, completando assim a presente divulgação. [SOLUÇÃO DA TÉCNICA]
[005] Um objeto da presente divulgação é fornecer uma variante da proteína do receptor cAMP.
[006] Um outro objeto da presente divulgação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante da proteína do receptor cAMP.
[007] Ainda um outro objeto da presente divulgação é fornecer um vetor incluindo o polinucleotídeo.
[008] Ainda um outro objeto da presente divulgação é fornecer um micro-organismo do gênero Escherichia incluindo a variante.
[009] Ainda um outro objeto da presente divulgação é fornecer um método de produzir um L-aminoácido, o método incluindo cultivar o micro-
3 / 30 organismo do gênero Escherichia em um meio.
[0010] Ainda um outro objeto da presente divulgação é fornecer o uso da variante ou do micro-organismo do gênero Escherichia incluindo a variante na produção de L-aminoácido. [EFEITOS VANTAJOSOS]
[0011] Quando um micro-organismo do gênero Escherichia produzindo um L-aminoácido, o micro-organismo incluindo uma variante da proteína do receptor cAMP da presente divulgação, é cultivado, é possível produzir o L-aminoácido com um alto rendimento. Consequentemente, em aspectos industriais, pode ser esperada a redução dos custos de produção, juntamente com a conveniência da produção. [MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO]
[0012] A presente divulgação será descrita em detalhes a seguir. Enquanto isso, cada descrição e modalidade divulgada nesta divulgação também pode ser aplicada a outras descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações de vários elementos divulgados nesta divulgação se enquadram no escopo da presente divulgação. Além disso, o escopo da presente divulgação não é limitado pela descrição específica descrita abaixo.
[0013] Para alcançar os objetos acima, um aspecto da presente divulgação fornece uma variante de proteína do receptor cAMP incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Especificamente, a presente divulgação fornece a variante de proteína do receptor cAMP incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que as substituições de aminoácidos incluem a substituição de lisina por um aminoácido na posição 33 do N-terminal. Mais especificamente, a presente divulgação fornece a variante de proteína do receptor cAMP incluindo a substituição de lisina pelo aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
4 / 30
[0014] Como usado aqui, o termo “proteína do receptor cAMP (CRP)” é o regulador de transcrição mais conhecido em E. coli, e a CRP também é chamada de “regulador duplo”, porque a própria CRP tem ambas as funções de um ativador e um inibidor. A CRP geralmente se liga a uma sequência de DNA simétrica com 22 bases a montante de um gene estrutural para induzir a flexão do DNA, e a CRP atua como ativador, permitindo que um primeiro local ativo no C-terminal e um segundo local ativo no N-terminal interajam com RNA polimerase responsável pela transcrição, e atua como inibidor, ocupando a posição de impedir a ligação da proteína ativa ao local ativo ou ligando-se à proteína ativa para converter a estrutura em uma estrutura que não se liga ao local ativo. A proteína do receptor cAMP é uma proteína do receptor cAMP codificada por um gene crp.
[0015] A “proteína do receptor cAMP (proteína do receptor AMP cíclico, CRP)” da presente divulgação pode ser usada de forma intercambiável com uma proteína ativadora de catabolito (CAP), uma proteína CRP, uma proteína CAP, etc.
[0016] Na presente divulgação, uma sequência da CRP pode ser obtida a partir de um banco de dados conhecido GenBank no NCBI. Por exemplo, a CRP pode ser uma CRP derivada do gênero Escherichia (Escherichia sp.) e, mais especificamente, um polipeptídeo/proteína incluindo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, mas não está limitada a isso. Além disso, uma sequência com a mesma atividade que a sequência de aminoácidos acima pode ser incluída sem limitação. Além disso, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia ou identidade a ela pode ser incluída, mas não está limitada a esta. Especificamente, o aminoácido pode incluir o aminoácido da SEQ ID NO: 1 e um aminoácido possuindo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 1. Além disso, é aparente que uma proteína
5 / 30 com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída ou adicionada, pode estar dentro do escopo da presente divulgação, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia ou identidade acima e exiba a eficácia correspondente à proteína acima.
[0017] Como usado aqui, o termo “variante” refere-se a um polipeptídeo, do qual um ou mais aminoácidos diferem da sequência recitada em substituições e/ou modificações conservadoras, mas mantém funções ou propriedades da proteína. Os polipeptídeos variantes diferem de uma sequência identificada por substituição, exclusão ou adição de vários aminoácidos. Tais variantes podem ser geralmente identificadas modificando uma das sequências polipeptídicas acima e avaliando as propriedades do polipeptídeo modificado. Por outras palavras, a capacidade de uma variante pode ser aumentada, inalterada ou diminuída, em comparação com a de uma proteína nativa. Tais variantes podem ser geralmente identificadas através da modificação de uma das sequências polipeptídicas acima e da avaliação da reatividade do polipeptídeo modificado. Além disso, algumas variantes podem incluir aquelas nas quais uma ou mais porções, como uma sequência líder do N-terminal ou domínio transmembranar, foram removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma porção foi removida do N- e/ou C-terminal de uma proteína madura.
[0018] Como usado aqui, o termo “substituição conservadora” significa substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. A variante pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservadoras enquanto retém uma ou mais atividades biológicas. Tais substituições de aminoácidos podem geralmente ser feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos carregados negativamente
6 / 30 (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano, e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, glicina, e triptofano.
[0019] Além disso, as variantes podem incluir deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima nas propriedades e uma estrutura secundária do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou líder) no N-terminal da proteína, que dirige de forma cotranslacional ou pós-traducional a transferência da proteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado com outra sequência ou um ligante para identificação, purificação ou síntese do polipeptídeo.
[0020] Como usado aqui, o termo “variante da proteína do receptor cAMP” é uma variante da proteína do receptor cAMP incluindo uma ou mais substituições de aminoácido em uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo tendo atividade da proteína do receptor cAMP, em que as substituições de aminoácido incluem substituição de um outro aminoácido para o aminoácido na posição 33 a partir do N-terminal. Especificamente, a variante pode incluir uma variante da proteína, em que um outro aminoácido é substituído no lugar do aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácido do polipeptídeo tendo atividade de proteína do receptor AMP. Por exemplo, a variante da proteína pode incluir uma variante da proteína em que variação ocorre na posição 33 a partir do N-terminal da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Mais especificamente, a variante da proteína pode ser uma proteína em que um outro aminoácido é substituído no lugar do aminoácido na posição 33 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. O “um outro aminoácido” não é limitado, desde que seja um aminoácido exceto L- glutamina que é o aminoácido na posição 33. Especificamente, a variante pode ser uma proteína em que um aminoácido básico é substituído no lugar do aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
7 / 30 O aminoácido básico pode ser um de L-lisina, L-arginina, e L-histidina. Mais especificamente, a variante pode ser uma proteína em que lisina é substituída no lugar do aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, mas não é limitado a este.
[0021] Além disso, a variante significa uma variante com uma variação do aminoácido na posição 33 do N-terminal na sequência de aminoácidos acima descrita da SEQ ID NO: 1 e/ou na sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 1.
[0022] Como usado aqui, o termo “variante da proteína do receptor cAMP” pode ser usado de forma intercambiável com uma proteína de CRP variante, uma variante de CRP, uma proteína do receptor cAMP variante, uma proteína de CAP variante, uma proteína de CAP variante, uma variante de CAP, uma proteína ativadora de catabolito variante, um ativador de catabolito variante da proteína, etc.
[0023] Com relação aos objetos da presente divulgação, um micro- organismo incluindo a variante da proteína do receptor cAMP é caracterizado por ter alta produtividade de L-aminoácidos, em comparação com um micro- organismo que não inclui variante da proteína do receptor cAMP. A variante de CRP é caracterizada por ter uma atividade reguladora de genes para aumentar a produtividade de L-aminoácidos, em comparação com uma proteína do receptor cAMP nativa de tipo selvagem ou não variante. Isso é significativo, pois a produtividade de L-aminoácidos pode ser aumentada pelo micro-organismo introduzido com a variante de CRP da presente divulgação. Especificamente, o L-aminoácido pode ser L-treonina ou L-triptofano entanto, qualquer L-aminoácido pode ser incluído sem limitação, desde que possa ser produzido através da introdução ou inclusão da proteína do receptor cAMP variante.
[0024] A variante da proteína do receptor cAMP pode ser, por
8 / 30 exemplo, uma variante que inclui uma sequência de aminoácidos na qual outro aminoácido é substituído pelo aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, a variante composta por SEQ ID NO: 3. A variante na qual a lisina é substituída pelo aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 pode ser composta pela SEQ ID NO: 3, mas não está limitada a isso. Além disso, a variante de CRP pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos possuindo 80% ou mais de homologia ou identidade, mas não está limitada a ela. Especificamente, a variante de CRP da presente divulgação pode incluir a proteína que possui a SEQ ID NO: 3 e uma proteína que possui pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais homologia ou identidade. Além disso, é aparente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída ou adicionada, além da sequência de aminoácidos na posição 33, pode estar dentro do escopo da presente divulgação, desde que como a sequência de aminoácidos possui a homologia ou identidade acima e exibe eficácia correspondente à proteína acima.
[0025] Em outras palavras, mesmo que “uma proteína com uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO específica” seja descrita aqui, é aparente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída, substituída conservativamente, ou adicionado, pode ser utilizado na presente divulgação, desde que tenha atividade idêntica ou correspondente à da proteína composta da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, desde que uma proteína tenha atividade idêntica ou correspondente à da proteína variante, a adição de uma sequência que não altera a função da proteína antes e depois da sequência de aminoácidos, mutações que ocorrem naturalmente, mutações silenciosas ou substituições conservadoras não são excluídos. É aparente que, embora a proteína possua tal adição ou mutação de sequência, ela se enquadra
9 / 30 no escopo da presente divulgação.
[0026] Como usado aqui, o termo “homologia” ou “identidade” significa o grau de relevância entre duas sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas fornecidas e pode ser expresso como uma porcentagem.
[0027] Os termos “homologia” e “identidade” podem ser frequentemente usados permutavelmente.
[0028] A homologia ou identidade de sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com penalidades de intervalo padrão estabelecidas pelo programa utilizado. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar sob condições moderadas ou altamente rigorosas, de modo que o comprimento total da sequência ou pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais do comprimento total possa hibridizar. Também são contemplados polinucleotídeos que contêm códons degenerados no lugar de códons na hibridação.
[0029] Se duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas têm ou não homologia, semelhança ou identidade podem ser determinadas usando algoritmos de computador conhecidos como o programa “FASTA”, usando, por exemplo, os parâmetros padrão como em Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85]: 2444, ou determinado usando o algoritmo Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), conforme implementado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J. MOLEC BIOL 215]:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA /.] (1988) SIAM J
10 / 30 Applied Math 48:1073) Por exemplo, o BLAST do banco de dados do National Center for Biotechnology Information, ou ClustalW, pode ser usado para determinar a homologia, similaridade ou identidade.
[0030] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada, por exemplo, comparando informações de sequência usando um programa de computador GAP, como Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48:443, como divulgado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482. Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos), que são semelhantes, divididos pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como divulgado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, páginas 353-358 (1979) (ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão do intervalo de 0,5); e (3) nenhuma penalidade por lacunas finais. Portanto, como aqui utilizado, o termo “homologia” ou “identidade” representa relevância entre as sequências.
[0031] Um outro aspecto da presente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de CRP, ou um vetor incluindo o polinucleotídeo.
[0032] Como usado aqui, o termo “polinucleotídeo” refere-se a um filamento de DNA ou RAN tendo um comprimento predeterminado ou mais, que é um polímero de cadeia longa de nucleotídeos formado pela ligação de
11 / 30 monômeros de nucleotídeos por meio de ligações covalentes. Mais especificamente, o polinucleotídeo refere-se a um fragmento de polinucleotídeo que codifica a proteína variante.
[0033] O polinucleotídeo que codifica a variante de CRP da presente divulgação pode incluir qualquer sequência de polinucleotídeo sem limitação, desde que seja uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante da proteína do receptor de cAMP da presente divulgação. O polinucleotídeo que codifica a variante de CRP pode incluir qualquer sequência sem limitação, desde que seja uma sequência que codifique a proteína variante na qual outro aminoácido é substituído pelo aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Especificamente, o polinucleotídeo pode ser uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante na qual a lisina é substituída pelo aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP da presente divulgação pode ser uma sequência polinucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, mas não está limitada a ela. Mais especificamente, o polinucleotídeo pode ser composto de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 4, mas não está limitada a isso. No polinucleotídeo, várias modificações podem ser feitas na região de codificação, desde que não alterem a sequência de aminoácidos da proteína, devido à degenerescência do códon ou à consideração dos códons preferidos pelo organismo no qual a proteína deve ser expressa. Portanto, é aparente que, devido à degeneração do códon, um polinucleotídeo que pode ser traduzido no polipeptídeo composto pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou pelo polipeptídeo com homologia ou identidade a ele também pode ser incluído.
[0034] Além disso, uma sonda que pode ser produzida a partir de uma sequência nucleotídica conhecida, por exemplo, uma sequência que hibridiza com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência nucleotídica
12 / 30 sob condições rigorosas para codificar a variante de CRP na qual outro aminoácido é substituído por o aminoácido na posição 33 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 também pode ser incluído sem limitação.
[0035] O termo “condições rigorosas” significa condições sob as quais é permitida a hibridação específica entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., Supra). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais genes com alta homologia ou identidade, 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou superior, particularmente especificamente 99% ou superior de homologia ou identidade são hibridizados entre si e genes com homologia ou identidade inferior à homologia ou identidade acima não são hibridados entre si, ou condições de lavagem comuns da hibridação Southern, ou seja, lavagem uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 ºC, 1 × SSC, SDS a 0,1%, especificamente, 60 ºC, 0,1 × SSC, SDS a 0,1% e, mais especificamente, 68 ºC, 0,1 × SSC, SDS a 0,1%.
[0036] Embora possa ocorrer uma incompatibilidade entre nucleotídeos devido ao rigor da hibridação, é necessário que os dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que podem hibridar. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Por conseguinte, a presente divulgação pode incluir não apenas as sequências de ácidos nucleicos substancialmente semelhantes, mas também fragmentos de ácidos nucleicos isolados que são complementares a toda a sequência.
[0037] Especificamente, o polinucleotídeo possuindo homologia ou identidade pode ser detectado usando condições de hibridação, incluindo a
13 / 30 hibridação a um valor de Tm de 55 ºC e as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser 60 ºC, 63 ºC ou 65 ºC, mas não está limitado a isso, e pode ser adequadamente controlado por uma pessoa versada na técnica de acordo com os propósitos.
[0038] A estringência apropriada para a hibridação de polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar, Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
[0039] Como usado aqui, o termo “vetor” refere-se a uma construção de DNA que inclui uma sequência nucleotídica de um polinucleotídeo que codifica uma proteína variante alvo operacionalmente ligada a uma sequência reguladora apropriada para permitir a expressão da proteína variante alvo em uma célula hospedeira apropriada. A sequência reguladora pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência do operador para a regulação dessa transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado e uma terminação de regulação da transcrição e tradução. Depois que o vetor é transformado na célula hospedeira apropriada, ele pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro e pode ser integrado ao próprio genoma.
[0040] O vetor usado na presente divulgação não é particularmente limitado, desde que seja capaz de se replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores comumente usados podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc., podem ser usados como um vetor de fago ou vetor cosmídeo. Como vetor plasmídico, podem ser utilizados o tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL e tipo pET, etc. Especificamente, os vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc. podem ser usados.
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[0041] Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína variante alvo no cromossomo pode ser substituído por um polinucleotídeo mutado usando um vetor para inserção cromossômica intracelular. A inserção cromossômica do polinucleotídeo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga, mas não está limitado a isso. Um marcador de seleção para confirmar a inserção cromossômica pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção é para selecionar células transformadas com o vetor, ou seja, para confirmar a inserção do polinucleotídeo desejado, e o marcador de seleção pode incluir marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou expressão da superfície proteínas modificadas. Uma vez que apenas as células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou mostrar diferentes fenótipos sob o ambiente tratado com um agente seletivo, as células transformadas podem ser selecionadas. Como ainda outro aspecto da presente divulgação, a presente divulgação fornece um micro-organismo que produz o L-aminoácido, o micro-organismo incluindo a proteína variante ou o polinucleotídeo que codifica a proteína variante. Especificamente, o micro- organismo incluindo a proteína variante e/ou o polinucleotídeo que codifica a proteína variante pode ser um micro-organismo preparado por transformação com o vetor incluindo o polinucleotídeo que codifica a proteína variante, mas não está limitado a este.
[0042] Como aqui utilizado, o termo “transformação” significa a introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira de tal maneira que a proteína codificada pelo polinucleotídeo é expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, ele pode ser integrado e colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou pode existir extracromossômica ou independentemente da mesma. Além disso, o
15 / 30 polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido de qualquer forma, desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso nela. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene incluindo todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Geralmente, a cassete de expressão pode incluir um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, sinais de terminação transcricional, locais de ligação ao ribossomo e sinais de terminação da tradução. A cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo como ele pode ser introduzido na célula hospedeira e operacionalmente ligado às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira, mas não está limitado a isso.
[0043] Como usado aqui, o termo “ligado de maneira operável” significa uma ligação funcional entre a sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína variante desejada da presente divulgação e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição da sequência polinucleotídica.
[0044] Ainda um outro aspecto da presente divulgação fornece um micro-organismo do gênero Escherichia (Escherichia sp.) incluindo a variante da proteína do receptor cAMP.
[0045] Como usado aqui, o termo “micro-organismo incluindo a variante de CRP” pode se referir a um micro-organismo recombinante para expressar a variante de CRP da presente divulgação. Por exemplo, o micro- organismo refere-se a uma célula hospedeira ou um micro-organismo capaz de expressar a variante incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP ou transformando com o vetor incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP. Com relação aos objetos da presente divulgação, o micro- organismo é um micro-organismo que expressa a variante de proteína do receptor cAMP, incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos na
16 / 30 sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e o micro-organismo pode ser um micro-organismo que expressa a variante proteína que possui a atividade de proteína do receptor cAMP, em que a substituição de aminoácidos é a substituição de lisina pelo aminoácido na posição 33 do N-terminal, mas não está limitada a isso.
[0046] O micro-organismo incluindo a variante de CRP pode ser qualquer micro-organismo, desde que inclua a variante de CRP para expressar um L-aminoácido, por exemplo, L-treonina ou L-triptofano, mas não está limitado a isso. Por exemplo, o micro-organismo incluindo a variante de CRP pode ser um micro-organismo recombinante com produtividade aumentada de L-aminoácidos, que é preparado pela expressão da variante de CRP em um micro-organismo natural do tipo selvagem ou em um micro-organismo que produz o L-aminoácido. O micro-organismo recombinante com produtividade aumentada de L-aminoácidos pode ser um micro-organismo com produtividade aumentada de L-aminoácidos, em comparação com o micro- organismo natural do tipo selvagem ou o micro-organismo não modificado, em que o L-aminoácido pode ser L-treonina ou L-triptofano, mas não está limitado a isso.
[0047] Como usado aqui, o termo “micro-organismo que produz o L- aminoácido” inclui um micro-organismo do tipo selvagem ou um micro- organismo no qual ocorre modificação genética natural ou artificial, e pode ser um micro-organismo que possui um mecanismo enfraquecido ou aprimorado devido à inserção de um gene estranho ou devido ao aprimoramento ou inativação da atividade de um gene endógeno, no qual ocorre uma variação genética ou a atividade é aprimorada para produzir o L- aminoácido desejado. No que diz respeito aos objetos da presente divulgação, o micro-organismo que produz o L-aminoácido pode incluir a proteína variante para aumentar a produtividade do L-aminoácido desejado. Especificamente, o micro-organismo que produz o L-aminoácido ou o micro-
17 / 30 organismo com produtividade de L-aminoácido na presente divulgação pode ser um micro-organismo no qual parte dos genes envolvidos na via de biossíntese de L-aminoácidos é aprimorada ou enfraquecida, ou parte de genes envolvidos na via de degradação de L-aminoácidos são aumentados ou enfraquecidos.
[0048] O “micro-organismo não modificado” refere-se a uma cepa natural como ela é, ou a um micro-organismo que não inclui nenhuma variante de CRP ou a um micro-organismo que não é transformado com o vetor, incluindo o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP. O “micro- organismo” pode incluir qualquer um dos micro-organismos procarióticos e micro-organismos eucarióticos, desde que seja capaz de produzir o L- aminoácido. Por exemplo, o micro-organismo pode incluir micro-organismos do gênero Escherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Corynebacterium e Brevibacterium. Especificamente, o micro-organismo pode ser um micro- organismo do gênero Escherichia e, mais especificamente, E. coli, mas não está limitado a ele.
[0049] Ainda um outro aspecto da presente divulgação fornece um método de produzir o L-aminoácido, o método incluindo cultivar o micro- organismo do gênero Escherichia em um meio, o micro-organismo produzindo o L-aminoácido e incluindo a variante da proteína do receptor cAMP.
[0050] Os termos “variante da proteína do receptor cAMP” e “L- aminoácido” são os mesmos como descritos acima.
[0051] No método, a cultura do micro-organismo pode ser, mas não está particularmente limitada a, realizada por cultura em lote conhecida, cultura contínua, cultura em lote alimentado, etc. Nesse sentido, as condições da cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente pH 6 a 8, e mais especificamente pH 6,8) podem ser mantidos usando um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio,
18 / 30 hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico) Além disso, as condições aeróbicas podem ser mantidas através da introdução de oxigênio ou mistura gasosa de oxigênio em uma cultura de células. A temperatura da cultura pode ser mantida entre 20 ºC e 45 ºC, e especificamente entre 25 ºC e 40 ºC. A cultura pode ser realizada por cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, mas não está limitada a isso. O L- aminoácido produzido pela cultura acima pode ser excretado para um meio de cultura ou pode permanecer dentro das células.
[0052] Além disso, o meio de cultura a ser usado pode incluir, como fontes de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleo e gordura (por exemplo, óleo de soja, semente de girassol óleo, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) individualmente ou em combinação, mas não está limitado a isso. Como fontes de nitrogênio, compostos orgânicos contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, milhocina, farelo de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, amônio carbonato e nitrato de amônio) podem ser usados individualmente ou em combinação, mas não se limitam a isso. Como fontes de fósforo, o hidrogenofosfato dipotássico, o di-hidrogenofosfato de potássio e os sais de sódio correspondentes podem ser utilizados individualmente ou em combinação, mas não estão limitados a isso. Além disso, o meio pode incluir substâncias essenciais para estimular o crescimento, incluindo outros sais de metais (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.
[0053] O método pode ainda compreender coletar o L-aminoácido do micro-organismo ou do meio.
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[0054] Um método para coletar o L-aminoácido produzido na cultura da presente divulgação pode coletar o L-aminoácido desejado do caldo de cultura usando um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc., podem ser utilizados, e o L- aminoácido desejado pode ser coletado do meio ou micro-organismo usando um método apropriado conhecido na técnica.
[0055] Além disso, a coleta pode incluir um processo de purificação e pode ser realizada usando um método apropriado conhecido na técnica. Portanto, o L-aminoácido a ser coletado pode ser uma forma purificada ou um caldo de fermentação do micro-organismo, incluindo o L-aminoácido (Introdução à Biotecnologia e Engenharia Genética, A. J. Nair., 2008).
[0056] Ainda um outro aspecto da presente divulgação fornece o uso da variante da proteína do receptor cAMP na produção de L-aminoácido, a variante da proteína do receptor cAMP incluindo uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
[0057] Ainda um outro aspecto da presente divulgação fornece o uso do micro-organismo do gênero Escherichia na produção de L-aminoácido, o micro-organismo do gênero Escherichia incluindo a variante da proteína do receptor cAMP.
[0058] O termo “variante da proteína do receptor cAMP” e “L- aminoácido” são o mesmo como descrito acima. [MODO PARA A INVENÇÃO]
[0059] Em seguida, a presente divulgação será descrita em mais detalhe com referência aos Exemplos. Entretanto, é evidente para as pessoas versadas na técnica que estes Exemplos são para propósitos ilustrativos apenas, e o escopo da presente divulgação não é intencionado a ser limitado a esses Exemplos. EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE pCC1BAC-crp DE VETOR
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RECOMBINANTE 1-1. PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE GENE crp
[0060] Para obter cerca de 0,96 kb de um fragmento de DNA da SEQ ID NO: 5, incluindo o gene crp e uma região reguladora da expressão, o DNA genômico (gDNA) de uma E. coli W3110 de tipo selvagem foi extraído usando um sistema de ponta genômica da Qiagen (empresa) e a PCR (reação em cadeia da polimerase) foi realizada usando o gDNA como modelo e um kit de pré-mistura de PCR HL (fabricado pela BIONEER Co., o mesmo se aplica a seguir). A PCR para amplificação do fragmento do gene crp foi realizada usando os iniciadores da SEQ ID NOS: 6 e 7 por 27 ciclos consistindo em desnaturação a 95 ºC por 30 s, recozimento a 56 ºC por 30 s e alongamento a 72 ºC por 2 minutos.
[0061] O produto de PCR foi digerido com EcoR I e a eletroforese em gel de agarose a 0,8% e a eluição foram realizadas para obter um fragmento de DNA de 0,96 Kb (em seguida, denominado como “fragmento de crp”). [TABELA 1] SEQ ID Nº Nome do Iniciador Sequência (5’-3’) 6 crp-F CACGAATTCTTTGCTACTCCACTGCGTCA 7 crp-R ACACGAATTCTTAACGAGTGCCGTAAACG 1-2. PREPARAÇÃO DE pCC1BAC-crp DE VETOR RECOMBINANTE
[0062] O vetor pCC1BAC Copycontrol (EPICENTRE, EUA) foi tratado com EcoR I, e eletroforese em um gel de agarose a 0,8% e eluição foram realizadas para obter um produto, que depois foi ligado com o fragmento de crp obtido no exemplo 1 - 1, desse modo preparando um plasmídeo de pCC1BAC-crp. EXEMPLO 2. PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE VARIANTE DE PCC1BAC-PCR DE VETOR RECOMBINANTE 2-1. PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE crp MUTANTE POR PCR
[0063] A PCR foi realizada usando o DNA genômico de uma E. coli W3110 de tipo selvagem como modelo e um kit de mutagênese aleatória de
21 / 30 PCR diversificada (catálogo #: K1830-1, Tabela III, reações de mutagênese 4) da clonetech. Em detalhe, a PCR foi realizada utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7, como utilizada no Exemplo 1-1, durante 27 ciclos consistindo em desnaturação a 94 ºC durante 30 segundos e alongamento a 68 ºC durante 1 minuto.
[0064] O produto de PCR foi digerido com EcoR I e a eletroforese em gel de agarose a 0,8% e a eluição foram realizadas para obter um fragmento de mutação de crp de 0,96 Kb (daqui em diante, denominado como “fragmento de crpm”). 2-2. PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE VARIANTE DE pCC1BAC- crp DE VETOR RECOMBINANTE
[0065] Um vetor pCC1BAC foi tratado com uma enzima de restrição EcoR I e depois tratado com fosfatase alcalina (NEB). O vetor preparado foi ligado ao fragmento de crpm obtido no Exemplo 2-1 e o produto de ligação foi transformado em E. coli eletrocompetente TransforMax EPI300 (EPICENTER, EUA) por eletroforese. A cepa transformada foi cultivada em meio sólido LB (15 µg/ml) contendo cloranfenicol para selecionar colônias. As colônias assim obtidas foram coletadas e submetidas à preparação de plasmídeo, preparando assim uma biblioteca de pCC1BAC-crpm. EXEMPLO 3. INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA VARIANTE DE crp
COM CRESCIMENTO MELHORADO 3-1. INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA DE pCC1BAC-crpm EM CEPA
[0066] A biblioteca de pCC1BAC-crpm obtida no Exemplo 2 foi transformada em células eletro-competentes de KCCM10541, que é um micro-organismo produtor de treonina por eletroporação. E. coli KCCM10541 (Patente Coreana Nº 10-0576342) utilizada neste Exemplo é E. coli preparada por inativação do gene galR em uma E. coli KFCC10718 produtora de L-
22 / 30 treonina (Patente Coreana Nº 10-0058286).
[0067] Como um grupo de controle do micro-organismo introduzido na biblioteca pCC1BAC-crpm, o pCC1BAC-crp foi transformado em KCCM10541 da mesma maneira que acima para preparar KCCM10541/pCC1BAC-crp (WT). 3-2. COMPARAÇÃO DE TAXA DE CRESCIMENTO DE
[0068] Um meio mínimo M9 contendo glicose a 1% e 0,2 g/l de extrato de levedura foi dispensado em uma microplaca de poço profundo e, em seguida, o transformante e a cepa de controle preparada no Exemplo 3-1 foram semeados, respectivamente. As cepas foram cultivadas usando um agitador de incubadora de temperatura constante de tamanho micro (TAITEC, Japão) sob condições de 37 ºC e 200 rpm por um método de HTS (Rastreio de Alto Rendimento) por 20 horas, e as cepas com melhor crescimento foram selecionadas. Entre eles, um tipo de cepa foi finalmente selecionado (Tabela 2).
[0069] A cepa KCCM10541 introduzida com o gene crp do tipo selvagem mostrou um ligeiro aumento no valor de OD devido à introdução adicional de crp, enquanto o transformante com melhor crescimento apresentou um alto valor de DO após o mesmo tempo de cultura, em comparação com a CRP do tipo selvagem estirpe não introduzida. Além disso, a variante de crp selecionada foi submetida à minipreparação de plasmídeo, seguida por análise de sequenciação. Os resultados estão resumidos na Tabela 2. [TABELA 2]
MELHORADO DEPOIS DE INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA DE crpm EM CEPA PRODUTORA DE TREONINA Cepa OD600 Variação KCCM10541/pCC1BAC 2,3 - KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) 2,8 - KCCM10541/pCC1BAC-crpTM3 3,9 Q33K
23 / 30 3-3. COMPARAÇÃO DO TÍTULO DE TREONINA DE
[0070] Para medir o título de treonina do micro-organismo recombinante selecionado no Exemplo 3-2, o micro-organismo recombinante foi cultivado em um meio de titulação de treonina preparado como na composição da Tabela 3 a seguir para examinar a melhoria da produtividade da L-treonina. [TABELA 3]
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TITULAÇÃO DE TREONINA Composição Concentração (por litro) Glicose 70 g KH2PO4 2g (NH4)2SO4 25 g MgSO4·7H2O 1g FeSO4·7H2O 5 mg MnSO4·4H2O 5 mg Extrato de levedura 2g Carbonato de cálcio 30 g pH 6,8
[0071] Em detalhe, cada uma das alças de platina de E. coli KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) e E. coli KCCM10541/pCC1BAC-crpTM3 cultivadas durante a noite em meio sólido LB em uma incubadora a 33 ºC foi inoculada em 25 ml do meio de titulação da Tabela 3, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 33 ºC e 200 rpm por 48 horas para comparar as taxas de consumo de açúcar e as concentrações de treonina.
[0072] Como um resultado, como descrito na seguinte Tabela 4, a cepa KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) como o grupo de controle mostrou consumo de açúcar de 26,1 g/l em 24 horas, enquanto a cepa mutante introduzida por crpTM3 mostrou cerca de 21% e melhoria de 16% na taxa de consumo de açúcar, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[0073] Além disso, quando cultivada por 48 horas, a cepa introduzida por crp do tipo selvagem mostrou 29,0 g/l de produção de L-treonina, enquanto a produção de L-treonina da cepa mutante obtida acima foi
24 / 30 aumentada para 32,5 g/l, mesmo que a velocidade da cultura fosse aumentada, mostrando uma melhoria de cerca de 13% e 12% na concentração, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[0074] Visto que, a introdução da variante de crp aumentou o rendimento e o consumo de açúcar da cepa, parece ser uma boa característica da variante, o que pode contribuir muito para melhorar a eficiência da produção durante a fermentação. [TABELA 4]
COMPARAÇÃO DO TÍTULO DE CEPA DE TREONINA INCLUINDO VARIANTE DE crp Cepa Consumo de açúcar (g/l)* Treonina (g/l)** KCCM10541/pCC1BAC 25,0 28,8 KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT) 26,1 29,0 KCCM10541/pCC1BAC-crpTM3 30,2 32,5 * valor medido em 24 h ** valor medido em 48 h EXEMPLO 4. INTRODUÇÃO DE VARIANTE DE pCC1BAC-crpTM3
EM CEPA PRODUTORA DE TRIPTOFANO 4-1. INTRODUÇÃO DE pCC1BAC-crpTM3 EM CEPA DE
[0075] pCC1BAC-crpTM3 obtido no exemplo 3 transformado em células eletrocompetentes de uma cepa produtora de triptofano KCCM11166P por eletroporação. O KCCM11166P utilizado neste exemplo é uma E. coli produtora de L-triptofano, na qual o gene tehB foi excluído e a atividade da NAD cinase foi aumentada (Patente Coreana Nº 10-1261147).
[0076] Como um grupo de controle do micro-organismo introduzido no pCC1BAC-crpTM3, o pCC1BAC-crp (WT) foi transformado em KCCM11166P da mesma maneira que acima para preparar KCCM11166P/pCC1BAC-crp (WT). 4-2. COMPARAÇÃO DE TAXA DE CRESCIMENTO DE
25 / 30
[0077] Um meio mínimo M9 contendo glicose a 1% e 0,2 g/l de extrato de levedura foi dispensado em uma microplaca de poço profundo e, em seguida, o transformante e a cepa de controle preparada como no Exemplo 4-1 foram semeados, respectivamente. As cepas foram cultivadas usando um agitador de incubadora de temperatura constante de tamanho micro (TAITEC, Japão) sob condições de 37 ºC e 200 rpm por um método de HTS (Rastreio de Alto Rendimento) por 16 horas para confirmar a melhoria do crescimento do transformante KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3 (Quadro 5).
[0078] A cepa KCCM11166P introduzida com o gene crp do tipo selvagem mostrou um nível equivalente de DO devido à introdução adicional de crp após o mesmo tempo de cultura, enquanto o transformante com crescimento melhorado mostrou um alto valor de DO, em comparação com a CRP do tipo selvagem. [TABELA 5]
INFORMAÇÃO DE TRANSFORMANTE COM CRESCIMENTO MELHORADO DEPOIS DE INTRODUÇÃO DE crpTM3 EM CEPA
PRODUTORA DE TRIPTOFANO Cepa OD600 Variação KCCM11166P/pCC1BAC 3,4 - KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT) 3,5 - KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3 3,9 Q33K 4-3. COMPARAÇÃO DE TÍTULO DE TRIPTOFANO DE
[0079] Para medir o título de triptofano do micro-organismo recombinante preparado no Exemplo 4-2, o micro-organismo recombinante foi cultivado em um meio de titulação de triptofano preparado como na composição da seguinte Tabela 6 para examinar melhoria de produtividade de L-triptofano. [TABELA 6]
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TITULAÇÃO DE TRIPTOFANO Composição Concentração (por litro) Glicose 60 g K2HPO4 1g
26 / 30 (NH4)2SO4 10 g NaCl 1g MgSO4·7H2O 1g Citrato de sódio 5g Extrato de levedura 2g Carbonato de cálcio 40 g Citrato de sódio 5g Fenil alanina 0,15 g Tirosina 0,1 g pH 6,8
[0080] Em detalhe, cada uma das alças de platina de E. coli KCCM11166P/pCC1BAC-crp (WT) e E. coli KCCM11166P/pCC1BAC- crpTM3 cultivadas durante a noite em meio sólido LB em uma incubadora a 37 ºC foi inoculada em 25 ml do meio de titulação da Tabela 6, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 37 ºC e 200 rpm por 48 horas para comparar as taxas de consumo de açúcar e as concentrações de triptofano Como resultado, conforme descrito na Tabela 7 a seguir, a cepa KCCM11166P/pCC1BAC-crp (WT) como grupo controle apresentou consumo de açúcar de 30,2 g/l às 22 horas, enquanto a cepa mutante introduzida por crpTM3 mostrou cerca de 12% e Melhoria de 8% na taxa de consumo de açúcar, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por CRP do tipo selvagem, respectivamente.
[0081] Quando cultivada por 48 horas, a cepa introduzida por crp do tipo selvagem mostrou 8,4 g/l de produção de L-triptofano, enquanto a produção de L-triptofano da cepa mutante obtida acima foi aumentada para 9,0 g/l, embora a velocidade da cultura fosse aumentada, mostrando uma melhora de cerca de 7% e 10% na concentração, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[0082] Visto que, a introdução da variante de crp aumentou o consumo de açúcar da cepa e o rendimento, parece ser uma boa característica da variante, o que pode contribuir muito para melhorar a eficiência da produção durante a fermentação. [Tabela 7]
27 / 30 INCLUINDO VARIANTE DE crp Cepa Consumo de açúcar (g/l)* Triptofano (g/l)** KCCM11166P/pCC1BAC 29,0 8,2 KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT) 30,2 8,4 KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM3 32,5 9,0 * valor medido em 22 h ** valor medido em 48 h EXEMPLO 5. INTRODUÇÃO DE VETOR ENDÓGENO DA VARIANTE DE crp EFICAZ EM E. coli DO TIPO SELVAGEM 5-1. INTRODUÇÃO DA VARIANTE DE pCC1BAC-crp EFICAZ CEPA
[0083] Para examinar se o vetor incluindo a variante de crp rastreada no Exemplo 3 também mostrou efeitos equivalentes na cepa do tipo selvagem, o vetor pCC1BAC-crp (WT) ou pCC1BAC-crpTM3 foi transformado na cepa derivada do tipo selvagem capaz de produzir treonina por eletroporação, respectivamente. Além disso, uma cepa induzida por pCC1BAC-crp (WT) foi preparada como um grupo controle.
[0084] A cepa derivada do tipo selvagem capaz de produzir treonina utilizada neste Exemplo é W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC. W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC é uma cepa na qual um promotor nativo de um gene ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilase no cromossomo foi substituído por um promotor de um gene cysK e um gene de operon de biossíntese de treonina foi introduzido na forma de um vetor para aumentar o número de cópias, aumentando assim a produtividade da treonina. Em detalhes, uma cepa W3110:PcycK-ppc foi preparada usando pUCpcycKmloxP da mesma maneira descrita na Patente Coreana Nº 10- 0966324, e pACYC184-thrABC (Patente Coreana Nº 10-1865998) foi transformada na cepa por eletroporação.
[0085] As cepas preparadas foram cultivadas em um meio de teste de treonina preparado como na composição da Tabela 8 a seguir, e as taxas de crescimento e produtividades de L-treonina foram comparadas. [TABELA 8]
28 / 30
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TESTE DE TREONINA Composição Concentração (por litro) Glicose 70 g KH2PO4 2g (NH4)2SO4 25 g MgSO4·7H2O 1g FeSO4·7H2O 5 mg MnSO4·7H2O 5 mg DL-metionina 0,15 g Extrato de levedura 2g Carbonato de cálcio 30 g pH 6,8
[0086] Em detalhes, cada uma das alças de platina de W3110 e as respectivas cepas cultivadas durante a noite em um meio sólido LB em uma incubadora a 33 ºC foi inoculada em 25 ml do meio de titulação da Tabela 8, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 33 ºC e 200 rpm por 48 horas. Os resultados dos mesmos são mostrados na Tabela 9 a seguir. Como mostrado nos resultados a seguir, a proteína variante selecionada na presente divulgação também é capaz de produzir eficientemente treonina com alto rendimento na cepa do tipo selvagem. [TABELA 9]
DE TREONINA DE CEPA DERIVADA DO TIPO SELVAGEM Cepa OD Treonina (g/l)** W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC 10,8 1,5 W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC-crp(WT) 11,0 1,6 W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC-crpTM3 13,5 2,5 5-2. INTRODUÇÃO DE VARIANTE DE pCC1BAC-crp EFICAZ EM
[0087] Para examinar se o vetor incluindo a variante de crp rastreada no Exemplo 4 também mostrou efeitos equivalentes na cepa do tipo selvagem, o vetor pCC1BAC-crp(WT) ou pCC1BAC-crpTM3 foi transformado na cepa derivada do tipo selvagem capaz de produzir triptofano, respectivamente.
[0088] A cepa derivada do tipo selvagem capaz de produzir triptofano utilizado neste exemplo é W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA. W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA é uma cepa introduzida com um vetor no
29 / 30 qual um mecanismo regulador de uma região reguladora de operon de triptofano foi liberado e a expressão do operon de triptofano foi aprimorada para superexpressar o triptofano (Patente Coreana Nº 10-1532129). As cepas introduzidas com vetor foram cultivadas em um meio de teste de triptofano preparado como na composição da Tabela 10 a seguir, e suas produtividades de L-triptofano foram comparadas. [TABELA 10]
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TESTE DE TRIPTOFANO Composição Concentração (por litro) Glicose 2g K2HPO4 1g (NH4)2SO4 12 g NaCl 1g Na2HPO4·H2O 5g MgSO4·H2O 1g MnSO4·H2O 15 mg CuSO4·H2O 3 mg ZnSO4·H2O 30 mg Citrato de sódio 1g Extrato de levedura 1g Fenil alanina 0,15 g pH 6,8
[0089] Em detalhes, cada uma das alças de platina das cepas cultivadas durante a noite em um meio sólido LB em uma incubadora a 37 ºC foi inoculada em 25 ml do meio de teste da Tabela 9, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 37 ºC e 200 rpm por 48 horas. Os valores de OD e as concentrações de triptofano foram comparados e mostrados na Tabela 11. Como mostrado nos resultados a seguir, a proteína variante selecionada na presente divulgação também é capaz de produzir eficientemente triptofano com alto rendimento na cepa do tipo selvagem. [TABELA 11]
DE TRIPTOFANO OF CEPA DERIVADA DO TIPO SELVAGEM Cepa OD Triptofano (g/l)** W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA/pCC1BAC 10,8 0,5 W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA/pCC1BAC-crp(WT) 11,0 0,6 W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA/pCC1BAC-crpTM3 12,7 0,9
[0090] Os presentes inventores designaram a cepa introduzida com
30 / 30 pCC1BAC-crpTM3 baseada em KCCM11166P, tendo melhor produtividade de triptofano e taxa de consumo de açúcar (KCCM11166P/pCC1BAC- crpTM3) como “CA04-2807” e depois depositaram a cepa no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM), que é a autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 7 de novembro de 2018 com o número de acesso KCCM12373P.
[0091] Esses resultados indicam que a taxa de consumo de açúcar foi aprimorada e a produtividade de L-aminoácidos foi aumentada no micro- organismo introduzido pela variante de crp do gênero Escherichia da presente divulgação, e consequentemente, a produtividade de L-aminoácidos foi aumentada, em comparação com a cepa não modificada.
[0092] Com base na descrição acima, será entendido pelas pessoas versadas na técnica que a presente invenção pode ser implementada em uma forma específica diferente sem alterar o espírito técnico ou as características essenciais da mesma. Portanto, deve ser entendido que a modalidade acima não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadram dentro das divisas e limites das reivindicações, ou equivalentes de tais divisas e limites, portanto, devem ser adotadas pelas reivindicações.
Claims (11)
1. Variante da proteína do receptor cAMP, caracterizada por a lisina ser substituída no lugar de um aminoácido na posição 33 em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
2. Polinucleotídeo, caracterizado por codificar a variante da proteína do receptor cAMP, de acordo com a reivindicação 1.
3. Vetor, caracterizado por compreender um polinucleotídeo que codifica a variante da proteína do receptor cAMP, de acordo com a reivindicação 1.
4. Micro-organismo do gênero Escherichia (Escherichia sp.), caracterizado por compreender uma variante da proteína do receptor cAMP em que lisina é substituída no lugar de um aminoácido na posição 33 em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
5. Micro-organismo do gênero Escherichia de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o micro-organismo do gênero Escherichia ser E. coli.
6. Micro-organismo do gênero Escherichia de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o micro-organismo do gênero Escherichia produzir um L-aminoácido.
7. Micro-organismo do gênero Escherichia de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o L-aminoácido é L-treonina ou L- triptofano
8. Método de produzir um L-aminoácido, o método caracterizado por compreender: cultivar um micro-organismo do gênero Escherichia em um meio, o micro-organismo incluindo uma variante da proteína do receptor cAMP em que lisina é substituída no lugar de um aminoácido na posição 33 em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ainda compreender coletar o L-aminoácido a partir do micro-organismo ou do meio.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o L-aminoácido é L-treonina ou L-triptofano
11. Uso de uma variante da proteína do receptor cAMP, caracterizada por a lisina ser substituída no lugar de um aminoácido na posição 33 em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou um micro- organismo do gênero Escherichia incluindo a variante na produção de L- aminoácido.
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|---|---|---|---|
| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |