JP6935584B2 - Camp受容タンパク質変異体及びそれを用いたl−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
1−1.遺伝子crp断片の準備
遺伝子crpと発現調節部位を含む配列番号5のDNA断片約0.96kbを得るために、Qiagen(社)のGenomic−tipシステムを用いて大腸菌野生株であるW3110の染色体DNA(gDNA)を抽出し、前記gDNAを鋳型としてPCR HL premix kit(BIONEER社製、以下同じ)を用いてPCR(polymerase chain reaction)を行った。遺伝子crp断片部位を増幅させるためのPCRは、配列番号6及び7のプライマーを用いて95℃で30秒の変性(denaturation)、56℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(elongation )からなるサイクルを27回繰り返し行った。
1−2.組換えベクターpCC1BAC−crpの製作
Copycontrol pCC1BACベクター(EPICENTRE、USA)をEcoRIで処理して0.8%アガロースゲル(agarose gel)で電気泳動した後、溶出して収得し、実施例1−1で得られたcrp断片をライゲーション(ligation)させて pCC1BAC−crpプラスミドを作製した。
2−1.error−prone PCRを用いた突然変異crp断片の準備
野生型大腸菌であるW3110染色体DNAを鋳型にclonetech社diversify PCR random mutagenesis kit(catalog#:K1830-1、TableIII、mutagenesis reactions 4)を用いてPCRを行った。具体的には、PCRは実施例1−1で用いられた配列番号6及び7のプライマーを用い、94℃で30秒の変性(denaturation)、68℃で1分の伸長(elongation)からなるサイクルを27回繰り返して行った。
ベクターpCC1BACを制限酵素EcoRIで処理した後、アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase(NEB))を処理して準備した。用意されたベクターに実施例2−1で収得したcrpm断片をライゲーション(ligation)させてTransforMax EPI300 Electrocompetent E.coli(EPICENTRE、USA)に電気穿孔法を用いて形質転換した。形質転換させた菌株は、クロラムフェニコールを含むLB固体培地(15μg/ml)でコロニー(colony)を選別した。このように獲得されたコロニーを集めてプラスミドプレップ(plasmid prep)を行い、pCC1BAC−crpmlibraryを作製した。
3−1.pCC1BAC−crpmlibraryのトレオニン生産菌株の導入
実施例2で収得したpCC1BAC−crpmlibraryをトレオニンを生産する微生物KCCM10541のelectroコンピテントセルに電気穿孔法を用いて形質転換(transformation)させて導入した。本実施例で用いられた大腸菌KCCM10541(特許文献1)は、L−トレオニンを生産する大腸菌KFCC10718(特許文献2)からgalR遺伝子が不活性化された大腸菌である。
1%グルコース(glucose)、0.2g/Lの酵母抽出物(yeast extract)が含まれたM9最小培地をディープウェルマイクロプレートに分注した後、前記実施例3−1で作られた形質転換体及び対照群菌株を接種した。マイクロサイズ恒温培養器シェーカー(Micro size constant temperature incubator shaker、TAITEC、Japan)を用いて(37℃、200rpmの条件)、HTS(High Throughput Screening)の方法で20時間、前記菌株を培養して成長が改善された菌株を選別し、そのうち、最終的に1種の菌株を選別した(表2)。
3−3.組換え微生物のトレオニン力価の比較
前記実施例3−2で選別された組換え微生物のトレオニン力価を測定するために、下記表3の組成に従って製造されたトレオニン力価培地で培養し、L−トレオニン生産性の向上を確認した。
具体的には、33℃培養機(incubator)内のLB固体培地で一晩培養した大腸菌KCCM10541/pCC1BAC−crp(WT)及び大腸菌KCCM10541/pCC1BAC−crpTM9をそれぞれ前記表3の25mLの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを33℃、200rpmの培養機で48時間培養して糖の消耗速度及びトレオニン濃度を比較した。
実施例4.pCC1BAC−crpTM9変異体のトリプトファン生産菌株の導入
4−1.pCC1BAC−crpTM9のスクリーニング菌株の導入
実施例3で得られたpCC1BAC−crpTM9をトリプトファンを生産する菌株KCCM11166Pのelectroコンピテントセルに電気穿孔法を用いて形質転換(transformation)させて導入した。本実施例で用いられたKCCM11166PはtehB遺伝子が欠失され、NADキナーゼの活性が強化されたL−トリプトファン生産大腸菌である( 特許文献3)。
1%グルコース、0.2g/Lの酵母抽出物が含まれたM9最小培地をディープウェルマイクロプレートに分注した後、前記実施例4−1で記述したように作られた形質転換体及び対照群菌株を接種した。マイクロサイズ恒温培養器シェーカー(Micro size constant temperature incubator shaker、TAITEC、Japan)を用いて(37℃、200rpmの条件)、HTS(High Throughput Screening)の方法で16時間前記菌株を培養して、KCCM11166P/pCC1BAC−crpTM9形質転換体の成長が改善されることを確認した(表5)。
4−3.組換え微生物のトリプトファン力価の比較
前記実施例4−2で製造した組換え微生物のトリプトファン力価を測定するために、下記表6の組成に従って製造されたトリプトファン力価培地で培養し、L−トリプトファン生産効率の向上を確認した。
具体的には、37℃培養機(incubator)でLB固体培地上に一晩培養した大腸菌KCCM11166P/pCC1BAC−crp(WT)及び大腸菌KCCM11166P/pCC1BAC−crpTM9をそれぞれ前記表6の25mLの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを37℃、200rpmの培養機で48時間培養して、糖の消耗速度及びトリプトファン濃度を比較した。その結果、下記表7に記載されたように、対照群であるKCCM11166P/pCC1BAC−crp(WT)菌株は、22時間で消耗糖が30.2g/Lであるが、突然変異型crpTM9を導入した菌株は、親菌株に比べて約7%、野生型crpを追加導入した菌株に比べて約6%まで改善された糖の消耗速度を示すことが確認された。
実施例5.有効crp変異型内在ベクターの野生型大腸菌の導入
5−1.有効pCC1BAC−crp変異型の野生型由来のトレオニン生産菌株の導入
前記実施例3でスクリーニングされたcrp変異型を含むベクターが野生型菌株でも同等の効果を示すかを確認するために、pCC1BAC−crp(WT)及びpCC1BAC−crpTM9のベクターをトレオニンを生成できる野生型由来の菌株に電気穿孔法を用いて形質転換(transformation)させて導入した。また、対照群としてpCC1BAC−crp(WT)を導入した菌株も製作した。
具体的には、33℃培養機(incubator)でLB固体培地中に一晩培養したW3110は、それぞれの菌株を表8の25mLの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを33℃、200rpmの培養機で48時間培養し、その結果を下記表9に示した。下記結果から分かるように、野生型菌株でも、本出願で選別した変異型タンパク質がトレオニンを高収率で効率的に生産できることを示唆しているものである。
5−2.有効pCC1BAC−crp変異型の野生型由来のトリプトファン生産菌株の導入
前記実施例4でスクリーニングされたcrp変異型を含むベクターが野生型菌株でも同等の効果を示すかを確認するために、pCC1BAC−crp(WT)及びpCC1BAC−crpTM9のベクターをトリプトファンを生産できる野生型由来菌株に形質転換(transformation)させて導入した。
具体的には、37℃培養機(incubator)でLB固体培地上に一晩培養した菌株をそれぞれ前記表9の25mL評価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを37℃、200rpmの培養機で48時間培養してOD及びトリプトファン濃度を比較して、表11に示した。下記結果から分かるように、野生型菌株でも、本出願で選別した変異型タンパク質がトリプトファンを高収率で効率的に生産できることを示唆しているものである。
本発明者らはKCCM11166Pの菌株基盤、pCC1BAC−crpTM9が導入されてトリプトファン生産能及び糖消耗速度が改善された菌株(KCCM11166P/pCC1BAC−crpTM9)を「CA04−2808」と命名した後、ブダペスト条約下で国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に2018年11月07日付で寄託し、受託番号KCCM12374Pを与えられた。
Claims (10)
- 配列番号1のアミノ酸配列で196番目のアミノ酸がグルタミンに置換された、cAMP受容タンパク質(cAMP receptor protein)変異体。
- 請求項1に記載のcAMP受容タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のcAMP受容タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 配列番号1のアミノ酸配列で196番目のアミノ酸がグルタミンに置換されたcAMP受容タンパク質変異体を含む、エシェリキア属(Escherichia sp.)微生物。
- 前記エシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項4に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記エシェリキア属微生物が、L−アミノ酸を生産するものである、請求項4に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記L−アミノ酸が、L−トレオニンまたはL−トリプトファンである、請求項6に記載のエシェリキア属微生物。
- 配列番号1のアミノ酸配列で196番目のアミノ酸がグルタミンに置換されたcAMP受容タンパク質変異体を含む、エシェリキア属微生物を培地で培養する段階を含む、L−アミノ酸を生産する方法。
- 前記微生物または培地からL−アミノ酸を回収する段階をさらに含む、請求項8に記載のL−アミノ酸を生産する方法。
- 前記L−アミノ酸が、L−トレオニンまたはL−トリプトファンである、請求項8に記載のL−アミノ酸を生産する方法。
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