CN103114069A - 混糖发酵生产l-色氨酸的细菌及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法。在生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌中，包含cAMP受体蛋白突变体的编码基因而使其具有同时利用己糖和戊糖生产L-色氨酸的能力。cAMP受体蛋白突变体由cAMP受体蛋白中一个或多个氨基酸位点突变获得。本发明提供的细菌在含葡萄糖和木糖的培养基中，同步消耗葡萄糖和木糖，并提高了L-色氨酸的产量和转化率。

Description

混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法。

背景技术

L-色氨酸是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在医药领域，L-色氨酸是氨基酸输液的重要组分和重要的医药中间体。在食品应用领域，L-色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促进发酵。在饲料添加领域，当赖氨酸和蛋氨酸得以满足之后，L-色氨酸成为日粮重要限制性氨基酸，补充外源L-色氨酸可以提高畜、禽、鱼类日粮内L-色氨酸的含量，改善日粮氨基酸组成和比例，提高日粮蛋白质的价值和利用效率。

1979年Tribe和pittard首次利用DNA重组技术将trpE引入大肠杆菌中，L-色氨酸产量达到1g/L。自此之后，随着分子生物学技术的发展，经基因工程改造的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，发酵生产L-色氨酸的效率得到了数十倍的提升。其中Ikeda M等在产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌pIK9960中过表达tktA，增加L-色氨酸合成前体E4P的含量，从而提高L-色氨酸的合成产率，发酵80小时，L-色氨酸产量最高可达到58g/L（Ikead M等，Hyperproduction oftryptophan by corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphatepathway,Applied and environmental microbiology,1999,51:201-206）。Berry A在大肠杆菌中高表达去除反馈抑制的aroG，TrpEDCBA基因，发酵50小时，产L-色氨酸45g/L，对葡萄糖的阶段转化率接近23%（Barry A,Improvingproduction of aromatic compounds in Escherichia coli by metabolic engineering.Trends Biotechnol,14:250-256,1996）。

目前，L-色氨酸多利用基因工程改造的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌通过发酵的方法进行工业化生产。其所使用的发酵培养基中通常包括充足的碳源和氮源。细菌能够利用各种碳水化合物，有机酸和醇作为碳源。在氨基酸发酵领域中最常用的碳源为葡萄糖和蔗糖，其来源为糖浆、谷物、糖蔗、淀粉的水解产物，其价格日渐升高。因此，需要找出更加廉价的替代碳源用于L-氨基酸的生产。

生物质是一种易得且相对便宜的L-氨基酸生产原料。在生物质中纤维素、半纤维素和木质素的常规量为约40-60%的纤维素、20-40%的半纤维素、10-25%的木质素和10%的其他成分。纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，这些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。木质素则是由聚合的芳香醇构成的一类物质。近二十年来已有大量的文献和专利或专利申请，通过生物催化剂（细菌和酵母）利用生物质生产乙醇，氨基酸，有机酸等，不少已经进入工业化生产阶段。通过扩增戊糖同化基因，对应阿拉伯糖的araFG和araBAD基因，木糖的基因xylABFGHR（中国专利200510076242.X）可以增加戊糖利用率。但是，上述方法需要在生产菌的基础上，额外进行大片段的克隆及启动子改造，操作复杂，不易实现。

野生型大肠杆菌可以利用戊糖如L-阿拉伯糖或D-木糖作为碳源，但其相关代谢受到严格调控。当培养基中同时存在葡萄糖和戊糖时，大肠杆菌会优先利用葡萄糖，等葡萄糖耗尽后才会利用戊糖。这种情况会表现为细菌的二次生长（diauxic growth）。其分子机制为PTS系统介导的复杂调控系统，其中cAMP为信号分子，CRP（cAMP receptor protein）为受体蛋白，CRP-cAMP复合物为激活蛋白，激活多种戊糖转运和代谢基因。简单而言，当胞外存在葡萄糖时，cAMP的合成受到抑制，cAMP含量很低，不足以形成大量的CRP-cAMP复合物，从而不能有效激活相关基因的转录，当胞外不存在葡萄糖或其他PTS系统的糖时，cAMP的合成被激活，CRP-cAMP复合物得以形成，相关基因的转录能被激活（Escherichia coli and Salmonella,Second Edition,Editor in Chief:F.C Neidhardt,ASM Press,Washingtong D.C.,1996)。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法。该细菌能够同时利用葡萄糖和木糖，增强L-色氨酸的产量和转化率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，其亲代菌株为L-色氨酸生产菌MHZ-0800，保藏编号为CGMCCNo.6863。其中，宿主菌SA01为E.coli K-12(CICC10303)衍生的E.coli K-12CICC10303tnaA serA，所包含质粒pMG43，为pBR322来源的，包含有serA，及反馈抑制去除aroG和trpEDCBA操作子的质粒。

合成引物PW037/PW038(序列如SEQ ID NO：3、4所示)，利用NEB公司的Phusion高保真聚合酶试剂盒，以E.coli菌株MG1655的染色体为模版，PCR扩增得到含crp基因DNA片段，经纯化后通过BamH I/Sal I酶切消耗，连接到同样被BamHI/SalI酶切消化的pACYC184载体上，构建新质粒命名为pW13。以pW13为模板，PW071/PW072(序列如SEQ ID NO：5、6所示)为引物，PCR扩增。PCR产物用Dpn I处理后，直接转化感受态细胞，获得含crp*（cAMP受体蛋白突变体基因）基因片段的载体pW13D。用CaCl₂转化等常规方法将pW13D质粒和对照质粒pACYC184δTc(去除Tc抗性基因的pACYC184质粒，即含未引入cAMP受体蛋白突变体的编码基因的载体质粒)分别转化菌株MHZ-0800，获得菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）及MHZ-0821（pMG43/SA01/pACYC184δTc）。

本发明提供的菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）已于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6864。

在大肠杆菌合成L-色氨酸的过程中，每合成1摩尔L-色氨酸需要，1摩尔的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和1摩尔4-磷酸赤藓糖（E4P）作为起始前体，另外还将消耗1摩尔的PEP，谷氨酰胺，5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP，phosphoribosyl-5-pyrophosphate）和丝氨酸。如果能够同时利用葡萄糖和戊糖，不仅能降低成本，且将有效的提高E4P与PRPP的供应，从而提高色氨酸的合成效率。本发明提供的菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）与对照菌株MHZ-0821（pMG43/SA01/pACYC184δTc）对比试验显示，菌株MHZ-0820在葡萄糖和木糖混合培养基中，同步消耗葡萄糖和木糖，并提高了L-色氨酸的产量和转化率。

本发明提供的混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，其引入cAMP受体蛋白突变体的编码基因而具有同时利用己糖和戊糖的能力；

cAMP受体蛋白突变体由cAMP受体蛋白中一个或多个氨基酸位点突变获得。

CRP为cAMP受体蛋白(cAMP receptor protein)的缩写，其编码基因为crp，又被称为cap，csm。其编码基因是已知的，并且标明为crp（GenBankaccession NC_000913.2的序列中核苷酸编号3484142到3484774）。CRP是DNA结合转录调控蛋白，与其配体cAMP结合后起调控作用。CRP-cAMP是大肠杆菌最重要的代谢调控蛋白之一。

cAMP受体蛋白突变体，记为CRP*，表示一个或多个氨基酸位点突变的CRP可以不依赖于cAMP行使其激活蛋白的功能，其编码基因为crp*。CRP*不需要cAMP就能激活CRP-cAMP控制的基因的转录（例如，那些负责木糖和阿拉伯糖的转运吸收和代谢的基因），因此，含有CRP*突变体的大肠杆菌能够同时利用葡萄糖和戊糖。

crp基因可以通过使用基于基因核苷酸序列的引物进行PCR（聚合酶链式反应）获得，crp*基因可以根据前述文献记载，利用单点或多点突变的方法获得。

当CRP*突变体表达量增加时，含CRP*突变体的细菌同时利用葡萄糖和戊糖（木糖或阿拉伯糖）的效果更显著。

用编码蛋白的DNA转化细菌，例如常规方法将DNA导入细菌细胞中以增加编码本发明所述蛋白的基因的表达并且增强细菌细胞中蛋白的活性。

增强基因表达的方法包括增加基因拷贝数。将基因导入能够在埃希氏菌属细菌中发挥功能的载体可增加基因的拷贝数。其转化的方法包括任何本领域技术人员已知的方法。例如，同源重组，Mu整合等方法将基因的多重拷贝导入细菌染色体中也可实现基因表达的增强。

另一方面，将控制本发明DNA的天然启动子更换为更有效的启动子也可以实现基因表达的增强。例如，PR启动子，lac启动子，trp启动子，trc启动子是公知的有效的组成型启动子

通过将更有效的Shine-Dalgarno序列（SD序列）导入本发明的DNA以替代天然SD序列可以实现翻译的增强。

此外，采用更有效的启动子可以与增加基因拷贝数的方法结合使用。

制备染色体DNA、杂交、PCR、制备质粒DNA、消化和连接DNA，转化，选择核苷酸作为引物等的方法可以为本领域技术人员公知的常规方法。这些方法记载于Sambrook,J.,and Russell D.“Molecular Cloning A laboratoryManual,Third Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）等。

通过将前述DNA导入本身具有生产L-色氨酸的细菌可获得本发明的细菌。或者，通过将生产L-色氨酸的能力给予已经含有该DNA的细菌可获得本发明的细菌。

作为优选，本发明提供的细菌属于埃希氏菌属（Escherichia）。埃希氏菌属细菌表示该细菌根据微生物技术领域常规技术人员公知的分类法分类于埃希氏菌属。用于本发明的埃希氏菌属细菌的例子包括，但不限于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）。

作为优选，cAMP受体蛋白突变体具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入或者增加一个或几个氨基酸后得到的氨基酸序列。

作为优选，cAMP受体蛋白突变体具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

作为优选，己糖为葡萄糖。

作为优选，戊糖为木糖或阿拉伯糖。但在本发明中适合发酵的戊糖不限于木糖和阿拉伯糖。

本发明提供了混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，其保藏编号为CGMCC No.6864。

本发明还提供了一种混糖发酵生产L-色氨酸的方法，取保藏编号为CGMCC No.6864的混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌接种于种子培养基进行扩繁后，将扩繁后的培养物转入含有戊糖和己糖的发酵培养基混糖发酵，收集L-色氨酸。

作为优选，戊糖和己糖为生物质中获得的糖的混合物。

作为优选，混糖发酵的温度为30～40℃。

作为优选，混糖发酵的pH值为6～8。

作为优选，扩繁后的培养物与所述发酵培养基的体积比为1:10。

作为优选，种子培养基的组分包括：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，KH₂PO₄9.5g/L，硫酸铵5g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，pH值为6～8。

作为优选，发酵培养基的组分包括：葡萄糖30g/L，木糖30g/L，KH₂PO₄5g/L，硫酸铵5g/L，柠檬酸钠2g/L，酵母提取物1g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，20g/L CaCO₃，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，MnSO₄·H₂O0.1g/L，ZnSO₄·H₂O0.1g/L，CoCl₂·6H₂O0.1g/L，CuSO₄·5H₂O0.03g/L，pH值为6～8。

戊糖，如木糖和阿拉伯糖，与己糖如葡萄糖的混合物可以从未充分利用的生物质资源中获得。通过气爆，酸解，酶解，浓缩，从植物生物质中释放葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其他碳水化合物。半纤维比纤维素更容易水解为戊糖和己糖，分离后可进一步水解纤维素形成葡萄糖。以上过程中的多种组分可以被分别分离，混合使用或与额外添加的己糖，如葡萄糖混合使用。

本研究使用1:1的葡萄糖/木糖组成的混合物，以模拟可能从生物质提取物中获得的己糖和戊糖原料混合物的组成（参见实施例部分）。由于多数生物质如玉米秸秆，玉米芯，蔗渣，棉杆等的半纤维素中阿拉伯糖含量较少，如玉米芯中半纤维素的总含量为37%，其单糖的组成成分主要为D－木糖，阿拉伯糖和葡萄糖，含量各为23％，3%，10%。本发明使用不同比例的葡萄糖/木糖组成的混合物，以模拟可能得葡萄糖和戊糖混合物的组成。

在本发明中，培养基中L-色氨酸的培养、收集和纯化等采用的方法类似于常规的微生物发酵生产氨基酸的方法。用于培养的培养基可以为合成培养基或天然培养基，只要该培养基中含有碳源、氮源和矿物质，以及其他所需的微生物生长营养物。

碳源可包括多种可被L-色氨酸生产菌用作碳源的碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，木糖，阿拉伯糖和其他戊糖和己糖。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其他碳水化合物可以是从生物质中获得的糖的原材料混合物的全部或一部分。

氮源，可以使用多种铵盐如硫酸铵，氯化铵，氨水，液氨、其他含氮组合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解产物和同化的发酵微生物。矿物质，可以使用磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、氯化钙等。需要时可在培养基中加入额外的营养物。如维生素，及其他缺陷型氨基酸组分。

优选地，在有氧的条件下进行培养，如摇瓶培养，和通风条件下搅拌培养，培养温度为30到40℃，优选30到38℃。培养基的pH值通常在6到8之间，优选在6.5到7.2之间。培养基的pH值可以用氨水，碳酸钙，多种酸、多种碱和缓冲液进行调节。通常，培养1到3天可以在液体培养基中产生目的L-色氨酸的积累。培养后，通过离心或膜过滤从液体培养基中除去固体物质如细胞，而后采用离子交换，浓缩和结晶方法收集和纯化L-色氨酸。

本发明提供了混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法。其亲代菌株为L-色氨酸生产菌MHZ-0800，其保藏编号为CGMCC No.6863。其宿主菌SA01为E.coli K-12(CICC10303)衍生的E.coli K-12CICC10303tnaA serA，包含质粒pMG43，为pBR322来源的，包含有serA，及反馈抑制去除aroG和trpEDCBA操作子的质粒。合成引物PW037/PW038(序列如SEQ ID NO：3、4所示)，利用NEB公司的Phusion高保真聚合酶试剂盒，以E.coli菌株MG1655的染色体为模版，PCR扩增得到含crp基因DNA片段，经纯化后通过BamH I/Sal I酶切消耗，连接到同样被BamHI/SalI酶切消化的pACYC184载体上，构建新质粒命名为pW13。以pW13为模板，PW071/PW072(序列如SEQ ID NO：5、6所示)为引物，PCR扩增。PCR产物用Dpn I处理后，直接转化感受态细胞，获得含crp*基因片段的载体pW13D。用CaCl₂转化等常规方法将pW13D质粒和对照质粒pACYC184δTc(去除Tc抗性基因的pACYC184质粒)分别转化菌株MHZ-0800，获得菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）及MHZ-0821（pMG43/SA01/pACYC184δTc）。

本发明提供的菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）已于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6864。

本发明提供的菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）与对照菌株MHZ-0821（pMG43/SA01/pACYC184δTc，即未引入cAMP受体蛋白突变体的编码基因）对比试验显示，菌株MHZ-0820在葡萄糖和木糖混合培养基中，同步消耗葡萄糖和木糖，并提高了L-色氨酸的产量。

生物保藏说明

MHZ-0820，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6864；

MHZ-0800，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6863。

附图说明

图1示含cAMP受体蛋白突变体的编码基因的载体pW13D结构图；

图2示菌株MHZ-0820和MHZ-0821在葡萄糖和戊糖混合培养基中的生长曲线（即经种子培养基扩繁、发酵培养基培养后OD₆₀₀的变化情况）；其中，线1示菌株MHZ-0821生长曲线，存在二次生长情况，线2示菌株MHZ-0820（保藏编号为CGMCC No.6864）生长曲线，无明显二次生长情况；

图3示菌株MHZ-0820和MHZ-0821在葡萄糖和戊糖混合培养基中生长时，培养基中葡萄糖和木糖的消耗变化情况；其中，线1，线4分别为培养MHZ-0821过程中，培养基中木糖和葡萄糖的含量变化，MHZ-0821需要耗尽葡萄糖之后方能利用木糖；线2，线3分别为培养MHZ-0820过程中，培养基中木糖和葡萄糖的含量变化，MHZ-0820可以同时消耗葡萄糖和木糖。

具体实施方式

本发明公开了混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法中所用试剂均可由市场购得。本发明提供的混糖发酵L-色氨酸的细菌的亲代菌株为L-色氨酸生产菌MHZ-0800，其宿主菌SA01为E.coli K-12(CICC10303)衍生的E.coli K-12CICC10303tnaA serA，包含质粒pMG43，为pBR322来源的，包含有serA，及反馈抑制去除aroG和trpEDCBA操作子的质粒。本申请人已于2012年11月22日将亲代菌株MHZ-0800保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6863。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1crp*基因的获得

合成引物PW037/PW038(如SEQ ID NO：3、4所示)，利用NEB公司的Phusion高保真聚合酶试剂盒，以E.coli菌株MG1655的染色体为模版，PCR扩增得到含crp基因DNA片段，经纯化后通过BamH I/Sal I酶切消耗，连接到同样被BamHI/SalI酶切消化的pACYC184载体上，构建新质粒命名为pW13。

以pW13为模板，PW071/PW072(如SEQ ID NO：5、6所示)为引物，PCR扩增。PCR产物用Dpn I处理后，直接转化感受态细胞，获得含crp*基因片段的载体pW13D，结构见图1。

同时将BamHI/SalI酶切消化的pACYC184载体粘末端补齐，获得pACYC184δTc，即去除Tc抗性基因的pACYC184质粒，为对照质粒。

实施例2L-色氨酸生产菌在葡萄糖和戊糖混合培养基中的生长和耗糖能力

L-色氨酸生产菌E.coli菌株MHZ-0800(pMG43/SA01)作为亲代菌株用于评价葡萄糖和戊糖的混合物的发酵生产L-色氨酸，其保藏编号为CGMCCNo.6863。

分别通过使用CaCl₂的常规方法用pW13D质粒和载体/pACYC184δTc(去除Tc抗性基因的pACYC184质粒)转化菌株MHZ-0800，获得菌株MHZ-0820（pMG43/SA01/pW13D）和MHZ-0821（pMG43/SA01//pACYC184δTc）。

从冻存管中取E.coli菌株MHZ-0820和MHZ-0821在LB平板（Tc、Cm抗性）上划线，37℃培养18-24hr；将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基（Tc、Cm抗性）的摇瓶中，37℃，转速240rpm，培养5-10小时，OD600控制在6-10；将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基（Tc、Cm抗性）的摇瓶中，摇床37℃，240rpm发酵培养。培养20-30小时，按时间间隔取样，测定样品OD600值，并取上清液用HPLC的方法测定残留的葡萄糖和木糖。LB培养基组分及抗生素添加量为标准浓度，详见实验指南（Sambrook,J.,andRussell D.“Molecular Cloning A laboratory Manual,Third Edition”,Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001）。

种子培养基的组分包括：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，KH₂PO₄9.5g/L，硫酸铵5g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，pH6-8。

发酵培养基的组分包括：葡萄糖10g/L，木糖10g/L，KH₂PO₄5g/L，硫酸铵5g/L，柠檬酸钠2g/L，酵母提取物1g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，MnSO₄·H₂O0.1g/L，ZnSO₄·H₂O0.1g/L，CoCl₂·6H₂O0.1g/L，CuSO₄·5H₂O0.03g/L，pH6-8。

实验结果见图2、图3。可见含CRP突变体基因的L-色氨酸生产菌MHZ-0820能够同步消耗培养基中的葡萄糖和木糖，无明显二次生长性状。将MHZ-0820于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6864。

实施例3使用L-色氨酸生产菌在葡萄糖和戊糖混合物中进行发酵生产L-色氨酸

从冻存管中取E.coli菌株MHZ-0820和MHZ-0821在LB平板（Tc、Cm抗性）上划线，37℃培养18-24hr；将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基（Tc、Cm抗性）的摇瓶中，37℃，转速240rpm，培养5-10小时，OD600控制在6-10；将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基（Tc、Cm抗性）的摇瓶中，往复摇床37℃，120rpm发酵培养。培养过程中流加稀氨水，控制发酵液pH值至6.5-7.0。直至残糖耗尽，发酵终了测样品OD600，并用HPLC的方法测定L-色氨酸含量，结果见表1。

LB培养基组分及抗生素添加量为标准浓度，详见实验指南（Sambrook,J.,and Russell D.“Molecular Cloning A laboratory Manual,Third Edition”,ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001）。

种子培养基的组分包括：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，KH₂PO₄9.5g/L，硫酸铵5g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，pH7.0。

发酵培养基的组分包括：葡萄糖30g/L，木糖30g/L，KH₂PO₄5g/L，硫酸铵5g/L，柠檬酸钠2g/L，酵母提取物1g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，20g/LCaCO₃，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，MnSO₄·H₂O0.1g/L，ZnSO₄·H₂O0.1g/L，CoCl₂·6H₂O0.1g/L，CuSO₄·5H₂O0.03g/L，pH7.0。

表1crp*对L-色氨酸生产菌在混糖发酵中的影响

如表1所示，MHZ-0820（保藏编号为CGMCC No.6864）能利用葡萄糖和木糖混合培养基生产L-色氨酸，并较对照菌MHZ-0821提高了L-色氨酸的产量和转化率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，其特征在于，其包含cAMP受体蛋白突变体的编码基因而具有同时利用己糖和戊糖的能力；

所述cAMP受体蛋白突变体由cAMP受体蛋白中一个或多个氨基酸位点突变获得。

2.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述cAMP受体蛋白突变体具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入或者增加一个或几个氨基酸后得到的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述cAMP受体蛋白突变体具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述己糖为葡萄糖。

5.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述戊糖为木糖或阿拉伯糖。

6.混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.6864。

7.一种混糖发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于，取保藏编号为CGMCC No.6864的混糖发酵生产L-色氨酸的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌接种于种子培养基进行扩繁后，将扩繁后的培养物转入含有戊糖和己糖的发酵培养基混糖发酵，收集L-色氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，所述戊糖和己糖为生物质中获得的糖的混合物。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混糖发酵的温度为30～40℃。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混糖发酵的pH值为6～8。

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