CN105452445A - 利用用于糖输入的易化扩散生产琥珀酸和其它化学品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过采用一种微生物进行发酵来生产琥珀酸和其它源于磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的化学品,其中所述的发酵培养基含有一种或更多种糖,并且其中通过易化扩散把一种或更多种所述的糖输入到细胞中。作为一个具体的实例,使用一种生物催化剂,通过发酵,从一种含有葡萄糖的可再生原料生产琥珀酸。这样的一种生物催化剂的例子包括其利用葡萄糖作为碳源和能量源的能力已经被增强的微生物。本发明所述的生物催化剂源于亲本菌株的遗传操作,最初构建亲本菌株的目标是使用包括例如葡萄糖、果糖或蔗糖在内的原料,以一种商业化规模生产一种或更多种化学品(例如琥珀酸和/或琥珀酸的一种盐)。本发明所述的遗传操作涉及引入与葡萄糖或果糖转运和代谢进入亲本菌株有关的外源基因。在开发所述的有机体使其生产特定的化学品之前,也能够把所述的与葡萄糖或果糖的转运和代谢有关的基因引入到微生物中。通过已知在生物发酵中具有某种关于葡萄糖利用的能力的菌株,也能够利用所述的与蔗糖的转运和代谢有关的基因来增强或改善糖输入和代谢的效率。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年7月23日提交的美国临时申请系列号61/857,300的优先权。
发明领域
本发明处于使用生物催化剂(细菌和其它微生物)生产专用品和日用品有机化学品的领域,可以对该生物催化剂进行修饰以增大它们在利用含糖原料中的效率。更具体地,本发明涉及基因的遗传修饰,该基因编码与用于琥珀酸和其它化学品的生物生产的糖的运输和代谢有关的功能。
发明背景
很多有机化学品目前源于石油化学原料。对于使用可再生原料通过生物发酵方法来生产许多的这些源于石油化学品的有机化合物有日益增长的兴趣。能够源自于可再生原料的有机化合物名录包括α,ω-二酸(琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸、葡糖二酸、丙二酸和顺丁烯二酸)、2,5-呋喃二羧酸、丙酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟基丁内酯、甘油和丁二醇例如1,4-丁二醇(美国专利申请20090047719)、1,3-丁二醇(美国专利申请20090253192)和2,3-丁二醇。使用可再生原料也能够生产许多其它类型的有机化合物,包括但不限于氨基酸、维生素、醇(例如乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和高级醇类)、脂肪酸、脂肪酸酯、烃、类异戊二烯、萜烯类、类胡萝卜素、胺。任何这样的化合物在这里将被称为一种“所要的化合物”。尽管许多这些所要的化合物的发酵方法已经被开发了,但是为了与石油化学方法竞争,始终需要改善发酵的总体经济学,例如改善产物的滴度(以克/升表示的产物的最终浓度)和产物产率(产品克数/克碳源,例如葡萄糖),并且减少不想要的副产物例如乙酸盐的滴度。
许多细菌,包括大肠杆菌,利用一种把葡萄糖和其它糖主动运输到细胞中的被称为磷酸转移酶体系(PTS)的体系。该体系使用PEP(丙酮酸磷酸烯醇酯)作为能量和磷酸的来源,用于同时运输和磷酸化所述的糖。PTS体系通常需要4种或更多种蛋白质一起发挥作用来输入和磷酸化进来的糖。这些蛋白质中的一些对于所有的糖来说是常见的,以致一种给定的有机体通过一种PTS输入,同时所述PTS的其它蛋白质组分对于一种或更多种特定的糖来说是特异性的。
例如,在大肠杆菌中,常见于所有的PTS途径的蛋白质是分别由基因ptsH和ptsI编码的PtsH和PtsI。除了这两种“常见的”PTS蛋白之外,还需要一种或更多种另外的糖-特异性的PTS蛋白来输入和磷酸化特定的糖。例如,由PTS输入葡萄糖需要两种名称为Crr和PtsG的另外的蛋白质。Crr是一种具有一个单一的被称为A结构域的细胞质的蛋白质,而PtsG是一种具有两个名称为B和C的结构域的膜蛋白。来自PEP的磷酸基团当它被输入时,被从蛋白质传递到蛋白质并且最后被转移到葡萄糖的第6位在细胞内提供葡萄糖-6-磷酸。以PEP开始的传递次序是PtsI、PtsH、Crr,最后是PtsG。在历史上,这些蛋白质也已经被称为其它名称,例如分别是EI、HPr、EIIAGlc和EIIBC。作为来自大肠杆菌的另一个实例,果糖是利用PtsI、PtsH、FruA和FruB通过一种相似的传递被输入的,其中最后的两种也分别被称为EIIFru和EIIFru。对于一些糖,例如甘露糖醇,如上面针对葡萄糖所提到的那样,对应于A、B和C的所述的糖特异性的蛋白质结构域被融合到一种膜结合多肽中,同时对于其它糖,例如甘露糖,所述的A和B结构域被融合到一种细胞质的多肽中,同时所述的膜结合组件由两个被称为C和D的亚基构成。
在所有的情形中,所述的体系依靠所述“常见的亚基”(在大肠杆菌中PtsI和PtsH,),并且PEP是能量和磷酸的来源.结果,通过一种PTS体系输入的每一个糖分子导致一分子的PEP被利用以及一分子的磷酸化的糖和一分子的丙酮酸酯的产生。然而,PEP也是几个生物化学途径中的一种必要的中间体,例如1)通过丙酮酸酯激酶形成丙酮酸和ATP,2)由PEP羧激酶和PEP羧化酶催化的回补途径,这两种酶把碳提供到TCA(三羧酸)循环中,和3)进入由3-脱氧-D-阿拉伯庚酮酸-7-磷酸合酶(DAHP合酶)的一种或更多种同工酶催化的常见的芳族氨基酸和芳族维生素生物合成途径。因此,在所述的用于糖输入的PTS体系和刚刚提到的其它途径之间存在着一种不可避免的对于PEP的竞争。
由于许多细菌,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者,利用一种PTS体系,它显然是一种在进化期间在许多环境下盛行的体系。然而,在无氧条件下从糖例如葡萄糖生产ATP的效率远远地低于在有氧条件下,并且与在有氧条件下相比,所谓的“底物水平”磷酸化(例如通过丙酮酸激酶)成为所述ATP生产预算的一个较大的部分,在有氧条件下氧化性磷酸化提供所述ATP预算的绝大部分。因此,值得注意的是,一些有机体,例如酿酒酵母和运动发酵单胞菌,这两者很好地适应于在葡萄糖和其它糖上面的无氧生长,并不具有一种PTS体系,而是利用一种易化扩散蛋白质(也被称为通透酶)来输入葡萄糖和其它糖。此外,当把天然地利用一种PTS的有机体遗传工程化来通过发酵过量生产特定的化合物时,所述的途径在许多情形中利用PEP作为中间体,使得所述的PTS与所要的生物合成途径竞争PEP。已知通过减小所述PTS的活性而减轻这种竞争,将会增大通向所要的生物合成途径的流量。
例如,PEP是通向琥珀酸盐的三羧酸(TCA)循环的还原分支中的一种中间体。在KJ122的代谢进化期间,一种大肠杆菌琥珀酸盐生产者,在所述的ptsI基因中出现了一种移码突变,它导致了从葡萄糖生产琥珀酸的增加。重新设置一种野生型ptsI基因引起了琥珀酸生产的大幅度减少,证明所述的ptsI突变强有力地促成所述的菌株改良。
对于另一个实例,芳族氨基酸是从PEP和赤藓糖-4-磷酸构建的。当让细胞在作为碳源的葡萄糖上生长时,显示在一种大肠杆菌菌株中缺失三个pts基因(ΔptsHI,crr)将要增大通向所述芳族氨基酸生物合成途径的流量。
在上述两个实例中,据推测葡萄糖的输入依然在某种水平上由所谓的半乳糖通透酶(GalP,由galP基因编码的)完成。在第一个实例中,发现减小所述galP基因的一种阻抑蛋白(GalS)活性的一种突变由代谢进化引起(WO2011/123154)。在第二个实例中,在缺失pts基因以后,发生了一种或更多种突变,导致了生长速度的增大。所得的菌株依靠galP获得在葡萄糖上的显著生长,并且在所述菌株中的一种或更多种突变能够与galP表达的增加相关联(US6,962,794)。然而,在把用于芳族氨基酸生产的所述“Pts-/Glu+”菌株工程化以后,来自该第二个实例的菌株仅仅生产低滴度的芳族氨基酸。分别以1.7、0.8和2.2g/l生产了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。由于这些滴度离足够高以支持在经济上有吸引力的一种商业化生产方法差得很远,因此不清楚US6,962,794中公开的发明是否可用于商业化生产。因此,为了在经济上切实可行地通过发酵来商业化生产化学品,依然存在着改善发酵参数的需要。
虽然用于葡萄糖输入的GalP的使用保留了PEP,但是它是一种质子同向转运体,因此对于每一个被输入的葡萄糖分子,它消耗了大约一个ATP的1/3。一些微生物,例如所述的细菌运动发酵单胞菌和所述的酵母酿酒酵母利用了易化扩散用于输入葡萄糖。运动发酵单胞菌具有一种易化蛋白,该蛋白质起着输入葡萄糖和果糖两者的作用。酿酒酵母具有至少14种不同的己糖输入体,它们中的许多输入葡萄糖并且至少它们中的一些也输入果糖。在所述的糖处于细胞质里面以前,这种葡萄糖输入模式不需要花费ATP,在此之后,一个ATP被消耗以形成葡萄糖-6-磷酸,以允许所述的糖进入糖酵解。最重要地,不像对于所述PTS体系那样,没有消耗PEP。因此很清楚,对于一些有机体,易化扩散效果很好,并且就PEP和ATP而言,不论与一种PTS体系相比,还是与一种质子同向转运体例如GalP相比,细胞都花费较少。Ingram等人(US5,602,030)证实,来自运动发酵单胞菌的易化扩散蛋白(Glf,由glf基因编码的),与一种也来自运动发酵单胞菌的从一种多拷贝质粒上的那些基因表达的葡糖激酶(Glk,由glk基因编码的)一起,能够在功能上替代所述的PTS来支持大肠杆菌菌株在一种极限葡萄糖培养基中的生长,其中亲本没有原生的葡萄糖易化扩散的能力,并且已经通过突变使其它葡萄糖输入体系无效。在一种质粒上含有这两种运动发酵单胞菌基因glf和glk的重组大肠杆菌ptsG-,ptsM-,glk-菌株ZSC113能够在极限葡萄糖培养基上有氧生长。
这些公开证明了,所述的运动发酵单胞菌蛋白质能够在大肠杆菌中发挥作用,足以支持以0.53hr-1的比生长速度有氧生长。然而,使用原生的PTS用于葡萄糖输入的野生型大肠杆菌具有1.0至1.2hr-1的有氧比生长速度,因此在US5,602,030中为了利用glf而被工程化的菌株显现出严重地受限于葡萄糖摄取。而且,所述的公开没有显示所述易化扩散体系能够支持无氧生长。很多通过发酵生产的重要化学品需要强健的无氧生长来支持在经济上有吸引力的商业化生产体系(WO2012/018699)。US5,602,030中和Snoep等人(1994)的实例显示通过表达来自多拷贝质粒的glf和glk能够获得适度的生长,但是没有证实生长能够得到整合的多拷贝的所述glf和glk基因的支持,然而常常希望商业化的规模生产利用不包含质粒的菌株。最后,US5,602,030没有证实一种基于glf的体系能够支持商品化学品例如乙醇或琥珀酸盐在大肠杆菌或没有天然地利用易化扩散的任何其它有机体中的高滴度生产。因此,单独从US5,602,030的公开中还不清楚一种glf能否替代所述的PTS并且导致在经济上有吸引力的发酵方法,该方法用于在一种不具有原生的易化扩散体系的宿主菌株中生产所要的化学品。
Tang等人(2013)进一步进行了几步来显示琥珀酸的无氧生产能够通过在一种大肠杆菌菌株背景中与一种葡糖激酶结合的运动发酵单胞菌glf的表达来实现,所述菌株背景是ΔptsI,ΔldhA,ΔpflB,pck*。然而,在该体系中最好的琥珀酸生产也是适度的,在96小时内只有220mM(26g/l)。尽管已经通过组合调制所述glf和glk的表达进行了最优化,但是这种滴度和产率比起以前公开的没有利用glf就能生产83g/l琥珀酸盐的菌株的滴度和产率还差得很远。因此,尽管有Tang等人的更为先进的工作,但是依然还没有证实:用于葡萄糖输入的易化扩散的利用实际上有益于在一些水平上改善发酵生产参数,这些水平对于经济上有吸引力的商业化生产来说是必要的,该商业化生产将会处于至少83g/l的基准(WO2012/018699)。为了进一步使PTS被glf潜在的替代复杂化,在大肠杆菌中以及据推测在其它细菌中,所述PTS的组件具有许多不同的调控功能,这些功能影响许多不同的代谢途径,因此,要预测在任何一个或更多个所述PTS基因中的一种缺失对于任何所得的被修饰的菌株的总的生理学和发酵性质将会有什么影响是不可能的。原生的运动发酵单胞菌菌株,其天然地利用用于葡萄糖摄取的易化扩散,能够从葡萄糖生产多达大约60g/l的乙醇和类似数量的二氧化碳。据报道运动发酵单胞菌的一种工程化的菌株能从葡萄糖生产64g/l琥珀酸盐(EP20070715351)。然而,这种发酵需要在所述发酵培养基中有10g/l的酵母提取物,这对于琥珀酸的商业化生产来说是不受欢迎的,既因为它的费用,也因为在下游中从所述的酵母提取物组分中纯化琥珀酸盐所需要的增大的成本。此外,运动发酵单胞菌常常不是一种方便的或最佳的用于发酵方法中的宿主有机体。
因此,概括现有技术,已经显示能够把大肠杆菌工程化以利用葡萄糖的易化扩散来支持有氧生长到一种适度的速度,并且支持一种适度水平的琥珀酸盐的无氧生产,但是没有公开任何已经被工程化而赋予非原生地利用用于葡萄糖输入的易化扩散并且与利用天然的葡萄糖输入体系例如PTS和/或GalP用于通过发酵生产一种化学品的菌株相比得到改善的细菌菌株或方法。此外,没有公开任何利用易化扩散用于葡萄糖输入并且能够在一种将会在商业上有吸引力的培养基(例如一种极限葡萄糖培养基)中以足够高的滴度、产率和速度生产琥珀酸盐或除乙醇和二氧化碳以外的任何化学品的细菌菌株或方法。因此,依然对于改善的菌株存在着需求,当考虑所有的因素包括生产力、培养基成本和下游纯化时,该菌株能够在一种经济上有吸引力的方法中生产琥珀酸盐和化学品。
发明概述
本发明提供生物催化剂(例如遗传工程化的微生物)和利用葡萄糖的易化扩散来改善发酵生产商业上重要的产品(例如但是不限于专用品和日用化学品)的方法。具体地,本发明可用于使用含糖的可再生原料,把PEP作为其生物合成途径中的一种生物化学中间体的有机酸、氨基酸和其它生物化学品的发酵生产中。作为一个具体的实例,本发明可用于使用生物催化剂,从一种含有葡萄糖、果糖或蔗糖的可再生原料发酵生产琥珀酸,所述的生物催化剂已经被构建成用来利用糖的易化扩散。能够把本发明的原理应用到能够通过发酵而生产的许多其它所要的化学化合物,特别是TCA循环的化学中间体或其衍生物,例如反丁烯二酸、苹果酸、谷氨酸盐、谷氨酸盐的衍生物、天冬氨酸盐、天冬氨酸盐的衍生物、芳族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)和源于所述中心芳族途径中的中间体的化合物,例如维生素和顺式,顺式-粘康酸。
根据本发明,能够把编码糖(例如葡萄糖)的易化扩散中所涉及的蛋白质的基因引入广泛种类的生物催化剂中,要么将要把一种新的能力赋予所述的生物催化剂来通过易化扩散输入一种作为碳源的糖和来自所述发酵培养基的能量,要么将要增强或改善所述生物催化剂的已经存在的糖输入和代谢的能力。被工程化而具有增大的通过易化扩散来输入糖的能力的菌株,当与亲本菌株的参数相比较时,能够具有改善的发酵参数,例如增大的滴度(g/l所要的化学产品)、增大的产率(每克消耗的糖所生产的产品克数)、增大的比生产力(g/l-hr产品形成)和/或减小的不想要的副产物(例如乙酸盐、丙酮酸和/或氨基酸)的滴度。这些改善的参数能够导致能量的保存(例如将较少的ATP用于形成质子梯度以驱动质子同向转运体例如GalP)、利用PEP作为一种中间体的途径的PEP的保存(例如所述的琥珀酸盐途径)和减少溢出的代谢进入乙酸盐生产途径或其它不想要的途径。
本方法特别有利于至少部分地源于PEP或经由PEP的化学品的生产,例如琥珀酸盐、苹果酸盐、反丁烯二酸盐、乳酸盐、乙醇、丁醇类、丙二醇类、3-羟基丙酸、丙烯酸、丙酸、乳酸、氨基酸例如谷氨酸盐、天冬氨酸盐、甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸、源于所述中心芳族途径的化合物例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、芳族维生素、与芳族维生素类似的化合物以及源于作为一种生物合成中间体的PEP的任何其它化合物。
在一种实施方式中,本发明提供具有一种添加的外源基因(或多种基因)并且不天然地具有通过易化扩散输入糖的能力的生物催化剂,所述的外源基因赋予一种通过易化扩散输入糖的新能力。在另一种实施方式中,本发明提供新型生物催化剂,与亲本生物催化剂相比,该新型生物催化剂能生产一种更高滴度的一种所要的发酵产品。在另一种实施方式中本发明提供新型生物催化剂,与亲本生物催化剂相比,该新型生物催化剂能生产一种更高产率的一种所要的发酵产品。在另一种实施方式中,本发明提供新型生物催化剂,与亲本生物催化剂相比,该新型生物催化剂能产生一种对于一种所要的发酵产品的更高的比生产率。在另一种实施方式中,本发明提供一种新型生物催化剂,与亲本生物催化剂相比,该新型生物催化剂能产生一种更低滴度的不想要的副产物。
编码在糖的易化扩散中发挥作用的一种或多种蛋白质的一种或多种基因能够源于具有原生的实施糖的易化扩散的能力的任何有机体,唯一的要求是:所述的蛋白质能够在所述新的宿主中发挥作用。编码一种糖激酶(例如在所述糖进入细胞质以后要将它磷酸化所需要的一种葡糖激酶)的基因能够源于用于易化扩散的基因所源自的同一供体,或者能够使用来自受体宿主的一种原生的糖激酶基因,或者能够使用这两种糖激酶的组合。
在另一种实施方式中,本发明提供用于生产一种所要的发酵产品的方法,该方法包括培养一种利用易化扩散来输入糖的被遗传工程化的微生物。
在另一种实施方式中,本发明提供用于改善被工程化以利用易化扩散的菌株的发酵性能参数(滴度、产率、比生产率、把副产物形成降至最低)的方法。
在另一种实施方式中,本发明提供用于在使用易化扩散来输入糖的遗传工程化的微生物中实现一种改善的易化扩散和糖激酶活性的平衡,导致改善的生长和发酵参数的方法。
根据本发明,一种方法是要把来自天然地含有有关基因(例如glf或glk或其一种组合)的一种第二供体有机体的一种用于输入糖的易化扩散体系遗传转移到并不天然地含有所述的有关基因的一种第一受体有机体中,以便赋予所述的第一受体有机体以一种通过易化扩散输入所述糖的新能力。在一种优选的实施方式中,所述的第一受体已经事先被工程化或被构建成缺乏或实质上减小它通过存在于所述第一受体菌株的一个亲本或祖本中的任何天然的体系来输入所述糖的能力。在这样的一种实施方式中,所得的菌株事实上被迫将易化扩散用于在所述糖上的生长。
在一种优选的实施方式中,所述的第一受体菌株是一种大肠杆菌菌株,并且所述的第二供体菌株是运动发酵单胞菌CP4。在一种更优选的实施方式中,所述的第一菌株是WG53,它转而通过缺失ptsH、ptsI和galP而源于KJ122。缺失ptsH、ptsI和galP的准确的本质能够变化很大,唯一重要的标准是:所述PtsH、PtsI和GalP蛋白的活性被消灭了或实质上减小了。
本发明所述的第一受体有机体能够变化很大,唯一的标准是:它并不天然地含有一种在一种糖例如葡萄糖的易化扩散中发挥作用的蛋白质。除了大肠杆菌之外,第一受体有机体的例子还包括但是不限于:氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans),浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacterasaii),德尔马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae),粘无色杆菌(Achromobacterviscosus),乳无色杆菌(Achromobacterlacticum),根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens),放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter),粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis),柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus),肿大节杆菌(Arthrobactertumescens),石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus),裂烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus),氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans),天牛金杆菌(Aureobacteriumsaperdae),印度固氮菌(Azotobacterindicus),产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes),叉分短杆菌(divaricatum),乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum),黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum),球形短杆菌(Brevibacteriumglobosum),暗褐短杆菌(Brevibacteriumfuscum),酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum),创伤短杆菌(Brevibacteriumhelcolum),极小短小杆菌(Brevibacteriumpusillum),砖红色短小杆菌(Brevibacteriumtestaceum),玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum),Brevibacteriumimmariophilium,扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens),原玻璃蝇短杆菌(Brevibacteriumprotopharmiae),嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum),谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum),美棒杆菌(Corynebacteriumcallunae),嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum),醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum),产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes),解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora),胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora),草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola),菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi),外来黄杆菌(Flavobacteriumperegrinum),染色假杆菌(Flavobacteriumfucatum),橙色黄杆菌(Flavobacteriumaurantinum),莱茵黄杆菌(Flavobacteriumrhenanum),塞沃尼假杆菌(Flavobacteriumsewanense),短黄杆菌(Flavobacteriumbreve),脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum),微球菌种CCM825(Micrococcussp.CCM825),摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii),灰暗诺卡氏菌(Nocardiaopaca),粗糙诺卡氏菌(Nocardiarugosa),Planococcuseucinatus,雷氏变形菌(Proteusrettgeri),谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii),类黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha),产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans),荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens),卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis),施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri),食酸假单胞菌(Pseudomonasacidovolans),霉味假单胞菌(Pseudomonasmucidolens),睾丸酮假单胞菌(Pseudomonastestosterone),铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),红串红球菌(Rhodococcuserythropolis),紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous),红球菌种ATCC15592(Rhodococcussp.ATCC15592),红球菌种ATCC19070(Rhodococcussp.ATCC19070),脲芽孢八叠球菌(Sporosarcinaureae),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),梅氏弧菌(Vibriometschnikovii),干酪弧菌(Vibriotyrogenes),马杜拉马杜拉放线菌(Actinomaduramadurae),紫产色链霉菌(Actinomycesviolaceochromogenes),丘疹性北里孢菌(Kitasatosporiaparulosa),天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor),浅黄链霉菌(Streptomycesflavelus),浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus),浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans),橄榄链霉菌(Streptomycesolivaceus),田无链霉菌(Streptomycestanashiensis),弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae),抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus),可可链霉菌(Streptomycescacaoi),淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae),绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida),短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus),环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans),解硫胺素芽孢杆菌(Bacillusthiaminolyticus),弗氏埃希氏菌(Escherichiafreundii),嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum),粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium),薛氏沙门氏菌(Salmonellaschottmulleri),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis),解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylolliquefaciens),产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca),肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia),Acinetobacterbaylyi,谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum),黄色短杆菌(Brevibacteiumflavum),产甘露糖半琥珀酸酯菌(Mannhemiasucciniproducens)和产琥珀酸厌氧生螺旋菌(Anaerobiospirilumsucciniproducens),以及柑橘黄单胞菌(Xanthomonascitri)。
第二供体有机体的例子是具有一种原生的一种糖的易化扩散体系的任何菌株或物种,例如运动发酵单胞菌菌株(除菌株CP4之外)、智人、无乳固氮螺菌(Azospirillumamazonense),黄杆菌科(Flavobacteriaceae)细菌S85、酿酒酵母或其它酵母菌属。
在另一种实施方式中,先把一种第一亲本菌株构建成利用用于输入糖的易化扩散,然后把所得的菌株进一步工程化来过度生产一种具有商业利益的化学品,例如琥珀酸。
本发明的新型方面是来自一种非致病的强健的糖利用者的glf基因,该基因已经被稳定地整合到一种细菌的染色体中,使得所述新构建的细菌能够以一种经济上切实可行的方法来生产一种商业上切实可行的产品。来自葡萄糖或另一种糖的产品的滴度、产率和/或比生产率大于亲本有机体的那些参数。所述的glf基因被整合到所述染色体中的一个位点处,该位点不干扰生长或产品生产的任何有关方面。在一种具有代表性的发酵中,在大约45至48小时时,乙酸盐的滴度小于亲本菌株的,该发酵允许一个2天的发酵循环时间,与现有技术的实例不同。利用用于糖输入的易化扩散的现有技术中的菌株没有产生足够的所要产品的滴度以在经济上有吸引力。本发明的另一个新型方面是通过利用用于糖输入的易化扩散,意外地发现了:不想要的副产物乙酸盐或乙酸的产生被显著地减少了。在一种典型的作为原料的葡萄糖的发酵中,现有技术的菌株KJ122产生了大约5至7g/l乙酸盐(WO2012/018699),而本发明的新型菌株仅仅产生了大约4.2g/l或更少。
从随后的描述中,本发明的另外的优点将会容易地变得显而易见。
附图的简要描述
图1.质粒pAC19的结构,运动发酵单胞菌glf和glk的表达盒的来源。
图2.质粒pAC21的结构,含有cat(氯霉素抗性)和sacB(果聚糖蔗糖酶)基因的一种可选择和反选择的盒的来源。
图3.质粒pSS2的结构,没有glk的运动发酵单胞菌glf的表达盒的来源。
图4.质粒pMH68的结构,在pflD基因座处用于大肠杆菌crr基因的第二拷贝的整合的一种表达盒的来源。
表1.在7升发酵罐中,通过AC15生产琥珀酸盐。
表2.在500ml微需氧菌发酵罐中,通过AC15的红色突变体生产琥珀酸盐。
表3.在500ml微需氧菌发酵罐中,通过SS8的两种分离物生产琥珀酸盐。
表4.在20升微需氧菌发酵罐中,通过YSS41生产琥珀酸盐。
表5.在500ml微需氧菌发酵罐中,通过MH141生产琥珀酸盐。
表6.通过大肠杆菌菌株KJ122和YSS41,在20升发酵罐中,在这两种菌株的优化通风条件下生产琥珀酸盐。
优选的实施方式的详细描述
定义。当使用短语“例如”或“如”时,随后提到的名目意味着要成为所公开的观念或概念的举例说明的实例。随后提到的名目并不意味着要受限于所给定的实例,因为将会落在一般化的所述观念或概念之下的任何其它具体的名目或实例都意味着被包括在内。对于任何给定的化合物,要生产所述化合物的一种盐可能是更合适的,因此例如,可以在接近7的pH下,以一种钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等形式生产琥珀酸,而赖氨酸则可以以一种盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐等形式被生产。因此,在本文中在任何时间提到一种化合物时,意味着所述化合物的任何盐被包括在内,并且在任何时间提到一种盐时,也意味着游离酸或游离碱被包括在内。因此,例如“琥珀酸盐”意味着包括“琥珀酸”并且反之亦然,以及“乙酸盐”意味着包括“乙酸”并且反之亦然。
“易化扩散”意指一种体系的所述作用,该体系典型地包括位于一种生物膜(例如一种革兰氏阴性菌的内膜或一种革兰氏阳性菌的单膜)中的一种膜内在蛋白质或位于一种生物膜中的多于一个蛋白质分子的复合物,该体系的功能是特异性地允许一种或更多种被称为“底物”(例如葡萄糖和/或果糖)的化学品,但是不允许一般化产品(例如水和除所述的特异性底物以外的细胞质代谢物),在没有任何能量(例如由ATP或PEP的水解提供的)或由所述细胞直接提供给所述体系的一种不同的化学品的梯度(例如质子梯度)的情况下穿过所述的膜。如果有一个浓度梯度,例如如果一种底物在细胞外的浓度高于在细胞内的浓度,将会有净流量的该底物以一种速度进入所述的细胞中,该速度比如果所述的易化扩散体系不存在时将会发生的更快。发挥易化扩散作用的所述蛋白质典型地具有一种结合亲和性,该结合亲和性对于一种或更多种底物是特异性并且允许所述体系以相对低的几个毫摩尔或更少的浓度帮助跨膜传递所述的底物。一些类型的易化扩散能够通过创建一种穿过所述的膜的孔或通道而发挥作用,所述的孔或通道优待一种底物,而在其它类型中,所述蛋白质能够与位于所述膜的一侧上的底物结合,然后旋转穿过所述的膜而把所述的底物释放到所述膜的相反一侧。一种易化扩散蛋白(有时被简单地称为一种易化蛋白)是这样一种体系的蛋白质组分。因此,易化扩散的热力学驱动力是一种底物浓度梯度,其中所述的底物(例如一种糖)从细胞外的更高浓度向所述细胞内的更低浓度流动。我们将利用遗传学符号Glf和glf来分别意指一种易化扩散蛋白和编码这样一种对葡萄糖具有特异性的蛋白质的基因。我们通常认为Glf由一条单一的多肽链构成,但是Glf能够是一种包含多于一个多肽链的复合物。虽然本文中所写的Glf的具体例子是来源于细菌的,但是我们的定义意味着包括源于任何有机体的易化扩散体系。例如,众所周知,所述的酵母酿酒酵母和其它酵母具有用于输入名称为HXT1、HXT2、HTX3、HTX4、HTX5、HTX6、HTX7等的己糖(例如葡萄糖和果糖)的一种或更多种易化扩散蛋白,而人的红细胞利用易化扩散,经由一种名称为GLUT1的蛋白质来输入和输出葡萄糖。Glf的作用机理能够宽泛地变化,包括孔易化的转运和载体易化的转运。虽然在本说明书中提供的具体实施例公开了一种对葡萄糖具有良好特异性的Glf,但是本领域中已知一种Glf蛋白能够对于一种以上的糖都有活性,例如来自运动发酵单胞菌和酿酒酵母的Glf能够对果糖以及葡萄糖有活性。
质子同向转运被定义为利用一种质子梯度作为驱动力的一种用于跨越生物膜输入底物的体系。细胞外面的一种更高的质子浓度具有扩散回到细胞中的热力学倾向。这种热力学压力被用来输入底物例如糖。一种质子同向转运体是发挥提供质子同向转运作用的一种蛋白质或蛋白质的复合物。质子同向转运体的一个实例是大肠杆菌的GalP蛋白质,众所周知它在半乳糖、葡萄糖和其它糖的输入中发挥作用。
葡糖激酶和果糖激酶是催化葡萄糖、果糖或其它糖的磷酸化的酶,磷酸化通常在第6碳位,但是备选地可能在第1碳位或另一个位置。我们将利用遗传学符号Glk和glk来分别意指葡糖激酶和编码葡糖激酶的基因。Frk和frk分别意指果糖激酶和编码果糖激酶的基因。
crr基因是一种基因,它编码PTS的EIIAglc组分,例如大肠杆菌菌株或枯草杆菌菌株的crr基因或这样一种crr基因的同源物。
PTS(磷酸转移酶体系)是一组蛋白质,它们一起作用而把一种糖泵入细胞质中并且同时磷酸化所述的糖,使用PEP作为磷酸和能量的来源。编码来自大肠杆菌的PTS蛋白的基因的例子包括ptsH、ptsI、crr、ptsG、fruA、fruB、manX、manY和manZ。相应的蛋白质被命名为PtsH、PtsI、Crr、PtsG、FruA、FruB、ManX、ManY和ManZ。然而,有许多更多来自大肠杆菌和其它原核生物的例子,并且这些蛋白质能够具有备用名称,例如Crr有时被称为EIIAglc。所述PTS蛋白中的一些对于一种或更多种特定的糖比对于其它糖具有更大的特异性,而一些PTS蛋白,例如来自大肠杆菌的PtsH和PtsI被共同用于许多不同的糖。
在本说明书中,术语“微需氧的”意指空气的注入速度少于0.1体积的空气/体积的液体培养基/分钟。在本文公开的7升和20升发酵罐实例中,这是采用一个喷淋器和流量计来完成的,或通过允许所述发酵罐通过一个与所述发酵罐的顶部连接的无菌膜呼吸,在没有任何受迫的空气流的情况下完成。在本文公开的500ml发酵罐实例中,没有有意地引入空气,但是从泄漏、碱液的加料和取样中引入了少量的空气。
“基本培养基”是一种微生物的生长培养基,其包含水、一种纯的碳源(例如一种实质上纯的糖或实质上纯的糖的混合物)、无机盐(例如钾、钠、镁、钙、碳酸氢盐加碳酸盐、磷酸盐、硫酸盐和盐酸盐)、一种纯的氮盐例如铵或脲、痕量金属(铁、铜、锌、锰、钴、钼和任选的硼酸盐)、任选的甘氨酸甜菜碱(也被简单地称为甜菜碱)和任选的一种消泡剂。基本培养基不含有任何复杂(也被称为“富的”)营养源例如酵母提取液、玉米浆、大豆水解产物、肉汤、酪蛋白水解产物、谷物、豆或任何其它“未限定的”的营养物混合物,该营养物混合物典型地将会源于一种农业源,没有任何物理或化学纯化或分离步骤。对于一种基本培养基,源于甘蔗、玉米淀粉、高粱淀粉、木薯淀粉或任何其它合理地纯的淀粉源的合理地纯的糖被认为是可以接受的。基本培养基能够含有一种或几种纯的化学品来满足一种特定的生长要求(营养缺陷型或营养迟缓型)或来增强一种生物化学途径。例如,一些菌株需要一种维生素例如生物素,能够以小的浓度添加它而对一种方法没有明显的负面影响。作为另一个实例,添加一种维生素例如硫胺,虽然它不是生长所绝对需要的,然而它能够促进生长或生物化学途径。基本培养基优选用于许多化学品的发酵生产,因为其相对低的组分成本,并且因为生产更清洁的发酵肉汤,允许下游纯化所要化学品的更有利的经济成本。乙醇的生产是一个例外,因为下游纯化能够采用蒸馏来完成,蒸馏是的纯化所要产品(甚至是来自复杂培养基)的一种在经济上有吸引力的方法。
芳族生物化学品意指下列中的任何一种或更多种:苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸,或其任何衍生物(例如L-二羟基苯丙氨酸、褪黑激素、吲哚、吲哚乙酸、靛蓝、5-羟色胺、肉桂酸、羟基苯乙烯)、含有芳族部分的维生素或维生素类似化合物(例如对羟基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、叶酸、生育酚、吡咯并喹啉醌)。
第一基因或蛋白质的同源物被定义为第二基因或蛋白质,其中所述的第二蛋白质或推断从所述的第二基因翻译而成的蛋白质具有与所述的第一蛋白质或推断从所述的第一基因翻译而成的蛋白质相同或相似的生物化学功能,并且对于长度至少为50个氨基酸的区域,当使用可公开得到的计算机比对程序例如BLAST的缺省参数时,其中所述的第一和第二蛋白质或第一和第二推断的翻译蛋白质的比对导致25%或更大的同源性或相似度。
突变是一种DNA序列相对于相关的野生型或原生基因的DNA序列的任何变化。突变能够是单个或多个碱基变化,它在那个位置引入一个提前终止密码子或一个不同于野生型氨基酸的氨基酸。突变可以是一个或更多个碱基的插入或缺失,它产生了移码,这种移码导致一种显著地不同于野生型蛋白质的蛋白质。突变可以是移除了一个编码区(也被称为一个开放读框或orf)的许多、大部分或全部的一种缺失。一种类型的突变移除一个或更多个全部orf加上来自所述编码区的上游或下游或上下游的另外的非编码DNA。突变能够由一个相对大的DNA序列(多于大约100个碱基)例如一个插入元件(例如IS186或IS4)或一个转座子(例如Tn10)的插入导致。当意图要移除一种功能时,一种优选的突变是缺失orf的全部或大部分,然而,事实上,较小的突变例如单个碱基的变化或插入常常能够完成一种功能的移除。突变能够是自发的、通过诱变诱发的或通过遗传工程构建的。一些突变,当想要让其完成一种菌株改良时,是减少或消灭一种生物学功能的突变,例如一种PTS的特定元件。然而,一些突变,当想要让其完成一种菌株改良时,是增加生物学功能的突变,例如一种“启动子增强突变”能够增大一种所要基因例如glf基因的表达。
“外源的”意指源于一种已经被安装在一种第一属中的第二属的一种基因或蛋白质,其中所述的第二属是与所述的第一属不同的一种属。
基因被定义为编码一种蛋白质或酶的染色体区域,并且意味着包括与所述的蛋白质或酶对应的可读框和有助于控制所述蛋白质或酶的生产水平或速度的围绕所述可读框的任何DNA序列,例如启动子、核糖体结合位点、操纵基因、调控蛋白结合位点、对应于5’未翻译的mRNA先导序列的DNA、终止子和抗终止子位点。当与编码蛋白质的DNA序列对应的两个或更多个可读框处于一个单一的启动子和一个单一的终止子的控制下时,围绕所述启动子的整个区域、与编码蛋白质的DNA序列对应的可读框和所述的终止子被称为操纵子。例如,当所述的外源基因glf和glk处于一个单一的启动子和一个单一的终止子的控制下时,它被称为glf-glk操纵子。
本发明提供生物催化剂,其用于使用含有作为碳源的糖的一种基本培养基以高滴度、产率和生产力生产琥珀酸。正如本发明中所定义的那样,术语“产率”是指每克消耗的糖(例如葡萄糖或蔗糖)所生产的产品(例如琥珀酸)的克数。正如本发明中所定义的那样,术语“生产力”是指每升培养物每小时生产的产品(例如琥珀酸)的克数。术语“滴度”被定义为在所述发酵肉汤中以克/升表示的产品(例如琥珀酸)的浓度。琥珀酸的理想产率在0.8–1.2克生产的琥珀酸/克消耗的糖的范围内。在本发明中,理想的琥珀酸的生产力在1克或更多生产的琥珀酸/升/小时的范围内。理想的琥珀酸的滴度是在48小时或更少的发酵时间内,大于26g/l,或更优选地,大于64g/l,并且最优选地,大于83g/l。
根据从所述的细菌增殖得到的液体培养基在550或600纳米处光密度的增加速度,测定了细菌的生长速度。也用倍增细菌细胞所需要的时间为单位来表示细菌的生长速度。在适用于本发明的细菌细胞中,期望所述的细菌细胞具有在20分钟和3小时之间的倍增时间。
根据本发明,能够以两种不同的方法开发用于琥珀酸生产的生物催化剂。在所述的第一种方法中,对野生型细菌菌种进行基因操作,任选地,使其进化,以利用用于葡萄糖或其它糖输入的易化扩散来有效地生长。一旦构建了这样的一种菌株,就在代谢途径中进行随后的基因操作而获得一种以高滴度、产率和生产力生产琥珀酸或另一种所要的化学品的细菌菌株,例如通过现有技术中已知的下列方法。
根据专利合作条约以公开号WO2010/115067和美国专利申请公开号US20100184171公开的专利申请提供了关于可用于生产一种具有改善的琥珀酸生产能力的大肠杆菌菌株的基因工程化技术的细节。在此通过引入这两篇专利申请作为参考。
根据所述的第二种方法,如所述专利申请公开US20100184171和WO2010/115067中所描述的那样,把已经开发的一种对于化学品例如琥珀酸具有一种商业上有吸引力的产率和生产力的细菌菌株用作亲本菌株。然后进一步对该菌株进行基因操作以及任选的进化,以获得一种具有利用易化扩散来输入葡萄糖或另一种糖的能力而以一种商业上有吸引力的滴度、产率和生产力生产琥珀酸的细菌菌株。
作为一个具体的实例,本发明公开了生物催化剂和方法,该方法与现有技术的方法相比,具有改善的以足够高的滴度、产率和生产力生产琥珀酸的能力,同时获得通过易化扩散来输入糖的新能力。例如,由Jantama等人描述的大肠杆菌的KJ122菌株能够被选择作为本发明的起始菌株。据报道大肠杆菌的KJ122菌株具有在一种基本培养基中以高滴度和生产力生产琥珀酸的能力。
大肠杆菌的KJ122菌株是从大肠杆菌C菌株,经由根据美国专利申请公开号20100184171中和国际专利申请公开号WO2010/115067中所描述的基因缺失和代谢进化而得到的。这两篇专利申请公开文件提供了关于导致所述大肠杆菌的KJ122菌株发展的遗传变化的细节,在此通过引入它们作为参考。在琥珀酸的生产中,KJ122并不具有通过易化扩散来输入作为碳源的葡萄糖的任何实质性的能力。在KJ122中这种功能的缺乏归因于缺乏编码Glf蛋白的基因。本发明人已经发现了遗传方法,该方法能使KJ122更有效地利用作为碳水化合物的来源的葡萄糖,同时保留或改善了它原有的在一种基本培养基中以高的滴度、产率和生产力生产琥珀酸的能力。
术语“碳水化合物”当在本发明中使用时,包括单糖例如葡萄糖、果糖、木糖和阿拉伯糖,二糖例如蔗糖、蜜二糖、麦芽糖和乳糖,三糖例如蜜三糖和麦芽三糖,和高级寡糖,以及源于酶或化学消化多糖(例如淀粉、纤维素和生物质)的水解产物。简单的碳水化合物(具有一至三个糖单元的那些碳水化合物)在本文中被称为“糖”,例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等。
术语“PTS+有机体”或“PTS+细菌”是指一种具有基于PTS转运碳水化合物的能力的细菌。术语“非PTS的有机体”或“非PTS的细菌”或“PTS-细菌”是指在一个或更多个编码PTS功能的基因中发生了突变,使得所述PTS的活性相对于野生型PTS的活性被减小的细菌细胞。
在一个方面中,本发明公开了给一种有机体添加基因以安装或增加与糖的输入和转化为代谢中间体有关的一种或更多种蛋白质和/或酶的活性,所述的代谢中间体例如是葡萄糖6-磷酸、葡萄糖1-磷酸、果糖6-磷酸或果糖1-磷酸,它们能够被细胞进一步代谢。编码相关的蛋白质或酶的基因选自一个由下列组成的组:glf基因、HXT基因、glk基因和frk基因。
在另一种实施方式中,本发明提供一种利用用于输入一种作为可再生原料的糖(例如葡萄糖)的易化扩散来生产琥珀酸或另一种化学品的方法。在一个方面中,本发明提供一种利用一种生物催化剂从一种含糖的培养基生产琥珀酸的方法,该生物催化剂在所述有机体的原生PTS体系的至少一种蛋白质中(相对于祖本或亲本菌株的活性)具有降低的活性。在另一个方面中,本发明提供一种利用一种生物催化剂在含糖的培养基中生产琥珀酸或其它化学品的方法,该生物催化剂在所述有机体的原生糖输入体系的至少一种蛋白质中具有降低的活性(相对于涉及利用蛋白质同向转运体系例如GalP的祖本或亲本菌株的所述活性)。
本发明提供操作PTS并且转而操作所述细菌的碳水化合物摄取体系的方法。因为EI和HPr蛋白作为所述PTS体系的“一般”或“常见”组分而发挥作用,灭活编码EI蛋白的ptsI基因或编码HPr蛋白的ptsH基因将会导致完全灭活PTS。在其中ptsH或ptsI或两者的活性已经被减小或消除的细菌细胞中,实质上将会有较少的碳水化合物经由所述的PTS体系转运。当所述PTS被部分或完全灭活时,所述的细菌细胞不得不依靠一种或更多种其它备选的通透酶体系进行碳水化合物的转运。
当有葡萄糖经由PTS主动转运时,所述的EIIAGlc仍然是未磷酸化的,因为有一种用于接受它的磷酸基团的碳水化合物底物。然而,当在所述中培养基中没有葡萄糖时,EIIAGlc的磷酸化形式不能把它的磷酸基团转移给葡萄糖,因此它仍然处于它的磷酸化的状态。所述未磷酸化的EIIAGlc介导一般被称为碳代谢物抑制(CCR)的现象。根据CCR,当葡萄糖存在于所述生长培养基中时,在所述培养基中葡萄糖被减少到低浓度以前,在所述培养基中其它碳水化合物的转运和/或利用被阻止了。所述的碳代谢物抑制由未磷酸化的EIIAGlc对碳源利用的通透酶体系或其它体系的抑制效应引起。已知与所述碳水化合物输入有关的很多通透酶受未磷酸化的EIIAGlc的抑制,例如LacY或乳糖通透酶。另外,还已知未磷酸化的EIIAGlc经由它对腺苷酸环化酶体系的影响,对碳水化合物输入和代谢中所涉及的许多基因的转录具有一种负面影响。
菌株KJ122,良好的琥珀酸盐生产者,在所述的ptsI基因中含有移码突变,并且这种突变对于良好的琥珀酸盐生产很重要。因此,在本发明的上下文中出人意料的是,在琥珀酸盐生产中的进一步改善能够通过缺失ptsHI和galP,并且然后安装一种易化扩散体系而取得。
在另一种实施方式中,本发明提供编码所述EIIAGlc蛋白的crr基因的非天然地发生的复制。本发明人发现,含有PTSHI缺失、galP突变和功能性glf基因的安装的菌株,具有一种预料不到的在所述crr基因中获得突变的倾向,该突变引起所述EIIAGlc蛋白的功能的减小或消除,这种减小或消除转而引起琥珀酸盐生产参数的一种预料不到的不受欢迎的减小。通过在与原生的crr基因座分开的一个基因座处整合crr基因的第二个拷贝复制所述crr基因,通过大大地减小突变体在表型上变成crr阴性的的频率解决了这个问题。
下面将要详细地解释本发明。属于本发明的埃希氏菌属的一种实例细菌是从一个亲本菌株构建的一种菌株,该亲本菌株最初不能利用易化扩散用于糖输入,但是如本文中公开的那样,在基因工程化以后,该亲本菌株留驻了一种glf基因,以及任选的一种外源的glk基因,并且具有利用易化扩散用于葡萄糖和果糖输入的能力。
被引入到所述细胞中的外源基因能够被保持在所述细胞内,位于自我复制型质粒上。经由抗生素筛选或一种染色体突变的互补作用,能够保持质粒。然而,当把所述的外源基因保持在所述细胞内的自我复制型质粒上的所述的生物催化剂内时,有必要确保没有不必要的能量和物质的浪费,这种浪费导致生长的抑制以及使用所述的生物催化剂生产的有机物质的产率或生产力的减小。优选地,把所述的外源基因整合到所述宿主的染色体中,使得没有必要添加任何抗生素来把所述的质粒保持在所述细胞内,并且为了质粒保持,在所述细胞上加微少的代谢负担或不加代谢负担。在所述细胞内有许多可能的位置用于外源基因的整合。优选的用于把外源基因整合到所述大肠杆菌染色体的DNA内的位置包括不编码用于在商业化发酵条件下生长和产品形成的必要功能的区域。
当以一种操纵子形式获得所述的外源基因时,优选的是移除来自所述操纵子的任何可能的负调控基因或蛋白质。理想的是只含有在易化扩散和代谢中发挥正面作用的基因和蛋白质。因此优选地,一种易化扩散基因的表达没有被阻抑蛋白或碳代谢物阻遏所抑制。
以一种举例说明本发明并且不作为一种限定的方式,提供了下列实施例。
根据本发明,不天然地利用一种易化扩散体系用于糖输入的任何细菌都能够被改善。
本发明的一种细菌可以通过把准许利用易化扩散的一个或更多个基因引入到生产琥珀酸的菌株例如KJ122或事先被工程化以生产一种所要的化学品的其它菌株中而获得。备选地,本发明的细菌可以通过把一种生产琥珀酸或其它所要的化学品的能力赋予已经通过遗传工程和任选地通过进化而获准利用易化扩散的细菌而获得。这后一种备选方案例如能够通过下列所有用于构建KJ122的步骤,但是以菌株ATCC9637或一种K-12型大肠杆菌菌株或任何其它安全的大肠杆菌菌株开始,而不是以菌株ATCC8739开始而被实现。
实施例1
含有来自运动发酵单胞菌CP4的基因簇的glf和glk基因的AC15—一种KJ122的衍生物的构建所有DNA和质粒的操作、聚合酶链反应(PCR)、转化和染色体的整合都是通过现有技术中熟知的标准方法完成的,众所周知,DNA序列能够被克隆和连接在一起而形成在自然界中不能被容易地发现的新组合。除了更传统的涉及限制酶和DNA连接酶的方法以外,使用在酵母中重组的更新的方法,即所谓体外DNA剪接的“Gibson方法”或任何其它合适的方法能够被用来构建这样的新型DNA序列。所需的DNA片段能够从克隆文库或通过PCR从合适的模板DNA获得。也应理解,能够设计并且从化学前体合成许多所要的DNA序列。这样的一种服务由很多商业化公司提供,例如DNA2.0和GeneArt(Invitrogen)。
质粒pAC19被构建成含有一种人工操纵子,该操纵子含有由来自枯草杆菌噬菌体SP01的P26启动子驱动的来自运动发酵单胞菌的glf和glk基因。该操纵子被嵌入在与大肠杆菌CtdcC基因同源的上游序列和与大肠杆菌CtdcE基因同源的下游序列之间,用来促进整合进入将要被工程化的菌株的tdcCDE基因座中。将前面所描述的盒负载在源于pCL1921的一种低拷贝质粒载体上,该载体含有所述pSC101的复制起点和一种壮观霉素抗性基因。所述盒的组件是使用从商业化供应商例如Sigma和IntegratedDNATechnologies(IDT)获得的合适的合成DNA引物,通过PCR获得的。所述发酵单胞菌基因的来源是pLOI1740,该pLOI1740最初除了含有所要的glf和glk基因以外,还含有zwf和edd基因。将所述的glf,zwf,edd,glk簇转移到pCL1921,然后通过内翻外PCR缺失不必要的zwf和edd基因。所述的上游和下游tdc序列是通过PCR从作为模板的KJ122染色体的DNA获得的。所述的P26启动子是从噬菌体SP01获得的。把所述pAC19的序列表示为SEQID#1。
所有的构建都是在与让菌株在LB培养基(10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和5g氯化钠)上生长的同时进行的,视情况而定,给所述培养基补充抗生素或蔗糖。为了构建菌株AC15,使用先前描述的两步基因替换法,把含有所述pAC19的人工操纵子的所述盒整合到菌株WG53的染色体中。用于所述第一步的cat,sacB盒被容纳在质粒pAC21,SEQID#2上。除了所述的人工操纵子被一个cat,sacB盒替代以外,pAC21类似于pAC19,该cat,sacB盒含有一种氯霉素抗性基因和一种编码果聚糖蔗糖酶的可反选择的sacB基因。对于所述的第一步,通过PCR从pAC21获得所述的转化DNA,并且对于所述的第二步,通过PCR从pAC19获得所述的转化DNA。
菌株WG53是使用一种与上一段落中描述的两步基因替换法类似的两步基因替换法,通过从生产琥珀酸盐的菌株KJ122中缺失所述的ptsH、ptsI和galP基因获得的。跨越所述的ptsHI缺失的DNA序列被表示为SEQID#3。注意这种缺失留下完整的所述crr基因以及天然地存在于所述ptsH基因上游的原生的启动子。跨越所述galP缺失的所述DNA序列被表示为SEQID#4。
虽然中间体菌株WG53在极限葡萄糖培养基上生长得极差,但是菌株KJ122和AC15在极限葡萄糖培养基上生长得很好,这证实了:1)在WG53中,所述的ptsHI和galP基因已经被成功地缺失了,和2)所述的glf,glk盒在AC15中有功能,允许葡萄糖被输入。
实施例2
菌株AC15生产琥珀酸盐以及亲本KJ122使用一种具有葡萄糖补料分批体系的基本培养基,让菌株KJ122和AC15在微需氧菌条件下,在处于39℃的7升发酵罐(NewBrunswickScientific)中生长。3升的起始体积含有磷酸二氢钾(18mM)、硫酸镁(2mM)、甜菜碱(1.33mM)、痕量元素、消泡剂204(8ppm)和25g/l葡萄糖。通过添加下面描述的氢氧化铵/碳酸氢铵溶液,最先把pH值调节到pH7.0,随后把pH值保持在pH6.5,因为产生了酸。让150ml接种物以有氧方式生长并且使它包含一种基本培养基,该基本培养基类似于上述培养基,只是葡萄糖浓度为20g/l并且氯化钙被添加到0.1mM的最终浓度。把搅拌设定在750RPM(转/分钟)。当葡萄糖减少到5g/l时,开始加入650g/l葡萄糖进料并且保持在一定速度,目的是将葡萄糖浓度保持在大约5g/l或更少。用于中和的储备溶液含有氢氧化铵和碳酸氢铵两者(7NNH4OH和3MNH4HCO3)。以35ml/分钟给AC15通气,同时不向KJ122提供空气,除了存在于所述在顶部空间中的空气以外,使该顶部空间通过一个透气的无菌膜过滤器与大气平衡。这些是已经被证明对于每一个菌株效果都很好的条件。通过HPLC分析了来自48小时样品的糖、琥珀酸盐和副产物。平均化的重复实验结果被显示在表1中。AC15产生的滴度与亲本KJ122大约相同,但是对于AC15,乙酸盐副产物明显地更低,并且基于葡萄糖的产率更高。
实施例3
源于AC15的自发“红色突变体”KJ122能够发酵乳糖,正如通过在MacConkey乳糖平板(Beckton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)上形成红色菌落所证明的那样。然而,AC15并不发酵乳糖,正如通过在MacConkey乳糖平板上产生“白色”(米黄色)菌落所证明的那样。AC15的这种白色菌落表型由未磷酸化的EIIAGlc蛋白对乳糖通透酶(LacY)的结合和抑制引起。这种白色菌落表型存在于所有缺失了ptsHI的菌株中,因为用来磷酸化EIIAGlc所需要的酶不存在了,结果,存在于所述中细胞的所有EIIAGlc仍然是未磷酸化的。因此具有讽刺意味地,大肠杆菌ptsHI突变体在表型上是Lac-,尽管如此,但是在大肠杆菌中,乳糖没有被PTS体系输入。
本发明人偶然地注意到:当用AC15使MacConkey乳糖平板划线接种并且允许它在37℃孵化过夜,然后在室温下(大约22℃)再温育一天时,从已经生长在所述线条的较密部分上的白色菌落的菌苔上出现很多红色菌落。在重新划线几个所述红色菌落时,观察到已经发展出两类红色菌落。我们将会把所述的第一类称为“实心红”,因为单个菌落横穿其整个菌落都一致地是红色的。第二类将会被称为“煎鸡蛋红”,因为单个菌落在中央是红色的,但是所述菌落的外围部分是白色的或米黄色的。我们将会把在MacConkey乳糖上造成所有类型的红色菌落的菌株统称为“红色突变体”。
使用一种培养基和方法,在500ml微需氧菌发酵罐(Fleakers,CorningGlass,Corning,NY)中,测试了一种AC15的白色菌落以及名称为AC15-R1、-R2、-R3和–R4(其中的两种是实心红以及其中的两种是煎鸡蛋红)的4种红色突变体的琥珀酸盐生产,所述的培养基和方法类似于前面描述的用于所述7升发酵罐的培养基和方法,区别是:所述基本培养基的起始体积是200ml,在所述起始培养基中所述的葡萄糖都是一批的,浓度在100g/l,无需进料葡萄糖,采用磁力搅拌棒以350RPM进行搅拌,并且没有有意地引入或除去空气。结果被显示在表2中。所述的两种煎鸡蛋突变体表现得与亲本AC15相似,同时所述的两种实心红突变体表现得明显比亲本AC15更差。
使用所述的IlluminaHiSeq2000体系对亲本AC15和所述的4种红色突变体进行的基因组测序,显示出两种实心红突变体每一个都获得了一种突变,并且这两种突变都在所述的编码EIIAGlc的crr基因中。判断两者都是无效突变。两种煎鸡蛋红突变体每一个都获得了一种突变,并且这两种突变都在所述的乳糖操纵子中。判断这两者都是将会导致所述乳糖操纵子的更高水平表达的突变(一种突变是在所述lacO操纵基因中的突变,而另一种是在lacI(编码Lac阻遏蛋白的基因)中的移码。所有这4种突变都有意义,原因在于它们能够解释所观察到的发酵乳糖能力增大的表型。正如将会被预期的那样,所述的crr无效突变减轻了所述LacY通透酶的抑制作用,同时将会预期所述的乳糖操纵子突变过度生产LacY,允许至少一些从所述的抑制中逃出。然而,所述的crr无效突变清楚地具有一种另外的多效性效应,在我们的发酵条件下引起细胞生产琥珀酸盐的能力的减小。这是一种没有被预计到的预料不到的效应。
实施例4
运动发酵单胞菌的glk基因不是所述glf基因在大肠杆菌中发挥功能所必要的使用类似于前面描述的用于pAC19的那些方法的方法,构建了质粒pSS2。在pSS2和pAC19之间唯一的区别是所述的运动发酵单胞菌的glk基因被从所述的人工操纵子中缺失了。在其它方面中,例如载体骨架、所述的驱动glf表达的启动子、使所述的人工操纵子嵌入所述tdc的侧翼序列中和所述各个组件的定位方面,pSS2类似于pAC19。所述pSS2的DNA序列被表示为SEQID#5。
象前面针对所述来自pAC19的操纵子描述的那样,使用所述的两步基因替换法,把所述来自pSS2的人工操纵子整合在所述KJ122的tdc基因座处。据推测彼此相同的两种分离物被命名为SS8-9和SS8-11。象前面在实施例3中描述的那样,在500ml微需氧菌发酵罐中,将这两种新的菌株与AC15进行比较。结果(作为在48小时时分析的一式两份发酵罐的平均值)被显示在表3中。SS8-9和SS8-11两者都给出了类似于AC15的生长和琥珀酸盐滴度,而两种SS8分离物的乙酸盐生产都在某种程度上低于AC15的。因此,所述的运动发酵单胞菌的glk基因对于所述的glf基因在此上下文中发挥作用是不必要的,并且所述的运动发酵单胞菌的glk基因甚至可能对所述的发酵参数轻微有害。据推测,所述的SS8分离物在使用所述内源的大肠杆菌glk基因来磷酸化葡萄糖。
实施例5
菌株AC15的代谢进化正如前面在实施例3中注意到的那样,在7升发酵罐中,与亲本KJ122相比,菌株AC15较喜欢接受一种更高水平的通气。为了获得一种能够喜欢较少空气的AC15的衍生物,采用一个200ml的起始体积并且没有有意的通气供应,让AC15在500ml发酵罐中经受代谢进化。条件是微需氧的,因为没有采取任何措施来除去氧气。假定在所述进化进程期间有少量的空气泄漏进入所述的发酵容器中。用于生长的条件与在实施例3中描述的一样。在生长48小时以后,把所述培养物以1:100稀释到一个含有200ml新鲜培养基的新鲜的发酵罐中,并且然后把这一步重复40多次。这些向新鲜培养基中接种的每一次接种都将被称为“转移”。因此,让所述菌株经受总共41次向新鲜培养基的转移。每一次转移对应于大约7代细胞分裂。将来自最后那次转移的液体培养基的一个样品铺在一种MacConkey乳糖琼脂培养板上,并且选择一个单一的白色菌落并且将其命名为YSS41。
通过改变在7升发酵罐中通气的速度,确定了对于琥珀酸盐生产,采用5ml/分钟的空气,YSS41表现得很好,该5ml/分钟的空气实质上少于亲本AC15的最佳表现所需要的35ml/分钟。采用5ml/分钟的空气流,YSS41生产了94g/l琥珀酸盐和1.3g/l乙酸盐,对于琥珀酸盐,在一个7升发酵罐中在48小时中,产率为0.95g/g葡萄糖。
在一个20升的发酵罐中,比较了YSS41与KJ122的琥珀酸盐生产。发酵流程类似于前面描述的关于7升发酵罐的流程,除了对于这两种菌株起始体积是9升,并且通气速度是25ml/分钟以外,已经被确定的条件对于这两种菌株都是多产的。关于48小时样品的结果被显示在表4中。YSS41的琥珀酸盐滴度是100g/l(显著地高于KJ122的),乙酸盐滴度是2.2g/l(显著地低于KJ122的),并且所述琥珀酸盐的产率是0.95g/g葡萄糖(略微低于KJ122的)。因此,所述进化的菌株YSS41能够在一个20升发酵罐中,在一种通气要求不高于祖本菌株KJ122的通气要求的情况下表现得很好。
实施例6
针对所述crr基因中的突变稳定化YSS41当在MacConkey乳糖平板上划线时,YSS41仍然产生红色突变体,所述的实心红类型和所述的煎鸡蛋红类型两者。针对每个类型的一种分离物,对所述的crr基因进行了测序。菌株MYR222,一种煎鸡蛋类型,具有野生型crr基因序列。MYR223,一种实心红类型,具有一个插入所述crr可读框中的插入元件。所述插入元件的DNA序列与IS186的DNA序列匹配。因此,为AC15红色突变体建立的模式似乎也适用于YSS41红色突变体。在500ml微需氧发酵罐中,象在实施例4中那样生长的MYR222表现得与YSS41相似,而MYR223表现得更差(见表5)。因此,对于菌株YSS41,由于实心红突变体在菌群中的积累而导致的潜在的性能损失仍然是一种可能。
为了解决这种潜在的损失,把第二份拷贝的所述的crr基因整合到远离所述原生的crr基因座的一个位点中。使用作为模板的YSS41染色体的DNA以及引物BY249(SEQID#6)和BY250(SEQID#7),通过PCR对所述的crr基因与它的侧翼启动子和终止子一起进行了扩增。然后把所得的平端片段连接到源于pCL1921的低拷贝质粒中,该质粒在所述pflD可读框中的所述单一BstZ17I限制位点处含有来自大肠杆菌C的pflDC结构域的一部分的克隆。所述的pflDC基因与编码丙酮酸-甲酸裂合酶和所述丙酮酸-甲酸裂合酶活化酶的pflBA基因是同源的。所述的pflDC基因不是大肠杆菌所必要的,并且缺失pflD或pflC对生长没有显著的影响,因此推理:在那个基因座处插入一个盒将不会对生长或琥珀酸盐的生产有任何负面的影响。所得的低拷贝质粒pMH68含有所述的来自YSS41的crr基因,该基因被嵌入一种低拷贝质粒中pflDC的侧翼序列中。所述pMH68的DNA序列被表示为SEQID#8。
使用引物BY124(SEQID#9)和BY125(SEQID#10),通过PCR,把所述来自pMH68的整合盒扩增,所述引物与用来克隆所述的pflDC基因而开始用的引物相同。然后使用所述的两步基因替换法,把所述的整合盒整合到YSS41的染色体中。所得的菌株被命名为MH141,它现在对于crr来说是部分二倍体,意指它在所述的染色体上在两个远隔的位置中含有两个拷贝的野生型crr基因,一个拷贝在它的原生基因座处,而第二个拷贝被插入所述pflD的可读框中
正如预期的那样,菌株MH141在MacConkey乳糖平板上生产白色菌落。如果产生了一条浓重的划线,并且允许所述的平板在37℃温育过夜,并且然后让所述的平板在室温下再温育一天,从已经生长在所述条纹的较密部分上的白色菌落的菌苔上出现多个红色菌落。然而,从MH141产生的红色突变体的数目显著地低于在同一个平板上产生的YSS41的类似划线的数目。从YSS41中挑选了23种红色突变体并且从MH141中挑选了12种红色突变体,并且让所有的突变体在MacConkey乳糖平板上重新划线。当对所述的类型的红色突变体进行评分时,所述的23种YSS41红色突变体中的12种是所述的实心红类型的,同时所述的23种中的其它11种是所述的煎鸡蛋类型的。相比之下,所述的MH141红色突变体的所有12种都是所述的煎鸡蛋类型的。因此,通过在所述染色体中复制所述的crr基因,形成所述的实心红突变体的速度已经被减小了至少10倍。把从MH141中分离的一种煎鸡蛋红突变体命名为MH141-R1,并且象前面描述的那样,在500ml微需氧发酵罐中对它进行测试(见表5)。在生长、琥珀酸盐滴度和乙酸盐滴度方面,MH141和MH141-R1这两者都表现得与亲本YSS41相似。因此,一种更稳定的菌株MH141已经被构建,当把它与所述的利用GalP体系用于葡萄糖输入的祖本菌株KJ122相比时,菌株MH141利用易化扩散用于葡萄糖输入,并且它生产一种更高滴度的琥珀酸盐和一种更低滴度的所述副产物乙酸盐,
实施例7
在代谢进化期间,YSS41在所述glf,glk盒中获得突变测定了AC15和YSS41中所述的glf,glk表达盒的DNA序列。通过PCR对所述的区域进行了扩增,并且通过二脱氧链终止法对所得的片段在所述glf和glk基因上以及在上游和下游超过200个碱基对测序。测序的区域对应于pAC19的碱基4976-7920,被表示为SEQID#1。发现这两种突变是在YSS41的进化期间获得的。所述的第一种突变是在SEQID#1的碱基序号7742处G变为A的变化。这个碱基位于所述的glf,glkmRNA转录物的5’未翻译的区域中,正好在所述glf可读框的上游,并且导致在所述glfmRNA(信使RNA)中,在碱基-22处相对于ATG起始密码子或在碱基+15处相对于转录起点,C变为U的变化。预期这种突变将要增大或减小所述glf可读框的翻译速度。所述的第二种突变是在SEQID#1的碱基号6173处G变为A的变化。这个碱基正好在所述的glk可读框上游的5’未翻译的区域中,并且导致在所述glkmRNA中,在碱基-15处相对于ATG起始密码子,C变为U的变化。预期这种突变将要增大或减小所述glk可读框的翻译速度。因此,所述YSS41的进化导致了在glf和glk可读框之间的表达更佳的平衡,以产生一种生长和表现都胜过亲本菌株AC15的菌株。
其它的改变所述glf和glk基因的转录或表达速度的突变,或改变所述的浓度、比活性或所述的glf和glk蛋白的稳定性,能够以类似方式在所述的两种被编码的蛋白质之间实现一种更佳的平衡的突变,也将会有益于生长和所要的化学品的生产。这些其它备选的突变能够通过使用前面针对YSS41所描述的方法获得。这种方法也能够被应用到被工程化以生产除琥珀酸盐以外的产品的菌株,其中所述的利用易化扩散或糖输入的能力已经被工程化进入所述的菌株中。
实施例8
在优化用于YSS41的空气流速后,KJ122和YSS41的发酵已经确定了在一个20升发酵罐中,用于亲本菌株KJ122的最佳空气流速是25ml/分钟。当与KJ122的琥珀酸盐滴度和产率相比时,在25ml/分钟的空气流速度下,YSS41菌株显示了更好的琥珀酸盐滴度和产率。使用YSS41菌株,琥珀酸盐产率和滴度的进一步改善是通过把空气流速增大到50ml/分钟而获得的。因此,对于YSS41菌株,关于琥珀酸盐产率和滴度的最佳空气流速似乎不同于KJ122的最佳空气流速。表6提供了在所述的20升发酵罐中,在优化的空气流条件下,每一个菌株的发酵结果。在滴度、产率和乙酸盐副产物形成方面,YSS41的表现胜过亲本KJ122。所述发酵的初始体积是9500ml。在加入葡萄糖并且用碱中和以后,最终体积是12500ml。
参考文献
(096)为了方便读者,列出了所有的参考文献。将每一篇参考文献整体引入作为参考。
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Claims (33)
1.一种细菌,其生产超过30g/升的一种所要的化学品,其中所述所要的化学品的一种生物合成中间体是磷酸烯醇丙酮酸,并且所述的细菌含有至少一种外源基因,该外源基因编码一种在糖的易化扩散中发挥功能的蛋白质。
2.权利要求1所述的细菌,其中所述的细菌选自由下列组成的组:氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans),浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacterasaii),德尔马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae),粘无色杆菌(Achromobacterviscosus),乳无色杆菌(Achromobacterlacticum),根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens),放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter),粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis),柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus),肿大节杆菌(Arthrobactertumescens),石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus),裂烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus),氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans),天牛金杆菌(Aureobacteriumsaperdae),印度固氮菌(Azotobacterindicus),产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes),叉分短杆菌(divaricatum),乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum),黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum),球形短杆菌(Brevibacteriumglobosum),暗褐短杆菌(Brevibacteriumfuscum),酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum),创伤短杆菌(Brevibacteriumhelcolum),极小短小杆菌(Brevibacteriumpusillum),砖红色短小杆菌(Brevibacteriumtestaceum),玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum),Brevibacteriumimmariophilium,扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens),原玻璃蝇短杆菌(Brevibacteriumprotopharmiae),嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum),谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum),美棒杆菌(Corynebacteriumcallunae),嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum),醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum),产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes),解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora),胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora),草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola),菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi),外来黄杆菌(Flavobacteriumperegrinum),染色假杆菌(Flavobacteriumfucatum),橙色黄杆菌(Flavobacteriumaurantinum),莱茵黄杆菌(Flavobacteriumrhenanum),塞沃尼假杆菌(Flavobacteriumsewanense),短黄杆菌(Flavobacteriumbreve),脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum),微球菌种CCM825(Micrococcussp.CCM825),摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii),灰暗诺卡氏菌(Nocardiaopaca),粗糙诺卡氏菌(Nocardiarugosa),Planococcuseucinatus,雷氏变形菌(Proteusrettgeri),谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii),类黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha),产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans),荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens),卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis),施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri),食酸假单胞菌(Pseudomonasacidovolans),霉味假单胞菌(Pseudomonasmucidolens),睾丸酮假单胞菌(Pseudomonastestosterone),铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),红串红球菌(Rhodococcuserythropolis),紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous),红球菌种ATCC15592(Rhodococcussp.ATCC15592),红球菌种ATCC19070(Rhodococcussp.ATCC19070),脲芽孢八叠球菌(Sporosarcinaureae),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),梅氏弧菌(Vibriometschnikovii),干酪弧菌(Vibriotyrogenes),马杜拉马杜拉放线菌(Actinomaduramadurae),紫产色链霉菌(Actinomycesviolaceochromogenes),丘疹性北里孢菌(Kitasatosporiaparulosa),天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor),浅黄链霉菌(Streptomycesflavelus),浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus),浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans),橄榄链霉菌(Streptomycesolivaceus),田无链霉菌(Streptomycestanashiensis),弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae),抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus),可可链霉菌(Streptomycescacaoi),淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae),绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida),短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus),环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans),解硫胺素芽孢杆菌(Bacillusthiaminolyticus),弗氏埃希氏菌(Escherichiafreundii),嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum),粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium),薛氏沙门氏菌(Salmonellaschottmulleri),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis),解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylolliquefaciens),以及柑橘黄单胞菌(Xanthomonascitri)。
3.权利要求1所述的细菌,其中所述的细菌选自由下列组成的组:大肠杆菌(Escherichiacoli),谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum),黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum),产甘露糖半琥珀酸酯菌(Mannhemiasucciniproducens)和产琥珀酸厌氧生螺旋菌(Anaerobiospirilumsucciniproducens)。
4.根据权利要求1所述的细菌,其中所述所要的化学品选自由下列组成的组:琥珀酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、丙二酸、顺丁烯二酸、2,5-呋喃二羧酸、丙酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟基丁内酯和丁二醇,例如1,4-丁二醇、1,3-丁二醇和2,3-丁二醇。
5.根据权利要求1所述的细菌,其中所述所要的化学品是琥珀酸盐。
6.根据权利要求1所述的细菌,其中所述所要的化学品是顺式,顺式-粘康酸。
7.根据权利要求1所述的细菌,其中所述所要的化学品是芳族生物化学品。
8.根据权利要求1所述的细菌,其中所述的细菌是PTS-细菌菌株。
9.根据权利要求1所述的细菌,其中所述的细菌与相关的野生型菌株相比,具有降低水平的磷酸转移酶活性。
10.权利要求1的细菌,其进一步在编码蛋白质的一种或更多种基因中包含突变或缺失,所述的蛋白质在用于糖输入的磷酸转移酶体系中发挥作用,所述突变的或缺失的基因不是crr基因。
11.权利要求10的细菌,其进一步在一种编码糖输入体的基因中包含一种缺失,该糖输入体利用质子同向转运发挥作用。
12.权利要求10的细菌,其中所述突变的或缺失的基因是ptsH基因或它的同源物。
13.权利要求10的细菌,其中所述突变的或缺失的基因是ptsI基因或它的同源物。
14.权利要求10的细菌,其中所述突变的或缺失的基因选自由下列组成的组:ptsH、ptsI、ptsH的同源物和ptsI的同源物。
15.根据权利要求1所述的细菌,其中所述的细菌是galP-细菌菌株。
16.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因被包含在一种复制型质粒上。
17.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因被整合到所述的宿主染色体中。
18.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因是glf基因。
19.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因是glf和glk基因。
20.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因是glf基因和frk基因。
21.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因源于酵母。
22.权利要求1所述的细菌,其中所述的外源基因源于运动发酵单胞菌的菌株。
23.权利要求1的细菌,其中所述的细菌在基本培养基中生长。
24.权利要求1的细菌,其中所述的细菌生产超过64克/升的所要的化学品。
25.权利要求1的细菌,其中所述的细菌生产超过83克/每升的所要的化学品。
26.一种细菌,它含有两个或更多个拷贝的功能性crr基因或crr基因的功能性同源物。
27.一种用于生产所要的化学品的方法,它包括下列步骤:
让权利要求1至26的细菌在基本发酵培养基中生长;和
任选地从所述的发酵培养基中纯化所述的化学品。
28.一种用于生产琥珀酸的方法,它包括下列步骤:
让细菌在基本发酵培养基中生长,所述细菌包括至少一种编码一种在糖的易化扩散中发挥作用的蛋白质的外源基因并且生产至少60克/升的琥珀酸盐和少于4.2克/升的乙酸盐;和
任选地从所述的发酵培养基中纯化琥珀酸。
29.一种用于改善由一种细菌菌株生产的一种所要的化学品的滴度和产率的方法,所述的细菌菌株已经被工程化而利用易化扩散用于输入糖,所述方法包括下列步骤:
让亲本菌株经受连续的向新鲜液体培养基中的转移;
把所得的单一菌落的培养物接种在培养皿上;和
选择单一的菌落。
30.一种被工程化而利用易化扩散用于输入糖的细菌菌株,它包含glf-glk操纵子,其中所述的细菌菌株已经被进化而获得生产琥珀酸盐的改善的滴度和产率,并且它进一步在所述glf-glk操纵子中包含一个或更多个突变。
31.权利要求30的细菌菌株,其中所述的一个或更多个突变改变所述的DNA序列中的碱基,所述的DNA序列对应于编码所述glf或glk基因中的任意一个的mRNA的5’未翻译的前导区。
32.一种被工程化而利用易化扩散用于输入糖的细菌菌株,它包含一种glf基因,其中所述的细菌菌株已经被进化而获得生产琥珀酸盐的改善的滴度和产率,并且所述的glf基因包含一个或更多个突变。
33.一种被工程化而利用易化扩散用于输入糖的细菌菌株,它包含一种glk基因,其中所述的细菌菌株已经被进化而获得生产琥珀酸盐的改善的滴度和产率,并且所述的glk基因包含一个或更多个突变。
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GR01 | Patent grant | ||
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