ES2908342T3 - Método de producción de ácido succínico utilizando difusión facilitada para la importación de azúcar - Google Patents

Abstract

Una bacteria Escherichia coli capaz de producir más de 30 gramos por litro de ácido succínico, en donde uno de los intermediarios biosintéticos para dicho ácido succínico es fosfoenolpiruvato, y dicha bacteria contiene al menos un gen exógeno que codifica una proteína que funciona en la difusión facilitada de un azúcar, una mutación o deleción en uno o más genes que codifican proteínas que funcionan en un sistema de fosfotransferasa para la importación de azúcar y dos o más copias de un gen crr funcional o un homólogo funcional de un gen crr.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de ácido succínico utilizando difusión facilitada para la importación de azúcar

Campo de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de la producción de productos químicos orgánicos de uso básico y especializado utilizando biocatalizadores (bacterias) que pueden modificarse para aumentar su eficiencia en el uso de materias primas que contienen azúcar. Más específicamente, la presente invención se refiere a modificaciones genéticas de genes que codifican funciones que implican transporte y metabolismo de azúcares para la producción biológica de ácido succínico.

Antecedentes de la invención

Un gran número de productos químicos orgánicos se obtienen actualmente a partir de materias primas petroquímicas. Existe un interés creciente en la producción de muchos de estos compuestos orgánicos obtenidos a partir de materias petroquímicas a través de procesos de fermentación biológica utilizando materias primas renovables. La lista de compuestos orgánicos que pueden obtenerse a partir de materias primas renovables incluye a,w-diácidos (succínico, fumárico, málico, glucárico, malónico y maleico), ácido 2,5-furano dicarboxílico, ácido propiónico, ácido 3-hidroxi propiónico, ácido aspártico, ácido glucárico, ácido glutámico, ácido itacónico, ácido levulínico, 3-hidroxibutirolactona, glicerol y butanodioles como el 1,4 butanodiol (Solicitud de patente de EEUU 20090047719), 1,3-butanodiol (Solicitud de patente de EEUU 20090253192), y 2,3-butanodiol. Muchos otros tipos de compuestos orgánicos, incluidos, entre otros, aminoácidos, vitaminas, alcoholes (como etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol y alcoholes superiores), ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos, isoprenoides, trementinas, carotenoides, aminas, también se pueden producir utilizando materias primas renovables. Cualquier compuesto de este tipo se denominará en el presente documento "compuesto deseado". Aunque se han desarrollado procesos de fermentación para muchos de estos compuestos deseados, con el fin de competir con procesos petroquímicos, existe una necesidad constante de mejorar la economía general de la fermentación, por ejemplo, de mejorar el título del producto (concentración final en gramos por litro de producto) y el rendimiento del producto (gramos de producto por gramo de fuente de carbono, tal como la glucosa), y para reducir el título de subproductos no deseados tales como el acetato.

Muchas bacterias, incluida Escherichia coli, utilizan un sistema, llamado sistema de fosfotransferasa (PTS), para transportar activamente glucosa y otros azúcares al interior de la célula. Este sistema utiliza PEP (fosfoenol piruvato) como fuente de energía y fosfato para transportar y fosforilar simultáneamente el azúcar. Los sistemas PTS generalmente requieren cuatro o más proteínas que funcionan juntas para importar y fosforilar el azúcar entrante. Algunas de estas proteínas son comunes a todos los azúcares que un organismo determinado importa mediante un sistema PTS, mientras que otros componentes proteicos del PTS son específicos de uno o más azúcares particulares.

Por ejemplo, en E. coli, las proteínas que son comunes a todas las vías PTS son PtsH y PtsI, codificadas por los genes ptsHy ptsl, respectivamente. Además de estas dos proteínas PTS "comunes", se requieren una o más proteínas PTS específicas de azúcar adicionales para importar y fosforilar azúcares particulares. Por ejemplo, la importación de glucosa por parte del PTS requiere dos proteínas adicionales denominadas Crr y PtsG. Crr es una proteína citoplasmática con un solo dominio llamado A, y PtsG es una proteína de membrana con dos dominios llamados B y C. El grupo fosfato del PEP se transmite de una proteína a otra y finalmente se transfiere a la glucosa a medida que se importa, en la posición 6 para dar glucosa-6-fosfato dentro de la célula. El orden de transmisión comenzando con PEP es PtsI, PtsH, Crr y finalmente PtsG. Históricamente, estas proteínas también han recibido otros nombres, como EI, HPr, EIIAGlc, y EIIBC, respectivamente. Como otro ejemplo en E. coli, la fructosa se importa mediante una transmisión similar que utiliza PtsI, PtsH, FruA y FruB, los dos últimos también conocidos como EIIFru y EIIFru, respectivamente. Para algunos azúcares, por ejemplo, el manitol, los dominios de proteína específicos del azúcar correspondientes a A, B y C, mencionados aquí anteriormente para la glucosa, se fusionan en un polipéptido unido a la membrana, mientras que para otros azúcares, por ejemplo, la manosa, los dominios A y B se fusionan en un polipéptido citoplasmático, mientras que el componente unido a la membrana se compone de dos subunidades llamadas C y D.

En todos los casos, el sistema se basa en las "subunidades comunes" (PtsI y PtsH en E. coli), y PEP es la fuente de energía y fosfato. Como resultado, cada molécula de azúcar importada por un sistema PTS da como resultado la utilización de una molécula de PEP y la producción de una molécula de azúcar fosforilado y una molécula de piruvato. Sin embargo, el PEP también es un intermediario obligado en varias rutas bioquímicas, tales como 1) la formación de piruvato y ATP por la piruvato quinasa, 2) las rutas apleuróticas catalizadas por la PEP carboxiquinasa y la PEP carboxilasa, que alimentan de carbono al ciclo TCA (ácido tricarboxílico) y 3) la entrada en la ruta de la biosíntesis de vitaminas aromáticas y aminoácidos aromáticos comunes catalizada por una o más isoenzimas de 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHP sintasa). Por lo tanto, existe una competencia inevitable para PEP entre el sistema PTS para la importación de azúcar y las otras rutas que se acaban de mencionar.

Dado que muchas bacterias, incluidas las Gram positivas y las Gram negativas, utilizan un sistema PTS, obviamente es un sistema que ha prevalecido en muchas circunstancias a lo largo de la evolución. Sin embargo, en condiciones anaerobias, la producción de ATP a partir de azúcares como la glucosa es mucho menos eficiente que en condiciones aerobias, y la llamada fosforilación a "nivel de sustrato", por ejemplo, por la piruvato quinasa, llega a producir una porción mayor de ATP por molécula de glucosa que en condiciones aerobias, donde la fosforilación oxidativa proporciona la mayor parte del ATP por molécula de glucosa. Como tal, cabe señalar que algunos organismos, tales como Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis, siendo ambos unos organismos bien adaptados al crecimiento anaerobio en glucosa y otros azúcares, no tienen un sistema PTS, sino que utilizan una proteína de difusión facilitada (también llamada permeasa) para importar glucosa y otros azúcares. Además, cuando los organismos que usan de forma nativa un PTS se manipulan genéticamente para producir un exceso de compuestos particulares por fermentación, las rutas en muchos casos usan PEP como intermediario, de modo que el sistema PTS compite con la ruta biosintética deseada para PEP. Se sabe que el alivio de esta competición mediante la reducción de la actividad del sistema PTS aumenta el flujo hacia una ruta biosintética deseada.

Por ejemplo, el PEP es un intermediario en la rama reductora del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) que conduce al succinato. Durante la evolución metabólica de KJ122, un productor de succinato en E. coli , surgió una mutación de desplazamiento de marco en el gen ptsl, lo que dio como resultado un aumento en la producción de succinato a partir de glucosa. La reinstalación de un gen ptsl de tipo salvaje provocó una reducción drástica en la producción de succinato, demostrando que la mutación de ptsl contribuyó fuertemente a la mejora de la cepa.

Para otro ejemplo, los aminoácidos aromáticos se construyen a partir de PEP y eritrosa-4-fosfato. Se demostró que la eliminación de tres genes pts (AptsHI, crr) en una cepa de E. coli aumentaba el flujo a la ruta biosintética de aminoácidos aromáticos cuando las células se cultivan en glucosa como fuente de carbono.

En los dos ejemplos anteriores, la importación de glucosa presumiblemente todavía se produce en algún nivel por la llamada galactosa permeasa (GalP, codificada por el gen galP). En el primer ejemplo, se encontró que una mutación que reducía la actividad de un represor (GalS) del gen galP era resultado de la evolución metabólica (WO2011/123154). En el segundo ejemplo, se produjeron una o más mutaciones después de la supresón de genes pts dando como resultado un aumento en la tasa de crecimiento. La cepa resultante dependía de galP para un crecimiento significativo en glucosa, y una o más mutaciones en la cepa podrían haber estado relacionadas con un aumento en la expresión de galP (US 6,962,794). Sin embargo, las cepas de este segundo ejemplo produjeron solo títulos bajos de aminoácidos aromáticos después de diseñar las cepas "Pts-/Glu+" para la producción de aminoácidos aromáticos. Se produjeron fenilalanina, tirosina y triptófano a 1,7, 0,8 y 2,2 g/l respectivamente. Dado que estos títulos no son lo suficientemente altos para respaldar un proceso comercial económicamente atractivo, no está claro que la invención descrita en US 6,962,794 sea útil para la producción comercial. Por tanto, todavía existe la necesidad de mejorar los parámetros de fermentación para la producción comercial económicamente viable de productos químicos por fermentación.

Aunque el uso de GalP para la importación de glucosa conserva PEP, es un simportador de protones, por lo que consume alrededor de 1/3 de un ATP por cada molécula de glucosa transportada. Algunos microorganismos, por ejemplo la bacteria Zymomonas mobilis y la levadura Saccharomyces cerevisiae utilizan la difusión facilitada para importar glucosa. Z.mobilis tiene una proteína facilitadora que funciona para importar glucosa y fructosa. S. cerevisiae tiene al menos 14 importadores de hexosa diferentes, muchos de los cuales importan glucosa y al menos algunos también importan fructosa. Este modo de importación de glucosa no requiere gasto de ATP hasta que el azúcar está dentro del citoplasma, después de lo cual se consume un ATP para formar glucosa-6-fosfato para permitir que el azúcar entre en la glucólisis. Lo que es más importante, a diferencia del sistema PTS, no consume PEP. Por tanto, la difusión facilitada claramente funciona bien para algunos organismos y le cuesta menos a la célula en términos de PEP y ATP que un sistema PTS o un simportador de protones como GalP. Ingram et al. (documento US 5,602,030) demostraron que la proteína de difusión facilitada (Glf, codificada por el gen glf) de Zymomonas mobilis, junto con una glucoquinasa (Glk, codificada por el gen glk), también de Zymomonas mobilis, expresada a partir de esos genes en un plásmido multicopia, podía reemplazar funcionalmente al PTS para apoyar el crecimiento en un medio mínimo de glucosa de una cepa de E. coli, donde el organismo parental no tenía capacidad de difusión facilitada por glucosa nativa, y otros sistemas de importación de glucosa habían sido desactivados por mutación. La cepa ZSC113 recombinante de E. coli ptsG-, ptsM-, glk-, que contiene los dos genes glf y glk de Z. mobilis en un plásmido, podría crecer aerobiamente en un medio mínimo de glucosa.

Estas revelaciones demostraron que las proteínas de Z. mobilis podrían funcionar en E. coli lo suficiente para apoyar el crecimiento aerobiamente con una tasa de crecimiento específica de 0,53 h-1. Sin embargo, el tipo salvaje de E. coli que utiliza el PTS nativo para la importación de glucosa tiene una tasa de crecimiento aerobio específico de 1,0 a 1,2 h-1), por lo que las cepas diseñadas en el documento US 5,602,030 para usar glf parecen estar seriamente limitadas por la captación de glucosa. Además, las descripciones no indicaron que el sistema de difusión facilitada pudiera soportar el crecimiento anaerobio. Una serie de sustancias químicas importantes producidas por fermentación requieren un crecimiento anaerobio robusto para respaldar un sistema de producción comercial económicamente atractivo (WO2012/018699). Los ejemplos en el documento US 5,602,030 y Snoep et al (1994) indicaron que se podía obtener un crecimiento modesto expresando glf y glk a partir de un plásmido multicopia, pero no se demostró que el crecimiento pudiera ser apoyado por copias integradas de los genes glf y glk, si bien, a menudo es deseable para la producción a escala comercial utilizar cepas que no contienen un plásmido. Finalmente, el documento US 5,602,030 no demostró que un sistema basado en g lf pudiera respaldar la producción de títulos altos de un producto químico de uso básico tal como etanol o succinato en E. coli o en cualquier otro organismo que no utiliza de forma nativa la difusión facilitada. En este sentido, no quedó claro a partir de la divulgación del documento US 5,602,030, tomado en solitario, que un glf pudiera reemplazar el PTS y dar como resultado procesos de fermentación económicamente atractivos para producir un producto químico deseado en una cepa huésped que no tiene un sistema nativo de difusión facilitada.

Tang et al (2013) fueron un par de pasos más allá para demostrar que podía lograrse la producción anaerobia de succinato mediante la expresión de glf de Z. mobilis en combinación con una glucoquinasa en una cepa de base de E. coli que era Aptsl, Aldha, ApflB, pck*. Sin embargo, la mejor producción de succinato en este sistema fue modesta, solo 220 mM (26 g/l) en 96 horas. A pesar de haber optimizado por modulación combinatoria la expresión de glf y glk, este título y esta productividad no se acercan a las cepas publicadas anteriormente que produjeron 83 g/l de succinato sin el uso de glf. Por lo tanto, a pesar del trabajo más avanzado de Tang et al., aún no se había demostrado que el uso de difusión facilitada para la importación de glucosa fuera útil para mejorar los parámetros de producción de fermentación a niveles que serían necesarios para una producción comercial económicamente atractiva, que estaría en el punto de referencia de al menos 83 g/l (WO2012/018699). Para complicar aún más la posible sustitución de un PTS por glf, en E. coli, y presumiblemente en otras bacterias, los componentes del PTS tienen muchas funciones reguladoras diversas que afectan a muchas rutas metabólicas diferentes, por lo que es imposible predecir cuáles serán los efectos de una eliminación en uno o más de los genes del PTS sobre la fisiología general y sobre las propiedades fermentativas de cualquier cepa modificada resultante. Las cepas nativas de Z. mobilis, que naturalmente utilizan la difusión facilitada para la captación de glucosa, son capaces de producir hasta aproximadamente 60 g/l de etanol y una cantidad similar de dióxido de carbono a partir de glucosa. Se da a conocer una cepa de diseño de Z. mobilis que produce 64 g/l de succinato a partir de glucosa (EP20070715351). Sin embargo, esta fermentación requirió 10 g/l de extracto de levadura en el medio de fermentación, lo que no es deseable para la producción comercial de ácido succínico, tanto por su gasto como por el mayor coste requerido para la purificación curso abajo del succinato a partir de los componentes del extracto de levadura. Además, Z. mobilis a menudo no es un organismo huésped conveniente u óptimo para su uso en procesos fermentativos.

Así, para resumir el estado de la técnica, se ha demostrado que E. coli puede diseñarse para usar la difusión facilitada de glucosa para apoyar el crecimiento aerobio a un ritmo modesto y para soportar un nivel modesto de producción de succinato anaerobiamente, pero no ha habido divulgación de ninguna cepa bacteriana o proceso que haya sido diseñado para conferir el uso no nativo de la difusión facilitada para la importación de glucosa y que se mejore con respecto a las cepas que usan sistemas nativos de importación de glucosa tales como PTS y/o GalP para la producción de un producto químico por fermentación. Además, no se ha divulgado ninguna cepa bacteriana o proceso que utilice la difusión facilitada para la importación de glucosa y que sea capaz de producir succinato o cualquier producto químico que no sea etanol y dióxido de carbono en un título, rendimiento y tasa que sea lo suficientemente alto en un medio que sería comercialmente atractivo, tal como un medio mínimo de glucosa. En este sentido, todavía existe la necesidad de cepas mejoradas que puedan producir succinato y productos químicos en un proceso que sea económicamente atractivo cuando se tengan en cuenta todos los factores, incluidos la productividad, el costo del medio y la purificación posterior.

Sumario de la invención

Esta presente invención proporciona biocatalizadores, es decir, microorganismos modificados genéticamente y métodos para usar la difusión facilitada de glucosa para mejorar la producción fermentativa de ácido succínico, que es un producto químico de uso básico y especializado comercialmente importante.. Específicamente, la presente invención es útil en la producción fermentativa de ácido succínico, que es un producto bioquímico que tiene PEP como intermedio bioquímico en su ruta biosintética, usando materias primas renovables que contienen azúcar. La presente invención es útil en la producción fermentativa de ácido succínico a partir de una materia prima renovable que contiene glucosa, fructosa o sacarosa utilizando biocatalizadores que se han construido para utilizar la difusión facilitada de un azúcar. Los principios de la presente invención se pueden aplicar a muchos otros compuestos químicos deseados que se pueden producir por fermentación, en particular productos químicos intermedios del ciclo TCA o derivados de los mismos, tales como ácido fumárico, ácido málico, glutamato, derivados de glutamato, aspartato, derivados de aspartato, aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano) y compuestos derivados de intermediarios en la ruta aromática central, tales como vitaminas y ácido cis,cis-mucónico.

De acuerdo con la presente invención, los genes que codifican las proteínas involucradas en la difusión facilitada de azúcares como la glucosa se introducen en un biocatalizador que es una bacteria Escherichia coli ya sea para conferir una nueva capacidad al biocatalizador para importar un azúcar como fuente de carbono y energía a partir del medio de fermentación por difusión facilitada, o para aumentar o mejorar una capacidad ya existente de los biocatalizadores para el transporte y metabolismo de azúcar. Las cepas diseñadas para tener la capacidad adicional de importar azúcares mediante difusión facilitada pueden tener parámetros de fermentación mejorados en comparación con los parámetros de la cepa original, tales como aumento del título (g/l del producto químico deseado), aumento del rendimiento (gramos de producto producido por gramo de azúcar consumido), aumento de la productividad específica (g/l-hora de formación de producto) y/o disminución del título de subproductos no deseados tales como acetato, piruvato y/o aminoácidos. Estos parámetros mejorados pueden ser resultado de la conservación de energía (por ejemplo, el uso de menos ATP para la formación de gradientes de protones para impulsar simportadores de protones como GalP), conservación de PEP para rutas que usan PEP como un intermedio, tales como la(s) rutas(s) del succinato, y disminución del metabolismo de desbordamiento en rutas de producción de acetato u otras vías no deseadas.

Este enfoque es particularmente ventajoso para la producción de productos químicos que se obtienen, al menos en parte, a partir de o a través de PEP, tales como succinato, malato, fumarato, lactato, etanol, butanoles, propanodioles, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido propiónico, ácido láctico, aminoácidos como glutamato, aspartato, metionina, lisina, treonina e isoleucina, compuestos que se obtienen a partir de la ruta aromática central, como fenilalanina, tirosina, triptófano, vitaminas aromáticas, compuestos similares a vitaminas aromáticas y cualquier otro compuesto obtenido a partir de PEP como intermediario biosintético.

En una primera realización, la presente invención proporciona una bacteria Escherichia coli capaz de producir más de 30 gramos por litro de ácido succínico, en donde uno de los intermediarios biosintéticos para dicho ácido succínico es fosfoenolpiruvato, y dicha bacteria contiene al menos un gen exógeno que codifica una proteína que funciona en la difusión facilitada de un azúcar, una mutación o eliminación en uno o más genes que codifican proteínas que funcionan en un sistema de fosfotransferasa para la importación de azúcar y dos o más copias de un gen crr funcional o un homólogo funcional de un gen crr.

La presente invención proporciona biocatalizadores que son una bacteria E. coli que no tiene de forma nativa la capacidad de importar un azúcar mediante difusión facilitada con un gen (o genes) heterólogo añadido que confiere una nueva capacidad para importar un azúcar mediante difusión facilitada. Los nuevos biocatalizadores pueden producir un título de un producto de fermentación deseado más alto que el biocatalizador original. Los nuevos biocatalizadores pueden producir un rendimiento de un producto de fermentación deseado mayor que el biocatalizador original. Los nuevos biocatalizadores pueden producir una productividad específica para un producto de fermentación deseado mayor que el biocatalizador original. El nuevo biocatalizador puede producir un título de un subproducto deseado no deseado más bajo que el biocatalizador original.

El gen o los genes que codifican la proteína o las proteínas que funcionan en la difusión facilitada de un azúcar pueden obtenerse a partir de cualquier organismo que tenga la capacidad natural de llevar a cabo la difusión facilitada de un azúcar, siendo el único requisito que la proteína o las proteínas sean capaces de funcionar en el nuevo huésped. El gen que codifica una azúcar quinasa, por ejemplo una glucoquinasa, que se requiere para fosforilar el azúcar después de que ingresa en el citoplasma, puede obtenerse a partir del mismo donante del que provienen el o los genes para la difusión facilitada, o se puede usar un gen de azúcar quinasa nativo a partir del huésped receptor, o se puede usar una combinación de ambas azúcar quinasas.

En una segunda realización, la presente invención proporciona métodos para producir un producto de fermentación deseado que es ácido succínico, que comprende cultivar el microorganismo modificado genéticamente según la primera realización en un medio de fermentación mínimo.

La presente descripción proporciona métodos para mejorar los parámetros de rendimiento de la fermentación (título, rendimiento, productividad específica, minimización de la formación de subproductos) de cepas diseñadas para usar difusión facilitada.

La presente descripción proporciona métodos para obtener un equilibrio mejorado de difusión facilitada y actividad de azúcar quinasa que conduce a parámetros de crecimiento y fermentación mejorados en microorganismos modificados genéticamente que utilizan difusión facilitada para importar un azúcar.

De acuerdo con la presente descripción, un enfoque es transferir genéticamente un sistema de difusión facilitada para importar un azúcar de un segundo organismo donante, que contiene de forma natural los genes relevantes (por ejemplo glf o glk o una combinación de los mismos), en un primer organismo receptor que no contiene de forma natural dichos genes relevantes, para conferir a dicho primer organismo receptor una nueva capacidad para importar dicho azúcar por difusión facilitada. Preferiblemente, el primer receptor se ha diseñado o construido previamente para que carezca de, o tenga sustancialmente reducida, su capacidad para importar dicho azúcar por cualquier sistema o sistemas nativos presentes en una cepa parental o ancestral de dicha primera cepa receptora. En tal caso, la cepa resultante se ve forzada de hecho a usar difusión facilitada para el crecimiento en dicho azúcar.

En una opción preferida, la primera cepa receptora es una cepa E. coli, y la segunda cepa donante es Zymomonas mobilis CP4. En una opción más preferida, dicha primera cepa es WG53, que a su vez se obtiene a partir de KJ122 por supresión de ptsH, ptsI, y galP. La naturaleza exacta de las supresiones de ptsH, ptsI, y galP puede variar ampliamente, siendo el único criterio importante que las actividades de las proteínas PtsH, PtsI y GalP se eliminen o reduzcan sustancialmente.

El primer organismo receptor en las realizaciones de la invención es E. coli. Alternativamente, de acuerdo con opciones que no están abarcadas por la presente invención, y que no forman parte de la invención, el primer organismo receptor puede variar ampliamente, siendo el único criterio que no contenga de forma nativa una proteína que funcione en difusión facilitada para un azúcar como la glucosa. Además de E. coli, los ejemplos de primeros organismos receptores (que no forman parte de la invención) incluyen, pero no se limitan a: Gluconobacteroxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium pereg rinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, rettgeri Proteus, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas oval, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyolliquefaciens, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baylyi, Corynebacterium glutamicum, Brevibacteium flavum, Mannhemia succiniproducens y Anaerobiospirilum succiniproducens, y Xanthomonas citri.

Ejemplos de segundos organismos donantes son cualquier cepa o especie que tenga un sistema nativo de difusión facilitada para un azúcar, por ejemplo cepas de Zymononas mobilis (además de la cepa CP4), Homo sapiens, Azospirillum amazonense, Flavobacteriaceae bacterium S85, Saccharomyces cerevisiae u otros géneros de levadura.

Opcionalmente, primero se construye una primera cepa parental para usar la difusión facilitada para importar un azúcar, y luego la cepa resultante se modifica para producir en exceso una sustancia química de interés comercial, como el ácido succínico.

Los aspectos novedosos de esta invención son que el gen glf de un consumidor robusto de azúcar no patógeno se ha integrado de manera estable en el cromosoma de una bacteria, de modo que la bacteria recién construida puede producir un producto comercialmente viable con un proceso económicamente viable. El título, el rendimiento y/o la productividad específica del producto a partir de glucosa u otro azúcar es mayor que los parámetros del organismo parental. El gen glf se integra en un sitio del cromosoma que no interfiere con ningún aspecto relevante del crecimiento o la producción de productos. El título de acetato es menor que el de la cepa parental en aproximadamente 45 a 48 horas en una fermentación representativa, lo que permite un tiempo de ciclo de fermentación de 2 días, a diferencia de un ejemplo de la técnica anterior. Las cepas en la técnica anterior que usaban difusión facilitada para la importación de azúcar no producían suficientes títulos del producto deseado para ser económicamente atractivos. Otro aspecto novedoso de esta invención es que mediante el uso de difusión facilitada para la importación de azúcar, se encontró inesperadamente que la producción del subproducto no deseado acetato o ácido acético se redujo significativamente. La cepa KJ122 de la técnica anterior produce alrededor de 5 a 7 g/l de acetato en una fermentación típica de glucosa alimentada (WO2012/018699), mientras que las nuevas cepas de la invención producen solo alrededor de 4,2 g/l o menos.

Las ventajas adicionales de esta invención se harán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1: Estructura del plásmido pAC19, una fuente de un casete de expresión para glf y glk de Z. mobilis.

Fig. 2: Estructura del plásmido pAC21, una fuente de un casete seleccionable y contraseleccionable que contiene los genes cat (resistencia al cloranfenicol) y sacB (leván sacarasa).

Fig. 3: Estructura del plásmido pSS2, una fuente de un casete de expresión para glf de Z. mobilis, sin glk.

Fig. 4: Estructura del plásmido pMH68, fuente de un casete de expresión para la integración de una segunda copia del gen crr de E. coli en el locus pfld.

Tabla 1. Producción de succinato por AC15 en fermentadores de 7 litros

Tabla 2. Producción de succinato por mutantes rojos de AC15 en fermentadores microaerobios de 500 ml.

Tabla 3. Producción de succinato por dos aislados de SS8 en fermentadores microaerobios de 500 ml.

Tabla 4. Producción de succinato por YSS41 en fermentadores microaerobios de 20 litros.

Tabla 5. Producción de succinato por MH141 en fermentadores microaerobios de 500 ml.

Tabla 6. Producción de succinato por las cepas KJ122 y YSS41 de E. coli en fermentadores de 20 litros bajo condiciones de aireación optimizadas para ambas cepas.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Definiciones

Cuando se usa la frase "por ejemplo" o "tal como", los elementos que se mencionan a continuación pretenden ser ejemplos ilustrativos de la idea o el concepto que se está describiendo. Los elementos mencionados a continuación no pretenden limitarse a los ejemplos dados, sino que se pretende incluir cualquier otro elemento o ejemplo específico que caiga dentro de la generalización de la idea o concepto. Para cualquier compuesto dado, podría ser más apropiado producir una sal de dicho compuesto, por ejemplo, el ácido succínico podría producirse a un pH cercano a 7 como una sal de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, etc., mientras que la lisina podría producirse como una sal de cloruro, sulfato, bicarbonato, etc. En este sentido, cada vez que se nombra un compuesto en este documento, se pretende incluir cualquier sal de dicho compuesto, y cada vez que se nombra una sal, se entiende que también está incluido el ácido libre o la base. Así, por ejemplo, "succinato" debe incluir "ácido succínico" y viceversa, y "acetato" debe incluir "ácido acético" y viceversa.

"Difusión facilitada" significa la acción de un sistema, que normalmente comprende una proteína de membrana integral situada en una membrana biológica (por ejemplo, la membrana interna de una bacteria Gram negativa o la membrana única de una bacteria Gram positiva), o de un complejo de más de una molécula de proteína situado en una membrana biológica, que funciona para permitir específicamente que una o más sustancias químicas denominadas "sustrato" (por ejemplo, glucosa y/o fructosa), pero no sustancias químicas en general (por ejemplo, agua y metabolitos citoplasmáticos distintos del sustrato específico), atraviesen la membrana sin ninguna energía (como la proporcionada por la hidrólisis de ATP o PEP) o gradiente de un producto químico diferente (por ejemplo, un gradiente de protones) proporcionado directamente al sistema por la célula. Si hay un gradiente de concentración, por ejemplo, si la concentración de un sustrato es mayor fuera de la célula que dentro de la célula, habrá un flujo neto de ese sustrato hacia la célula a un ritmo más rápido que el que ocurriría si el sistema de difusión facilitada fuera de la célula. estuviera ausente. La(s) proteína(s) que funcionan para la difusión facilitada típicamente tienen una afinidad de unión que es específica para uno o más sustratos y permite que el sistema ayude a pasar el sustrato a través de la membrana en concentraciones relativamente bajas de varios milimolares o menos. Algunos tipos de difusión facilitada pueden funcionar creando un poro o canal a través de la membrana que discrimina a favor de un sustrato, y en otros tipos, la(s) proteína(s) puede(n) unirse al sustrato en un lado de la membrana y luego rotar a través de la membrana para liberar el sustrato en el lado opuesto de la membrana. Una proteína de difusión facilitada (a veces denominada simplemente facilitador) es un componente proteico de dicho sistema. Por lo tanto, la fuerza impulsora termodinámica para la difusión facilitada es un gradiente de concentración de sustrato, en el que el sustrato (por ejemplo, un azúcar) fluye desde una concentración más alta fuera de una célula a una concentración más baja dentro de la célula. Usaremos los símbolos genéticos Glf y glf para representar respectivamente una proteína de difusión facilitada y un gen que codifica dicha proteína que tiene especificidad por la glucosa. Por lo general, consideramos que Glf está compuesta por una sola cadena polipeptídica, pero una Glf podría ser un complejo formado por más de una cadena polipeptídica. Aunque los ejemplos específicos de Glf descritos en este documento son de origen bacteriano, nuestra definición pretende incluir el sistema de difusión facilitada obtenido a partir de cualquier organismo. Por ejemplo, es bien sabido que la levadura Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras tienen una o más proteínas de difusión facilitada para importar hexosas (por ejemplo, glucosa y fructosa) denominadas HXT1, HXT2, HTX3, HTX4, HTX5, HTX6, HTX7, etc.), y los eritrocitos humanos utilizan difusión facilitada para importar y exportar glucosa a través de una proteína llamada GLUT1. El mecanismo de acción de las Glf puede variar ampliamente, incluido el transporte facilitado por poros y el transporte facilitado por portadores. Aunque los ejemplos específicos proporcionados en esta memoria descriptiva describen una Glf que tiene una buena especificidad por la glucosa, se sabe en la técnica que una proteína Glf puede ser activa sobre más de un azúcar, por ejemplo, Glf de Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiae puede ser activa tanto sobre la fructosa como sobre la glucosa.

El simporte de protones se define como un sistema para importar un sustrato a través de una membrana biológica que utiliza un gradiente de protones como fuerza impulsora. Una mayor concentración de protones fuera de la célula tiene una tendencia termodinámica a difundirse de vuelta al interior de la célula. Esta presión termodinámica se utiliza para transportar al interior un sustrato como el azúcar. Un simportador de protones es una proteína o un complejo de proteínas que funciona para proporcionar un simporte de protones. Un ejemplo de un simportador de protones es la proteína GalP de E. coli, que se sabe que funciona en el simporte de galactosa, glucosa y otros azúcares.

Una glucoquinasa y una fructoquinasa son enzimas que catalizan la fosforilación de glucosa, fructosa u otro azúcar, generalmente en la posición del 6° carbono, pero como alternativa posiblemente en el 1er carbono u otra posición. Se utilizan los símbolos genéticos Glk y glk para indicar respectivamente una glucoquinasa y un gen que codifica una glucoquinasa. Frk y frk indican una fructoquinasa y un gen que codifica una fructoquinasa, respectivamente.

Un gen c rres un gen que codifica un componente EIIAglc de un PTS, como el gen crr de una cepa de E. coli o de una cepa de Bacillus subtilis o un homólogo de tal gen crr.

Un PTS (sistema de fosfotransferasa) es un grupo de proteínas que actúan juntas para bombear un azúcar al citoplasma y simultáneamente fosforilar el azúcar, usando PEP como fuente de fosfato y energía. Ejemplos de genes que codifican proteínas del PTS de E. coli incluyen ptsH, ptsI, crr, ptsG, fruA, fruB, manX, manY, y manZ. Las proteínas correspondientes se denominan PtsH, PtsI, Crr, PtsG, FruA, FruB, ManX, ManY y ManZ. Sin embargo, hay muchos más ejemplos de E. co liy otros procariotas, y estas proteínas pueden tener nombres alternativos, por ejemplo, Crr a veces se denomina EMAglc. Algunas de las proteínas de PTS son más específicas para uno o más azúcares particulares que para otros azúcares, mientras que algunas proteínas del PTS, por ejemplo PtsH y PtsI de E. coli, se utilizan en común para muchos azúcares diferentes.

En esta memoria, el término "microaerobio" significa que la tasa de alimentación de aire es inferior a 0,1 volumen de aire por volumen de cultivo líquido por minuto. En los ejemplos de fermentadores de 7 y 20 litros descritos en este documento, esto se logra con un rociador y un medidor de flujo, o permitiendo que el tanque respire a través de una membrana estéril unida a la parte superior del tanque sin ningún flujo de aire forzado. En los ejemplos de tanques de fermentación de 500 ml descritos en el presente documento, no se introduce aire deliberadamente, pero se introduce una pequeña cantidad de aire procedente de fugas, alimentación de la solución base y toma de muestras.

Un "medio mínimo" es un medio de crecimiento microbiano compuesto por agua, una fuente de carbono pura (tal como un azúcar sustancialmente puro o una mezcla de azúcares sustancialmente puros), sales minerales (por ejemplo, potasio, sodio, magnesio, calcio, bicarbonato más carbonato, fosfato, sulfato y cloruro), una fuente de nitrógeno pura como amonio o urea, metales traza (hierro, cobre, zinc, manganeso, cobalto, molibdeno y opcionalmente borato), opcionalmente glicina betaína (también conocida simplemente como betaína) y opcionalmente un agente antiespumante. Los medios mínimos no contienen ninguna fuente de nutrientes compleja (también conocida como "rica") tal como extracto de levadura, licor de maceración de maíz, hidrolizado de soja, caldo, hidrolizado de caseína, granos, legumbres o cualquier otra mezcla "indefinida" de nutrientes que normalmente se obtendría a partir de una fuente agrícola sin ninguna etapa de purificación o separación física o química. Los azúcares razonablemente puros obtenidos a partir de caña de azúcar, almidón de maíz, almidón de sorgo, almidón de tapioca o cualquier otra fuente de almidón razonablemente puro se consideran aceptables para un medio mínimo. Un medio mínimo puede contener una o unas pocas sustancias químicas puras para satisfacer un requisito de crecimiento particular (auxotrofia o braditrofia) o para mejorar una ruta bioquímica. Por ejemplo, algunas cepas requieren una vitamina como la biotina, que se puede agregar en pequeñas concentraciones sin un impacto negativo significativo sobre un proceso. Otro ejemplo, la adición de una vitamina como la tiamina, aunque no es absolutamente necesaria para el crecimiento, puede no obstante mejorar el crecimiento o una ruta bioquímica. Los medios mínimos son preferibles para la producción fermentativa de muchos productos químicos debido al costo relativamente bajo de los componentes y debido a que producen caldos de fermentación más limpios que permiten una economía más favorable para la purificación posterior del producto químico deseado. La producción de etanol es una excepción, ya que la purificación aguas abajo se puede lograr con destilación, un método económicamente atractivo para la purificación del producto deseado, incluso a partir de medios complejos.

Un homólogo de un primer gen o proteína se define como un segundo gen o proteína en donde la segunda proteína o la proteína que se supone que se traducirá a partir del segundo gen tiene la misma o similar función bioquímica que la primera proteína o proteína que se supone que se traducirá a partir del primer gen, y en el que un alineamiento de la primera y la segunda proteínas o la primera y la segunda proteínas que se supone se traducirán da como resultado un 25% o más de identidad o similitud para una región de al menos 50 aminoácidos de longitud, cuando se utilizan los parámetros predeterminados de un programa informático de alineamiento disponible para el público tal como BLAST.

Una mutación es cualquier cambio en una secuencia de ADN con respecto a la secuencia de ADN del gen nativo o de tipo salvaje relacionado. Una mutación puede ser un cambio de base único o múltiple que introduce un codón de parada prematuro o un aminoácido que es diferente del aminoácido de tipo salvaje en esa posición. Una mutación puede ser una inserción o supresión de una o más bases que crea un desplazamiento del marco que da como resultado una proteína que es significativamente diferente de la proteína de tipo salvaje. Una mutación puede ser una deleción que elimina gran parte, la mayoría o la totalidad de una región de codificación (también conocida como marco de lectura abierto u orf). Un tipo de mutación elimina uno o más orfs enteros más ADN no codificante adicional ya sea secuencia arriba o secuencia abajo de la región codificante, o ambas. Una mutación puede ser resultado de la inserción de una secuencia de ADN relativamente grande (más de aproximadamente 100 bases), por ejemplo, un elemento de inserción (por ejemplo IS186o IS4) o un transposón (por ejemplo, Tn10). Cuando la intención es eliminar una función, una mutación preferible es una eliminación de todo o la mayor parte de un orf, sin embargo, las mutaciones más pequeñas, como los cambios o las inserciones de una sola base, a menudo pueden lograr la eliminación de una función para todos los propósitos prácticos. Las mutaciones pueden ser espontáneas, inducidas por mutagénesis o construidas por ingeniería genética. Algunas mutaciones, cuando se desea lograr una mejora de la cepa, son mutaciones que disminuyen o eliminan una función biológica, tal como elementos particulares de un PTS. Sin embargo, algunas mutaciones, cuando se desea lograr una mejora de la cepa, son mutaciones que aumentan una función biológica, por ejemplo, una "mutación ascendente del promotor" puede aumentar la expresión de un gen deseado, tal como un gen glf.

"Exógeno" significa un gen o proteína obtenido a partir de un segundo género que se ha instalado en un primer género, donde dicho segundo género es un género diferente de dicho primer género.

Un gen se define como una región de un cromosoma que codifica una proteína o enzima, y pretende incluir tanto el marco de lectura abierto que corresponde a la proteína o enzima como cualquier secuencia de ADN que rodea el marco de lectura abierto y contribuye a controlar el nivel o tasa de producción de la proteína o enzima, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, operadores, sitios de unión a proteínas reguladoras, ADN correspondiente a secuencias líder de ARNm no traducidas en 5', terminadores y sitios antiterminadores. Cuando dos o más marcos de lectura abiertos que corresponden a secuencias de ADN que codifican proteínas están bajo el control de un solo promotor y un solo terminador, la región completa que abarca el promotor, los marcos de lectura abiertos correspondientes a secuencias de ADN que codifican proteínas y el terminador reciben el nombre de operón Por ejemplo, cuando los genes exógenos glf y glk están bajo el control de un solo promotor y un solo terminador, reciben el nombre de operón glf-glk.

La presente invención proporciona biocatalizadores para la producción de ácido succínico con alto título, rendimiento y productividad utilizando un medio mínimo con un azúcar como fuente de carbono. El término "rendimiento" como se define en esta invención se refiere al número de gramos de producto (como ácido succínico) producidos por gramo de azúcar (como glucosa o sacarosa) consumido. El término "productividad" tal como se define en la presente invención se refiere al número de gramos de producto (como ácido succínico) producidos por litro de cultivo por hora. El término "título" se define como la concentración de producto (tal como ácido succínico) en el caldo de fermentación en gramos por litro. El rendimiento deseable de ácido succínico está en el intervalo de 0,8 - 1,2 gramos de ácido succínico producido por gramo de azúcar consumido. La productividad deseable para el ácido succínico en la presente invención está en el intervalo de 1 gramo o más de ácido succínico producido por litro por hora. El título deseable de ácido succínico es superior a 26 g/l, o más preferiblemente superior a 64 g/l, y lo más preferiblemente superior a 83 g/l en un tiempo de fermentación de 48 horas o menos.

La tasa de crecimiento bacteriano se mide en términos de la tasa de aumento de la densidad óptica a 550 o 600 nanómetros de un cultivo líquido que es resultado de la multiplicación bacteriana. La tasa de crecimiento bacteriano también se expresa en términos de tiempo requerido para duplicar las células bacterianas. En las células bacterianas adecuadas para la presente invención, se espera que las células bacterianas tengan un tiempo de duplicación de entre 20 minutos y 3 horas.

El biocatalizador utilizado de acuerdo con la presente invención para la producción de ácido succínico se puede desarrollar de dos formas diferentes. Bajo el primer enfoque, una especie bacteriana de tipo salvaje se manipula genéticamente y, opcionalmente, se desarrolla, para crecer eficientemente usando difusión facilitada para la importación de glucosa u otro azúcar. Una vez que se construye dicha cepa, se llevan a cabo manipulaciones genéticas posteriores en las vías metabólicas para obtener una cepa bacteriana que produzca ácido succínico u otra sustancia química deseada con alto título, rendimiento y productividad, por ejemplo, siguiendo métodos conocidos en la técnica.

Según el segundo enfoque, se utiliza como cepa parental una cepa bacteriana ya desarrollada que tiene un rendimiento y una productividad comercialmente atractivos para una sustancia química como el ácido succínico, como se describe en las publicaciones de las solicitudes de patente US 20100184171 y WO 2010/115067. Luego se llevan a cabo manipulaciones genéticas adicionales y, opcionalmente, evolución, con esta cepa para obtener una cepa bacteriana que tenga la capacidad de utilizar la difusión facilitada para importar glucosa u otro azúcar para producir ácido succínico en un título, rendimiento y productividad comercialmente atractivos.

Como ejemplo específico, esta presente invención describe biocatalizadores y métodos que tienen una capacidad mejorada con respecto a la técnica anterior para producir ácido succínico con un título, rendimiento y productividad lo suficientemente altos mientras adquieren la nueva capacidad de importar un azúcar por difusión facilitada. Por ejemplo, la cepa KJ122 de E. co lidescrita por Jantama et al. puede seleccionarse como la cepa de partida para la presente invención. Se da a conocer que la cepa KJ122 de E. coli tiene la capacidad de producir ácido succínico en un medio mínimo con un alto título y productividad.

La cepa KJ122 de E. coli se obtuvo a partir de la cepa C de E. coli a través de deleciones de genes y evolución metabólica como se describe en la solicitud de patente de EEUU núm. de publicación 20100184171 y en la solicitud de patente internacional núm. de publicación WO 2010/115067. Estos dos documentos de publicación de solicitudes de patente brindan detalles sobre los cambios genéticos que llevaron al desarrollo de la cepa KJ122 de E. coli. KJ122 no tiene ninguna capacidad sustancial para importar glucosa como fuente de carbono mediante difusión facilitada en la producción de ácido succínico. La ausencia de esta función en KJ122 es atribuible a la falta de un gen que codifique una proteína Glf. Los inventores han dilucidado enfoques genéticos que permiten a KJ122 usar la glucosa de manera más eficiente como fuente de carbohidratos mientras retiene o mejora su capacidad original para producir ácido succínico con alto título, rendimiento y productividad en un medio mínimo.

El término "carbohidrato", como se usa en esta invención, incluye monosacáridos como glucosa, fructosa, xilosa y arabinosa, disacáridos como sacarosa, melibiosa, maltosa y lactosa, trisacáridos como rafinosa y maltotriosa, y oligosacáridos superiores e hidrolizados derivados de la digestión enzimática o química de polisacáridos como el almidón, la celulosa y la biomasa. Los carbohidratos simples, aquellos que tienen de una a tres unidades de sacárido, se denominan aquí "azúcares", por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, etc.

Los términos "organismo PTS+" o "bacteria PTS+" se refiere a una bacteria que tiene la capacidad de transportar carbohidratos basada en un PTS. El término "organismo no PTS", o "bacteria no PTS" o " bacteria PTS-" se refiere a células bacterianas que están mutadas en uno o más genes que codifican una función de PTS, de modo que la actividad de PTS disminuye en relación con la del lPTS de tipo salvaje.

En un aspecto, la presente invención describe la adición de genes a un organismo para instalar o aumentar la actividad de una o más proteínas y/o enzimas involucradas en la importación y conversión de un azúcar en intermediarios metabólicos tales como glucosa 6-fosfato, glucosa 1 -fosfato, fructosa 6-fosfato o fructosa 1 -fosfato que la célula puede metabolizar más. Los genes que codifican proteínas o enzimas relevantes se eligen de un grupo que consiste en un gen glf, un gen glf y un gen glk, y un gen g lf y un gen frk.

En una segunda realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir ácido succínico utilizando los biocatalizadores descritos anteriormente que son la E. coli modificada genéticamente de la primera realización, y usando difusión facilitada para importar un azúcar tal como glucosa como materia prima renovable. La presente invención proporciona un procedimiento para producir ácido succínico a partir de un medio que contiene azúcar que utiliza un biocatalizador que tiene una actividad reducida en al menos una proteína del sistema PTS nativo del organismo en relación con la cepa ancestral o parental. El biocatalizador puede tener una actividad reducida en al menos una proteína del sistema de importación de azúcar nativo del organismo en relación con la cepa ancestral o parental lo que implica el uso de un sistema de simporte de proteínas, tal como GalP.

La presente descripción proporciona formas de manipular un PTS y, a su vez, el sistema bacteriano de absorción de carbohidratos. Dado que las proteínas EI y HPr funcionan como componentes "generales" o "comunes" del sistema PTS, la inactivación de cualquiera de los genes ptsI que codifica la proteína EI o ptsH que codifica la proteína HPr conduciría a la inactivación completa de un PTS. Habrá sustancialmente menos transporte de carbohidratos a través del sistema PTS en células bacterianas donde la actividad de ptsH o ptsI o ambos ha sido disminuida o eliminada. Cuando el PTS se inactiva parcial o completamente, la célula bacteriana tiene que depender de uno o más sistemas alternativos de permeasa para el transporte de carbohidratos.

Cuando hay transporte activo de glucosa a través de PTS, la proteína EIIAGlc permanece sin fosforilar ya que hay un sustrato carbohidrato para aceptar su grupo fosfato. Sin embargo, cuando no hay glucosa en el medio, la forma fosforilada de EIIAGcl no puede transferir su grupo fosfato a la glucosa y, por lo tanto, permanece en su estado fosforilado. La EIIAGlc no fosforilada media el fenómeno generalmente conocido como represión por catabolitos de carbono (CCR). Bajo CCR, cuando la glucosa está presente en el medio de cultivo, se impide el transporte y/o la utilización de otros carbohidratos en el medio hasta que la glucosa en el medio se reduce a una concentración baja. La represión de catabolitos de carbono es resultado del efecto inhibidor de EIIAGlc no fosforilado sobre sistemas de permeasa u otros sistemas de utilización de fuentes de carbono. Se sabe que varias permeasas involucradas en el transporte de carbohidratos son inhibidas por EIIAGlc no fosforilado, por ejemplo, LacY o lactosa permeasa. Además, se sabe que la EIIAGlc no fosforilada tiene un efecto negativo en la transcripción de una serie de genes implicados en el transporte y el metabolismo de los hidratos de carbono a través de su influencia en el sistema de adenilato ciclasa.

La cepa KJ122, buena productora de succinato, contiene una mutación de desplazamiento de marco en el gen ptsI, y esta mutación es importante para una buena producción de succinato. Por lo tanto, fue sorprendente en el contexto de la presente invención que se pudieran realizar mejoras adicionales en la producción de succinato suprimiendo los genes ptsHI y galP, instalando un sistema de difusión facilitada y luego integrando el gen crr.

La presente invención proporciona una duplicación no natural del gen crr que codifica la proteína EIIAGlc. Los inventores descubrieron que las cepas que contienen una deleción en ptsHI, una mutación en galP, y una instalación de un gen glf funcional, tienen una tendencia inesperada a adquirir una mutación en el gen crr que provoca una disminución o eliminación de la función de la proteína EIIAglc, que a su vez provoca una disminución indeseable inesperada en los parámetros de producción de succinato. La duplicación del gen crr mediante la integración de una segunda copia de crr en un lugar separado del locus nativo de crr resuelve este problema al reducir en gran medida la frecuencia de mutantes que se vuelven fenotípicamente crr negativo.

La presente invención se explicará en detalle a continuación. Un ejemplo de bacteria perteneciente al género Escherichia de la presente invención es una cepa que se construye a partir de una cepa parental que inicialmente no es capaz de utilizar la difusión facilitada para la importación de azúcar, pero que después de la ingeniería genética como se describe en este documento alberga un gen glf, y opcionalmente un gen g lk exógeno, y tiene la capacidad de utilizar la difusión facilitada para la importación de glucosa y fructosa.

Los genes exógenos introducidos en la célula pueden mantenerse dentro de la célula en un plásmido autorreplicante. Un plásmido se puede mantener a través de la selección de antibióticos o la complementación de una mutación cromosómica. Sin embargo, cuando los genes exógenos se mantienen dentro del biocatalizador en un plásmido autorreplicante dentro de la célula, es necesario asegurar que no haya desperdicio innecesario de energía y materiales que conduzcan a la inhibición del crecimiento y una disminución en el rendimiento o productividad del material orgánico que se está fabricando utilizando el biocatalizador. Preferentemente, los genes exógenos se integran en el cromosoma huésped de modo que no hay necesidad de añadir ningún antibiótico para mantener los plásmidos dentro de la célula, y se coloca poca o ninguna carga metabólica en la célula para el mantenimiento del plásmido. Hay muchas ubicaciones posibles dentro de la célula para la integración de los genes exógenos. Las ubicaciones preferenciales para integrar los genes exógenos dentro del ADN cromosómico de E. coli incluyen regiones que no codifican una función esencial para el crecimiento y la formación de productos en condiciones de fermentación comerciales.

Cuando los genes exógenos se obtienen como un operón, es preferible eliminar del operón cualquier posible gen o proteína de regulación negativa. Es ideal tener solo los genes y proteínas que funcionan positivamente en la difusión facilitada y el metabolismo. Por lo tanto, la expresión de un gen de difusión facilitada preferiblemente no es inhibida por un represor o por represión de catabolitos de carbono.

Los siguientes ejemplos se proporcionan como una forma de ilustrar la presente invención y no como una limitación.

Cualquier bacteria E. coli que no utiliza de forma nativa un sistema de difusión facilitada para la importación de azúcar puede mejorarse según la presente invención.

Una bacteria de la presente invención se puede obtener mediante la introducción de uno o más genes que permiten la utilización de la difusión facilitada en una cepa de E. coli que produce ácido succínico, tal como KJ122 u otra cepa de E. coli previamente diseñada para producir ácido succínico. Alternativamente, se puede obtener una bacteria de la presente invención confiriendo la capacidad de producir ácido succínico u otra sustancia química deseada a una bacteria E. coli en la que la utilización de la difusión facilitada ya ha sido permitida por ingeniería genética y, opcionalmente, por evolución. Esta última alternativa se puede lograr, por ejemplo, siguiendo todas las etapas utilizadas para construir KJ122 pero comenzando con la cepa ATCC 9637 o una cepa E. coli tipo K-12, o cualquier otra cepa E. coli segura, en lugar de comenzar con la cepa ATCC 8739.

Ejemplo 1

Construcción de AC15, un derivado de KJ122 que contiene los genes glf y glk del grupo de genes de Zymomonas mobilis CP4

Todas las manipulaciones de ADN y plásmidos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la transformación y la integración cromosómica se lograron mediante métodos estándar bien conocidos en la técnica. Es bien sabido que las secuencias de ADN se pueden clonar y unir para formar nuevas combinaciones que no se pueden encontrar fácilmente en la naturaleza. Además de los métodos más tradicionales que involucran enzimas de restricción y ADN ligasa, se pueden usar métodos más nuevos que usan recombinación en levadura, el llamado "Método Gibson" de corte y empalme de ADN in vitro, o cualquier otro método apropiado para construir tales secuencias de ADN novedosas. Los fragmentos de ADN necesarios se pueden obtener a partir de bibliotecas de clones o mediante PCR a partir de ADN molde adecuado. También se entiende que pueden diseñarse y sintetizarse muchas secuencias de ADN deseadas a partir de precursores químicos. Este servicio es proporcionado por una serie de empresas comerciales, por ejemplo, DNA 2.0 y GeneArt (Invitrogen).

El plásmido pAC19 se construyó para contener un operón artificial que contenía los genes glf y glk de Z. mobilis, impulsado por el promotor P²⁶ del fago SP01 que infecta a la bacteria Bacillus subtilis . Este operón estaba incrustado entre una secuencia curso arriba homóloga al gen tdcc de E. coli C y una secuencia curso abajo homóloga al gen tdcE de E. coli C, para fomentar la integración en el locus tdcCDEde las cepas que se van a diseñar. El casete descrito anteriormente se transporta en un vector de plásmido de bajo número de copias obtenido a partir de pCL1921, que contiene el origen de replicación de pSC101 y un gen de resistencia a la espectinomicina. Los componentes del casete se obtuvieron mediante PCR utilizando cebadores de ADN sintético apropiados obtenidos de proveedores comerciales como Sigma e Integrated DNA Technologies (IDT). La fuente de los genes de Zymononas era pLOI1740, que originalmente contenía un gen zwf y edd además de los genes deseados glf y glk. La agrupación de genes glf, zwf, edd, glk se transfirió a pCL1921, y luego los genes zwf y edd innecesarios fueron eliminados por PCR de adentro hacia afuera. Las secuencias de tdc curso arriba y curso abajo se obtuvieron por PCR a partir de ADN cromosómico de KJ122 como molde. El promotor P²⁶ se obtuvo a partir del bacteriófago SP01. La secuencia de pAC19 se proporciona como SEQ ID #1.

Todas las construcciones se realizaron mientras se cultivaban las cepas en medio LB (10 gramos de Bacto-triptona, 5 gramos de extracto de Bacto-levadura y 5 gramos de cloruro de sodio) complementado según fuera apropiado con antibiótico o sacarosa. Para construir la cepa AC15, el casete que contenía el operón artificial de pAC19 se integró en el cromosoma de la cepa WG53, usando un método de reemplazo de genes en dos etapas descrito anteriormente. El casete cat, sacB para la primera etapa estaba contenido en el plásmido pAC21, SEQ ID #2. pAC21 es similar a pAC19, excepto que el operón artificial se reemplaza con un casete cat, sacB que contiene un gen de resistencia al cloranfenicol y un gen sacB contraseleccionable que codifica leván sacarasa. El ADN transformante se obtuvo mediante PCR de pAC21 para la primera etapa y mediante PCR de pAC19 para la segunda etapa.

La cepa WG53 se obtuvo eliminando los genes ptsH, ptsl, y galP de la cepa KJ122 productora de succinato, usando un método de sustitución de genes en dos etapas similar al descrito en el párrafo anterior. La secuencia de ADN que abarca la deleción de ptsHI se da como SEQ ID #3. Téngase en cuenta que esta deleción deja el gen crr intacto, así como los promotores nativos que existen naturalmente secuencia arriba del gen ptsH. La secuencia de ADN que abarca la deleción de galP se da como SEQ ID #4.

Mientras que la cepa intermedia WG53 creció extremadamente mal en medio mínimo de glucosa, las cepas KJ122 y AC15 crecieron bien en medio mínimo de glucosa, lo que demuestra que 1) los genes ptsH Iy galP habían sido suprimidos con éxito en WG53, y 2) el casete glf, glk era funcional en AC15, lo que permitía importar glucosa.

Ejemplo 2

La cepa AC15 produce succinato tan bien como la cepa KJ122 parental

Las cepas KJ122 y AC15 se cultivaron en condiciones microaerobias en fermentadores de 7 litros (New Brunswick Scientific) a 39°C usando un medio mínimo con sistema de alimentación de glucosa por lotes. El volumen inicial de 3 litros contenía fosfato monobásico de potasio (18 mM), sulfato de magnesio (2 mM), betaína (1,33 mM), oligoelementos, Antifoam 204 (8 ppm) y 25 g/l de glucosa. El pH se ajustó inicialmente a pH 7,0 y después se mantuvo a pH 6,5 a medida que se producía ácido mediante la adición de la solución de hidróxido de amonio/bicarbonato de amonio descrita a continuación. Los inóculos de 150 ml se cultivaron aerobiamente y contenían un medio mínimo similar al medio descrito anteriormente, excepto que la glucosa estaba a 20 g/l y se añadió cloruro de calcio hasta una concentración final de 0,1 mM. La agitación se fijó a 750 RPM (revoluciones por minuto). Cuando la glucosa disminuyó a 5 g/l, se inició una alimentación de glucosa de 650 g/l y se mantuvo a un ritmo destinado a mantener la concentración de glucosa en aproximadamente 5 g/l o menos. La solución madre utilizada para la neutralización contenía tanto hidróxido de amonio como bicarbonato de amonio (NH⁴OH 7N y NH⁴ HCO³3M). AC15 se aireó a 35 ml/min, mientras que KJ122 no recibió más aire que el que estaba presente en el espacio de cabeza, que se equilibró con la atmósfera a través de un filtro de membrana estéril respirable. Estas eran condiciones que habían demostrado funcionar bien para cada cepa. Los azúcares, el succinato y los subproductos de las muestras de 48 horas se analizaron mediante HPLC. Los resultados de los duplicados promediados se muestran en la Tabla 1. AC15 produjo aproximadamente el mismo título que el KJ122 parental, pero el subproducto de acetato fue significativamente menor y el rendimiento en glucosa fue mayor para AC15.

Ejemplo 3

"Mutantes rojos" espontáneos obtenidos a partir de AC15

KJ122 es capaz de fermentar lactosa, como lo demuestra la formación de colonias rojas en placas de lactosa MacConkey (Beckton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Sin embargo, AC15 no fermenta la lactosa, como lo demuestra la producción de colonias "blancas" (color beige) en placas de lactosa MacConkey. Este fenotipo de colonia blanca de AC15 es resultado de la unión e inhibición de la lactosa permeasa (LacY) por la proteína EIIAGlc no fosforilada. Este fenotipo de colonia blanca está presente en todas las cepas con deleción de ptsHI, ya que las enzimas requeridas para fosforilar EIIAGlc están ausentes, y como resultado, toda la EIIAGlc presente en las células permanece sin fosforilar. Así, irónicamente, los mutantes ptsHI de E. coli son fenotípicamente Lac-, aunque la lactosa no es importada por el sistema STP en E. coli.

Los inventores notaron por casualidad que cuando las placas de lactosa MacConkey se sembraban con AC15 y se dejaban incubar durante la noche a 37°C, y luego durante un día más a temperatura ambiente (alrededor de 22°C), una gran cantidad de colonias rojas emergían del manto de colonias blancas que había crecido sobre la parte más densa de la raya de siembra. Al volver a sembrar varias de las colonias rojas, se observó que habían evolucionado dos clases de colonias rojas. Se llamará a la primera clase "rojo uniforme", ya que las colonias individuales eran uniformemente rojas en toda la colonia. Una segunda clase se denominará "rojo en yema de huevo frito", ya que las colonias individuales eran rojas en el centro, pero la parte exterior de las colonias era blanca o beige. Las cepas que dan lugar a todos los tipos de colonias rojas en lactosa MacConkey se llamarán colectivamente "mutantes rojos".

Una colonia blanca de AC15 y cuatro mutantes rojos, denominados AC15-R1, -R2, -R3 y -R4 (dos de los cuales son de color rojo uniforme y dos de los cuales son de color rojo en yema de huevo frito), se analizaron para determinar la producción de succinato en fermentadores microaerobios (Fleakers, Corning Glass, Corning, NY) de 500 ml utilizando un medio y un método similar a los descritos anteriormente para los fermentadores de 7 litros, con las diferencias de que el volumen inicial del medio mínimo fue de 200 ml, toda la glucosa se dosificó en el medio de partida a 100 g/l, no se alimentó glucosa, la agitación se realizó con una barra agitadora magnética a 350 RPM, y no se introdujo ni extrajo aire deliberadamente. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Los dos mutantes con patrón de huevo frito se comportaron de manera similar al AC15 original, mientras que los dos mutantes rojos uniformes se comportaron significativamente peor que el AC15 original.

La secuenciación del genoma del AC15 original y los cuatro mutantes rojos, utilizando el sistema Illumina HiSeq2000, reveló que ambos mutantes rojos uniformes habían adquirido una mutación cada uno, y ambas mutaciones estaban en el gen crr, que codifica EIlAGlc. Se consideró que ambas eran mutaciones nulas. Ambos mutantes de tipo rojo en yema de huevo frito habían adquirido una mutación cada uno, y ambas mutaciones estaban en el operón de lactosa. Se consideró que ambas eran mutaciones que conducirían a un mayor nivel de expresión del operón de lactosa (una era una mutación en el operador lacO, y el otro era un desplazamiento del marco en lacI, el gen que codifica el represor Lac. Las cuatro mutaciones tenían sentido porque podían explicar el fenotipo observado de mayor capacidad para fermentar lactosa. Las mutaciones nulas en crr aliviaron la inhibición de la permeasa LacY, como era de esperar, si bien era de esperar que las mutaciones en el operón de lactosa sobreprodujeran LacY, permitiendo al menos cierto escape de la inhibición. Sin embargo, las mutaciones nulas en el crr claramente tenían un efecto pleiotrópico adicional, causando una disminución en la capacidad de las células para producir succinato en nuestras condiciones de fermentación. Este fue un efecto inesperado que no se predijo.

Ejemplo 4

El gen g lk de Zymomonas mobilis no es esencial para el funcionamiento del gen glf en E. coli

Se construyó el plásmido pSS2 utilizando métodos similares a los descritos anteriormente para pAC19. Las únicas diferencias entre pSS2 y pAC19 es que el gen glk de Z. mobilis fue eliminado del operón artificial. En otros aspectos, tales como la cadena principal del vector, el promotor que impulsa la expresión de glf, la incrustación del operón artificial en las secuencias flanqueantes de tdc, y la orientación de los diversos componentes, pSS2 es similar a pAC19. La secuencia de ADN de pSS2 se proporciona como SEQ ID #5.

El operón artificial de pSS2 se integró en el locus tdc de KJ122 como se describe anteriormente para el operón de pAC19, usando el método de reemplazo de genes en dos etapas. Dos aislados, que presumiblemente son idénticos entre sí, se denominaron SS8-9 y SS8-11. Estas dos nuevas cepas se compararon con AC15 en fermentadores microaerobios de 500 ml como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Los resultados, que son promedios de fermentadores duplicados analizados a las 48 horas, se muestran en la Tabla 3. SS8-9 y SS8-11 dieron crecimiento y títulos de succinato similares a los de AC15, mientras que la producción de acetato de ambos aislados SS8 fue algo menor que la de AC15. Así, el gen glk de Z. mobilis es innecesario para el funcionamiento del gen glf en este contexto, y el gen glk de Z. mobilis podría incluso ser ligeramente dañino para los parámetros de fermentación. Presumiblemente, los aislados SS8 están utilizando el gen endógeno glk de E. coli gen para fosforilar la glucosa.

Ejemplo 5

Evolución metabólica de la cepa AC15

Como se indicó anteriormente en el Ejemplo 3, la cepa AC15 prefirió recibir un mayor nivel de aireación que la KJ122 original en fermentadores de 7 litros. Para obtener un derivado de AC15 que pudiera prosperar con menos aire, AC15 se sometió a evolución metabólica en fermentadores de 500 ml con un volumen inicial de 200 ml y sin suministro deliberado de aireación. Las condiciones fueron microaerobias, ya que no se tomaron medidas para eliminar el oxígeno. Se supuso que una pequeña cantidad de aire se filtraba en los recipientes de fermentación durante el curso de la evolución. Las condiciones de crecimiento fueron las descritas en el Ejemplo 3. Después de 48 horas de crecimiento, el cultivo se diluyó 1:100 en un nuevo fermentador que contenía 200 ml de medio de nueva aportación y esta etapa se repitió 40 veces más. Cada una de estas inoculaciones en medio de nueva aportación se denominará "transferencia". Así, la cepa se sometió a un total de 41 transferencias a medio de nueva aportación. Cada transferencia corresponde a unas 7 generaciones de división celular. Se sembró una muestra del cultivo líquido de la última transferencia en una placa petri de agar lactosa MacConkey y se seleccionó una sola colonia blanca y se denominó YSS41.

Al variar la tasa de aireación en fermentadores de 7 litros, se determinó que YSS41 funcionaba bien para la producción de succinato con 5 ml/min de aire, que era sustancialmente menos que los 35 ml/min necesarios para un rendimiento óptimo del AC15 original. Con un flujo de aire de 5 ml/min, YSS41 produjo 94 g/l de succinato y 1,3 g/l de acetato, para un rendimiento de succinato de 0,95 g/g de glucosa en 48 horas en un fermentador de 7 litros.

YSS41 se comparó con KJ122 para la producción de succinato en un fermentador de 20 litros. El protocolo de fermentación fue similar al descrito anteriormente para fermentadores de 7 litros, excepto que el volumen inicial fue de 9 litros y la tasa de aireación fue de 25 ml/min para ambas cepas, condiciones que se determinó que eran productivas para ambas cepas. Los resultados para las muestras de 48 horas se muestran en la Tabla 4. El título de succinato para YSS41 fue de 100 g/l (significativamente más alto que para KJ122), el de acetato de 2,2 g/l (significativamente más bajo que para KJ122) y el rendimiento de succinato fue 0,95 g/g de glucosa (un poco más bajo que para KJ122). Por lo tanto, la cepa evolucionada YSS41 pudo funcionar bien en un fermentador de 20 litros con un requisito de aireación que no fue mayor que el de la cepa ancestral KJ122.

Ejemplo 6

Estabilización de YSS41 contra mutaciones en el gen crr

Cuando se sembró YSS41 en placas de lactosa MacConkey, seguía dando lugar a mutantes rojos, tanto del tipo rojo uniforme como del tipo yema roja de huevo frito. Se secuenció el gen crr para un aislado de cada tipo. La cepa MYR222, un tipo huevo frito, tenía una secuencia de genes crr de tipo salvaje. MYR223, un tipo rojo uniforme, tenía un elemento de inserción insertado en el marco de lectura abierto de crr. La secuencia de ADN del elemento de inserción coincidía con la de IS186. Por lo tanto, el patrón establecido para los mutantes rojos AC15 parecía aplicarse también a los mutantes rojos YSS41. En fermentadores microaerobios de 500 ml, cultivados como en el Ejemplo 4, MYR222 se comportó de manera similar a YSS41, mientras que MYR223 se comportó peor (ver Tabla 5). Por lo tanto, la pérdida potencial de rendimiento debido a la acumulación de mutantes rojos sólidos en una población siguió siendo una posibilidad con la cepa YSS41.

Para solucionar esta pérdida potencial, se integró una segunda copia del gen crr en un sitio distante del locus crr nativo. El gen crr, junto con sus promotores flanqueantes y el terminador, se amplificaron mediante PCR usando ADN cromosómico YSS41 como molde y los cebadores BY249 (SEQ ID #6) y BY250 (SEQ ID #7). El fragmento romo resultante se ligó luego en un plásmido de bajo número de copias obtenido a partir de pCL1921 que contenía un clon de una porción de la región pflDC de E. coli C en el único sitio de restricción BsfZ17I en el marco de lectura abierto de pflD. Los genes pflDC son homólogos a los genes pflBA que codifican piruvato-formiato liasa y la enzima activadora de piruvato-formiato liasa. Los genes pflDC no son esenciales para E. coli, y la deleción de cualquiera de pflD o pflC no tiene un efecto significativo sobre el crecimiento, por lo que se razonó que la inserción de un casete en ese locus no tendría ninguna consecuencia negativa para el crecimiento o la producción de succinato. El plásmido de pocas copias resultante, pMH68, contiene el gen crr de YSS41 incrustado en secuencias flanqueantes de pflDC, en un plásmido de pocas copias. La secuencia de ADN de pMH68 se proporciona como SEQ ID #8.

El casete de integración de pMH68 se amplificó mediante PCR usando los cebadores BY124 (SEQ ID #9) y BY125 (SEQ ID #10), que eran los mismos cebadores usados para clonar los genes pflDC para empezar. El casete de integración se integró luego en el cromosoma de YSS41, usando el método de reemplazo de genes en dos etapas. La cepa resultante se denominó MH141, que ahora es un merodiploide para crr, lo que significa que contiene dos copias de un gen crr de tipo salvaje en dos lugares distantes en el cromosoma, uno en su locus nativo y el segundo insertado en el marco de lectura abierto de pflD.

Como se esperaba, la cepa MH141 produjo colonias blancas en placas de lactosa MacConkey. Si se hace una siembra gruesa, y las placas se dejan incubar durante la noche a 37°C, y luego durante un día más a temperatura ambiente, emergen colonias rojas del lecho de colonias blancas que han crecido sobre la parte más densa de la siembra. Sin embargo, el número de mutantes rojos que surgieron de MH141 fue significativamente menor que el de una siembra similar de YSS41 realizada en la misma placa. Se seleccionaron 23 mutantes rojos de YSS41 y 12 mutantes rojos de MH141, y todos se volvieron a sembrar en placas de lactosa MacConkey. Cuando se puntuaron para el tipo de mutante rojo, 12 de los 23 mutantes rojos YSS41 eran del tipo rojo uniforme, mientras que los otros 11 de los 23 eran de tipo huevo frito. Por el contrario, los 12 mutantes rojos MH141 eran del tipo huevo frito. Así, al duplicar el gen crr en el cromosoma, la tasa de formación de los mutantes rojos uniformes se ha reducido en al menos un factor de diez. Un mutante de tipo huevo frito con yema roja aislado de MH141 se denominó MH141-R1 y se ensayó en fermentadores microaerobios de 500 ml como se describe anteriormente (ver Tabla 5). Tanto MH141 como MH141-R1 se comportaron de manera similar al YSS41 original con respecto al crecimiento, el título de succinato y el título de acetato. Por lo tanto, se ha construido una cepa más estable, MH141, que utiliza la difusión facilitada para la importación de glucosa y que produce un título más alto de succinato y un título más bajo del subproducto acetato en comparación con la cepa ancestral KJ122, que usa el sistema GalP para la importación de glucosa.

Ejemplo 7

Mutaciones adquiridas por YSS41 en el casete glf, glk durante la evolución metabólica

Se determinaron las secuencias de ADN de los casetes de expresión glf, glk en AC15 y YSS41. Las regiones fueron amplificadas por PCR y los fragmentos resultantes fueron secuenciados sobre los genes glf y glk y más de 200 pares de bases curso arriba y curso abajo, por el método de terminación de cadena didesoxi. La región secuenciada corresponde a las bases 4976 a 7920 de pAC19, proporcionadas en SEQ ID #1. Se encontraron dos mutaciones que se adquirieron durante la evolución de YSS41. La primera mutación fue un cambio de G a A en el número de base 7742 de SEQ ID #1. Esta base está en la región 5' no traducida del producto de transcripción de ARNm glf, glk, justo arriba del marco de lectura abierto de glf, y da como resultado un cambio de C a U en la base -22 en relación con el codón de inicio ATG, o 15 en relación con el inicio de la transcripción, en el ARNm (ARN mensajero) de glf. Se espera que esta mutación aumente o disminuya la tasa de traducción del marco de lectura abierto de glf. La segunda mutación fue un cambio de G a A en el número de base 6173 de SEQ ID #1. Esta base está en la región 5' no traducida justo arriba del marco de lectura abierto de glk, y da como resultado un cambio de C a U en la base -15 en relación con el codón de inicio ATG en el ARNm de glk. Se espera que esta mutación aumente o disminuya la tasa de traducción del marco de lectura abierto de glk. Por lo tanto, la evolución de YSS41 dio como resultado un equilibrio de expresión más óptimo entre los marcos de lectura abiertos de glf y glk, para dar como resultado una cepa que creció y superó a la cepa parental AC15.

Otras mutaciones que alteran la tasa de transcripción o expresión de los genes glf y glk, o que alteran la concentración, la actividad específica o la estabilidad de las proteínas glf y glk, pueden lograr de manera similar un equilibrio más óptimo entre las dos proteínas codificadas y ambién beneficiarán el crecimiento y la producción de una sustancia química deseada. Estas otras mutaciones alternativas se pueden obtener utilizando el método descrito anteriormente para YSS41. Este método también se puede aplicar a cepas modificadas para producir productos distintos al succinato, donde la capacidad de utilizar la difusión facilitada o la importación de azúcar se ha diseñado en la cepa.

Ejemplo 8

Fermentación de KJ122 e YSS41 después de la optimización del caudal de aire para YSS41

Se había determinado que el caudal de aire óptimo para la cepa original KJ122 era de 25 ml/minuto en un fermentador de 20 litros. Al caudal de aire de 25 ml/min, la cepa YSS41 mostró un mejor título y rendimiento de succinato en comparación con la KJ122. Se obtuvo una mejora adicional en el rendimiento y el título de succinato con la cepa YSS41 aumentando el caudal de aire a 50 ml/min. Por lo tanto, la tasa de caudal de aire óptima para la cepa YSS41 con referencia al rendimiento y título de succinato parece ser diferente de la de KJ122. La Tabla 6 proporciona los resultados de la fermentación en el termentador de 20 litros en condiciones de flujo de aire optimizadas para cada cepa. YSS41 superó al KJ122 original en título, rendimiento y formación de subproductos de acetato. El volumen inicial de la fermentación fue de 9500 ml. Después de alimentar con glucosa y neutralizar con base, el volumen final fue de 12500 ml.

Referencias

Todas las referencias se enumeran para comodidad del lector.

Patente de EE.UU. n° 5,602,030

Patente de EE.UU. n° 6,962,794

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Documento de Patente Europea n° EP0785275B1

Publicación de Solicitud de Patente Internacional n° WO 2010/115067

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una bacteria Escherichia coli capaz de producir más de 30 gramos por litro de ácido succínico, en donde uno de los intermediarios biosintéticos para dicho ácido succínico es fosfoenolpiruvato, y dicha bacteria contiene al menos un gen exógeno que codifica una proteína que funciona en la difusión facilitada de un azúcar, una mutación o deleción en uno o más genes que codifican proteínas que funcionan en un sistema de fosfotransferasa para la importación de azúcar y dos o más copias de un gen crr funcional o un homólogo funcional de un gen crr.

   2. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1 que comprende además una deleción en un gen que codifica un importador de azúcar que funciona usando simporte de protones.

   3. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dicho gen mutado o suprimido es un gen ptsH o un homólogo del mismo.

   4. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dicho gen mutado o suprimido es un gen ptsl o un homólogo del mismo.

   5. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dichos genes mutados o eliminados se seleccionan del grupo que consiste en un gen ptsH, un gen ptsl, un homólogo de un gen ptsH y un homólogo de un gen ptsl. 6. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dicho gen exógeno está contenido en un plásmido de replicación.

   7. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dicho gen exógeno está integrado en el cromosoma del huésped.

   8. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dicho gen exógeno es un gen glf.

   9. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1, en la que dichos genes exógenos son un gen glf y un gen glk.

   10. La bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1 en la que dichos genes exógenos son un gen glf y un gen frk.

   11. Un método para producir ácido succínico, que comprende las etapas de:

   cultivar la bacteria Escherichia coli de la reivindicación 1 en un medio de fermentación mínimo; y opcionalmente purificar el ácido succínico del medio de fermentación.