JP2024505755A - 植物におけるテルペン産生方法 - Google Patents

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Abstract

植物葉に特定の香気および芳香特性を与えるテルペンの形成を制御する、タバコまたは大麻などの植物における腺毛状突起の二次代謝機能の改変のための、組成物および方法が提供される。増強されたテルペン産生および組成物が、メントールおよびcis-アビエノールの生化学合成経路における標的化改変を通じて達成される。本出願は、タバコおよび大麻におけるこれらのテルペンの産生のための酵素学をコードする新規ヌクレオチド配列、それらの使用植物への応用を提供する。TIFF2024505755000019.tif168167

Description

関連出願の相互参照および配列表の組み入れ
本出願は、2021年2月3日に出願された米国仮特許出願第63/145,259号；2021年2月3日に出願された米国仮特許出願第63/145,262号；および2021年2月3日に出願された米国仮特許出願第63/145,263号の恩典を主張するものであり、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本出願はまた、ASCIIフォーマットで電子提出されている配列表を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2022年1月25日に作成された前記ASCIIコピーは、P34829WO00_SL.txtという名称であり、Microsoft Windows（登録商標）で測定した場合に744,449バイトサイズである。
分野
本開示は、テルペノイド生合成遺伝子、ならびにタバコおよび大麻を含めた植物におけるその遺伝子操作に関する。
配列
表1は、本開示において使用される核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
（表１）本開示において使用される配列
Figure 2024505755000002
Figure 2024505755000003
Figure 2024505755000004
Figure 2024505755000005
Figure 2024505755000006
Figure 2024505755000007
Figure 2024505755000008
背景
植物は、多種多様な二次代謝物を産生することが可能であり、多くの二次代謝物は、腺毛状突起と呼ばれる地上構造体において産生される。多様な植物および一部の昆虫によって産生されるテルペンは、5炭素構成単位であるイソプレンからなる巨大かつ多様な有機化合物のクラスを表す。テルペノイドは、さらなる官能基を含有する修飾されたテルペンである。
テルペノイドは、植物に存在する最大かつ最も多様な二次代謝物のファミリーを含む。環式または非環式であり得るテルペノイドは、5炭素ヘミテルペンから数千のイソプレン単位を含有する長い複合分子まで、サイズが様々である。テルペノイドのオレフィン骨格は、5炭素（C）イソプレン単位の倍数からできており、主要なグループは、モノテルペン（10C）、セスキテルペン（15C）、およびジテルペン（20C）である。これらのテルペノイドは、5-Cイソプレン単位（ジメチルアリル二リン酸［DMAPP］およびイソペンテニル二リン酸［IPP］）同士の、ほとんどがDMAPPからIPPへの逐次的な頭尾付加による、縮合を通じて産生される。
下流の植物ベース製品の香気および芳香特性を改善するために、タバコおよび大麻などの植物中のテルペノイドレベルを、テルペン生合成経路における遺伝子の遺伝子発現の標的化操作によって増強および改変することができる。
概要
一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、改変されたタバコ植物、タバコ種子もしくはその部分、または改変された大麻植物、大麻種子もしくはその部分を提供する。
一局面では、本開示は、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含む、改変されたタバコ植物、タバコ種子もしくはその部分、または改変された大麻植物、大麻種子もしくはその部分であって、改変されたタバコ植物または改変された大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコ植物または対照大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、改変されたタバコ植物、タバコ種子もしくはその部分、または改変された大麻植物、大麻種子もしくはその部分を提供する。
一局面では、本開示は、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、改変されたタバコ植物、タバコ種子もしくはその部分、または改変された大麻植物、大麻種子もしくはその部分を提供する。
一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。
一局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変されたタバコ植物または改変された大麻植物を生産する方法を提供する：（a）組換え核酸分子を少なくとも1つのタバコ細胞または大麻細胞に導入する工程であって、組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されているテルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、工程；（b）組換え核酸分子を含む少なくとも1つのタバコ細胞または大麻細胞を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの組換え核酸分子を欠く対照タバコ植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
一局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変されたタバコ植物または改変された大麻植物を生産する方法を提供する：（a）少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞において、テルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの非天然変異を誘導する工程；（b）工程（a）から少なくとも1つの非天然変異を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
一局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変されたタバコ植物または改変された大麻植物を生産する方法を提供する：（a）組換えDNA構築物を少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞に導入する工程であって、該組換えDNA構築物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、工程；（b）組換えDNA構築物を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、少なくとも1つの改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの組換えDNA構築物を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの低減した量を含む、工程。
一局面では、本開示は、改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコ製品または大麻製品を調製する工程を含む方法であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、方法を提供する。
一局面では、本開示は、改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコ製品または大麻製品を調製する工程を含む方法であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、方法を提供する。
一局面では、本開示は、改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸分子に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、方法を提供する。
一局面では、本開示は、タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法を提供する。
一局面では、本開示は、タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、組換え核酸分子が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、方法を提供する。
一局面では、本開示は、以下の工程を含む、タバコ植物または大麻植物を生産するための方法を提供する：（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、工程；および（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が組換え核酸分子を含む、工程。
一局面では、本開示は、以下の工程を含む、タバコ植物または大麻植物を生産するための方法を提供する：（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く第1のタバコまたは大麻品種の対照タバコまたは大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、工程；および（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が少なくとも1つの非天然変異を含む、工程。
一局面では、本開示は、以下の工程を含む、タバコ植物または大麻植物を生産するための方法を提供する：（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸分子に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換え核酸分子を含む、工程；および（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が組換え核酸分子を含む、工程。
植物におけるフェニルプロパノイド、細胞質メバロン酸（MVA）、色素体メチルエリスリトールリン酸（MEP）、およびポリケチド生合成経路を描写している。前駆体の輸送は、破線矢印によって表され、一方、直接触媒反応は、太字矢印によって描写される。使用される略称：IPP、イソペンテニル二リン酸；DMAPP、ジメチルアリル二リン酸；GPP、ゲラニル二リン酸；FPP、ファルネシル二リン酸；MVA、メバロン酸；MEP、メチルエリスリトールリン酸。 植物におけるメントール生合成経路を描写している。 植物におけるcis-アビエノール生合成経路を描写している。 植物におけるセンブラトリエンジオール生合成経路を描写している。 植物におけるレボピマル酸生合成経路を描写している。 植物におけるL-ロイシン生合成経路を描写している。 テルペン生合成遺伝子の毛状突起における遺伝子発現を描写している。 パネルAおよびBを含む。パネルAは、異なる植物発達段階でのタバコ栽培品種TN90およびK326の花および葉における、RNAシーケンシングによって作製されたNtNMDの転写物の存在量を描写している。パネルBは、異なる植物発達段階でのタバコ栽培品種TN90およびK326の花および葉における、RNAシーケンシングによって作製されたNtABSの転写物の存在量を描写している（d：日目；w：週目）。 タバコにおける候補遺伝子の過剰発現のための代表的なベクター構築物を描写している。各プロモーターは、候補遺伝子および緑色蛍光タンパク質（G3GFP）をコードする配列に機能的に連結されている。 タバコにおける候補テルペン生合成遺伝子の過剰発現およびノックダウンに使用できる代表的なベクターpGWB551のマップを描写している。 パネルA、B、C、D、E、F、およびGを含み、図は、トランスジェニックタバコ植物系統のカルスにおける緑色蛍光タンパク質（GFP）発現（CaMV 35Sプロモーターによって駆動される）を描写している。図11Aは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ-TN90を示している；図11Bは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ-Nbを示している；図11Cは、センブラトリエノールシンターゼ2a-Nbを示している；図11Dは、ネオメントールデヒドロゲナーゼ-Nbを示している；図11Eは、cis-アビエノールシンターゼ-TN90を示している；図11Fは、メントフランシンターゼ-Nbを示している；そして、図11Gは、GFP-TN90を示している。Nb＝N. ベンサミアナ；TN90＝タバコ栽培品種「TN90」。 パネルAおよびBを含む。パネルAは、cis-アビエノールシンターゼ過剰発現構築物で形質転換されたT0トランスジェニックタバコ植物における、NtaABSの相対遺伝子発現を描写しており、パネルBは、NtABSの相対遺伝子発現を描写している。NtaABSおよびNtABSは各々、CaMV 35Sプロモーターに機能的に連結されている。 メントンレダクターゼ過剰発現構築物で形質転換されたT0トランスジェニックタバコ植物における、CaMV 35Sプロモーターに機能的に連結されているNtNMDの相対遺伝子発現を描写している。 パネルAおよびBを含む。パネルAは、NtNMD過剰発現T0トランスジェニックタバコ植物におけるネオフィタジエンの相対遺伝子発現を、T90対照植物と比較して描写している。パネルBは、NtABS/NtaABS過剰発現T0トランスジェニックタバコ植物における相対遺伝子発現を、TN90対照植物と比較して描写している。 NtNMDを過剰発現するタバコ系統TN90のT1トランスジェニック植物におけるNtNMD（SEQ ID NO：15）の相対遺伝子発現レベルを、野生型TN90植物（示さず）と比較して描写している。 NtaABSを過剰発現するタバコ系統TN90のT1トランスジェニック植物におけるNtaABS（SEQ ID NO：4）の相対遺伝子発現レベルを、野生型TN90植物（示さず）と比較して描写している。
詳細な説明
特に定義のない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、本開示の実践において多くの方法を使用できることを認識するだろう。実際に、本開示は、決して記載される方法および材料に限定されるものではない。用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形によって記載される本開示の局面も想定しており、その逆もまた同様である。参照により組み入れられる参考文献において使用される用語および定義に相違がある場合、本出願において使用される用語は、本明細書に与えられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、様々な専門用語辞典、例えば、「The American Heritage（登録商標）Science Dictionary」（Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Houghton Mifflin Harcourt, Boston and New York）、「McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms」（6th edition, 2002, McGraw-Hill, New York）、または「Oxford Dictionary of Biology」（6th edition, 2008, Oxford University Press, Oxford and New York）に例示されるように、それらが使用される技術分野における一般的な意味を有する。
例えば、すべての特許、公開特許出願および非特許刊行物を含め、本明細書において引用されるあらゆる参考文献が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
選択肢のグループ分けが提示される場合、その選択肢のグループ分けを成すメンバーのありとあらゆる組み合わせが具体的に想定される。例えば、ある項目が、A、B、C、およびDからなる群より選択される場合、本発明者らは、それぞれの選択肢を個別に（例えば、A単独、B単独など）、また、例えばAとBとD；AとC；BとCなどの組み合わせも、具体的に想定している。「および／または」という用語は、2つ以上の項目の一覧において使用される場合、列挙された項目のいずれか1つを単独として、またはその他の列挙された項目のいずれか1つもしくは複数との組み合わせとして意味する。例えば、「Aおよび／またはB」という表現は、AとBのいずれか一方または両方、すなわち、A単独、B単独、またはAとBの組み合わせを意味することが意図される。「A、Bおよび／またはC」という表現は、A単独、B単独、C単独、AとBの組み合わせ、AとCの組み合わせ、BとCの組み合わせ、またはAとBとCの組み合わせを意味することが意図される。
本明細書において数値の範囲が提供される場合、その範囲は、その範囲の端部も、その規定された範囲の端部間の任意の数値も包含するものと理解される。例えば、「1～10」は、1～10の間の任意の数値も、数値1および数値10も含む。
「約」という用語は、本明細書において、およそ、大体、前後、またはその領域内にあることを意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、「約」は、その範囲を、示されている数値の上下の境界を延長することによって修飾し、＋10％または－10％を意味するものと理解される。例えば、「約100」は、90から110までを含むだろう。
本明細書において使用される場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確にそうでないと示していない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「1つの化合物」または「少なくとも1つの化合物」という用語は、その混合物を含め、複数の化合物を含み得る。
本明細書において使用される場合、「約～」、「少なくとも～」、「少なくとも約～」、「多くても～」、「～より少ない」、「～より多い」、「～以内」または「～と同様に」などの用語または語句の後に一続きまたは一並びのパーセンテージの数値が続く場合、そのような用語または語句は、ありとあらゆるメンバーの前に副詞、前置詞または他の修飾句が再現されているかどうかにかかわらず、その一続きまたは一並びの中のありとあらゆるパーセンテージの数値を修飾すると見なされる。
本明細書に提供される任意のタバコ植物、またはその部分が、本明細書に提供される任意の方法との使用に具体的に想定される。同様に、任意の改変されたタバコ植物、またはその部分も、本明細書に提供される任意の方法との使用に具体的に想定される。本明細書に提供される任意の大麻植物、またはその部分が、本明細書に提供される任意の方法との使用に具体的に想定される。同様に、任意の改変された大麻植物、またはその部分も、本明細書に提供される任意の方法との使用に具体的に想定される。
本明細書に提供される任意の核酸配列、アミノ酸配列、または他の組成物が、本明細書に提供される任意の方法との使用に具体的に想定される。
テルペンは、5炭素構成単位であるイソプレンからなる巨大かつ多様な有機化合物のクラスを表す。テルペンは、多様な植物および一部の昆虫によって産生される。テルペンは、強い臭気を有することが多く、草食動物を躊躇させることによりそれらを産生する植物を保護し得る。テルペノイドは、さらなる官能基を含有する修飾されたテルペンである。
植物における最大かつ最も多様な二次代謝物のファミリーがテルペノイドである。テルペノイドは、5-Cイソプレン単位（ジメチルアリル二リン酸［DMAPP］およびイソペンテニル二リン酸［IPP］）同士の、ほとんどがDMAPPからIPPへの逐次的な頭尾付加による、縮合を通じて合成される。色素体メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸をIPPとDMAPPに変換する7つの工程からなる。図1を参照されたい。初期の環化プロセスは、異なるテルペンシンターゼ（TPS）によって触媒され、酵素の変異は、モノテルペン構造の変異を導く。テルペンは、5炭素ヘミテルペンから数千のイソプレン単位を含有する長い複合分子まで、サイズが広範囲に及び得る。いくつかのモノテルペンシンターゼは、複数の生成物を産生することができる。
テルペンシンターゼに加えて、trans-イソプレニル二リン酸シンターゼ（IDS）も、多様なテルペノイドの作製に関与するコア酵素の1つである。TPSおよびIDSは、保存されたアルファ-テルペノイドシンターゼ折り畳み構造および触媒作用のための三核金属クラスターを共有する。
モノテルペンは、2つのイソプレン単位から構成される環状分子である。モノテルペンは、植物に対して特徴的な芳香および香気を与える、C10の無色で脂溶性の構造的に多様な（環式および非環式の）揮発性分子である。これらの分子はまた、植物とそれらの花粉媒介種との間の化学誘引物質として、ならびに植物-植物および植物-草食動物の情報伝達における抑制物質として重要な役割を果たしており、植物防御の重要な成分である。モノテルペンの産生および蓄積は、一般的に腺毛状突起に限定されており、そのような特殊な構造を欠いた植物は、典型的には、ほんの僅かな量のモノテルペンしか蓄積しない。
テルペンシンターゼ（TPS）遺伝子は、7つの分岐群（TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g、およびTPS-h）にグループ分けすることができ、この場合、TPS-dおよびTPS-hは、裸子植物およびヒカゲノカズラ類のセラギネラ・モエレンドルフィー（Selaginalla moellendorffii）に特異的であり、TPS-a、TPS-bおよびTPS-gは、被子植物に特異的である。TPS-aは、多くの場合、セスキテルペンシンターゼおよびジテルペンシンターゼを含有する。ネオフィタジエンは、タバコにおいて豊富なセスキテルペノイドの一例である。TPS-bおよびTPS-g分岐群は、多くの場合、モノテルペンシンターゼを含む。タバコの近縁種である栽培トマト（S. リコペルシカム）のゲノムは、44個のTPS遺伝子を含有し、そのうち29個は、機能的または潜在的に機能的であるように思われる。葉および茎毛状突起におけるトマトTPS遺伝子の発現パターンは、定量的および定性的に異なり、これらの2つの器官の別個の揮発性プロファイルと一致する。ソラナセア（Solanaceae）種における遺伝子発現の組織特異的な差異は、一部には、観察される別個の種内および種間の化学的変動性が原因である。多くのテルペンシンターゼは、同じ基質から複数の生成物を形成する。
タバコ葉組織の芳香（臭気）および感覚受容（味覚／香気）特性は、テルペノイド形成を制御する生合成経路の標的化遺伝子操作によって増強することができる。同様に、大麻樹脂も、多様なモノテルペンおよびセスキテルペンを含有する。2つの主要な生合成経路がテルペノイド形成を制御する。一方の経路が、メントールおよび関連化合物の形成を制御し（図2を参照のこと）、もう一方が、cis-アビエノールなどのラブダノイドの形成を制御する（図3を参照のこと）。
メントール生合成経路における遺伝子の標的化過剰発現は、タバコ植物におけるメントールの蓄積を増強することができる。C10モノテルペンの(-)-メントールは、様々な工業生産および医療目的に使用される精油の生産にとって経済的に重要な植物である、メンタ・ピペリタ（Mentha x piperita）（ペパーミント）の特徴的な構成要素である。ハッカ種（Mentha species）において、メントールの生合成および貯蔵は、植物の地上表面の楯状の腺毛状突起（腺鱗）に限定される。
(-)-メントールの生合成は、8つの酵素工程を伴う。遍在的なモノテルペン前駆体であるゲラニル二リン酸の形成およびその後の親オレフィン(-)-(4S)-リモネンへの環化は、メントール生合成経路の最初に関与する酵素反応である。
メントール生合成経路の酵素をコードする遺伝子は、ゲラニル二リン酸シンターゼ（GDP）（SEQ ID NO：7、28、および49）、リモネンシンターゼ（LS）（SEQ ID NO：8、29、および50）、リモネン 3-ヒドロキシラーゼ（L3OH）（SEQ ID NO：10、31、および52）、リモネンシンターゼ葉緑体アイソフォームX1（SEQ ID NO：165、181、および197）、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ（IPD）（SEQ ID NO：13、34、55、169、185、および201）、プレゴンレダクターゼ（SEQ ID NO：14、35、および56）、メントフランシンターゼ（MFS）（SEQ ID NO：16、37、および58）、および別名ネオメントールデヒドロゲナーゼ（NtNMD）（SEQ ID NO：15、36、および57）とも呼ばれるメントンレダクターゼを含む。図2を参照されたい。
第2の主要なテルペノイド生合成経路は、cis-アビエノールなどのラブダノイドの形成に関与する（図3を参照のこと）。いくつかの形態のタバコを含めたいくつかの芳香族植物に見いだされる主要なラブダノイドは、Cis-アビエノールおよびラブデンジオールである。Cis-アビエノールは、いくつかのオリエンタル（Oriental）タバコ品種に豊富なジテルペノイドであるが、TN90などの市販の熱風（flue）およびバーレー（Burley）型タバコにおいては一般的でない。
Cis-アビエノールの生合成は、2工程で進行する（図3を参照のこと）。クラスIIテルペンシンターゼ（8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ）（SEQ ID NO：3、24、45、115、129、および143）が、ゲラニルゲラニル二リン酸から8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸を合成し、カウレンシンターゼ様（KSL）酵素（cis-アビエノールシンターゼ）（SEQ ID NO：4、5、6、25、26、27、46、47、48、119、133、および147）が、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸をCis-アビエノールに変換する。
標的化芳香増強に使用されるさらなる生合成経路は、センブラトリエンジオール生合成経路（図4を参照のこと）、レボピマル酸生合成経路（図5を参照のこと）、およびL-ロイシン生合成経路（図6を参照のこと）を含む。センブラトリエノールシンターゼ2a（SEQ ID NO：17、38、59、114、128、および142）は、センブラトリエンジオール生合成経路における重要な酵素である（図4を参照のこと）。ジテルペンのセンブラトリエンオール（CBTol）およびセンブラトリエンジオール（CBTdiol）は、重要な防御化合物と考えられ、毛状突起において産生される。レボピマラジエンシンターゼ（SEQ ID NO：18、39、および60）は、レボピマル酸生合成経路における重要な酵素である（図5を参照のこと）。レボピマル酸は、球果植物におけるジテルペン樹脂酸産生に関与すると報告されている。2-イソプロピルリンゴ酸シンテターゼ（IPS）（SEQ ID NO：19、40、61、116、124、130、138、144、152、175、191、および207）および2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ（SEQ ID NO：20、21、41、42、62、および63）は、L-ロイシン生合成経路における重要な酵素である（図6を参照のこと）。ロイシンは、オリエンタルタバコにおける芳香特性に寄与する分岐鎖アミノ酸の1つである。
ある局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分を提供する。
さらなる局面では、本開示は、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分を提供する。
テルペン
テルペンは、植物および一部の昆虫によって産生される芳香族有機化合物のクラスである。テルペンは、植物の精油に見いだされる揮発性不飽和炭化水素の一群のメンバーであり、式C10H16を有する環状分子；および関連構造、例えば、限定されないが、式C15H24を有するセスキテルペンなどの化合物、またはそのような化合物の単純誘導体をベースとする。テルペンは、食害を直接阻止するためかまたは植物草食動物の捕食者もしくは寄生生物を誘引するために植物がよく利用する炭化水素分子である。テルペンの非限定的な例は、シトラール、メントール、ショウノウ、サルビノリンA、カンナビノイド、およびクルクミノイドを含む。
大麻において、限定されないがミルセン、ピネン、リモネン、カリオフィレン、リナロール、テルピノレン、カンフェン、テルピネオール、フェランドレン、カレン、フムレン、プレゴンおよびゲラニオールを含め、いくつかのテルペンのクラスが特定されている。ミルセン、具体的にはベータ-ミルセンは、モノテルペンであり、大麻によって産生される最も一般的なテルペンである。ピネンは、二環式モノテルペノイドである。ピネンの2つの天然に存在する構造異性体：アルファ-ピネンおよびベータ-ピネンが知られている。リモネンは、単環式モノテルペノイドであり、ピネンから形成される2つの主要な化合物の1つである。カリオフィレン、具体的にはベータカリオフィレンは、クローブ、シナモン葉およびコショウを含めた、大麻を除く多くの植物に共通するセスキテルペンである。ベータ-カリオフィレンは、機能的なカンナビノイド-2受容体（CB2）アゴニストであるので、カリオフィレンは、エンドカンナビノイド系と相互作用することが知られている唯一のテルペンである。リナロールは、ビタミンEの形成において極めて重要な前駆体である非環式モノテルペノイドであり、多くの異なる植物から単離されている。デルタ-3-カレンは、二環式モノテルペンである。アルファ-テルピネオール、テルピネン-4-オール、および4-テルピネオールは、3つの密接に関連したモノテルペノイドである。フムレンは、アルファ-フムレンとしても知られているセスキテルペンである。単環式モノテルペノイドであるプレゴンは、大麻の微量成分である。
ある局面では、テルペンは、テルペノイドである。テルペノイド（イソプレノイドとも称される）は、しばしば酸素を含むさらなる官能基を含有する修飾されたテルペンである。環式または非環式であり得るテルペノイドは、5炭素ヘミテルペンから数千のイソプレン単位を含有する長い複合分子まで、サイズが様々である。テルペノイドは、5炭素イソプレン単位（例えば、ジメチルアリル二リン酸（DMAPP）およびイソペンテニル二リン酸（IPP））同士の、ほとんどがDMAPPからIPPへの逐次的な頭尾付加による、縮合を通じて産生される。初期の環化プロセスは、異なるテルペンシンターゼによって触媒され、酵素の変異は、モノテルペン構造の変異を導く。
テルペノイドは、親テルペンを含むイソプレン単位の数に従って分類される。ヘミテルペノイドは、1個のイソプレン単位を含む。モノテルペノイドは、2個のイソプレン単位を含む。セスキテルペノイドは、3個のイソプレン単位を含む。ジテルペノイドは、4個のイソプレン単位を含む。セスタテルペノイドは、5個のイソプレン単位を含む。トリテルペノイドは、6個のイソプレン単位を含む。テトラテルペノイドは、8個のイソプレン単位を含む。ポリテルペノイドは、8個を超えるイソプレン単位を含む。
ある局面では、ポリペプチドは、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セスタテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、およびポリテルペノイドからなる群より選択される少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セスタテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、およびポリテルペンからなる群より選択される少なくとも1つのテルペンの生合成に関与する。
本明細書において使用される場合、「生合成」という用語は、植物または植物細胞内での複合分子（例えば、限定されないが、テルペンまたはテルペノイド）の産生のことを指す。化合物の生合成に「関与する」ために、ポリペプチドは、化合物の生合成の間に基質と直接相互作用し得るか、または、ポリペプチドは、基質と直接相互作用するポリペプチドの発現に（正にまたは負に）影響を及ぼし得る（例えば、基質を新たな形態に変換する酵素の発現を促進する転写因子、または基質を新たな形態に変換する酵素の発現を阻害するリプレッサー）。生合成経路の例は、図1～6に見いだすことができる。ある局面では、転写因子は、MYB61アイソフォームX1である。非限定的な例として、SEQ ID NO：208および176は、それぞれ、転写因子MYB61アイソフォームX1のアミノ酸および核酸配列である。
ある局面では、ポリペプチドは、ヘミテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ヘミテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、モノテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、モノテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、セスキテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、セスキテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ジテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ジテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、セスタテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、セスタテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、トリテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、トリテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、テトラテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ポリテルペノイドの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、モノテルペンの生合成に関与する。ある局面では、ポリペプチドは、ポリテルペノイドの生合成に関与する。
テルペンシンターゼ（TPS）遺伝子は、7つの分岐群：TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g、およびTPS-hにグループ分けすることができる。TPS-a、TPS-b、およびTPS-gは、被子植物に限定されており、TPS-dおよびTPS-hは、裸子植物およびヒカゲノカズラ類のセラギネラ・モエレンドルフィーに特異的である。TPS-a分岐群は、多くの場合、セスキテルペンシンターゼおよびジテルペンシンターゼを含み、一方、TPS-bおよびTPS-g分岐群は、多くの場合、モノテルペンシンターゼを含む。
テルペンシンターゼ様遺伝子
ある局面では、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与するポリペプチドは、TPS-a分岐群メンバーである。ある局面では、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与するポリペプチドは、TPS-b分岐群メンバーである。ある局面では、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与するポリペプチドは、TPS-c分岐群メンバーである。ある局面では、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与するポリペプチドは、TPS-e/f分岐群メンバーである。ある局面では、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与するポリペプチドは、TPS-g分岐群メンバーである。ある局面では、少なくとも1つのテルペノイドの生合成に関与するポリペプチドは、TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e/fおよびTPS-gからなる群より選択される分岐群のメンバーである。
ある局面では、テルペンは、メントールである。ある局面では、テルペンは、メントールまたは関連化合物である。ある局面では、テルペンは、ラブダノイドである。ある局面では、テルペンは、センブラトリエンジオールである。ある局面では、テルペンは、レボピマル酸である。ある局面では、テルペンは、L-ロイシンである。ある局面では、テルペンは、ネオフィタジエンである。ある局面では、ラブダノイドは、cis-アビエノールである。ある局面では、ラブダノイドは、ラブダン-ジオールである。ある局面では、テルペンは、メントールまたは関連化合物、ラブダノイド、センブラトリエンジオール、レボピマル酸、およびL-ロイシンからなる群より選択される。ある局面では、テルペンは、メントールまたは関連化合物、ラブダノイド、センブラトリエンジオール、レボピマル酸、L-ロイシン、およびネオフィタジエンからなる群より選択される。ある局面では、テルペンは、メントール、ラブダノイド、センブラトリエンジオール、レボピマル酸、およびL-ロイシンからなる群より選択される。ある局面では、テルペンは、メントール、ラブダノイド、センブラトリエンジオール、レボピマル酸、L-ロイシン、およびネオフィタジエンからなる群より選択される。
ある局面では、テルペンは、ミルセンである。ある局面では、テルペンは、ピネンである。ある局面では、テルペンは、リモネンである。ある局面では、テルペンは、カリオフィレンである。ある局面では、テルペンは、リナロールである。ある局面では、テルペンは、テルピノレンである。ある局面では、テルペンは、カンフェンである。ある局面では、テルペンは、テルピネオールである。ある局面では、テルペンは、フェランドレンである。ある局面では、テルペンは、カレンである。ある局面では、テルペンは、フムレンである。ある局面では、テルペンは、プレゴンである。ある局面では、テルペンは、ゲラニオールである。
本明細書において使用される場合、「メントール」は、化学式：C10H20OおよびInternational Union of Pure and Applied Chemistry（IUPAC）名：5-メチル-2-(プロパン-2-イル)シクロヘキサン-1-オールを有する有機化合物のことを指す。メントールは、「(-)-メントール」とも称される。メントールの関連化合物は、(+)-メントール、(+)-イソメントール、(+)-ネオメントール、(+)-ネオイソメントール、(-)-イソメントール、(-)-ネオメントール、および(-)-ネオイソメントールを含むが、それらに限定されない。ある局面では、メントールの関連化合物は、(+)-メントール、(+)-イソメントール、(+)-ネオメントール、(+)-ネオイソメントール、(-)-イソメントール、(-)-ネオメントール、および(-)-ネオイソメントールからなる群より選択される。
本明細書において使用される場合、「ネオフィタジエン」は、化学式：C20H38およびIUPAC名：7,11,15-トリメチル-3-メチリデンヘキサデカ-1-エンを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「センブラトリエンジオール」は、化学式：C20H34O2およびIUPAC名：(1R,3R,4Z,8Z,12S,13Z)-1,5,9-トリメチル-12-プロパン-2-イルシクロテトラデカ-4,8,13-トリエン-1,3-ジオールを有する有機化合物のことを指す。センブラトリエンジオールは、「ベータ-センブレンジオール」とも称される。
本明細書において使用される場合、「レボピマル酸」は、化学式：C20H30O2およびIUPAC名：(1R,4aR,4bS,10aR)-1,4a-ジメチル-7-プロパン-2-イル-2,3,4,4b,5,9,10,10a-オクタヒドロフェナントレン-1-カルボン酸を有する有機化合物のことを指す。レボピマル酸は、「L-ピマル酸」とも称される。ある局面では、レボピマル酸は、ジテルペン樹脂酸産生に関与する。
本明細書において使用される場合、「L-ロイシン」は、化学式：C6H12NO2およびIUPAC名：(2S)-2-アミノ-4-メチルペンタン酸を有するアミノ酸のことを指す。
本明細書において使用される場合、「ラブダノイド」は、基本的な親ラブダンのテルペノイド誘導体であるジテルペンのことを指す。ラブダンは、化学式：C20H38およびIUPAC名：(1S,2S,4aS,8aR)-2,5,5,8a-テトラメチル-1-[(3R)-3-メチルペンチル]-1,2,3,4,4a,6,7,8-オクタヒドロナフタレンを有する。
ラブダノイドの非限定的な例は、cis-アビエノールである。本明細書において使用される場合、「cis-アビエノール」は、化学式：C20H34OおよびIUPAC名：(1R,2R,4aS,8aS)-2,5,5,8a-テトラメチル-1-[(2Z)-3-メチルペンタ-2,4,-ジエニル]-3,4,4a,6,7,8-ヘキサヒドロ-1H-ナフタレン-2-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「ミルセン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：7-メチル-3-メチレン-オクタ-1,6-ジエンを有する化合物のことを指す。ベータ-ミルセンまたはアルファ-ミルセンとしても知られているミルセンは、非環式モノテルペノイドとして知られている有機化合物のクラスに属する。したがって、ミルセンは、イソプレノイド脂質分子であると見なされる。
本明細書において使用される場合、「ピネン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：(1S,5S)-2,6,6-トリメチルビシクロ[3.1.1]ヘプタ-2-エンを有する化合物（(-)-α-ピネン）のことを指す。2-ピネンまたはアシンテンa（acintene a）としても知られている(+)-a-ピネンは、二環式モノテルペノイドとして知られている有機化合物のクラスに属する。これらは、正確に2つの互いに縮合している環を含有するモノテルペノイドである。アルファ-ピネンは、2、6および6位がそれぞれメチル基により置換されているビシクロ[3.1.1]ヘプタ-2-エンであるピネンである。それは、植物代謝物としての役割を有する。
本明細書において使用される場合、「リモネン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：1-メチル-4-(1-メチルエテニル)-シクロヘキセンを有する化合物のことを指す。リモネン(+/-)-は、天然の環式モノテルペンであるリモネンのラセミ混合物である。
本明細書において使用される場合、「カリオフィレン」または「ベータカリオフィレン」は、化学式：C15H24およびIUPAC名：(1R,4E,9S)-4,11,11-トリメチル-8-メチリデンビシクロ[7.2.0]ウンデカ-4-エンを有する有機化合物のことを指す。ベータ-カリオフィレンは、セスキテルペノイドとして分類される。(-)-ベータ-カリオフィレンは、環外二重結合に隣接する立体中心がS立体配置を有し、残りの立体中心がR立体配置を有する、ベータ-カリオフィレンである。それは、ベータ-カリオフィレンの最も一般的に存在する形態であり、多くの精油に存在する。
本明細書において使用される場合、「リナロール」は、化学式：C10H18OおよびIUPAC名：3,7-ジメチルオクタ-1,6-ジエン-3-オールを有する化合物のことを指す。3,7-ジメチル-1,6-オクタジエン-3-オールまたは2,6-ジメチルオクタ-2,7-ジエン-6-オールとしても知られているベータ-リナロールは、非環式モノテルペノイドとして分類される。
本明細書において使用される場合、「テルピノレン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：1-メチル-4-プロパン-2-イリデンシクロヘキセンを有する有機化合物のことを指す。アルファ-テルピノレンまたはイソテルピネンとしても知られているテルピノレンは、メンタンモノテルペノイドとして分類される。これらは、o-、m-またはp-メンタン骨格をベースとした構造を有するモノテルペノイドである。
本明細書において使用される場合、「カンフェン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：2,2-ジメチル-3-メチリデンビシクロ[2.2.1]ヘプタンを有する有機化合物のことを指す。カンフェンは、2つの互いに縮合している環を含有する二環式モノテルペノイドとして分類される。カンフェンは、2位がジェミナルメチル基により、3位がメチリデン基により置換されているビシクロ[2.2.1]ヘプタンである二環式骨格を有するモノテルペンである。
本明細書において使用される場合、「テルピネオール」は、モノテルペンアルコールのことを指し、その中に、4つの異性体：アルファ-テルピネオール、ベータ-テルピネオール、ガンマ-テルピネオール、およびテルピネン-4-オールがある。ベータ-テルピネオールおよびガンマ-テルピネオールは、二重結合の位置だけが異なる。テルピネオールは、通常、主要な構成要素としてアルファ-テルピネオールを有するこれらの異性体の混合物である。本明細書において使用される場合、「アルファテルピネオール」は、化学式：C10H18OおよびIUPAC名：2-(4-メチルシクロヘキサ-3-エン-1-イル)プロパン-2-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「フェランドレン」は、環式モノテルペンの「アルファ-フェランドレン」または「ベータ-フェランドレン」のことを指す。本明細書において使用される場合、「アルファ-フェランドレン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：2-メチル-5-プロパン-2-イルシクロヘキサ-1,3-ジエンを有する有機化合物のことを指す。アルファ-フェランドレン（phellandrene）は、アルファ-フェランドレン（phellandren）またはジヒドロ-p-シメンとしても知られている。本明細書において使用される場合、「ベータ-フェランドレン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：3-メチリデン-6-プロパン-2-イルシクロヘキセンを有する有機化合物のことを指す。ベータ-フェランドレン（phellandrene）は、ベータ-フェランドレン（phellandren）または2-p-メンタジエンとしても知られている。
本明細書において使用される場合、「カレン」または「アルファカレン」は、化学式：C10H16およびIUPAC名：3,7,7-トリメチルビシクロ[4.1.0]ヘプタ-3-エンを有する有機化合物のことを指す。3-カレンまたはデルタ-カル-3-エンとしても知られているアルファ-カレンは、二環式モノテルペノイドとして分類される。
本明細書において使用される場合、「フムレン」は、化学式：C15H24およびIUPAC名：(1E,4E,8E)-2,6,6,9-テトラメチルシクロウンデカ-1,4,8-トリエンを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「プレゴン」は、化学式：C10H16OおよびIUPAC名：(5R)-5-メチル-2-プロパン-2-イリデンシクロヘキサン-1-オンを有する有機化合物のことを指す。D-プレゴンまたはcis-イソプレゴンとしても知られている(+)-プレゴンは、メンタンモノテルペノイドとして分類される。
本明細書において使用される場合、「ゲラニオール」は、化学式：C10H18OおよびIUPAC名：(2E)-3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-オールを有する有機化合物のことを指す。ゲラニオールは、非環式モノテルペノイドであり、2E-ゲラニオール、(e)-ゲラニオール、またはゲラニルアルコールとも称される。
ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、cis-アビエノールシンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、センブラトリエノールシンターゼ2aである。ある局面では、ポリペプチドは、レボピマラジエンシンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、2-イソプロピルリンゴ酸シンテターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼである。ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニル二リン酸シンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、リモネンシンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、リモネン 3-ヒドロキシラーゼである。ある局面では、ポリペプチドは、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼである。ある局面では、ポリペプチドは、プレゴンレダクターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、メントフランシンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、ネオメントールデヒドロゲナーゼである。ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、コラベニル二リン酸シンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、ソラネシル二リン酸シンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、テルペンシンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、2-アルケナールレダクターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、ゲルマクレンシンターゼである。ある局面では、ポリペプチドは、シトクロムP450である。ある局面では、ポリペプチドは、カルベオールデヒドロゲナーゼである。ある局面では、ポリペプチドは、MYB61転写因子である。
ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニル二リン酸シンターゼ（GDP）、リモネンシンターゼ（LS）、リモネン 3-ヒドロキシラーゼ（L3OH）、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ（IPD）、プレゴンレダクターゼ、メントフランシンターゼ、およびGGPPSネオメントールデヒドロゲナーゼ（NtNMD）からなる群より選択される。
ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS2）、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ、およびcis-アビエノールシンターゼからなる群より選択される。
ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ、cis-アビエノールシンターゼ、センブラトリエノールシンターゼ2a、レボピマラジエンシンテターゼ、2-イソプロピルリンゴ酸シンテターゼ、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、ゲラニル二リン酸シンターゼ、リモネンシンターゼ、リモネン 3-ヒドロキシラーゼ、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ、プレゴンレダクターゼ、メントフランシンターゼ、ネオメントールデヒドロゲナーゼ、フィロプラニン、およびプレムナスピロジエンオキシゲナーゼからなる群より選択される。
ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、コラベニル二リン酸シンターゼ、ソラネシル二リン酸シンターゼ、テルペンシンターゼ、リモネンシンターゼ、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ、2-アルケナールレダクターゼ、ゲルマクレンシンターゼ、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、およびMYB61からなる群より選択される。
ある局面では、ポリペプチドは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ、cis-アビエノールシンターゼ、センブラトリエノールシンターゼ2a、レボピマラジエンシンテターゼ、2-イソプロピルリンゴ酸シンテターゼ、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、ゲラニル二リン酸シンターゼ、リモネンシンターゼ、リモネン 3-ヒドロキシラーゼ、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ、プレゴンレダクターゼ、メントフランシンターゼ、ネオメントールデヒドロゲナーゼ、フィロプラニン、プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、コラベニル二リン酸シンターゼ、ソラネシル二リン酸シンターゼ、テルペンシンターゼ、2-アルケナールレダクターゼ、ゲルマクレンシンターゼ、およびMYB61からなる群より選択される。
非限定的な例として、SEQ ID NO：45および3は、それぞれ、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：59および17は、それぞれ、センブラトリエノールシンターゼ2aのアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：60および18は、それぞれ、レボピマラジエンシンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：61および207は、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼのアミノ酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：61および174は、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼの核酸配列の代表例である。
非限定的な例として、SEQ ID NO：160および158は、それぞれ、プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ（Gene id g89817）のアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：157および155は、それぞれ、フィロプラニン（Gene id g62191）のアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：194および164は、それぞれ、テルペンシンターゼの代表的なアミノ酸および核酸配列である。
ある局面では、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼは、cis-アビエノール生合成経路の成分である。非限定的な例として、SEQ ID NO：43および1は、それぞれ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。ある局面では、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼは、cis-アビエノール生合成経路の成分である。非限定的な例として、SEQ ID NO：44および191は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのアミノ酸配列の非限定的な例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：2および161は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの核酸配列の代表例である。
ある局面では、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼは、植物におけるL-ロイシン生合成経路の成分である。非限定的な例として、SEQ ID NO：62および20は、それぞれ、デヒドロゲナーゼサブユニットアルファ（Gene id g50844）のアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：63および21は、それぞれ、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットアルファ（Gene id g63865）のアミノ酸および核酸配列の代表例である。
ある局面では、cis-アビエノールシンターゼは、cis-アビエノール生合成経路の成分である。非限定的な例として、SEQ ID NO：147および119は、それぞれ、cis-アビエノールシンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。ある局面では、cis-アビエノールシンターゼは、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1およびcis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2からなる群より選択される。ある局面では、cis-アビエノールシンターゼは、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2、およびEnt-カウレンシンターゼからなる群より選択される。ある局面では、cis-アビエノールシンターゼは、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1である。ある局面では、cis-アビエノールシンターゼは、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2である。ある局面では、cis-アビエノールシンターゼは、ent-カウレンシンターゼである。非限定的な例として、SEQ ID NO：46および4は、それぞれ、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1のアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：47および5は、それぞれ、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2のアミノ酸および核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：48および6は、それぞれ、ent-カウレンシンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。
ある局面では、コラベニル二リン酸シンターゼは、(-)-コラベニル二リン酸（(-)-KPP）の形成であるサルビノリンA生合成の最初の反応を触媒する。(-)-KPPは、その後、脱リン酸化されて、(-)-コラベノールをもたらす。非限定的な例として、SEQ ID NO：192および162は、それぞれ、コラベニル二リン酸シンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。
ある局面では、NAD(P)依存性オキシドレダクターゼは、幅広い基質のNADPH依存性還元を触媒する。ある局面では、オキシドレダクターゼタンパク質は、オキシドレダクターゼドメインを含有する。ある局面では、SDRファミリーオキシドレダクターゼは、同定された［哺乳動物］カルボニルレダクターゼと、保存されているオキシドレダクターゼドメインを共有する。ある局面では、SDRファミリーオキシドレダクターゼ保存ドメインを含有するタンパク質の一例は、性質不明タンパク質LOC115704491である。非限定的な例として、SEQ ID NO：201および171は、それぞれ、性質不明タンパク質LOC115704491のアミノ酸および核酸配列の代表例である。
ある局面では、オキシドレダクターゼファミリー内の酵素の別の例は、2-アルケナールレダクターゼである。2-アルケナールレダクターゼの基質は、n-アルカナール、NAD+、およびNADP+である。2-アルケナールレダクターゼは、NADPH依存性アルケナール／オンオキシドレダクターゼとも呼ばれる。非限定的な例として、SEQ ID NO：200および170は、それぞれ、2-アルケナールレダクターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。
ある局面では、シトクロムP450（CYP）は、多様なテルペン基質のヒドロキシル化を触媒する大きな酵素ファミリーである。ある局面では、プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ（PSO）（SEQ ID NO：158および160）は、多様なセスキテルペン基質のヒドロキシル化を触媒する。様々なシトクロムP450によって触媒されるヒドロキシル化反応は、位置特異的かつ立体特異的である。非限定的な例として、SEQ ID NO：31～33、37、159、166～168、および172は、シトクロムP450の核酸配列の代表例である。非限定的な例として、SEQ ID NO：52～54、58、160、196～198、および202は、シトクロムP450のアミノ酸配列の代表例である。
ある局面では、ゲルマクレンDシンターゼは、ゲルマクレンDの形成を触媒するセスキテルペンシンターゼである。ある局面では、ゲルマクレンDシンターゼは、(-)-ゲルマクレンDシンターゼである。非限定的な例として、SEQ ID NO：203および173は、それぞれ、(-)-ゲルマクレンDシンターゼのアミノ酸および核酸配列の代表例である。
ある局面では、本明細書に提供される組換え核酸を含む改変された植物、種子または植物部分は、同等条件下で生育させたときの組換え核酸分子を欠く対照植物、種子または植物部分と比較して、少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む。ある局面では、本明細書に提供される組換え核酸を含む改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはタバコ植物部分は、同等条件下で生育させたときの組換え核酸分子を欠く対照タバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはタバコもしくは大麻植物部分と比較して、少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む。
ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも0.5％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも1％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも2％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも3％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも4％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも5％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも10％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも12.5％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも15％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも17.5％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも20％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも25％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも30％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも40％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも50％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも60％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも70％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも80％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも90％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも100％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも150％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも200％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも250％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、少なくとも500％の増加を含む。
ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～500％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～250％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～100％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～75％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～50％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～25％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～10％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～5％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、0.5％～500％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、5％～250％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、5％～100％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、5％～50％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、25％～500％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、25％～250％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、50％～100％の増加を含む。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの増加した量は、100％～500％の増加を含む。
テルペンは、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、溶媒抽出を使用して抽出され得る。例えば、Jiang et al., Curr Protoc Plant Biol., 1:345-358 (2016)を参照されたい。無溶媒抽出法も当技術分野において公知である。例えば、Yang and Xie, Science Direct, 162: 135-139 (2006)を参照されたい。
植物中のテルペンの量は、限定されないがガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）、核磁気共鳴分光法および液体クロマトグラフィー結合質量分析を含む、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定することができる。The Handbook of Plant Metabolomics, edited by Weckwerth and Kahl, (Wiley-Blackwell) (May 28, 2013)を参照されたい。ある局面では、少なくとも1つのテルペンの量は、採取された組織中のそのテルペンの濃度のことを指す。
ある局面では、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または大麻植物は、異種プロモーターに機能的に連結されているポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子であって、ポリペプチドが、同等条件下で生育させたときの導入遺伝子または改変を欠く対照タバコ植物または大麻植物と比較して平均毛状突起密度の増加を引き起こす、組換え核酸分子をさらに含む。平均毛状突起密度を増加させるために過剰発現され得る遺伝子の非限定的な例は、NtGIS、NtMYB86、NbGIS、大麻MYB61、大麻GIS3、および大麻非特異的脂質輸送タンパク質1様を含む。
カンナビノイド
カンナビノイドは、カンナビス（Cannabis）植物に見いだされる天然に存在する化合物である。多くのカンナビノイドは、腺毛状突起において産生される樹脂中に濃縮されており、少なくとも113のカンナビノイドが知られている。2つの主要なカンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール（THC）およびカンナビジオール（CBD）であるが、100を超えるさらなるカンナビノイドが特定されている。CBDは、植物樹脂抽出物のおよそ40％を構成する。
カンナビノイドは、特異的なカンナビノイド受容体と相互作用することによりその効果を発揮する。ヒトにおける2つの主要な種類のカンナビノイド受容体は、カンナビノイド受容体1型（CB1）およびカンナビノイド受容体2型（CB2）である。
ある局面では、異種ポリヌクレオチドは、カンナビノイドの生合成に関与する。天然のカンナビノイドにはいくつかの主要なクラスがある。カンナビス植物由来のカンナビノイドは、フィトカンナビノイドと称される。カンナビゲロール型（CBG）化合物に由来するすべてのクラスは、この前駆体が環化される様式に主に違いがある。
ある局面では、カンナビノイドは、カンナビゲロール型（CBG）カンナビノイド、カンナビクロメン型（CBC）カンナビノイド、カンナビジオール型（CBD）カンナビノイド、テトラヒドロカンナビノール型（THC）カンナビノイド、カンナビノール型（CBN）カンナビノイド、カンナビノジオール型（CBDL）カンナビノイド、カンナビエルソイン型（CBE）カンナビノイド、イソ-テトラヒドロカンナビノール型（イソ-THC）カンナビノイド、カンナビシクロール型（CBL）カンナビノイド、およびカンナビトリオール型（CBT）カンナビノイドからなる群より選択される。
カンナビゲロール（CBG）は、カンナビス・サティバに存在する主要なフィトカンナビノイドの1つである。CBGは、他のカンナビノイドが合成される親分子であるカンナビゲロール酸の非酸性形態である。カンナビクロメン（CBC）は、非精神活性カンナビノイドである。CBCは、カンナビクロム、カンナビクロメン、ペンチルカンナビクロメン、またはカンナビノクロメンとも呼ばれる。
カンナビジオール（CBD）は、大麻の樹脂質の花に見いだされる天然に存在する化合物である。CBDは、カンナビス植物の抽出物の最大40％を占める主要なフィトカンナビノイドであり、エンドカンナビノイド系の多種多様な生理学的標的に結合する。テトラヒドロカンナビノール（THC）は、デルタ-9-テトラヒドロカンナビノールとしても知られている。いくつかの大麻植物は、ごく少量のTHCを含有し、「産業用ヘンプ」と見なされる。
カンナビノール（CBN）は、カンナビスにおいて微量にしか見いだされない弱精神活性カンナビノイドであり、多くの場合、年数を経たカンナビスに見いだされる。THCは、長期間経過後にCBNへと分解する。THCからCBNへの分解は、乾燥植物物質が酸素および熱に曝露されることによって加速され得る。カンナビノジオール（CBDL）は、CBDの完全に芳香族化された抽出物である。CBDLは、カンナビス・サティバに低濃度で存在する精神活性カンナビノイドである。
カンナビエルソイン（CBE）は、CBDから生じる非精神活性カンナビノイド代謝物である。カンナビシクロール（CBL）は、カンナビスに見いだされる非精神活性カンナビノイドである。カンナビクロメンは、自然放射線によりまたは酸性条件下でCBLへと分解する。カンナビトリオールCBTは、大麻中に常に検出されるわけではないカンナビノイドであるが、検出可能であるとき、CBTは低濃度で存在することが多い。CBTは、THCと構造的に類似する。現在のところ、9種類の既知のCBTがある。
ある局面では、カンナビス由来カンナビノイド、またはフィトカンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール、テトラヒドロカンナビノール酸、カンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビノール、カンナビゲロール、カンナビクロメン、カンナビシクロール、カンナビバリン、テトラヒドロカンナビバリン、カンナビジバリン、カンナビクロムバリン、カンナビゲロバリン、カンナビゲロールモノメチルエーテル、カンナビエルソイン、およびカンナビシトランからなる群より選択される。
本明細書において使用される場合、「テトラヒドロカンナビノール」（「THC」）は、化学式：C21H30O2およびIUPAC名：(-)-(6aR,10aR)-6,6,9-トリメチル-3-ペンチル-6a,7,8,10a-テトラヒドロ-6H-ベンゾ[c]クロメン-1-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「テトラヒドロカンナビノール酸」（「THCA」または「2-COOH-THC」）は、化学式：C22H30O4を有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビジオール」（「CBD」）は、化学式：C21H30O2、分子量：314.469g/mol、およびIUPAC名：2-[(1R,6R)-3-メチル-6-(プロパ-1-エン-2-イル)シクロヘキサ-2-エン-1-イル]-5-ペンチルベンゼン-1,3-ジオールを有する有機化合物のことを指す。それは、カンナビジオール酸前駆体から脱炭酸に続いて形成される21炭素テルペノフェノール化合物であるが、合成により生産することもできる。CBDは、通常、天然に存在する(-)-鏡像異性体を指すとされる。(+)CBDは、合成されている。
本明細書において使用される場合、「カンナビジオール酸」（「CBDA」）は、化学式：C22H30O4およびIUPAC名：2,4-ジヒドロキシ-3-[(1R,6R)-3-メチル-6-プロパ-1-エン-2-イルシクロヘキサ-2-エン-1-イル]-6-ペンチル安息香酸を有する有機化合物のことを指す。
植物では、THCおよびCBDは、それぞれ、それらの酸性前駆体であるTHCAおよびCBDAから生じ、これらの前駆体は、共にカンナビゲロール酸（CBGA）から生じる。最終生合成工程が異なり、それぞれ、CBGAから、THCAシンターゼがTHCAを産生し、CBDAシンターゼがCBDAを産生する。その後の光曝露、加熱または経時変化によるTHCAおよびCBDAの脱炭酸は、THCまたはCBDの生合成をもたらす。THCAシンターゼは、CBGAのモノテルペン部分の酸化的環化を触媒してTHCAを形成する。CBDAシンターゼは、CBGAのモノテルペン部分の酸化的環化を触媒してCBDAを形成する。THCは、非酵素的脱炭酸によってTHCAから作製される。CBDは、非酵素的脱炭酸によってCBDAから作製される。
本明細書において使用される場合、「カンナビノール」は、化学式：C21H26O2およびIUPAC名：6,6,9-トリメチル-3-ペンチルベンゾ[c]クロメン-1-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビゲロール」は、化学式：C21H32O2およびIUPAC名：2-[(2E)-3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエニル]-5-ペンチルベンゼン-1,3-ジオールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビクロメン」は、化学式：C21H30O2およびIUPAC名：2-メチル-2-(4-メチルペンタ-3-エニル)-7-ペンチルクロメン-5-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビシクロール」は、化学式：C21H30O2およびIUPAC名：9,13,13-トリメチル-5-ペンチル-8-オキサテトラシクロ[7.4.1.0.0]テトラデカ-2,4,6-トリエン-3-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビバリン」は、化学式：C19H22O2およびIUPAC名：6,6,9-トリメチル-3-プロピルベンゾ[c]クロメン-1-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「テトラヒドロカンナビバリン」は、化学式：C19H26O2およびIUPAC名：(6aR,10aR)-6,6,9-トリメチル-3-プロピル-6a,7,8,10a-テトラヒドロベンゾ[c]クロメン-1-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビジバリン」は、化学式：C19H26O2およびIUPAC名：2-[(1R,6R)-3-メチル-6-プロパ-1-エン-2-イルシクロヘキサ-2-エン-1-イル]-5-プロピルベンゼン-1,3-ジオールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビクロムバリン」は、化学式：C19H26O2およびIUPAC名：2-メチル-2-(4-メチルペンタ-3-エニル)-7-プロピルクロメン-5-オールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビゲロバリン」は、化学式：C19H28O2およびIUPAC名：2-[(2E)-3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエニル]-5-プロピルベンゼン-1,3-ジオールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビゲロールモノメチルエーテル」は、化学式：C22H28O2およびIUPAC名：1-メトキシ-6,6,9-トリメチル-3-ペンチルベンゾ[c]クロメンを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビエルソイン」は、化学式：C21H30O3およびIUPAC名：(5aS,6S,9R,9aR)-6-メチル-3-ペンチル-9-プロパ-1-エン-2-イル-7,8,9,9a-テトラヒドロ-5aH-ジベンゾフラン-1,6-ジオールを有する有機化合物のことを指す。
本明細書において使用される場合、「カンナビシトラン」は、化学式：C21H30O2およびIUPAC名：1,5,5-トリメチル-9-ペンチル-6,15-ジオキサテトラシクロ[9.3.1.0.0]ペンタデカ-7(12),8,10-トリエンを有する有機化合物のことを指す。
プロモーター
当技術分野において一般的に理解されているように、「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼ結合部位、転写開始部位および／またはTATAボックスを含有し、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列および／または遺伝子（または導入遺伝子）の転写および発現を支援または促進する、DNA配列のことを指す。プロモーターは、公知のまたは天然に存在するプロモーター配列または他のプロモーター配列から、合成により生産され得るか、それから変更され得るか、またはそれに由来し得る。プロモーターはまた、2つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターを含むこともできる。したがって、本出願のプロモーターは、公知のまたは本明細書に提供される他のプロモーター配列と組成は類似するが同一ではない、プロモーター配列のバリアントを含むことができる。
一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。
プロモーター配列の断片が、機能的に連結されている核酸分子の転写を駆動するように機能できることが当技術分野において認識される。例えば、限定されないが、1000bpのプロモーターが500bpに短縮され、その500bpの断片が転写を駆動可能である場合、その500bpの断片は、「機能的断片」と称される。
ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも92.5％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも95％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも96％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも97％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも98％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも99％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも99.9％同一である核酸配列を含む。ある局面では、異種プロモーターは、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して100％同一である核酸配列を含む。
植物の全組織または大部分の組織において発現を駆動するプロモーターは、「構成的」プロモーターと称される。ある局面では、構成的プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、オピンプロモーター、グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターからなる群より選択される。
発生のある特定の期間または段階の間に発現を駆動するプロモーターは、「発生的」プロモーターと称される。
生物のある特定の組織において生物の他の組織と比べて増強された発現を駆動するプロモーターは、「組織優先型（tissue-preferred）」プロモーターと称される。したがって、「組織優先型」プロモーターは、植物の特定の組織において比較的高いまたは優先的な発現を引き起こすが、植物の他の組織における発現レベルはより低い。非限定的な例として、毛状突起組織優先型プロモーターは、毛状突起においてより高い活性を示すが、より低いレベルではあるものの、茎、葉および花組織などのさらなる組織においても活性を示し得る。「組織特異的」プロモーターは、特定の組織においてのみ発現を引き起こす。非限定的な例として、毛状突起組織特異的プロモーターは、毛状突起においてのみ発現を駆動する。ある局面では、組織特異的プロモーターは、毛状突起組織特異的プロモーターである。別の局面では、組織優先型プロモーターは、毛状突起組織優先型プロモーターである。
ある局面では、プロモーターは、シクラーゼプロモーター、プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ（PSO）プロモーター、およびリブロースビリン酸カルボキシラーゼプロモーターからなる群より選択される。
ある局面では、本開示は、組織優先型プロモーターが毛状突起優先プロモーターを含む、改変されたタバコ植物、タバコ種子、またはその部分を提供する。ある局面では、本開示は、組織特異的プロモーターが毛状突起特異的プロモーターを含む、改変されたタバコ植物、タバコ種子、またはその部分を提供する。ある局面では、本開示は、組織優先型プロモーターまたは組織特異的プロモーターが、毛状突起優先プロモーターまたは毛状突起特異的プロモーターを含む、改変されたタバコ植物、タバコ種子、またはその部分を提供する。ある局面では、毛状突起特異的プロモーター配列は、SEQ ID NO：104～111および206～208からなる群より選択される。ある局面では、毛状突起優先プロモーター配列は、SEQ ID NO：104～111および206～208からなる群より選択される。
「誘導性」プロモーターは、熱、寒冷、日照り、光などの環境刺激、または創傷もしくは化学薬品の適用などの他の刺激に応答して転写を開始するプロモーターである。
ある局面では、本明細書に提供されるプロモーターは、構成的プロモーターである。別の局面では、本明細書に提供されるプロモーターは、誘導性プロモーターである。さらなる局面では、本明細書に提供されるプロモーターは、発生的プロモーターである。別の局面では、プロモーターは、組織優先型または組織特異的プロモーターである。さらなる局面では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織優先型プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択される。
ある局面では、本開示は、異種プロモーターを提供する。別の局面では、本開示は、異種ポリヌクレオチドに機能的に連結されているプロモーターを提供する。別の局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されているポリヌクレオチド配列を提供する。
本明細書において使用される場合、「機能的に連結されている」は、2つ以上の要素間の機能的連結のことを指す。例えば、関心対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の機能的連結は、関心対象のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な関係性である。機能的に連結されている要素は、連続的であっても非連続的であってもよい。ある局面では、本明細書に提供されるプロモーターは、異種核酸分子に機能的に連結されている。
植物
ある局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分を提供する。
ある局面では、本開示は、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分を提供する。
ある局面では、本明細書に提供される植物は、改変された植物である。ある局面では、本明細書に提供される種子は、改変された種子である。ある局面では、本明細書に提供される植物部分は、改変された植物部分である。本明細書において使用される場合、植物、種子または植物部分との関連での「改変された」は、ある特定の目的のために導入され、自然多型の域を超える遺伝子変異を含む、植物、種子または植物部分のことを指す。限定されないが、改変された植物、種子または植物部分は、組換え核酸分子を含む。別の局面では、改変された植物、種子または植物部分は、遺伝子改変を含む。ある局面では、改変された植物、種子または植物部分は、トランスジェニックである。
カンナビス栽培品種は、娯楽目的の大麻を生産するために生育される植物から、植物の茎に由来する麻繊維（例えば、産業用ヘンプ）を使用するために生産される植物まで広範囲に及ぶ。娯楽目的で利用される栽培品種では、喫煙および経口投与に使用される乾燥させた雌花序において、THC量がCBD量を超える。産業用ヘンプ栽培品種は、実質的により低いレベルのTHCおよびより高いレベルのCBDを産生する。
カンナビスという植物の属は、C. サティバ種、C. インディカ種、およびC. ルデラリス種を包含する。カンナビスに適用される別の分類スキームは、化学分類学的な分類体系である。大麻には5つの化学分類学的タイプがある：高レベルのTHCを持つもの、高レベルのCBDを持つもの、同等レベルのTHCおよびCBDを有するもの、高レベルのCBGを持つもの、ならびに低～検出可能でないカンナビノイドを持つもの。
遺伝的特性に加えて、栽培大麻植物は、そのライフサイクル中の環境条件および生産技術によって影響を受ける。産業用ヘンプ中のTHCおよびCBDの含有量への周囲温度および湿度、土壌温度ならびに降水量の影響を評価する研究は、これらの農業気候条件が、THCおよびCBDに異なる影響を及ぼすことを述べている。例えば、CBD含有量は、土壌温度および周囲温度により良い影響を受けるが、降水量により悪影響を受ける。例えば、Sikora, V., et al., 2011, Genetika, 43(3):449-456を参照されたい。
ある局面では、植物は、タバコ植物である。ある局面では、植物は、ニコチアナ（Nicotiana）植物である。ある局面では、タバコ植物は、ニコチアナ・タバカム植物である。
ある局面では、ニコチアナ植物、種子または植物部分は、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）PI 271989；ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）PI 555478；ニコチアナ・ビゲロヴィー（Nicotiana bigelovii）PI 555485；ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）；ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）PI 224063；ニコチアナ・グルチノーサ（Nicotiana glutinosa）PI 555507；ニコチアナ・グッドスピーディ（Nicotiana goodspeedii）PI 241012；ニコチアナ・ゴッセイ（Nicotiana gossei）PI 230953；ニコチアナ・ヘスペリス（Nicotiana hesperis）PI 271991；ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）PI 555527；ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）PI 555535；ニコチアナ・メガロシホン（Nicotiana megalosiphon）PI 555536；ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）PI 555540；ニコチアナ・パニキュラータ（Nicotiana paniculata）PI 555545；ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）PI 555548；ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）PI 555552；ニコチアナ・ラスティカ（Nicotiana rustica）；ニコチアナ・スアベオレンス（Nicotiana suaveolens）PI 230960；ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）PI 555569；ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）PI 266379；ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）；およびニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）PI 555572からなる群より選択される。
ある局面では、植物は、大麻植物（cannabis plant）である。ある局面では、植物は、カンナビス植物（Cannabis plant）である。ある局面では、大麻植物は、カンナビス・サティバ（Cannabis sativa）植物である。ある局面では、大麻植物は、カンナビス・インディカ（Cannabis indica）植物である。ある局面では、大麻植物は、カンナビス・ルデラリス（Cannabis ruderalis）植物である。ある局面では、大麻植物は、カンナビス・サティバ、カンナビス・インディカ、およびカンナビス・ルデラリスからなる群より選択される。
ある局面では、大麻植物は、THC/CBDの比に基づいて化学種または化学分類学的グループに分けられ得る。ある局面では、THC/CBDの比は、所与の大麻植物内のTHCおよびCBDの相対レベルに基づく。THC/CBD比が1.0より大きい大麻植物は、高レベルのTHCを有する。THC/CBD比がおよそ1.0の大麻植物は、同等レベルのTHCおよびCBDを有する。THC/CBD比が1.0より小さい大麻植物は、高レベルのCBDを有する。
ある局面では、大麻植物は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのTHCを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのCBDを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物は、同等レベルのTHCおよびCBDを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのCBGを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物は、低～検出可能でないカンナビノイドを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。
ある局面では、大麻植物、植物部分、または種子は、低～検出可能でないレベルのTHCを含む。ある局面では、大麻植物、植物部分、または種子は、低～検出可能でないレベルのCBDを含む。ある局面では、大麻植物、植物部分、または種子は、低～検出可能でないレベルのCBGを含む。
ある局面では、種子は、タバコ種子である。ある局面では、種子は、ニコチアナ種子である。ある局面では、タバコ種子は、ニコチアナ・タバカム種子である。
ある局面では、種子は、大麻種子（cannabis seed）である。ある局面では、種子は、カンナビス種子（Cannabis seed）である。ある局面では、大麻種子は、カンナビス・サティバ種子である。ある局面では、大麻種子は、カンナビス・インディカ種子である。ある局面では、大麻種子は、カンナビス・ルデラリス種子である。ある局面では、大麻種子は、カンナビス・サティバ、カンナビス・インディカ、およびカンナビス・ルデラリスからなる群より選択される。
ある局面では、大麻種子は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのTHCを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻種子は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのCBDを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻種子は、同等レベルのTHCおよびCBDを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻種子は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのCBGを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻種子は、低～検出可能でないカンナビノイドを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。
ある局面では、植物部分は、タバコ植物部分である。ある局面では、植物部分は、ニコチアナ植物部分である。ある局面では、タバコ植物部分は、ニコチアナ・タバカム植物部分である。
ある局面では、植物部分は、大麻植物部分（cannabis plant part）である。ある局面では、植物部分は、カンナビス植物部分（Cannabis plant part）である。ある局面では、大麻植物部分は、カンナビス・サティバ植物部分である。ある局面では、大麻植物部分は、カンナビス・インディカ植物部分である。ある局面では、大麻植物部分は、カンナビス・ルデラリス植物部分である。ある局面では、大麻植物部分は、カンナビス・サティバ、カンナビス・インディカ、およびカンナビス・ルデラリスからなる群より選択される。
ある局面では、大麻植物部分は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのTHCを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物部分は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのCBDを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物部分は、同等レベルのTHCおよびCBDを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物部分は、他の評価されたカンナビノイドと比べて高レベルのCBGを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。ある局面では、大麻植物部分は、低～検出可能でないカンナビノイドを含む化学分類学的タイプに位置付けられる。
ある局面では、提供される植物部分は、葉、茎、根、毛状突起、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、莢、胚、胚乳、外植体、カルス、組織培養物、芽、細胞、およびプロトプラストを含むが、それらに限定されない。ある局面では、植物部分は、種子を含まない。ある局面では、本開示は、生殖物質ではなくかつ植物の自然生殖を媒介しない、植物細胞、組織および器官を提供する。別の局面では、本開示はまた、生殖物質でありかつ植物の自然生殖を媒介する、植物細胞、組織および器官も提供する。別の局面では、本開示は、光合成を介して自らを維持できない植物細胞、組織および器官を提供する。別の局面では、本開示は、体細胞性の植物細胞を提供する。体細胞は、生殖系細胞とは対照的に、植物生殖を媒介しない。
細胞、組織および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、胚乳、根、芽、茎、毛状突起、莢、花、花序、柄、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、萼、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、維管束組織由来であることができる。別の局面では、本開示は、植物葉緑体を提供する。さらなる局面では、本開示は、表皮細胞、ストーマ細胞、葉もしくは根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の局面では、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。別の局面では、本開示は、大麻プロトプラストを提供する。
当業者は、タバコおよび大麻植物が、無性生殖または栄養繁殖を介するのではなく、種子を介して自然生殖することを理解する。ある局面では、本開示は、植物胚乳を提供する。
本開示は、本明細書に提供される植物由来の細胞を提供する。
本明細書において使用される場合、「後代植物」または「後代種子」は、任意の雑種世代、例えば、F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7など由来であることができる。
ある局面では、タバコ植物、種子または植物部分は、熱風乾燥品種（flue cured variety）、ブライト品種（bright variety）、バーレー品種（Burley variety）、バージニア品種（Virginia variety）、メリーランド品種（Maryland variety）、ダーク品種（dark variety）、ガルパオ品種（Galpao variety）、オリエンタル品種（Oriental variety）、およびトルコ品種（Turkish variety）からなる群より選択されるタバコ品種のものである。
ある局面では、タバコ細胞は、熱風乾燥品種、ブライト品種、バーレー品種、バージニア品種、メリーランド品種、ダーク品種、ガルパオ品種、オリエンタル品種、およびトルコ品種からなる群より選択されるタバコ品種のものである。
ある局面では、タバコ葉は、熱風乾燥品種、ブライト品種、バーレー品種、バージニア品種、メリーランド品種、ダーク品種、ガルパオ品種、オリエンタル品種、およびトルコ品種からなる群より選択されるタバコ品種のものである。
ある局面では、乾燥タバコ葉または植物部分は、熱風乾燥品種、ブライト品種、バーレー品種、バージニア品種、メリーランド品種、ダーク品種、ガルパオ品種、オリエンタル品種、およびトルコ品種からなる群より選択されるタバコ品種のものである。当業者は、乾燥タバコが、生物の構成要素となることがなく、生育または生殖することができないことをさらに理解する。
熱風乾燥タバコ（「バージニア」または「ブライト」タバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ生産のおよそ40％を占める。熱風乾燥タバコは、しばしば、乾燥の間に到達する金色を帯びた黄色～濃い橙色のため、「ブライトタバコ」とも称される。熱風乾燥タバコは、軽快で華やかな芳香および香気を有する。熱風乾燥タバコは、一般的に、糖分が多く油分が少ない。主な熱風乾燥タバコ栽培国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニアおよび米国である。一局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表2に列挙される品種からなる群より選択される熱風乾燥タバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。WO 2004/041006 A1を参照されたい。さらなる局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、K326、K346、およびNC196からなる群より選択される熱風乾燥品種中のものである。
（表２）熱風乾燥タバコ品種
Figure 2024505755000009
Figure 2024505755000010
空気乾燥タバコは、「バーレー」、「メリーランド」および「ダーク」タバコを含む。空気乾燥タバコをつなぐ共通因子は、主として人工的な熱源および水分源なしに乾燥が行われることである。バーレータバコは、淡褐色～暗褐色であり、油分が多く糖分が少ない。バーレータバコは、典型的には、倉庫で空気乾燥される。主なバーレー栽培国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国を含む。
メリーランドタバコは、非常にふわふわしており、良好な燃焼特性、低ニコチンおよび中性的な香りを有する。主なメリーランド栽培国は、米国およびイタリアを含む。
一局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表3に列挙されるタバコ品種からなる群より選択されるバーレータバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。さらなる局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、TN 90、KT 209、KT 206、KT212、およびHB 4488からなる群より選択されるバーレー品種中のものである。
（表３）バーレータバコ品種
Figure 2024505755000011
別の局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表4に列挙されるタバコ品種からなる群より選択されるメリーランドタバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。
（表４）メリーランドタバコ品種
Figure 2024505755000012
暗色空気乾燥タバコは、主にその中褐色～暗褐色および異なる芳香を暗色空気乾燥タバコに与えるその乾燥プロセスによって、他のタバコタイプと区別される。暗色空気乾燥タバコは、主に、噛みタバコおよびスナッフの生産において使用される。一局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、スマトラ（Sumatra）、ジャティム（Jatim）、ドミニカンキューバノ（Dominican Cubano）、ベスキ（Besuki）、ワンサッカー（One sucker）、グリーンリバー（Green River）、天日乾燥バージニア（Virginia sun-cured）、およびパラグアンパッサード（Paraguan Passado）からなる群より選択される暗色空気乾燥タバコ品種、ならびに前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。
暗色火力乾燥タバコは、一般的に、密閉された乾燥倉庫の床上での低燃焼木材の火で乾燥させる。暗色火力乾燥タバコは、典型的には、パイプブレンド、シガレット、噛みタバコ、スナッフ、および味が強い葉巻を製造するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主な栽培地域は、米国のテネシー州、ケンタッキー州およびバージニア州である。一局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表5に列挙されるタバコ品種からなる群より選択される暗色火力乾燥タバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。
（表５）暗色火力乾燥タバコ品種
Figure 2024505755000013
オリエンタルタバコは、典型的にはトルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリアおよびルーマニアなどの東地中海地方で栽培されていることから、ギリシャ・ローマ・トルコ（Greek, aroma and Turkish）タバコとも称される。オリエンタルタバコ品種の小さな植物サイズ、小さな葉サイズ、および特有の芳香特性は、痩せた土壌およびストレスの多い気候条件の中で進化してきたその適応の結果である。一局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表6に列挙されるタバコ品種からなる群より選択されるオリエンタルタバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。
（表６）オリエンタルタバコ品種
Figure 2024505755000014
ある局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表7に列挙されるタバコ品種からなる群より選択される葉巻タバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。
（表７）葉巻タバコ品種
Figure 2024505755000015
ある局面では、本明細書に提供されるタバコ植物、種子または植物部分は、表8に列挙されるタバコ品種からなる群より選択されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種のものである。
（表８）他のタバコ品種
Figure 2024505755000016
ある局面では、タバコ植物または植物部分は、表2、表3、表4、表5、表6、表7および表8に列挙されるタバコ品種からなる群より選択される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表2に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表3に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表4に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表5に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表6に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表7に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ植物または植物部分は、表8に列挙される品種由来である。
ある局面では、タバコ種子は、表2、表3、表4、表5、表6、表7および表8に列挙されるタバコ品種からなる群より選択される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表2に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表3に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表4に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表5に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表6に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表7に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ種子は、表8に列挙される品種由来である。
ある局面では、タバコ細胞は、表2、表3、表4、表5、表6、表7および表8に列挙されるタバコ品種からなる群より選択される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表2に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表3に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表4に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表5に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表6に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表7に列挙される品種由来である。別の局面では、タバコ細胞は、表8に列挙される品種由来である。
熱風乾燥、暗色空気乾燥、バーレー、メリーランド、暗色火力乾燥、葉巻、またはオリエンタルタイプの前述の特定の品種はすべて、例示的な目的でのみ列記される。任意のさらなる熱風乾燥、暗色空気乾燥、バーレー、メリーランド、暗色火力乾燥、葉巻、またはオリエンタル品種も、本出願において想定される。
ある局面では、本明細書に提供される植物または品種は、同系交配植物または品種である。本明細書において使用される場合、「同系交配」品種は、遺伝的等質性のために繁殖された品種である。
本明細書において使用される場合、「ハイブリッド」は、子孫がそれぞれの親由来の遺伝物質を含むように、異なる品種または種由来の2つの植物を交雑させることによって産出される。当業者は、より高次のハイブリッドも同様に作出できることを認識する。例えば、第1のハイブリッドは、品種Cを品種Dと交雑してC×Dハイブリッドを産出させることによって作製することができ、第2のハイブリッドは、品種Eを品種Fと交雑してE×Fハイブリッドを産出させることによって作製することができる。第1および第2のハイブリッドをさらに交雑して、4つの親品種のすべての遺伝情報を含むより高次のハイブリッド（C×D）×（E×F）を産出させることができる。ある局面では、本明細書に提供される植物または種子は、ハイブリッド植物または種子である。
ある局面では、本明細書に提供されるタバコ植物は、同系交配タバコ植物である。ある局面では、本明細書に提供されるタバコ種子は、同系交配タバコ種子である。ある局面では、本明細書に提供されるタバコ植物は、ハイブリッドタバコ植物である。別の局面では、本明細書に提供されるタバコ種子は、ハイブリッドタバコ種子である。
ある局面では、本明細書に提供される大麻植物は、同系交配大麻植物である。ある局面では、本明細書に提供される大麻種子は、同系交配大麻種子である。ある局面では、本明細書に提供される大麻植物は、ハイブリッド大麻植物である。別の局面では、本明細書に提供される大麻種子は、ハイブリッド大麻種子である。
特に指定のない限り、対照植物とのすべての比較は、2つの植物が比較されるために類似の生育条件または同等の生育条件を必要とする。本明細書において使用される場合、「同等条件下で生育させた」、「類似の生育条件」または「同等の生育条件」は、2つ以上の植物遺伝子型間での生育および有意義な比較のための類似の環境条件および／または農耕法であって、2つ以上の植物遺伝子型間で観察される相違に寄与することも、それを説明することもないような、環境条件および／または農耕法のことを指す。環境条件は、例えば、光、温度、水分（湿気）、および栄養（例えば、窒素およびリン）を含む。農耕法は、例えば、播種、刈込み、下部切取り、植付け、摘心、および株分けを含む。Chapters 4B and 4C of Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford (1999), pp 70-103を参照されたい。同じくAmaducci et al. Field Crops Research, 107:161-169 (2008)も参照されたい。本明細書において使用される場合、「対照植物」は、改変された植物に導入された本明細書に提供される非天然変異または組換えDNA以外は、比較されている改変された植物と同一またはほぼ同一の遺伝子構造の植物のことを指す。
ある局面では、第1の植物品種および第2の植物品種は、同じ品種である。ある局面では、第1の植物品種および第2の植物品種は、2つの異なる品種である。ある局面では、第2の植物品種は、組換え核酸分子を含む。
ある局面では、第1の植物品種は、組換え核酸分子についてヘテロ接合性である。ある局面では、第1の植物品種は、組換え核酸分子についてヘミ接合性である。ある局面では、第1の植物品種は、組換え核酸分子についてホモ接合性である。ある局面では、第2の植物品種は、組換え核酸分子についてヘテロ接合性である。ある局面では、第2の植物品種は、組換え核酸分子についてヘミ接合性である。ある局面では、第2の植物品種は、組換え核酸分子についてホモ接合性である。ある局面では、後代種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてヘテロ接合性である。ある局面では、後代種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてヘミ接合性である。ある局面では、後代種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてホモ接合性である。
ある局面では、第1の植物品種は、タバコ植物品種である。ある局面では、第2の植物品種は、タバコ植物品種である。
ある局面では、第1の植物品種は、大麻植物品種である。ある局面では、第2の植物品種は、大麻植物品種である。
本明細書において使用される場合、「交雑する」という用語は、2つの植物の意図的な交配のことを指す。ある局面では、交雑することは、第1の植物の第2の植物による授粉および／または受精を含む。交雑されている2つの植物は、遠い関係にある、近い関係にある、または同一であることができる。ある局面では、交雑されている2つの植物は、共に改変された植物である。ある局面では、交雑されている2つの植物は、同じ品種のものである。ある局面では、交雑されている2つの植物は、2つの異なる品種のものである。ある局面では、交雑されている2つの植物の一方は、雄性不稔である。ある局面では、交雑されている2つの植物の一方は、雌性不稔である。ある局面では、交雑されている2つの植物の少なくとも一方は、ハイブリッドタバコ植物である。ある局面では、交雑されている2つの植物の少なくとも一方は、ハイブリッド大麻植物である。ある局面では、交雑されている2つの植物の少なくとも一方は、改変された植物である。
ある局面では、第1の品種の植物は、交雑工程において雄親である。ある局面では、第1の品種の植物は、交雑工程において雌親である。ある局面では、第2の品種の植物は、交雑工程において雄親である。ある局面では、第2の品種の植物は、交雑工程において雌親である。
ある局面では、本明細書に提供される植物または品種は、雄性不稔である。別の局面では、本明細書に提供される植物または品種は、細胞質雄性不稔（CMS）である。雄性不稔植物は、当技術分野において公知の任意の方法によって生産することができる。雄性不稔タバコを生産する方法は、Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 in: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y. 761 ppに記載されている。ロデリゼーションおよびエチレン発生を低下させるために開花後に雌性大麻植物にコロイド銀を毎日噴霧するなどのプロセスを記載している、kush[dot]com/blog/feminized-cannabis-seeds-all-you-need-to-knowも参照されたい。
別の局面では、本明細書に提供される植物または品種は、雌性不稔である。非限定的な例として、雌性不稔植物は、STIG1遺伝子を変異させることによって作製することができる。例えば、Goldman et al. 1994, EMBO Journal 13:2976-2984を参照されたい。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変されたタバコ植物を生産する方法を提供する：（a）組換え核酸分子を少なくとも1つのタバコ細胞に導入する工程であって、組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されているテルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、工程；（b）組換え核酸分子を含む少なくとも1つのタバコ細胞を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコ細胞から、改変されたタバコ植物を再生させる工程であって、改変されたタバコ植物が、同等条件下で生育させたときの組換え核酸分子を欠く対照タバコ植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変された大麻植物を生産する方法を提供する：（a）組換え核酸分子を少なくとも1つの大麻細胞に導入する工程であって、組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されているテルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、工程；（b）組換え核酸分子を含む少なくとも1つの大麻細胞を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つの大麻細胞から、改変された大麻植物を再生させる工程であって、改変された大麻植物が、同等条件下で生育させたときの組換え核酸分子を欠く対照大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
形質転換
植物細胞に組換えDNA構築物を導入するための数多くの方法が、当技術分野において公知であり、これらを本出願の方法に従って使用して、トランスジェニック植物細胞および植物を生産することができる。当技術分野において公知の植物細胞の形質転換のための任意の好適な方法または技法を、本方法に従って使用することができる。植物の形質転換のための有効な方法は、細菌によって媒介される形質転換、例えば、アグロバクテリウム媒介またはリゾビウム媒介形質転換、および微粒子銃媒介形質転換を含む。例えば、Feeney and Punja, In Vitro Cell. and Dev. Biol. - Plant, 39:578-585 (2003)を参照されたい。細菌によって媒介される形質転換または微粒子銃を介して形質転換ベクターで外植体を形質転換し、その後、続いて、それらの外植体を培養などしてトランスジェニック植物を再生または発生させるために、多様な方法が当技術分野において公知である。植物形質転換のための他の方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、減圧浸潤、加圧、超音波処理、炭化ケイ素繊維撹拌、ポリエチレングリコール（PEG）媒介形質転換なども、当技術分野において公知である。これらの形質転換法によって生産されたトランスジェニック植物は、使用される方法および外植体に応じて形質転換事象についてキメラまたは非キメラであり得る。
植物細胞を形質転換する方法は、当業者によく知られている。例えば、組換えDNAで被覆された粒子を用いた微粒子銃によって植物細胞を形質転換（例えば、バイオリステック形質転換）するための具体的教示が、米国特許第5,550,318号；同第5,538,880号、同第6,160,208号；同第6,399,861号；および同第6,153,812号に見いだされ、アグロバクテリウム媒介形質転換が、米国特許第5,159,135号；同第5,824,877号；同第5,591,616号；同第6,384,301号；同第5,750,871号；同第5,463,174号；および同第5,188,958号に記載されており、それらのすべてが参照により本明細書に組み入れられる。植物を形質転換するためのさらなる方法については、例えば、Compendium of Transgenic Crop Plants (2009) Blackwell Publishingに見いだすことができる。本明細書に提供される核酸分子のいずれかでタバコまたは大麻細胞を形質転換するために、当業者に公知の任意の適切な方法を使用することができる。
ある局面では、本開示は、タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法を提供する。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含むタバコまたは大麻植物を生産するための方法を提供する：（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、工程；および（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が組換え核酸分子を含む、工程。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法を提供する：（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く第1のタバコまたは大麻品種の対照タバコまたは大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、工程；および（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が少なくとも1つの非天然変異を含む、工程。
ある局面では、タバコまたは大麻細胞に核酸分子を導入する方法は、アグロバクテリウム媒介形質転換を含む。別の局面では、タバコまたは大麻細胞に核酸分子を導入する方法は、PEG媒介形質転換を含む。別の局面では、タバコまたは大麻細胞に核酸分子を導入する方法は、バイオリステック形質転換を含む。別の局面では、タバコまたは大麻細胞に核酸分子を導入する方法は、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）を含む。別の局面では、タバコまたは大麻細胞に核酸分子を導入する方法は、レンチウイルストランスフェクションを含む。
リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787号；および同第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Transfectam（商標）およびLipofectin（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質は、国際公開WO 1991/017424および国際公開WO 1991/016024のものを含む。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであることができる。
稔性タバコ植物を再生できるあらゆるタバコ細胞が、本開示の実践のための有用な受容細胞として想定される。同様に、稔性大麻植物を再生できるあらゆる大麻細胞が、本開示の実践のための有用な受容細胞として想定される。
ある局面では、組換えDNA構築物は、タバコ細胞に導入される。ある局面では、組換えDNA構築物は、タバコプロトプラスト細胞に導入される。別の局面では、組換えDNA構築物は、タバコカルス細胞に導入される。ある局面では、組換えDNA構築物は、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、分裂組織細胞、胚細胞、胚乳細胞、根細胞、芽細胞、茎細胞、花細胞、花序細胞、柄細胞、小花柄細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花托細胞、花弁細胞、萼細胞、花粉細胞、葯細胞、花糸細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、および師部細胞からなる群より選択されるタバコ細胞に導入される。
ある局面では、組換えDNA構築物は、大麻細胞に導入される。ある局面では、組換えDNA構築物は、大麻プロトプラスト細胞に導入される。別の局面では、組換えDNA構築物は、大麻カルス細胞に導入される。ある局面では、組換えDNA構築物は、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、分裂組織細胞、胚細胞、胚乳細胞、根細胞、芽細胞、茎細胞、花細胞、花序細胞、柄細胞、小花柄細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花托細胞、花弁細胞、萼細胞、花粉細胞、葯細胞、花糸細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、および師部細胞からなる群より選択される大麻細胞に導入される。
カルスは、未熟胚または胚の部分、苗頂端分裂組織、小胞子などを含むがそれらに限定されない様々な組織供給源から開始することができる。カルスとして増殖可能なそれらの細胞は、形質転換のための受容細胞として役立つことができる。本開示のトランスジェニック植物を作製するための実践的な形質転換法および材料（例えば、様々な培地および受容標的細胞、未熟胚の形質転換、その後の稔性トランスジェニック植物の再生）は、例えば、米国特許6,194,636および6,232,526ならびに米国特許出願公開2004/0216189に開示されており、それらのすべてが参照により本明細書に組み入れられる。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法を提供する：（a）組換えDNA構築物を少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞に導入する工程であって、該組換えDNA構築物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、工程；（b）該組換えDNA構築物を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、少なくとも1つの改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの組換えDNA構築物を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの低減した量を含む、工程。
ある局面では、本開示は、タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、組換え核酸分子が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、方法を提供する。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法を提供する：（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換え核酸分子を含む、工程；および少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が組換え核酸分子を含む、工程。
変異
限定されないが、改変された植物は、非天然変異または組換えDNA構築物を含むことができる。ある局面では、改変されたタバコ植物は、非天然変異を含む。別の局面では、改変されたタバコ植物は、組換えDNA構築物を含む。別の局面では、改変されたタバコ植物は、遺伝子改変を含む。ある局面では、改変された大麻植物は、非天然変異を含む。別の局面では、改変された大麻植物は、組換えDNA構築物を含む。別の局面では、改変された大麻植物は、遺伝子改変を含む。
ある局面では、本開示は、以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法を提供する：（a）少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞において、テルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの非天然変異を誘導する工程；（b）工程（a）から少なくとも1つの非天然変異を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を選択する工程；および（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
本明細書において使用される場合、「変異」は、遺伝子の参照配列によってコードされる産物の発現または活性を変更するために遺伝子に導入される継承可能な遺伝子改変のことを指す。例えば、リモネンシンターゼ（LS）などのある特定の遺伝子の変異は、LS変異体と称される。そのような改変は、遺伝子の任意の配列領域、例えば、プロモーター、5'非翻訳領域（UTR）、エクソン、イントロン、3'-UTR、またはターミネーター領域におけるものであることができる。ある局面では、変異は、遺伝子産物の発現または活性を低下させる、阻害する、または排除する。別の局面では、変異は、遺伝子産物の発現または活性を増加させる、上昇させる、強化する、または増大する。
ある局面では、変異は、特定のタバコ品種または栽培品種に存在する自然多型性ではない。ある局面では、変異は、「非天然」または「天然に存在しない」変異である。本明細書において使用される場合、「非天然」または「天然に存在しない」変異は、ヒトの介在を介して作製される非自然発生変異のことを指し、ヒトの介在なしに作製される自然発生変異には当たらない。ヒトの介在の非限定的な例は、変異誘発（例えば、化学変異誘発、電離放射線変異誘発）および標的化遺伝子改変（例えば、CRISPRに基づく方法、TALENに基づく方法、ジンクフィンガーに基づく方法）を含む。非天然変異および天然に存在しない変異は、天然に生じる（例えば、植物の生殖系列における異常なDNA複製を介して）自然発生変異を含まない。
ある局面では、変異は、特定のタバコ品種または栽培品種に存在する自然多型性ではない。変異を特定する際、参照DNA配列は、同じタバコ品種由来であるべきことが認識されよう。例えば、変異を含む改変されたタバコ植物が、品種TN90由来である場合、内因性の参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、K326）由来の相同配列ではなく、内因性のTN90配列でなければならない。同様に、変異を含む改変されたタバコ細胞がTN90細胞である場合、内因性の参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、K326）由来のタバコ細胞に由来する相同配列ではなく、内因性のTN90配列でなければならない。
ある局面では、変異は、特定の大麻種、品種または栽培品種に存在する自然多型性ではない。変異を特定する際、参照DNA配列は、同じ大麻種、品種または栽培品種由来であるべきことが認識されよう。例えば、変異を含む改変された大麻植物が、C. インディカの一株である場合、内因性の参照配列は、異なる大麻種または株由来の相同配列（例えば、C. サティバまたはC. インディカの異なる株由来の配列）ではなく、対応する内因性のC. インディカ配列でなければならない。同様に、変異を含む改変された大麻細胞が、C. インディカ由来の細胞である場合、内因性の参照配列は、異なる大麻品種または種（例えば、サティバ株）由来の大麻細胞に由来する相同配列ではなく、対応する内因性のC. インディカ配列でなければならない。
ある局面では、タバコ植物、タバコ種子、またはその部分は、少なくとも1つの非天然変異についてホモ接合性である。別の局面では、タバコ植物、タバコ種子、またはその部分は、少なくとも1つの非天然変異についてヘテロ接合性である。ある局面では、タバコ植物、タバコ種子、またはその部分は、少なくとも1つの非天然変異についてヘミ接合性である。別の局面では、タバコ植物、タバコ種子、またはその部分は、導入された組換えDNA構築物についてホモ接合性である。別の局面では、タバコ植物、タバコ種子、またはその部分は、導入された組換えDNA構築物についてヘミ接合性である。さらなる局面では、タバコ植物、タバコ種子、またはその部分は、導入された組換えDNA構築物についてヘテロ接合性である。
ある局面では、大麻植物、大麻種子、またはその部分は、少なくとも1つの非天然変異についてホモ接合性である。別の局面では、大麻植物、大麻種子、またはその部分は、少なくとも1つの非天然変異についてヘテロ接合性である。ある局面では、大麻植物、大麻種子、またはその部分は、少なくとも1つの非天然変異についてヘミ接合性である。別の局面では、大麻植物、大麻種子、またはその部分は、導入された組換えDNA構築物についてホモ接合性である。別の局面では、大麻植物、大麻種子、またはその部分は、導入された組換えDNA構築物についてヘミ接合性である。さらなる局面では、大麻植物、大麻種子、またはその部分は、導入された組換えDNA構築物についてヘテロ接合性である。
ある局面では、タバコ種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてヘテロ接合性である。ある局面では、タバコ種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてヘミ接合性である。ある局面では、タバコ種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてホモ接合性である。
ある局面では、大麻種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてヘテロ接合性である。ある局面では、大麻種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてヘミ接合性である。ある局面では、大麻種子、またはそれから発芽した植物は、組換え核酸分子についてホモ接合性である。
ある局面では、本明細書に提供される変異は、変異遺伝子座のドミナント対立遺伝子を創出する。ドミナント対立遺伝子は、同じ遺伝子座で第2の対立遺伝子の寄与を消す対立遺伝子である。ドミナント対立遺伝子は、「ドミナントネガティブ対立遺伝子」または「ドミナントポジティブ対立遺伝子」であることができる。ドミナントネガティブ対立遺伝子、またはアンチモルフは、正常な対立遺伝子機能と反対に作用する対立遺伝子である。ドミナントネガティブ対立遺伝子は、典型的には、正常に機能せず、野生型タンパク質の活性を（例えば、二量体化を通じて）直接阻害するか、または野生型タンパク質の正常な機能に必要とされる第2のタンパク質（例えば、経路の活性化因子または下流成分）の活性を阻害するかのいずれかである。例えば、ドミナントネガティブ対立遺伝子は、ヘテロ接合性またはホモ接合状態の対立遺伝子の正常な機能を無効にするまたは低下させる。ドミナントポジティブ対立遺伝子は、正常な遺伝子機能を増加させる（例えば、ハイパーモルフ）または遺伝子に対して新たな機能を与える（例えば、ネオモルフ）ことができる。セミドミナント対立遺伝子は、対立遺伝子についてヘテロ接合性の個体における関連表現型の浸透率が、対立遺伝子についてホモ接合性の個体において観察されるものより小さいときに生じる。
ある局面では、本明細書に提供される変異は、変異遺伝子座のドミナントネガティブ対立遺伝子を創出する。別の局面では、本明細書に提供される変異は、変異遺伝子座のドミナントポジティブ対立遺伝子を創出する。
本明細書において使用される場合、変異を「誘導すること」は、ヒトの介在を介してポリヌクレオチド配列において変異を引き起こすことを指す。タバコおよび大麻において変異を誘導するための多くの好適な方法が、当技術分野において公知である。そのような方法の非限定的な例は、化学変異誘発物質の使用、放射線の使用、ヌクレアーゼの使用、トランスポゾンの使用、およびアグロバクテリウムの使用を含む。ある局面では、変異を誘導することは、化学変異誘発物質、放射線、トランスポゾン、アグロバクテリウム、およびヌクレアーゼからなる群より選択される作用物質の使用を含む。
ある局面では、変異を誘導することは、化学変異誘発物質の使用を含む。ある局面では、化学変異誘発物質は、メタンスルホン酸エチル（EMS）を含む。
別の局面では、変異を誘導することは、放射線の使用を含む。ある局面では、放射線は、ガンマ線、X線、電離放射線、または高速中性子を含む。
ある局面では、変異を誘導することは、トランスポゾンの使用を含む。別の局面では、変異を誘導することは、アグロバクテリウムの使用を含む。
さらなる局面では、変異を誘導することは、ヌクレアーゼの使用を含む。ある局面では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、CRISPR/Cpf1ヌクレアーゼ、CRISPR/CasXヌクレアーゼ、CRISPR/CasYヌクレアーゼ、およびCsm1ヌクレアーゼからなる群より選択される。ある局面では、変異を誘導することは、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの使用を含む。ある局面では、変異を誘導することは、CRISPR/Cpf1ヌクレアーゼの使用を含む。ある局面では、変異を誘導することは、CRISPR/CasXヌクレアーゼの使用を含む。ある局面では、変異を誘導することは、CRISPR/CasYヌクレアーゼの使用を含む。ある局面では、変異を誘導することは、Csm1ヌクレアーゼの使用を含む。
いくつかの種類の変異が当技術分野において公知である。ある局面では、変異は、挿入を含む。「挿入」は、所与のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列への、それぞれ、内因性の参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加のことを指す。別の局面では、変異は、欠失を含む。「欠失」は、所与のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する、それぞれ、内因性の参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の除去のことを指す。別の局面では、変異は、置換を含む。「置換」は、所与のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する、それぞれ、内因性の参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換わりのことを指す。別の局面では、変異は、逆位を含む。「逆位」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列のセグメントが末端間で反転する場合を指す。「重複」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列のセグメントが繰り返される場合を指す。繰り返しのセグメントは、元のセグメントのすぐ後に続き得るか、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸によって元のセグメントから分離され得る。ある局面では、本明細書に提供される変異は、挿入、欠失、置換、重複、および逆位からなる群より選択される変異を含む。
ある局面では、非天然変異は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される内因性核酸配列と比べた、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群より選択される変異を含む。
ある局面では、非天然変異は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする内因性核酸配列と比べた、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群より選択される変異を含む。
ある局面では、非天然変異は、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、少なくとも1つの変異を含む。本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」は、核酸配列によるアミノ酸配列に未成熟終止コドンを導入する、核酸配列に対する変異のことを指す。本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」は、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列内部に置換を引き起こす、核酸配列に対する変異のことを指す。本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」は、核酸配列をアミノ酸配列へ翻訳するためのフレームをシフトさせる、核酸配列に対する挿入または欠失のことを指す。「スプライス部位変異」は、イントロンがタンパク質翻訳のために保持されるようにするか、または代わりに、エクソンがタンパク質翻訳から除外される、核酸配列における変異のことを指す。スプライス部位変異は、ナンセンス、ミスセンス、またはフレームシフト変異を引き起こすことができる。
遺伝子のコーディング領域における変異（例えば、エクソン変異）は、変異したメッセンジャーRNA（mRNA）がタンパク質またはポリペプチドに翻訳されたときに、短縮したタンパク質またはポリペプチドをもたらすことができる。ある局面では、本開示は、タンパク質またはポリペプチドの短縮をもたらす変異を提供する。本明細書において使用される場合、「短縮した」タンパク質またはポリペプチドは、内因性の対照タンパク質またはポリペプチドと比較して少なくとも1個少ないアミノ酸を含む。例えば、内因性プロテインAが100個のアミノ酸を含む場合、プロテインAの短縮型は、1～99個のアミノ酸を含むことができる。ある局面では、非天然変異は、ポリペプチドの短縮をもたらす。
いかなる科学的理論にも制限されるわけではないが、タンパク質またはポリペプチドの短縮を引き起こすための1つの方法は、内因性遺伝子のmRNA転写物における未成熟終止コドンの導入によるものである。ある局面では、本開示は、内因性遺伝子のmRNA転写物において未成熟終止コドンを生じさせる変異を提供する。本明細書において使用される場合、「終止コドン」は、タンパク質翻訳の終結をシグナルで伝えるmRNA転写物内のヌクレオチドトリプレットのことを指す。「未成熟終止コドン」は、内因性mRNA転写物における通常の終止コドン位置よりも前に位置する（例えば、5'側上に）終止コドンのことを指す。限定されないが、「UAG」、「UAA」、「UGA」、「TAG」、「TAA」および「TGA」を含め、いくつかの終止コドンが当技術分野において公知である。
ある局面では、本明細書に提供される変異は、ヌル変異を含む。ある局面では、本明細書に提供される少なくとも1つの非天然変異は、ヌル変異を含む。本明細書において使用される場合、「ヌル変異」は、変異を含む遺伝子によってコードされるタンパク質に対して完全な機能喪失を付与する変異、または代わりに、ゲノム遺伝子座によってコードされる小型RNAに対して完全な機能喪失を付与する変異のことを指す。ヌル変異は、mRNA転写物産生の欠如、小型RNA転写物産生の欠如、タンパク質機能の欠如、またはそれらの組み合わせを引き起こすことができる。
本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子のいずれかの部位に位置付けることができる。ある局面では、本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子のエクソン内に位置付けられる。別の局面では、本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子のイントロン内に位置付けられる。さらなる局面では、本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子の5'-UTR内に位置付けられる。さらに別の局面では、本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子の3'-UTR内に位置付けられる。なお別の局面では、本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子のプロモーター内に位置付けられる。なお別の局面では、本明細書に提供される変異は、内因性遺伝子のターミネーター内に位置付けられる。ある局面では、本明細書に提供される非天然変異は、プロモーター、5'-UTR、3'-UTR、エクソン、イントロン、およびターミネーターからなる群より選択される配列領域における変異を含む。
変異誘発されたタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論を通じて行うことができる。スクリーニングおよび選択方法論の例は、サザン分析、ポリヌクレオチドの検出のためのPCR増幅、ノーザンブロット、RNaseプロテクション、プライマーエクステンション、RNA転写物を検出するためのRT-PCR増幅、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング技術（例えば、Illumina、PacBio、Ion Torrent、454、およびOxford nanopore）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイを含むが、それらに限定されない。インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの他の技法も、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用できる。参照および類似の技法のすべてを実施するための方法は、公知である。
低減された発現／活性
ある局面では、小型RNA分子は、それが結合可能である任意の核酸配列の発現を低減する。別の局面では、本明細書に提供される非天然変異は、同等条件下で生育させた対照植物における変異していない核酸配列と比較して、変異した核酸配列の発現を低減する。
内因性核酸配列の低減された発現は、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して測定することができる。発現を測定することの非限定的な例は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）、デジタルPCR、RNAブロット（例えば、ノーザンブロット）、RNAシーケンシングを含む。発現の違いは、絶対定量または相対定量として説明することができる。例えば、Livak and Schmittgen, Methods, 25:402-408 (2001)を参照されたい。内因性核酸配列がタンパク質をコードする場合、発現の変化は、コードされているタンパク質の蓄積を調べることによって推測することができる。タンパク質蓄積を測定することの非限定的な例は、ウエスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を含む。
ある局面では、発現の低減は、qRT-PCRを使用して測定される。別の局面では、発現の低減は、RNAブロットを使用して測定される。別の局面では、発現の低減は、RNAシーケンシングを使用して測定される。ある局面では、発現の低減は、デジタルPCRを使用して測定される。さらなる局面では、発現の低減は、ウエスタンブロットを使用して測定される。なおさらなる局面では、発現の低減は、ELISAを使用して測定される。
ある局面では、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列における非天然変異は、同等条件下で生育させた対照植物における非天然変異を欠く核酸配列と比較して、低減されたレベルの核酸配列の発現をもたらす。ある局面では、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列における非天然変異は、同等条件下で生育させた対照植物における非天然変異を欠く核酸配列と比較して、低減されたレベルの核酸配列の発現をもたらす。
ある局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも1％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも5％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも10％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも25％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも50％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも75％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも90％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも95％の低減を含む。
ある局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、1％～99％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、1％～90％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、1％～75％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、1％～50％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、1％～25％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、25％～90％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、50％～90％の低減を含む。別の局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、25％～75％の低減を含む。
ある局面では、発現の低減は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、統計的に有意な低減を含む。低減のレベルが、認められている統計的仮説検定を使用して統計的に有意であると判定される限り、当業者は、あらゆる低減のレベルが想定されることを認識するだろう。非限定的な例として、スチューデントのt検定は、改変された植物と対照植物との間の発現の低減が統計的に有意であるかどうかを判定するために使用できる1つの統計的仮説検定である。本明細書において使用される場合、「統計的に有意な」は、0.05より小さいまたは等しいp値のことを指す。
ある局面では、非天然変異は、同等条件下で生育させた対照植物の活性と比較して、本明細書に提供される核酸配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる低減されたレベルの活性をもたらす。別の局面では、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される内因性核酸配列における非天然変異は、同等条件下で生育させたときの対照タバコまたは大麻植物における内因性核酸配列（ここで、該核酸配列は、対照タバコまたは大麻植物において非天然変異を欠いている）によってコードされるタンパク質またはポリペプチドの活性と比較して、該核酸配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性のレベルを低減する。別の局面では、内因性核酸配列（ここで、該内因性核酸配列は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする）における非天然変異は、同等条件下で生育させたときの対照タバコまたは大麻植物における内因性核酸配列（ここで、該核酸配列は、対照タバコまたは大麻植物において非天然変異を欠いている）によってコードされるタンパク質またはポリペプチドの活性と比較して、該核酸配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性のレベルを低減する。
本明細書において使用される場合、タンパク質またはポリペプチドについて言及する際の「活性」は、酵素機能を遂行する能力のことを指す。非限定的な例として、デヒドロゲナーゼタンパク質またはポリペプチドの活性は、有機分子基質から水素基を除去するデヒドロゲナーゼの能力のことを指す。いかなる科学的理論にも制限されるわけではないが、変異したデヒドロゲナーゼタンパク質が、変異していない対照デヒドロゲナーゼタンパク質と比較して低減された活性を有する場合、変異したデヒドロゲナーゼは、（a）いずれの有機分子基質からも水素基を除去できない；（b）変異していないデヒドロゲナーゼタンパク質と比較して低減された速度でのみ、有機分子基質から水素基を除去できる；（c）変異していないデヒドロゲナーゼタンパク質に適した基質でない基質からのみ、水素基を除去できる；または（d）（b）と（c）の組み合わせであり得る。反対に、またいかなる科学的理論にも制限されるわけではないが、変異したデヒドロゲナーゼタンパク質が、変異していない対照デヒドロゲナーゼタンパク質と比較して増加した活性を有する場合、変異したデヒドロゲナーゼは、（a）変異していないデヒドロゲナーゼタンパク質と比較して増加した速度で有機分子基質から水素基を除去できる；（b）変異していないデヒドロゲナーゼに適した基質でない基質から水素基を除去できる；または（c）（a）と（b）の両方であり得る。デヒドロゲナーゼの活性は、当技術分野において標準的な技法を使用して測定することができる。例えば、Yu et al., Enzyme Microb. Technol., 49:272-276 (2011)；Seely and Pegg, J. Biol. Chem., 258:2496-2500 (1983)；およびMizusaki et al., Plant and Cell Physiology, 14:103-110 (1973)を参照されたい。
増加した発現／活性
ある局面では、非天然変異は、核酸配列の増加した発現をもたらす。ある局面では、非天然変異は、同等条件下で生育させたときの対照タバコまたは大麻植物の同組織における前記核酸配列（ここで、前記核酸配列は、前記対照タバコまたは大麻植物において少なくとも1つの非天然変異を欠いている）の発現と比較して、前記核酸配列の増加したレベルの発現をもたらす。
ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも70％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも75％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも85％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも92.5％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも95％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも96％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも97％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも98％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも99％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも99.5％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して100％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。
ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも70％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも75％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも85％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも92.5％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも95％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも96％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも97％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも98％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも99％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも99.5％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して100％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。
ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも70％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも75％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも85％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも92.5％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも95％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも96％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも97％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも98％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも99％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して少なくとも99.5％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される配列に対して100％同一である配列の増加した発現を含むタバコ植物を提供する。
ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも70％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも75％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも85％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも92.5％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも95％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも96％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも97％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも98％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも99％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して少なくとも99.5％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。ある局面では、本開示は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される配列に対して100％同一である配列の増加した発現を含む大麻植物を提供する。
別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも75％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも92.5％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも96％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも97％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも98％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも99％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも99.5％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。別の局面では、本開示は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して100％同一または類似のタンパク質をコードする配列の増加した発現を提供する。
ある局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも1％の増加を含む。ある局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも5％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも10％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも25％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも50％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも75％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも100％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも200％の増加を含む。別の局面では、増加したレベルの発現は、同等条件下で生育させた対照植物の同組織における発現と比較して、少なくとも500％の増加を含む。
ある局面では、非天然変異は、同等条件下で生育させたときの対照タバコ植物または対照大麻植物における前記核酸配列（ここで、前記核酸配列は、前記対照タバコまたは大麻植物において少なくとも1つの非天然変異を欠いている）によってコードされるタンパク質またはポリペプチドの活性と比較して、前記核酸配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる増加したレベルの活性をもたらす。
核酸およびアミノ酸
本明細書において使用される場合、「異種」は、外来種を起源とする、または、同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成および／もしくはゲノム遺伝子座がその天然形態から実質的に改変されている、配列（核酸またはアミノ酸）のことを指す。この用語はまた、本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」とも称される核酸構築物にも適用可能である。このように、「異種」核酸構築物は、外来種を起源とする、または、同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成および／もしくはゲノム遺伝子座がその天然形態から実質的に改変されている、構築物を意味することが意図される。異種核酸構築物は、植物またはその植物部分に、例えば、形質転換法またはトランスジェニック植物と関心対象の別の植物とのその後の繁殖を介して導入された、組換えヌクレオチド構築物を含むが、それに限定されない。内因性プロモーターと内因性遺伝子が天然に機能的に連結されていない場合、内因性プロモーターは、機能的に連結されている内因性遺伝子に対して異種と見なすことができる（例えば、ヒト介入は、それらを機能的連結状態に置くことを必要とする）ことが理解されよう。本明細書において使用される場合、「内因性」核酸配列は、生物のゲノム中に天然に存在する核酸配列のことを指す。
ある局面では、異種ポリヌクレオチドは、遺伝子を含む。ある局面では、異種ポリヌクレオチドは、小さなRNA分子またはその前駆体をコードする。ある局面では、異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする。
本明細書において使用される場合、「遺伝子」は、機能的単位（例えば、限定されないが、例えば、ポリペプチド、または小さなRNA分子）を産生できるポリヌクレオチドのことを指す。遺伝子は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、1つもしくは複数のエクソン、1つもしくは複数のイントロン、5'-UTR、3'-UTR、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。「遺伝子配列」は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、1つもしくは複数のエクソン、1つもしくは複数のイントロン、5'-UTR、3'-UTR、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一局面では、遺伝子は、小さなRNA分子またはその前駆体をコードする。別の局面では、遺伝子は、ポリペプチドをコードする。
ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも70％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも75％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも80％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも85％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも92.5％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも95％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも96％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも97％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも98％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも99％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも99.5％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して100％同一である核酸配列を含む。
ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも70％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも75％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも80％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも85％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも92.5％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも95％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも96％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも97％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも98％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも99％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも99.5％同一である核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して100％同一である核酸配列を含む。
ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも75％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも92.5％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも96％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも97％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも98％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも99％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも99.9％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある局面では、遺伝子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して100％同一または類似のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも75％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも92.5％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも96％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも97％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも98％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも99％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも99.9％同一または類似のアミノ酸配列を含む。ある局面では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して100％同一または類似のアミノ酸配列を含む。
「パーセント同一性」または「パーセント同一である」という用語は、2つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して本明細書において使用される場合、（i）2つの最適にアライメントされた配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）を比較ウインドウ（「アライメント可能な」1つまたは複数の領域）にわたって比較すること、（ii）両方の配列において同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列について）またはアミノ酸残基（タンパク質およびポリペプチドについて）が生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、（iii）一致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割ること、次いで、（iv）この商に100％を掛けてパーセント同一性を得ることによって算出される。「パーセント同一性」が、特定の比較ウインドウが指定されることなく参照配列に関して算出される場合、パーセント同一性は、アライメントの領域にわたる一致した位置の数を参照配列の全長で割ることによって決定される。したがって、本出願の目的では、2つの配列（クエリーおよび対象）が最適にアライメントされるとき（それらのアライメントにおいてギャップが許容される）、クエリー配列に対する「パーセント同一性」は、2つの配列間で同一の位置の数を、クエリー配列中のその長さ（または比較ウインドウ）にわたる位置の総数で割って、それに100％を掛けたものに等しい。
配列同一性のパーセンテージがアミノ酸に関して使用されるとき、同一でない残基位置は、しばしば保存的アミノ酸置換によって相違することが認識されており、この場合、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されており、それゆえ、分子の機能的特性を変化させることはない。配列が保存的置換で相違するとき、置換の保存的性質が補正されるようにパーセント配列同一性を上方調整することができる。そのような保存的置換によって相違する配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。
パーセント同一性を算出するための配列の最適なアライメントについて、2つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列同一性または類似性を比較するために使用できる、ClustalWまたはBasic Local Alignment Search Tool（登録商標）（BLAST（商標））などの様々なペアワイズまたは多重配列アライメントアルゴリズムおよびプログラムが、当技術分野において公知である。他のアライメントおよび比較法が当技術分野において公知であるが、2つの配列間のアライメントおよびパーセント同一性（上述したパーセント同一性範囲を含む）は、Clustal Wアルゴリズムによって決定することができ、例えば、Chenna et al., "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs," Nucleic Acids Research 31: 3497-3500 (2003)；Thompson et al., "Clustal W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice," Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)；Larkin MA et al., "Clustal W and Clustal X version 2.0," Bioinformatics 23: 2947-48 (2007)；およびAltschul et al. "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)を参照されたく、これらの全内容および開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
「パーセント相補性」または「パーセント相補的である」という用語は、2つのヌクレオチド配列に関して本明細書において使用される場合、パーセント同一性の概念と同様であるが、クエリーおよび対象配列が、ループ、ステムまたはヘアピンなどの二次フォールディング構造なく、直線的に配置されて最適に塩基対合されたときに、対象配列のヌクレオチドに最適に塩基対合またはハイブリダイズするクエリー配列のヌクレオチドのパーセンテージのことを指す。そのようなパーセント相補性は、2本のDNA鎖、2本のRNA鎖、またはDNA鎖とRNA鎖との間のものであることができる。「パーセント相補性」は、（i）2つのヌクレオチド配列を、比較ウインドウにわたって直線的かつ完全に伸びた配置（すなわち、フォールディングまたは二次構造なし）で最適に塩基対合またはハイブリッドさせること、（ii）比較ウインドウにわたって2つの配列間で塩基対合する位置の数を決定して、相補位置の数を得ること、（iii）相補位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割ること、および（iv）この商に100％を掛けて2つの配列のパーセント相補性を得ることによって算出することができる。2つの配列の最適な塩基対合は、水素結合を通じたヌクレオチド塩基の既知の対合（G-C、A-TおよびA-Uなど）に基づいて決定することができる。「パーセント相補性」が、特定の比較ウインドウが指定されることなく参照配列に関して算出されている場合、パーセント同一性は、2つの直線配列間の相補位置の数を参照配列の全長で割ることによって決定される。したがって、本出願の目的では、2つの配列（クエリーおよび対象）が最適に塩基対合されるとき（ミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチドが許容される）、クエリー配列に対する「パーセント相補性」は、2つの配列間の塩基対合した位置の数を、クエリー配列中のその長さにわたる位置の総数で割って、それに100％を掛けたものに等しい。
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語の使用は、本開示を、デオキシリボ核酸（DNA）を含むポリヌクレオチドに限定することを意図していない。例えば、リボ核酸（RNA）分子も想定される。当業者は、ポリヌクレオチドおよび核酸分子が、リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができることを認識するだろう。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子および合成類似体の両方を含む。本開示のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などを含むがそれらに限定されないあらゆる形態の配列を包含する。ある局面では、本明細書に提供される核酸分子は、DNA分子である。別の局面では、本明細書に提供される核酸分子は、RNA分子である。ある局面では、本明細書に提供される核酸分子は、一本鎖である。別の局面では、本明細書に提供される核酸分子は、二本鎖である。核酸分子は、ポリペプチドまたは小さなRNAをコードすることができる。
本明細書において使用される場合、「組換え核酸分子」は、限定されないが分子クローニングなどの遺伝子組換えの実験法によって形成される核酸分子のことを指す。同様に、「組換えDNA構築物」は、遺伝子組換えの実験法によって形成されるDNA分子のことを指す。
一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。
核酸は、当技術分野において慣用の技法を使用して単離することができる。例えば、核酸は、非限定的に組換え核酸技術および／またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含めた任意の方法を使用して単離することができる。一般的なPCR技法は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消化およびライゲーションを含み、これらは、核酸を単離するために使用することができる。単離核酸はまた、単一核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。本開示において提供される特定の候補遺伝子を増幅させるために使用できるプライマーの非限定的な例を表1に提供する（SEQ ID NO：64～103）。
ある局面では、本開示は、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子のmRNA発現を検出する方法を提供する。メッセンジャーRNA（mRNA）レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）およびマイクロアレイ解析などの当技術分野において標準的な技法によって測定することができる。RNAは、当技術分野において公知の方法によってcDNA（相補的DNA）に逆転写することができる。合成したcDNAは、mRNA転写物標的の相対または絶対定量のためのリアルタイムPCRおよびデジタルPCRなどの当技術分野において公知の方法によって増幅させてよい。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも2つの共有結合で連結されたアミノ酸の鎖のことを指す。ポリペプチドは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。本明細書に提供されるタンパク質は、本明細書に提供される核酸分子によってコードされ得る。タンパク質は、本明細書に提供されるポリペプチドを含むことができる。本明細書において使用される場合、「タンパク質」は、細胞に構造または酵素活性を提供可能なアミノ酸残基の鎖のことを指す。
ポリペプチドは、天然供給源（例えば、生体試料）から、DEAEイオン交換、ゲル濾過およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法によって精製することができる。ポリペプチドはまた、例えば、発現ベクターで核酸を発現させることによって精製することもできる。加えて、精製ポリペプチドを化学合成によって得ることもできる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析を使用して測定することができる。
一局面では、本開示は、植物細胞における組換え核酸およびポリペプチドを検出する方法を提供する。限定されないが、核酸はまた、ハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Sambrookら（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）において詳細に考察されている。mRNA発現は、インサイチューハイブリダイゼーションを使用して組織試料において局在させることができる。
ある局面では、本開示は、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコ植物と比較した、改変されたタバコ植物におけるポリペプチドの蓄積を検出するための方法を提供する。改変された植物におけるポリペプチドの増加した蓄積は、非天然変異を欠いておりかつ同等条件下で生育させた対照植物における同ポリペプチドの検出と比べて決定される。
ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技法は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法を含む。本明細書に提供される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。本明細書に提供されるポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する抗体を、当技術分野において周知の方法を使用して作製することができる。本明細書に提供される抗体は、当技術分野において公知の方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体支持体に付着させることができる。
検出（例えば、増幅産物の、ハイブリダイゼーション複合体の、ポリペプチドの）は、検出可能な標識を使用して達成することができる。「標識」という用語は、直接標識の使用も間接標識の使用も包含することを意図している。検出可能な標識は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を含む。
ある局面では、本開示は、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分を提供する。
ある局面では、本開示は、小型RNA分子、またはその前駆体を提供する。本明細書において使用される場合、「小型RNA分子」は、16個のヌクレオチド～50個のヌクレオチド長のノンコーディングRNA分子のことを指す。ある局面では、小型RNA分子は、16個のヌクレオチド～40個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、16個のヌクレオチド～30個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、18個のヌクレオチド～50個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、18個のヌクレオチド～40個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、18個のヌクレオチド～30個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、18個のヌクレオチド～25個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、20個のヌクレオチド～28個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、20個のヌクレオチド～24個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、21個のヌクレオチド～23個のヌクレオチドを含む。別の局面では、小型RNA分子は、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個のヌクレオチドを含む。
ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも75％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも80％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも85％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも90％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも92.5％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも95％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも97.5％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも99％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列に対して100％同一または相補的である。
ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも75％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも80％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも85％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも90％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも92.5％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも95％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも97.5％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも99％同一または相補的である。ある局面では、小型RNA分子は、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して100％同一または相補的である。
ある局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも88.7％同一または相補的である核酸配列を含む。別の局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも94.3％同一または相補的である核酸配列を含む。別の局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも18個の連続するヌクレオチドに対して100％同一または相補的である核酸配列を含む。別の局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも85％同一または相補的である核酸配列を含む。別の局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90％同一または相補的である核酸配列を含む。別の局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも95％同一または相補的である核酸配列を含む。別の局面では、本明細書に提供される小型RNAは、SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190からなる群より選択される核酸配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドに対して100％同一または相補的である核酸配列を含む。
ある局面では、小型RNA分子は、二本鎖RNA、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用性siRNA、およびマイクロRNA（miRNA）からなる群より選択される。
miRNAは、一般的に、標的転写物のトランスの切断をガイドし、様々な調節および発生経路に関与する遺伝子の発現を負に調節する、約19～約25個のヌクレオチド（植物では通常約20～24個のヌクレオチド）のものである。いくつかの場合には、miRNAは、siRNA一次転写物のインフェーズ（in-phase）プロセシングをガイドする役割を果たす。
多くのマイクロRNA遺伝子（MIR遺伝子）が特定され、データベースに公表されている（microrna[dot]sanger[dot]ac[dot]uk/sequencesにてオンラインで利用可能な「miRBase」；またGriffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441も参照のこと）。MIR遺伝子は、遺伝子間領域に存在する（ゲノム中に単独およびクラスターの両方で）ことが報告されているが、他の遺伝子（タンパク質コードおよび非タンパク質コードの両方）のイントロン内に全体的にまたは部分的に位置する場合もある。miRNAの生物発生の概説については、Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 6:376-385を参照されたい。MIR遺伝子の転写は、少なくともいくつかの場合には、MIR遺伝子自体のプロモーターの促進的制御下にあることができる。「プリ-miRNA」と称される一次転写物は、かなり巨大（数キロベース）であることができ、かつ、多シストロン性であることができ、1つまたは複数のプレ-miRNA（成熟miRNAへとプロセシングされるステム・ループ配置を含有する折り畳み構造）ならびにmRNAの通常の5'「キャップ」およびポリアデニル化尾部を含有する。
その対応する前駆体（プリ-miRNAおよびプレ-miRNA）からの成熟miRNAの成熟は、動物と植物との間で大きく異なる。例えば、植物細胞では、マイクロRNA前駆体分子が、大部分、核で完全に成熟miRNAへとプロセシングされると考えられるが、動物細胞では、プリ-miRNA転写物が、核で動物特異的酵素Droshaによってプロセシングされ、続いて、プレ-miRNAが細胞質に運ばれ、そこで、さらに成熟miRNAへとプロセシングされる。植物における成熟miRNAは、典型的には、21個のヌクレオチド長である。
miRNA（天然に存在する配列であるか人工配列であるか問わない）のトランスジェニック発現を採用して、miRNAの標的遺伝子（1つまたは複数）の発現を調節することができる。また、トランスジェニック発現された転写物中へのmiRNA認識部位の包含も、転写物の発現の調節に有用である。miRNAの認識部位は、5'非翻訳領域、コーディング領域および3'非翻訳領域を含めたmRNAのすべての領域で立証されており、コーディング配列に対するmiRNA標的部位の位置は、必ずしも抑制に影響を及ぼすとは限らないことが示された。miRNAは、真核生物における重要な調節要素であるので、miRNAのトランスジェニック抑制は、生物学的経路および応答を操作する上で有用である。最後に、MIR遺伝子のプロモーターは、非常に特異的な発現パターン（例えば、細胞特異的、組織特異的、時間特異的、または誘導性）を有することができ、したがって、組換え構築物において、これらが機能的に連結されているDNA配列のそのような特異的転写を誘導するために有用である。miRNA、その前駆体、その認識部位、およびそのプロモーターの様々な利用が、米国特許出願公開2006/0200878 A1に詳述されており、これは、参照により本明細書に組み入れられる。これらの利用の非限定的な例は、（1）標的遺伝子を抑制するためのネイティブmiRNAまたはmiRNA前駆体配列の発現；（2）標的遺伝子を抑制するための人工miRNAまたはmiRNA前駆体配列の発現；（3）miRNA認識部位を有する導入遺伝子の発現（この場合、成熟miRNAが発現されたときに導入遺伝子が抑制される）；（4）miRNAプロモーターによって駆動される導入遺伝子の発現を含む。
人工miRNA配列を設計することは、Zeng et al. (2002) Mol. Cell, 9:1327-1333によって実証されているように、miRNA前駆体のmiRNAステム領域中のヌクレオチドを意図する標的と相補的である配列に置換することと同じくらい簡単であり得る。操作miRNA前駆体を生産するためにネイティブmiRNA配列中のヌクレオチド変化を決定するための一般的な方法の非限定的な一例は、以下の工程を含む：（a）標的遺伝子に特異的な少なくとも18個のヌクレオチドの特有の標的配列を、例えば、タバコのcDNAとゲノムDNAの両データベースについて、例えば、BLAST（例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. , 215:403-410；Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402を参照のこと）などの配列アライメントツールを使用することによって選択して、標的転写物オルソログおよび無関係な遺伝子との任意の潜在的なマッチを識別し、それにより、非標的配列の意図しないサイレンシングを回避する工程；（b）標的遺伝子を、望ましくない配列（例えば、非標的種由来の配列とマッチするもの）について解析し、それぞれの潜在的な19-merのセグメントを、GC含量、レイノルズ（Reynolds）スコア（Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330を参照のこと）、および自由エネルギーの負の差分（「.DELTA..DELTA.G」または「ΔΔG」）を特徴とする機能的非対称性（Khvorova et al. (2003) Cell, 115:209-216を参照のこと）についてスコア化する工程。好ましくは、以下の特徴のすべてまたは大部分を有する19-merが選択される：（1）レイノルズスコア＞4、（2）GC含量が約40％～約60％、（3）負のΔΔG、（4）末端アデノシン、（5）連続して4個以上の同じヌクレオチドの欠如；（6）標的遺伝子の3'末端の近くに位置；（7）miRNA前駆体転写物との相違が最小。siRNAにおける3番目のヌクレオチド毎の位置が、RNAi効力への影響にとりわけ重要であることが報告されており、アルゴリズム「siExplorer」が、rna[dot]chem[dot]t[dot]u-tokyo[dot]ac[dot]jp/siexplorer.htm（Katoh and Suzuki (2007) Nucleic Acids Res., 10.1093/nar/gkl1120を参照のこと）に公表されている；（c）改変された成熟miRNAの作製において使用するための、選択された19-merの逆相補配列を決定する工程。20位のさらなるヌクレオチドは、好ましくは、選択された標的配列とマッチし、21位のヌクレオチドは、好ましくは、標的転写物に対するサイレンシングの拡大を防ぐために対合しないようにまたは標的転写物に対するサイレンシングの拡大を促進するために標的配列に対合するように選択される；ならびに（d）植物を人工miRNAで形質転換する工程。
ある局面では、ベクターは、例えば、候補テルペン生合成遺伝子の過剰発現およびノックダウンに使用することができる。ベクターの非限定的な例は、pGWB551である。ある局面では、ベクターは、SEQ ID NO：154に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む。ある局面では、ベクターは、SEQ ID NO：154に対して少なくとも95％同一である核酸配列を含む。ある局面では、ベクターは、SEQ ID NO：154に対して100％同一である核酸配列を含む。
製品
ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の植物または植物部分由来の植物材料を提供する。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の大麻植物または大麻植物部分由来の大麻材料を提供する。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の植物または植物部分由来の乾燥植物材料を提供する。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意のタバコ植物またはタバコ植物部分由来の乾燥タバコ材料を提供する。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の大麻植物または大麻植物部分由来の乾燥大麻材料を提供する。
ある局面では、本開示は、改変されたタバコまたは大麻植物に由来する乾燥タバコ材料または大麻材料を使用したタバコ製品または大麻製品を調製する工程を含む方法であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、方法を提供する。ある局面では、本開示は、改変されたタバコまたは大麻植物に由来する乾燥タバコ材料または大麻材料を使用したタバコ製品または大麻製品を調製する工程を含む方法であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、内因性遺伝子の増加したmRNA発現またはポリペプチドの増加した蓄積を示す、方法を提供する。
ある局面では、乾燥タバコ植物材料は、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および天日乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスによって作製される。ある局面では、乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および天日乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスによって作製される。
「乾燥」は、水分量を低下させてクロロフィルの破壊を招くことで、タバコ葉に金色を付け、それによってデンプンを糖に変換する、熟成プロセスである。乾燥タバコは、それゆえ、収穫した緑色の葉と比べて還元糖含有量が高く、デンプン含有量が低い。一局面では、本明細書に提供されるタバコ植物または植物成分は、従来の手段、例えば、熱風乾燥、倉庫乾燥、火力乾燥、空気乾燥または天日乾燥を使用して乾燥することができる。異なる種類の乾燥法の説明については、例えば、Tso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）を参照されたい。乾燥タバコは、通常、木製ドラム（例えば、大樽）または厚紙カートン内で、圧縮条件で数年間（例えば、2～5年）、10％～約25％の範囲の水分含有量で熟成される。米国特許第4,516,590号および同第5,372,149号を参照されたい。乾燥および熟成させたタバコを、その後さらに加工することができる。さらなる加工は、様々な温度で蒸気を注入してまたは注入しないで真空下でタバコをコンディショニングすること、低温殺菌、および発酵を含む。
大麻植物の収穫に続いて、大麻植物材料は、典型的には、乾燥処理（curing）の前に干される（dried）。カンナビスは、温度を約15℃～約22℃、湿度45％～55％に維持した、ゆるやかな空気循環用のファンを備えた暗室で、干すことができる。最初の干すサイクルは、5日間～15日間に及ぶ。干した大麻は、次いで、香気、芳香および効能を高めるために乾燥させることができる。大麻乾燥処理の長さは、株に左右される。例えば、2～3週間の乾燥処理が有益なカンナビス株もあれば、4～8週間の乾燥処理が有益なカンナビス株もあり、一方で、6ヶ月以上の乾燥処理が有益なカンナビス株もある。
バーレーおよびダークタバコ品種の収穫に関する情報は、ケンタッキー大学、テネシー大学、バージニア工科大学、およびノースカロライナ州立大学によって出版された2019-2020 Burley and Dark Tobacco Production Guide（December 2018）に見いだすことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
ある局面では、乾燥タバコ材料は、乾燥葉材料、乾燥茎材料、乾燥蕾材料、乾燥花材料、および乾燥根材料から選択される群より選択されるタバコ材料を含む。ある局面では、乾燥タバコ材料は、乾燥葉材料、乾燥茎材料、または両方を含む。ある局面では、乾燥タバコ材料は、乾燥葉材料を含む。ある局面では、乾燥タバコ材料は、乾燥茎材料を含む。
ある局面では、大麻材料は、葉材料、茎材料、蕾材料、花材料、根材料、毛状根、細胞培養物、およびカルスから選択される群より選択される大麻材料を含む。ある局面では、大麻材料は、葉材料、茎材料、または両方を含む。ある局面では、大麻材料は、葉材料を含む。ある局面では、大麻材料は、茎材料を含む。
ある局面では、乾燥タバコ材料は、熱風乾燥タバコ材料を含む。ある局面では、乾燥タバコ材料は、空気乾燥タバコ材料を含む。ある局面では、乾燥タバコ材料は、火力乾燥タバコ材料を含む。ある局面では、乾燥タバコ材料は、天日乾燥タバコ材料を含む。ある局面では、本明細書に提供される乾燥タバコ材料は、空気乾燥タバコ材料、火力乾燥タバコ材料、天日乾燥タバコ材料、および熱風乾燥タバコ材料からなる群より選択される。ある局面では、乾燥タバコ材料は、熱風乾燥品種、ブライト品種、バーレー品種、バージニア品種、メリーランド品種、ダーク品種、オリエンタル品種、およびトルコ品種からなる群より選択されるタバコ品種由来である。
ある局面では、本明細書に提供される乾燥タバコ葉は、空気乾燥タバコ葉、火力乾燥タバコ葉、天日乾燥タバコ葉、および熱風乾燥タバコ葉からなる群より選択される。ある局面では、乾燥タバコ葉は、熱風乾燥品種、ブライト品種、バーレー品種、バージニア品種、メリーランド品種、ダーク品種、オリエンタル品種、およびトルコ品種からなる群より選択されるタバコ品種由来である。
発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱発生、および乾燥重量の10～20％の喪失を特徴とする。例えば、米国特許第4,528,993号、同第4,660,577号、同第4,848,373号、同第5,372,149号；米国特許公開第2005/0178398；およびTso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）を参照されたい。乾燥、熟成および発酵させたタバコは、さらに加工（例えば、カット、細断、膨張、またはブレンド）することができる。例えば、米国特許第4,528,993号；同第4,660,577号；および同第4,987,907号を参照されたい。乾燥、熟成および発酵させた大麻は、さらに加工（例えば、カット、細断、膨張、またはブレンド）することができる。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意のタバコ植物、またはその部分に由来する発酵タバコ材料を提供する。別の局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の改変されたタバコ植物、またはその部分に由来するの発酵タバコ材料を提供する。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の大麻植物、またはその部分に由来する発酵大麻材料を提供する。別の局面では、本開示は、本明細書に提供される任意の改変された大麻植物、またはその部分に由来する発酵大麻材料を提供する。
本開示のタバコ系統、品種またはハイブリッドから得られたタバコ材料を使用して、タバコ製品を製造することができる。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトでの使用または消費を意図したタバコから製造されるまたはそれに由来する任意の製品として定義される。ある局面では、本開示は、本明細書に提供されるタバコ植物由来の植物材料を含むタバコ製品を提供する。別の局面では、本開示は、本明細書に提供される改変されたタバコ植物由来の植物材料を含むタバコ製品を提供する。別の局面では、本開示は、乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供する。別の局面では、本開示は、発酵させたタバコ材料を含むタバコ製品を提供する。別の局面では、本開示は、タバコブレンドを含むタバコ製品を提供する。
本開示の大麻系統、株、品種またはハイブリッドから得られた大麻材料を使用して、大麻製品を製造することができる。本明細書において使用される場合、「大麻製品」は、ヒトでの使用または消費を意図した大麻から製造されるまたはそれに由来する任意の製品として定義される。ある局面では、本開示は、本明細書に提供される大麻植物由来の植物材料を含む大麻製品を提供する。別の局面では、本開示は、本明細書に提供される改変された大麻植物由来の植物材料を含む大麻製品を提供する。別の局面では、本開示は、大麻材料を含む大麻製品を提供する。別の局面では、本開示は、乾燥大麻材料を含む大麻製品を提供する。別の局面では、本開示は、発酵大麻材料を含む大麻製品を提供する。別の局面では、本開示は、大麻ブレンドを含む大麻製品を提供する。
タバコ製品は、非限定的に、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、葉巻製品（例えば、葉巻包装タバコおよびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコに由来する製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、モイストスナッフ、ドライスナッフ、および噛みタバコ）、フィルム、チュアブル、タブ、シェイプドパーツ、ゲル、コンシューマブルユニット、不溶性マトリックス、中空形状物、再構成タバコ、膨張タバコなどを含む。例えば、米国特許公開第US 2006/0191548号を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「棒状部」および「充填物」を有するタバコ製品のことを指す。シガレットの「棒状部」は、シガレット用紙、フィルター、プラグラップ（濾過材を収納するために使用される）、フィルターにシガレット用紙（充填物を含む）を固定するチッピング紙、およびこれら成分を一緒に固定するすべての接着剤を含む。「充填物」は、（1）再構成タバコおよび膨張タバコを含むがそれらに限定されないすべてのタバコ、（2）非タバコ代替物（ハーブ、非タバコ植物材料およびシガレット用紙に巻かれるタバコに付随し得る他のスパイスを含むが、それらに限定されない）、（3）ケーシング、（4）香料、および（5）他のすべての添加物（タバコおよび代替物に混合され、シガレット中に巻かれる）を含む。
ある局面では、タバコ製品は、再構成タバコを含む。別の局面では、本開示は、乾燥タバコ材料を含む再構成タバコを提供する。本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート状に加工されてタバコに似せて細片にカットされた、タバコダストおよび他のタバコスクラップ材料から製造されたタバコ充填物の一員のことを指す。コスト削減に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との間の反応を使用して香りの発生を進めることから、シガレット風味へのその寄与に対しても非常に重要である。
ある局面では、大麻製品は、再構成大麻を含む。別の局面では、本開示は、大麻材料を含む再構成大麻を提供する。本明細書において使用される場合、「再構成大麻」は、シート状に加工されて大麻に似せて細片にカットされた、大麻ダストおよび他の大麻スクラップ材料から製造された大麻充填物の一員のことを指す。
ある局面では、タバコ製品は、膨張タバコを含む。本明細書において使用される場合、「膨張タバコ」は、タバコを「膨らませて」密度の低下およびより大きな充填性能を生じるように、適切な気体の膨張を通じて加工されているタバコ充填物の一員のことを指す。膨張タバコは、シガレットで使用されるタバコの重量を低減する。
ある局面では、大麻製品は、膨張大麻を含む。本明細書において使用される場合、「膨張大麻」は、大麻を「膨らませて」密度の低下およびより大きな充填性能を生じるように、適切な気体の膨張を通じて加工されている大麻充填物の一員のことを指す。
本開示の植物に由来するタバコ製品はまた、シガレットおよび他の喫煙物品、特に、フィルター要素を含む喫煙物品も含み、この場合、喫煙可能材料の棒状部は、タバコブレンド内に乾燥タバコを含む。ある局面では、本開示のタバコ製品は、クレテック、ビディシガレット、シガリロ、非通気リセスドフィルター（non-ventilated recess filter）シガレット、通気リセスドフィルター（vented recess filter）シガレット、葉巻、スナッフ、パイプタバコ、葉巻タバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群より選択される。
本開示の植物に由来する大麻製品はまた、シガレットおよび他の喫煙物品、特に、フィルター要素を含む喫煙物品も含み、この場合、喫煙可能材料の棒状部は、大麻ブレンド内に乾燥大麻を含む。ある局面では、本開示の大麻製品は、クレテック、シガリロ、葉巻、スナッフ、パイプ大麻、葉巻大麻、シガレット大麻、噛み大麻、水大麻、刻み大麻、およびカット大麻からなる群より選択される。
ある局面では、本開示のタバコ製品は、シガレット、加熱タバコ製品、クレテック、ビディシガレット、葉巻、シガリロ、非通気シガレット通気リセスドフィルターシガレット、パイプタバコ、スナッフ、スヌース、噛みタバコ、モイスト無煙タバコ、ファインカット噛みタバコ、ロングカット噛みタバコ、ポーチ入り噛みタバコ製品、ガム、タブレット、ロゼンジ、および溶解ストリップからなる群より選択される。
ある局面では、本開示の大麻製品は、シガレット、加熱大麻製品、クレテック、葉巻、シガリロ、パイプ大麻、スナッフ、スヌース、噛み大麻、モイスト無煙大麻、ファインカット噛み大麻、ロングカット噛み大麻、ポーチ入り噛み大麻製品、ガム、タブレット、ロゼンジ、および溶解ストリップからなる群より選択される。
ある局面では、本開示の大麻製品は、消費用製品である。さらなる局面では、消費用製品は、食用製品である。ある局面では、消費用製品は、オイルである。
ある局面では、本開示のタバコ製品は、無煙タバコ製品である。ある局面では、無煙タバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、固形噛みタバコ、モイストスナッフ、鼻用スナッフ、ドライスナッフ、およびスヌースからなる群より選択される。
ある局面では、本開示の大麻製品は、無煙大麻製品である。ある局面では、無煙大麻製品は、噛み大麻、モイストスナッフ、ドライスナッフ、およびスヌースからなる群より選択される。
無煙タバコまたは無煙大麻製品は、燃焼せず、噛みタバコ、モイスト無煙タバコ、モイスト無煙大麻、スヌース、およびドライスナッフを含むが、それらに限定されない。噛みタバコまたは大麻は、粗く分割されたタバコまたは大麻葉であり、典型的には大きなポーチ様パッケージに包装されて、固形またはねじった状態で使用される。モイスト無煙タバコまたは大麻は、湿り気を有するより細かく分割されたタバコまたは大麻であり、ばらばらの形態または袋の形態で提供され、典型的には、円形缶に包装され、一つまみとしてまたは袋状で成人のタバコまたは大麻消費者の頬と歯茎の間に入れて使用される。スヌースは、加熱処理された無煙タバコまたは大麻である。ドライスナッフは、細かく粉末にされたタバコまたは大麻であり、口内に置くかまたは経鼻使用される。
なお別の局面では、本開示のタバコまたは大麻製品は、電子加熱シガレット、e-シガレット、電子式気化デバイスからなる群より選択される。
ある局面では、本開示のタバコまたは大麻製品は、ブレンドされたタバコまたは大麻製品であることができる。
別の局面では、本開示は、乾燥タバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。タバコブレンドは、乾燥タバコ、未乾燥タバコ、発酵タバコ、未発酵タバコ、膨張タバコ、および再構成タバコの任意の組み合わせを含むことができる。
別の局面では、本開示は、大麻材料を含む大麻ブレンドを提供する。大麻ブレンドは、発酵大麻、未発酵大麻、膨張大麻、および再構成大麻の任意の組み合わせを含むことができる。
ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも5重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも10重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも15重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも20重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも25重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも30重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも35重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも40重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも45重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも50重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも55重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも60重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも65重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも70重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも75重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも80重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも85重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも90重量％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも95重量％の乾燥タバコを含む。
ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも5重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも10重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも15重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも20重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも25重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも30重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも35重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも40重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも45重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも50重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも55重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも60重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも65重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも70重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも75重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも80重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも85重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも90重量％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも95重量％の大麻を含む。
ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも5体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも10体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも15体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも20体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも25体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも30体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも35体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも40体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも45体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも50体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも55体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも60体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも65体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも70体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも75体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも80体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも85体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも90体積％の乾燥タバコを含む。ある局面では、タバコブレンドは、少なくとも95体積％の乾燥タバコを含む。
ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも5体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも10体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも15体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも20体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも25体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも30体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも35体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも40体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも45体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも50体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも55体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも60体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも65体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも70体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも75体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも80体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも85体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも90体積％の大麻を含む。ある局面では、大麻ブレンドは、少なくとも95体積％の大麻を含む。
ある局面では、本開示は、改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、方法を提供する。
態様
下記の非限定的な態様の例が想定される。
1. 異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
2. 少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、該内因性遺伝子の増加したmRNA発現または該ポリペプチドの増加した蓄積を示す、前記改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
3. 少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
4. 前記ポリペプチドが、ゲラニル二リン酸シンターゼ（GDP）、リモネンシンターゼ（LS）、リモネン 3-ヒドロキシラーゼ（L3OH）、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ（IPD）、プレゴンレダクターゼ、メントフランシンターゼ（MFS）、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS）、ネオメントールデヒドロゲナーゼ（NtNMD）、フィロプラニン、プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ（PSO）、コラベニル二リン酸シンターゼ（KPS）、ソラネシルリン酸シンターゼ3、テルペンシンターゼ10様、およびゲルマクレンDシンターゼからなる群より選択される、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
5. 少なくとも1つのテルペンが、メントールまたは関連化合物である、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
6. 前記ポリペプチドが、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS2）、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ、およびcis-アビエノールシンターゼからなる群より選択される、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
7. cis-アビエノールシンターゼが、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1およびcis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2からなる群より選択される、態様6の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
8. 少なくとも1つのテルペンがラブダノイドである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
9. 少なくとも1つのテルペンがネオフィタジエンである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
10. ラブダノイドがcis-アビエノールである、態様8の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
11. 前記ポリペプチドがセンブラトリエノールシンターゼ2aである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
12. 少なくとも1つのテルペンがセンブラトリエンジオールである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
13. 前記ポリペプチドがレボピマラジエンシンテターゼである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
14. 少なくとも1つのテルペンがレボピマル酸である、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
15. 前記ポリペプチドが、2-イソプロピルリンゴ酸シンテターゼ（IPS）、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、および2-アルケナールレダクターゼからなる群より選択される、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
16. 少なくとも1つのテルペンがL-ロイシンである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
17. 前記核酸配列が、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも70％同一である配列を含む、態様[0059]の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
18. 前記内因性遺伝子が、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも70％同一である配列を含む、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
19. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一または類似のアミノ酸配列を含む、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
20. 異種プロモーターが構成的プロモーターを含む、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
21. 異種プロモーターが、組織優先型（tissue-preferred）プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
22. 組織優先型プロモーターまたは組織特異的プロモーターが、毛状突起優先プロモーターまたは毛状突起特異的プロモーターを含む、態様21の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
23. 異種プロモーターが、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
24. 前記改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの前記組換え核酸分子を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、態様[0059]の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
25. 前記改変されたタバコまたは大麻植物が、前記対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
26. 前記少なくとも1つのテルペンの増加した量が、前記対照タバコまたは大麻植物と比較して少なくとも5％の増加を含む、態様24または25の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
27. 前記タバコ植物、タバコ種子、またはその部分が、熱風乾燥品種（flue-cured variety）、ブライト品種（bright variety）、バーレー品種（Burley variety）、バージニア品種（Virginia variety）、メリーランド品種（Maryland variety）、ダーク品種（dark variety）、ガルパオ品種（Galpao variety）、オリエンタル品種（Oriental variety）、およびトルコ品種（Turkish variety）からなる群より選択されるタバコ品種のものである、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコ植物、タバコ種子、またはその部分。
28. 前記タバコまたは大麻植物が、雄性不稔または細胞質的に雄性不稔である、態様[0059]～3のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
29. 少なくとも1つの非天然変異についてホモ接合性である、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
30. 少なくとも1つの非天然変異についてヘテロ接合性である、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
31. 少なくとも1つの非天然変異が、挿入、欠失、置換、重複、および逆位からなる群より選択される変異を含む、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
32. 少なくとも1つの非天然変異が、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
33. 少なくとも1つの非天然変異がヌル変異を含む、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
34. 少なくとも1つの非天然変異が、前記ポリペプチドの短縮をもたらす、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
35. 少なくとも1つの非天然変異が、プロモーター、5'-非翻訳領域（UTR）、エクソン、イントロン、3'-UTR、およびターミネーターからなる群より選択される配列領域における変異を含む、態様2の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
36. 態様[0059]～35のいずれかの改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分に由来する、乾燥タバコ材料または大麻材料。
37. 熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および天日乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスによって作製される、態様36の乾燥タバコ材料。
38. タバコまたは大麻製品が、クレテック、ビディシガレット、シガリロ、非通気リセスドフィルター（non-ventilated recess filter）シガレット、通気リセスドフィルター（vented recess filter）シガレット、葉巻、スナッフ、パイプタバコ、パイプ大麻、葉巻タバコ、葉巻大麻、シガレットタバコ、シガレット大麻、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、水大麻、刻みタバコ、刻み大麻、カットタバコ、およびカット大麻からなる群より選択される、態様36または37の乾燥タバコ材料または大麻材料を含むタバコ製品。
39. 無煙タバコまたは無煙大麻製品である、態様38のタバコまたは大麻製品。
40. 無煙タバコまたは無煙大麻製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、ルーズリーフ噛み大麻、固形噛みタバコ、固形噛み大麻、モイストスナッフ、鼻用スナッフ、ドライスナッフ、およびスヌースからなる群より選択される、態様39のタバコまたは大麻製品。
41. 態様36または37の乾燥タバコ材料または大麻材料を含む、再構成タバコまたは大麻。
42. 態様36または37の乾燥タバコ材料または大麻材料を含む、発酵タバコまたは発酵大麻。
43. 再構成タバコまたは再構成大麻を含む、態様38のタバコまたは大麻製品。
44. 発酵タバコまたは発酵大麻を含む、態様38のタバコまたは大麻製品。
45. 異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え核酸分子。
46. 以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法：
（a）組換え核酸分子を少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞に導入する工程であって、該組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されているテルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、工程；
（b）該組換え核酸分子を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および
（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該組換え核酸分子を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
47. 以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法：
（a）少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞において、テルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの非天然変異を誘導する工程；
（b）工程（a）から該少なくとも1つの非天然変異を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を選択する工程；および
（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
48. 以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法：
（a）組換えDNA構築物を少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞に導入する工程であって、該組換えDNA構築物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、工程；
（b）該組換えDNA構築物を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および
（c）工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、少なくとも1つの改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該組換えDNA構築物を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの低減した量を含む、工程。
49. 改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコ材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、方法。
50. 改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、該内因性遺伝子の増加したmRNA発現または該ポリペプチドの増加した蓄積を示す、方法。
51. 改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、方法。
52. タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、該組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法。
53. タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、該組換え核酸分子が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、方法。
54. 以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法：
（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコ品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、工程；および
（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、該少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が該組換え核酸分子を含む、工程。
55. 以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法：
（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコ植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換え核酸分子を含む、工程；および
（b）少なくとも1つの後代タバコ種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、該少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が該組換え核酸分子を含む、工程。
56. 以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法：
（a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコ品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコ品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く第1のタバコまたは大麻品種の対照タバコまたは大麻植物と比較して、該内因性遺伝子の増加したmRNA発現または該ポリペプチドの増加した蓄積を示す、工程；および
（b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、該少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が、該少なくとも1つの非天然変異を含む、工程。
57. 第1のタバコ品種および第2のタバコ品種が同じタバコ品種であるか、または第1の大麻品種および第2の大麻品種が同じ大麻品種である、態様54～56のいずれかの方法。
58. 第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が前記組換え核酸分子を含む、態様54～55のいずれかの方法。
59. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記組換え核酸分子についてヘテロ接合性である、態様54～55のいずれかの方法。
60. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記組換え核酸分子についてホモ接合性である、態様54～55のいずれかの方法。
61. 第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、前記少なくとも1つの非天然変異を含む、態様56の方法。
62. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記少なくとも1つの非天然変異についてヘテロ接合性である、態様56の方法。
63. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記少なくとも1つの非天然変異についてホモ接合性である、態様56の方法。
これまで本開示を一般的に説明してきたが、本開示は、下記実施例を参照してより容易に理解され、該実施例は、例証として提供されるものであって、特に指定のない限り本開示を制限することを意図するものではない。
実施例1. 候補となる毛状突起／テルペノイド遺伝子の特定
いくつかのテルペンを産生するための生合成段階を実行するタンパク質（図1～6を参照のこと）については、ほとんど知られていない。テルペン生合成に関与する公表されている遺伝子を、National Center for Biotechnology Information（NCBI）データベースにおいてクエリーとして使用した。結果として得られた配列を、次いで、第2の内部データベースから抽出した。この方法論は、テルペン生合成に推定的に関与する遺伝子候補およびホモログを作製した（SEQ ID NO：1～63、112～153、および155～205）。表1を参照されたい。
実施例2. 候補遺伝子のネイティブ発現の調査
実施例1において特定された候補遺伝子の発現プロファイルをタバコ毛状突起において調査する。図7を参照されたい。タバコ栽培品種「TN90」の成熟葉から、液体窒素中に浸しておいたブラシで葉をブラッシングすることによって毛状突起を分離する。毛状突起を、RNA抽出のために液体窒素を含有する容器に収集する。TRIzol（商標）を使用してトータルRNAを単離し、当技術分野において公知の方法を使用してcDNAを合成する。遺伝子特異的プライマーを使用してPCRを実施する。評価のための候補遺伝子は、シクラーゼ（SEQ ID NO：17）；フィロプラニン（SEQ ID NO：155）；プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ（PSO）（SEQ ID NO：158）；ネオメントールデヒドロゲナーゼ（SEQ ID NO：15）；およびcis-アビエノールシンターゼ（SEQ ID NO：4）を含む。CYP71D16は、毛状突起遺伝子発現の陽性対照として使用されるタバコ毛状突起特異的P450ヒドロキシラーゼ遺伝子である。CYP71D16は、PSOとおよそ98.5％の相同性を共有する。
実施例3. NMDおよびABS発現プロファイルの調査
実施例1において特定された候補遺伝子の発現プロファイルを、様々なタバコ植物発生段階にあるタバコ栽培品種TN90およびK326ならびにN. ベンサミアナ由来の花ならびに葉において調査する。
ネオメントールデヒドロゲナーゼ（NMD；SEQ ID NO：15）ならびにcis-アビエノール（ABS）アイソフォーム1（SEQ ID NO：4）および2（SEQ ID NO：5）の転写物存在量を、TN90およびK326タバコ栽培品種における異なる植物発達段階でRNAシーケンシングを使用して調べる。
1品種当たり植物およそ22～25体を2列で生育させる。実験は、無作為化法を用いて3連で行う。開花期は、植物によって異なるので、植物の少なくとも50％が開花し始めたときにすべての植物を摘心する。均一サイズに近づいた植物を、異なる時点でのサンプリング用に選択する。評価される植物試料は、花（摘心前）および多様な摘心後時期（例えば、摘心後1日目；摘心後3日目；摘心後1週目；摘心後2週目；摘心後3週目；および収穫時期）の葉を含む。図8A～8Bを参照されたい。
実施例4. 改変されたタバコまたは大麻植物を作製するためのベクター構築物
cis-アビエノール生合成経路の酵素（例えば、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS2）（SEQ ID NO：1および113）、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ（SEQ ID NO：3および115）、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1（SEQ ID NO:4）、およびcis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2（SEQ ID NO：5））をコードする実施例1において特定された候補遺伝子を構築物にクローニングする。
CaMV 35Sプロモーターの制御下にSEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190のそれぞれ1つずつを含む別々の形質転換ベクターを、当技術分野において公知の方法およびベクターpGWB551（SEQ ID NO：154）を使用して構築する。タバコまたは大麻植物を形質転換するために使用する代表的なベクター構築物を図9に描写する。ベクター構築物を作製するために使用するベクター骨格のマップを図10に描写する。
当技術分野において標準的な方法を使用して、作製された各ベクター構築物で、別々の実験でタバコまたは大麻細胞を別々に形質転換する。簡単に述べると、ベクターを、アグロバクテリウム媒介形質転換を介してタバコまたは大麻葉ディスクに導入する。例えば、Mayo et al., Nat. Protoc., 1:1105-1111 (2006)；およびHorsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985)を参照されたい。
異なるバックグラウンドのGFPを発現する対照およびトランスジェニックタバコ系統（Nb＝N. ベンサミアナ；TN90＝タバコ栽培品種「TN90」）からのカルスの代表的な画像を図11A～11Fに提供する。図11Aは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ-TN90（SEQ ID NO：1および43）を描写している；図11Bは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ-Nb（SEQ ID NO：1および43）を描写している；図11Cは、センブラトリエノールシンターゼ2a-Nb（SEQ ID NO：17および59）を描写している；図11Dは、ネオメントールデヒドロゲナーゼ-Nb（SEQ ID NO：15および57）を描写している；図11Eは、cis-アビエノールシンターゼ-TN90（SEQ ID NO：4および46）を描写している；図11Fは、メントフランシンターゼ-Nb（SEQ ID NO：16および58）を描写している；そして、図11Gは、陽性対照であるGFP-TN90を描写している。
実施例5. 改変されたタバコ植物の再生
タバコ遺伝子型（TN90およびK326）およびN. ベンサミアナ植物を、実施例4に記載の通りベクター構築物で形質転換し、Magenta（商標）GA-7ボックス内で生育させ、葉ディスクをカットしてペトリ皿に入れる。50mLの遠心分離チューブ中の20mLの細胞懸濁液を3500 RPMで10分間遠心分離することによって、形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を収集する。上清を取り除き、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞ペレットを40mLの液体再懸濁培地に再懸濁する。中肋を避けたタバコ葉を、#15カミソリ刃で8つの0.6cmのディスクにカットし、上下逆にしてペトリ皿に入れる。B5ビタミン液体再懸濁培地を含むMurashige & Skoog（MS）の薄層をペトリ皿に加え、葉ディスクを先が細い針で均一に突く。約25mLのアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液をペトリ皿に加え、葉ディスクを懸濁液中で10分間インキュベートする。
葉ディスクを共栽培ペトリ皿（1/2 MS培地）に移し、ディスクを上下逆にして共栽培TOM培地（30g/L スクロース；0.1mg/L インドール-3-酢酸；および1mg/L 6-ベンジルアミノプリン（BAP）を含むMS培地）上に敷いたフィルター紙と接触させる。ペトリ皿をパラフィルムで密閉した後、薄明かり（60～80mE/ms）にて、24℃で18時間点灯と6時間消灯の光周期で、2日間インキュベートする。
インキュベーション後、葉ディスクを再生／選択TOM Hyg培地ペトリ皿（TOM培地＋200mg/L セフォタキシムおよび50mg/L ハイグロマイシン）に移す。葉ディスクを、薄明かり（60～80mE/ms）にて、24℃で18時間点灯と6時間消灯の光周期で、2週間に1回、新鮮TOM K培地に、芽が切り取り可能となるまで継代培養する。葉からの芽を、鉗子で取り出し、50mg/L ハイグロマイシンおよび200mg/L セフォタキシムを含むMS発根培地（MS Gamborg B5、3g/L スクロースおよび7g/L デキストロース）に入れる。50mg/L ハイグロマイシンおよび200mg/L セフォタキシムを含むMS発根培地上の芽を、照明（およそ60～80mE/ms）下、24℃で18時間点灯と6時間消灯の光周期でインキュベートして、発根を誘導する。
芽と根の両方を含む小植物体が十分に大きく生育したら（例えば、Magenta（商標）GA-7ボックスの高さの半分を超える）、これらを、生育室内の順化用のJiffyピートペレットに移す。根付いたら、実生をさらなる生育、繁殖および分析のために温室に移す。
実施例6. 改変されたタバコ植物におけるテルペン生合成遺伝子の発現の確認
栄養生長期間中の実施例5で作製された改変されたタバコ植物（T0世代）の若葉からRNAを単離する。また、同等条件下で生育させた組換え核酸構築物を欠く対照タバコ植物からもRNAを単離する。TRIzol（商標）を使用してトータルRNAを単離し、当技術分野において公知の方法を使用してcDNAを合成する。各遺伝子構築物の異なるトランスジェニック系統におけるテルペノイド遺伝子発現を、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）を介して定量する。候補遺伝子に特異的なプライマーを表1に提供する（SEQ ID NO：64～103）。
改変されたタバコ植物でのNtNMD（SEQ ID NO：15）、NtaABS（SEQ ID NO：4）、およびNtABS（SEQ ID NO：5）の遺伝子発現を、qRT-PCRを使用して定量し、対照タバコ植物でのNtNMD、NtaABS、およびNtABS発現と比較する。cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1（aABS）（SEQ ID NO：4）およびcis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2（ABS）（SEQ ID NO：5）の相対遺伝子発現を、トランスジェニックタバコ植物のT0系統について算出する。図12A～12Bを参照されたい。NtNMD（SEQ ID NO：15）の相対遺伝子発現を、トランスジェニックタバコ植物のT0系統について算出する。図13を参照されたい。また、NtNMD（図15を参照のこと）およびNtaABS（図16を参照のこと）の相対発現をT1トランスジェニックタバコ植物において調べる。相対発現は、当技術分野において標準である2（-ΔΔC（t））方法論を使用して判定し、ここで、野生型植物における過剰発現遺伝子のネイティブ発現を、ベースラインとして使用する（例えば、1に等しくなるように設定する）。例えば、Livak and Schmittgen, Methods, 25:402-408 (2001)を参照されたい。
実施例7. 候補遺伝子を過剰発現する改変されたタバコ植物におけるテルペノイドの測定
定量的代謝プロファイル分析を、栄養生長期間中の実施例5で作製されたT0トランスジェニック植物を使用して実施する。若葉または古葉からの葉試料を、テルペンの溶媒抽出のために液体窒素中で別々に粉砕する。粉砕した葉を、内部標準としてヘプタデカノールを補充した60：40のヘキサン：酢酸エチル溶媒混合物（v/v）と混合し、次いで、シェーカー内で一晩インキュベートする。溶媒抽出物を、冷却SpeedVac中で濃縮し、シリカカラムに装填する。カラムをヘキサンで洗浄し、収集チューブに流し入れる。通過画分から試料を小分けし、これをガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）による代謝物分析に使用する。
NtNMD（SEQ ID NO：15）を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物においてネオフィタジエンのレベルの上昇が観察される。図14Aを参照されたい。ネオフィタジエンのレベルの上昇は、NtABS（SEQ ID NO：5）およびNtaABS（SEQ ID NO：4）を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物でも観察される。図15Bを参照されたい。
GC-MSによって検出した場合に、ネオメントールが、TN90対照植物と比較して、NtNMD（SEQ ID NO：15）を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物において過剰蓄積する。表9を参照されたい。
（表９）NtNMDトランスジェニックタバコ植物における揮発性芳香物の蓄積
Figure 2024505755000017
GC-MSによって検出した場合に、増強された揮発性香気化合物が、NtABS（SEQ ID NO：5）およびNtaABS（SEQ ID NO：4）を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物において蓄積する。表10を参照されたい。
（表１０）NtABSおよびNtaABSトランスジェニックタバコ植物における揮発性芳香物の蓄積
Figure 2024505755000018
実施例8. 候補遺伝子における変異の作製
SEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190を、別々に、タバコまたは大麻ゲノムにおいて特異的に編集することによって、実施例1において特定された遺伝子の各々において変異を引き起こす。タバコまたは大麻プロトプラストに、ポリエチレングリコール（PEG）を使用して、所望の位置で個々の遺伝子を標的とするCRISPRタンパク質またはCRISPRタンパク質および特異的ガイドRNA（gRNA）をコードするプラスミドをトランスフェクトする。
次いで、トランスフェクトしたプロトプラストを1％アガロースビーズ中で固定し、組織培養に供する。カルスが直径およそ1ミリメートルまで成長したら、これらをTOM2プレート上に広げる。フラグメント解析を使用して、標的位置で変異（例えば、挿入または欠失（インデル））についてカルスをスクリーニングする。野生型対照と比較してサイズシフトを示している候補をさらなる培養のために選択し、結果として生じた芽をフラグメント解析によって試験して、変異の存在を再度確認する。
改変されたタバコまたは大麻植物（T0世代）を実施例5に記載の通り生育させる。次いで、テルペノイドレベルを実施例7に記載の通り測定する。
実施例9. タバコおよび大麻における小型RNA分子を使用した候補遺伝子のノックダウン
特定のテルペノイドのレベルへの影響について、実施例1において特定された遺伝子の発現の低減を試験する。
CaMV 35Sによって駆動されるSEQ ID NO：1～42、112～139、155～156、158～159、および161～190のそれぞれ1つずつの転写または翻訳を低下させるように設計された人工miRNAを含む、別々の形質転換ベクターを構築する。
改変されたタバコ植物（T0世代）を実施例5に記載の通り生育させる。次いで、テルペノイドレベルを実施例7に記載の通り測定する。
実施例10. 毛状突起特異的プロモーターでテルペノイド生合成遺伝子を発現させる
毛状突起特異的プロモーターを使用して、テルペノイド生合成に関与する遺伝子の発現を駆動する。各毛状突起特異的プロモーター（例えば、SEQ ID NO：104～111および206～208、表1を参照のこと）が、ネオメントールデヒドロゲナーゼ（NtNMD；SEQ ID NO：15）、またはcis-アビエノールシンターゼの2つのアイソフォーム（NtaABS（アイソフォーム1；SEQ ID NO：4）およびNtABS（アイソフォーム2；SEQ ID NO：5））の1つもしくはそのホモログ、例えば、cis-アビエノールシンターゼ（例えば SEQ ID NO：119）の発現を別々の構築物で駆動する形で、構築物を実施例4に記載の通り作製する。
実施例5に記載の通り、構築物の各々で、タバコまたは大麻細胞を別々に形質転換し、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる。改変されたタバコまたは大麻植物を、実施例7に提供した通りテルペンについて試験する。

Claims (63)

  1. 異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  2. 少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、該内因性遺伝子の増加したmRNA発現または該ポリペプチドの増加した蓄積を示す、前記改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  3. 少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸配列を含む核酸分子に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  4. 前記ポリペプチドが、ゲラニル二リン酸シンターゼ（GDP）、リモネンシンターゼ（LS）、リモネン 3-ヒドロキシラーゼ（L3OH）、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ（IPD）、プレゴンレダクターゼ、メントフランシンターゼ（MFS）、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS）、ネオメントールデヒドロゲナーゼ（NtNMD）、フィロプラニン、プレムナスピロジエンオキシゲナーゼ（PSO）、コラベニル二リン酸シンターゼ（KPS）、ソラネシルリン酸シンターゼ3、テルペンシンターゼ10様、およびゲルマクレンDシンターゼからなる群より選択される、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  5. 少なくとも1つのテルペンが、メントールまたは関連化合物である、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  6. 前記ポリペプチドが、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS2）、8-ヒドロキシ-コパリル二リン酸シンターゼ、およびcis-アビエノールシンターゼからなる群より選択される、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  7. cis-アビエノールシンターゼが、cis-アビエノールシンターゼアイソフォーム1およびcis-アビエノールシンターゼアイソフォーム2からなる群より選択される、請求項6記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  8. 少なくとも1つのテルペンがラブダノイドである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  9. 少なくとも1つのテルペンがネオフィタジエンである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  10. ラブダノイドがcis-アビエノールである、請求項8記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  11. 前記ポリペプチドがセンブラトリエノールシンターゼ2aである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  12. 少なくとも1つのテルペンがセンブラトリエンジオールである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  13. 前記ポリペプチドがレボピマラジエンシンテターゼである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  14. 少なくとも1つのテルペンがレボピマル酸である、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  15. 前記ポリペプチドが、2-イソプロピルリンゴ酸シンテターゼ（IPS）、2-オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、および2-アルケナールレダクターゼからなる群より選択される、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  16. 少なくとも1つのテルペンがL-ロイシンである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  17. 前記核酸配列が、SEQ ID NO：1～21、112～125、155、158、および176～190からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも70％同一である配列を含む、請求項1記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  18. 前記内因性遺伝子が、SEQ ID NO：22～42、126～139、156、159、および161～175からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも70％同一である配列を含む、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  19. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO：43～63、140～153、157、160、および191～205からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一または類似のアミノ酸配列を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  20. 異種プロモーターが構成的プロモーターを含む、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  21. 異種プロモーターが、組織優先型（tissue-preferred）プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  22. 組織優先型プロモーターまたは組織特異的プロモーターが、毛状突起優先プロモーターまたは毛状突起特異的プロモーターを含む、請求項21記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  23. 異種プロモーターが、SEQ ID NO：104～111、206～208、またはその機能的断片に対して少なくとも90％同一である核酸配列を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  24. 前記改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの前記組換え核酸分子を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、請求項1記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  25. 前記改変されたタバコまたは大麻植物が、前記対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  26. 前記少なくとも1つのテルペンの増加した量が、前記対照タバコまたは大麻植物と比較して少なくとも5％の増加を含む、請求項24または25記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  27. 前記タバコ植物、タバコ種子、またはその部分が、熱風乾燥品種（flue-cured variety）、ブライト品種（bright variety）、バーレー品種（Burley variety）、バージニア品種（Virginia variety）、メリーランド品種（Maryland variety）、ダーク品種（dark variety）、ガルパオ品種（Galpao variety）、オリエンタル品種（Oriental variety）、およびトルコ品種（Turkish variety）からなる群より選択されるタバコ品種のものである、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコ植物、タバコ種子、またはその部分。
  28. 前記タバコまたは大麻植物が、雄性不稔または細胞質的に雄性不稔である、請求項1～3のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  29. 少なくとも1つの非天然変異についてホモ接合性である、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  30. 少なくとも1つの非天然変異についてヘテロ接合性である、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  31. 少なくとも1つの非天然変異が、挿入、欠失、置換、重複、および逆位からなる群より選択される変異を含む、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  32. 少なくとも1つの非天然変異が、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  33. 少なくとも1つの非天然変異がヌル変異を含む、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  34. 少なくとも1つの非天然変異が、前記ポリペプチドの短縮をもたらす、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  35. 少なくとも1つの非天然変異が、プロモーター、5'-非翻訳領域（UTR）、エクソン、イントロン、3'-UTR、およびターミネーターからなる群より選択される配列領域における変異を含む、請求項2記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分。
  36. 請求項[0059]～35のいずれか一項記載の改変されたタバコもしくは大麻植物、タバコもしくは大麻種子、またはその部分に由来する、乾燥タバコ材料または大麻材料。
  37. 熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および天日乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスによって作製される、請求項36記載の乾燥タバコ材料。
  38. タバコまたは大麻製品が、クレテック、ビディシガレット、シガリロ、非通気リセスドフィルター（non-ventilated recess filter）シガレット、通気リセスドフィルター（vented recess filter）シガレット、葉巻、スナッフ、パイプタバコ、パイプ大麻、葉巻タバコ、葉巻大麻、シガレットタバコ、シガレット大麻、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、水大麻、刻みタバコ、刻み大麻、カットタバコ、およびカット大麻からなる群より選択される、請求項36または37記載の乾燥タバコ材料または大麻材料を含むタバコ製品。
  39. 無煙タバコまたは無煙大麻製品である、請求項38記載のタバコまたは大麻製品。
  40. 無煙タバコまたは無煙大麻製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、固形噛みタバコ、固形噛み大麻、モイストスナッフ、鼻用スナッフ、ドライスナッフ、およびスヌースからなる群より選択される、請求項39記載のタバコまたは大麻製品。
  41. 請求項36または37記載の乾燥タバコ材料または大麻材料を含む、再構成タバコまたは大麻。
  42. 請求項36または37記載の乾燥タバコ材料または大麻材料を含む、発酵タバコまたは発酵大麻。
  43. 再構成タバコまたは再構成大麻を含む、請求項38記載のタバコまたは大麻製品。
  44. 発酵タバコまたは発酵大麻を含む、請求項38記載のタバコまたは大麻製品。
  45. 異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え核酸分子。
  46. 以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法：
    組換え核酸分子を少なくとも1つのタバコ細胞に導入する工程であって、該組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されているテルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、工程；
    該組換え核酸分子を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および
    工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該組換え核酸分子を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
  47. 以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法：
    少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞において、テルペン生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの非天然変異を誘導する工程；
    工程（a）から該少なくとも1つの非天然変異を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を選択する工程；および
    工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞から、改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの増加した量を含む、工程。
  48. 以下の工程を含む、改変されたタバコまたは大麻植物を生産する方法：
    組換えDNA構築物を少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞に導入する工程であって、該組換えDNA構築物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、工程；
    該組換えDNA構築物を含む少なくとも1つのタバコまたは大麻細胞を選択する工程；および
    工程（b）で選択された少なくとも1つのタバコ細胞から、少なくとも1つの改変されたタバコまたは大麻植物を再生させる工程であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該組換えDNA構築物を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、少なくとも1つの組織中に少なくとも1つのテルペンの低減した量を含む、工程。
  49. 改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコまたは大麻材料を使用してタバコ製品を調製する工程を含む方法であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、方法。
  50. 改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコ材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、該改変されたタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く対照タバコまたは大麻植物と比較して、該内因性遺伝子の増加したmRNA発現または該ポリペプチドの増加した蓄積を示す、方法。
  51. 改変されたタバコまたは大麻植物由来の乾燥タバコ材料を使用してタバコまたは大麻製品を調製する工程を含む方法であって、該改変されたタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含む、方法。
  52. タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、該組換え核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法。
  53. タバコまたは大麻細胞を組換え核酸分子で形質転換する工程を含む方法であって、該組換え核酸分子が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む、方法。
  54. 以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法：
    少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコ植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、異種プロモーターに機能的に連結されている少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む、工程；および
    少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、該少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が該組換え核酸分子を含む、工程。
  55. 以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法：
    （a）少なくとも1つの後代タバコまたは大麻種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列に結合可能かつ該核酸配列の発現を低減可能な少なくとも1つの小型RNA分子をコードする核酸に機能的に連結されている異種プロモーターを含む組換え核酸分子を含む、工程；および
    （b）少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、該少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が該組換え核酸分子を含む、工程。
  56. 以下の工程を含む、タバコまたは大麻植物を生産するための方法：
    少なくとも1つの後代タバコ種子を生産するために、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物を、第2のタバコ品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物と交雑させる工程であって、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、少なくとも1つのテルペンの生合成に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも1つの非天然変異を含み、第1のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、同等条件下で生育させたときの該少なくとも1つの非天然変異を欠く第1のタバコまたは大麻品種の対照タバコまたは大麻植物と比較して、該内因性遺伝子の増加したmRNA発現または該ポリペプチドの増加した蓄積を示す、工程；および
    少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物を選択する工程であって、該少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子またはそれから発芽した植物が、該少なくとも1つの非天然変異を含む、工程。
  57. 第1のタバコ品種および第2のタバコ品種が同じタバコ品種であるか、または第1の大麻品種および第2の大麻品種が同じ大麻品種である、請求項54～56のいずれか一項記載の方法。
  58. 第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が前記組換え核酸分子を含む、請求項54～55のいずれか一項記載の方法。
  59. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記組換え核酸分子についてヘテロ接合性である、請求項54～55のいずれか一項記載の方法。
  60. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記組換え核酸分子についてホモ接合性である、請求項54～55のいずれか一項記載の方法。
  61. 第2のタバコまたは大麻品種の少なくとも1つのタバコまたは大麻植物が、前記少なくとも1つの非天然変異を含む、請求項56記載の方法。
  62. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記少なくとも1つの非天然変異についてヘテロ接合性である、請求項56記載の方法。
  63. 前記少なくとも1つの後代タバコもしくは大麻種子、またはそれから発芽した植物が、前記少なくとも1つの非天然変異についてホモ接合性である、請求項56記載の方法。
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