JP4217482B2 - 高等植物のプラスチド形質転換の方法及びベクター - Google Patents
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Description
一般的な分子クローン化技術の発達に伴って、やがて形質転換によって高等植物を遺伝的に改変させることが可能になった。最近その完全な配列が発表されたシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(シロイヌナズナゲノムイニシアチブ(The Arabidopsis Genome Initiative)、2000)の場合、遺伝子の大部分、約26,000個が細胞核に存在するので、植物形質転換における主な重点は、昔も今も核の形質転換にある。核の形質転換が効率的に行えるように改変することができる、アグロバクテリア(Agrobacterium tumefaciens)など生物ベクターを利用することができたので、核の形質転換を実現することがより容易であった(Galvin、1998)。さらに、オルガネラは一般に、DNAなど高分子を透過させない2重の包膜に囲まれているが、核は外来核酸とより直接に接近することができる。
(a)プラスチドゲノム中の遺伝子の機能を改変又は破壊して、選択可能な又は認識可能な表現型を生じさせる段階、
(b)前記表現型を発現するプラスチドを含む植物又は細胞を分離又は選択する段階、
(c)前記機能を修復することができる修復配列を有する少なくとも1つの形質転換ベクターを用いて、前記分離した又は選択した植物、種、細胞、又はプラスチドの前記プラスチドゲノムを形質転換させる段階、
(d)前記修復された機能を発現するプラスチドを有する、前記形質転換された植物又は細胞を分離又は選択する段階。
本発明の明細書中で使用する特定の用語の意味を明確にするために、以下の定義を示す。
遺伝子は、少なくとも1つの完全なコード領域を含むオペロンとして組織化される。
ポリペプチドをコードする遺伝子では、これらの要素は、(1)プロモーター、(2)5’非翻訳領域(5’−UTR)、(3)完全なコード領域、(4)3’非翻訳領域(3’−UTR)である。
RNAをコードする遺伝子では、5’−UTR及び3’−UTRは存在しない。
1つより多くのコード領域からなるオペロンでは、前後する2つの完全なコード領域が、スペーサーによって分離されており、プロモーター、5’−UTR、3’−UTR要素は、そのオペロンのコード領域によって共用される。
植物細胞を死滅させないが成長をある程度まで阻害する致命的でない阻害剤濃度を、プラスチド形質転換で用いることができる。細胞1個あたり最高10000個もあるプラストームコピーのうち、1個又は数個のみが、最初の形質転換現象の後に組換え体となるとみなされる。形質転換されたプラストームのコピー数は低いので、形質転換させた後に、培養した細胞又は組織を致死的な阻害剤濃度で処理すると、中程度の耐性を発現するヘテロプラストミック細胞の回収ができなくなる。選択及び分離によって、野生型とトランスプラストミック組織の両方が生じる。形質転換されたプラスチドが野生型のプラスチドを覆い隠してしまう可能性があるので、このプロセス中に野生型と遺伝子導入組織を識別することは大きな課題である。KhanとMaliga(1999)は、aadA及びGFPコード領域を含む蛍光抗生物質耐性マーカーを使用して、紫外光下でプラスチド形質転換体の分離を追跡した。本発明では、裸眼で検出することができる、トランスプラストミック組織領域の可視マーカーを提示する。野生型及び組換えプラスチドを選別する段階的なプロセスは容易にモニターすることができ、したがって加速させることができる。変異表現型の白色背景上での緑色領域の出現は、簡単に検出することができる。
従来の葉緑体形質転換戦略は、阻害剤たとえばスペクチノマイシンに対する耐性の選択性に基づいている。阻害剤の施用を形質転換させた後に開始し、ホモプラストミックな遺伝子型を得るのに必要な反復再分化プロセスの間中ずっと施用し続けなければならない。阻害剤の施用には、再分化の可能性を減少させる欠点がある。単一のプロトプラスト又は葉の小片から植物全体を再分化させることは、特にこの方法を種に広げる場合、確立され信頼できる再分化プロトコルは存在しないので、葉緑体形質転換における重要な段階である。最初の形質転換後の短い期間だけ阻害剤を利用すればよいかもしれないことは、本発明の主な利点である。本発明の新規な方法を使用すると、ホモプラストミック状態を得るための反復再分化中で、また第2の形質転換段階の全体で阻害剤の施用を省くことができる。
プラスチドの相同組換えは、高効率で起こることが知られている。その結果、抗生物質耐性マーカーの調節要素と内在性調節要素との間の望ましくない組換え現象により、遺伝的な不安定さがもたらされる可能性がある(Eibl他、1999)。第2の形質転換段階の後、トランスプラストミック植物はどのようなマーカー発現カセットも含まない。その結果、最終的な形質転換体に含まれる相同領域は、従来のプラスチド形質転換体に比べて少ない。形質転換体の遺伝的な安定性が増強され、配列の望まない損失(Eibl他、1999)が回避される。
rpoB遺伝子機能の標的破壊のために、rpoBプロモーター及びその開始コドンをたとえばaadAマーカー遺伝子又は別のマーカー遺伝子で置換することができる。aadAマーカーの場合、ボンバードした葉組織を、スペクチノマイシンを含む培地上での一時的選択下で再分化させることができる。形質転換体は、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず、抗生物質耐性を示し、最初は光中で緑色表現型を示す。これら一次形質転換体は野生型と形質転換された葉緑体ゲノムの両方の混合物を含む。緑色のヘテロプラストミックな材料を非選択的培地に移す。分離により、白色領域、混合領域、及び緑色領域がもたらされる。ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、白色領域からの材料で、非選択的培地上で数回の追加の再分化ラウンドを行った。
ycf3遺伝子の破壊は、5’制御要素とycf3の最初のエキソンをaadAマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子で置換することによって実施することができる。形質転換ベクターは、たとえば微粒子銃プロトコル又はPEGで媒介する形質転換を使用してタバコプラスチドに導入することができる。微粒子銃プロトコルの場合、ボンバードした葉組織は、阻害剤又は抗生物質、aadA遺伝子の場合はスペクチノマイシンを含む培地での選択下で再分化させる。形質転換体は阻害剤耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず通常の光条件(3.5〜4W/m2)で最初は緑色表現型を示す。これら一次形質転換体は通常、野生型及び形質転換された葉緑体ゲノムの混合物を含む。抗生物質を含まない培地に移した後、分離により、黄色−白色区域及び緑色区域(通常の光条件下、上記参照)が出現する。ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で、白色区域からの材料で、数回の追加の再分化ラウンドを行った。光中で蒼白な、ほとんど白色の表現型を有する他は、この変異体は成長が抑制されていた。第2の形質転換段階用に十分な材料を得るために、変異植物系を低い光条件に移すことができる。これらの条件下(0.4〜0.5W/m2)では、植物はそれほど目立たない表現型を示し、たとえばパーティクルガンによる形質転換のための適切な供与材料を得ることができる。この第2の形質転換では、ycf3遺伝子を再構成し、マーカー遺伝子を取り除き、好ましくは目的の遺伝子(又は複数の遺伝子)を導入することが同時にできるように設計されたベクターを用いてホモプラストミックΔycf3植物を形質転換させる。ボンバードした葉組織は、ショ糖減培地(抗生物質を含まない)での選択下で、強い光の下で再分化させることができる。正常な緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択することができる。
petA遺伝子の標的破壊のために、コード領域をマーカー遺伝子たとえばaadAマーカー遺伝子で置換することができる。パーティクルボンバードメントによる形質転換の場合、ボンバードした葉組織は、抗生物質を含む培地での選択下で再分化させることができる。形質転換体は抗生物質耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で最初は緑色表現型を示す。これら一次形質転換体は通常、野生型及び形質転換された葉緑体ゲノムの混合物を含む。抗生物質を含まない培地に移した後、分離により、紫外光照明下で検出することができるhcf表現型を示す区域が出現する。ホモプラストミック変異体材料を得るために、非選択的培地上で、変異体区域からの材料で、数回の追加の再分化ラウンドを実施することができる。
この方法は、光合成に欠陥があるすべての変異体で用いることができる。実施形態3と同様に、プラスチド形質転換体の選択は、petA遺伝子の不活性化及び修復に基づいて行うことができる。対照的に、ΔpetA変異体の選択は、有効であるには光合成の活性が必要とされる除草剤たとえば除草剤パラコートを含む培地で実施することができる。petA遺伝子が少しでも完全に不活性化されていれば、このような除草剤に対する変異植物系の耐性が野生型に比べて増大する可能性がある。重要なことに、第1の形質転換段階でどのような抗生物質又は除草剤耐性マーカーの導入も省略することができる。
形質転換の第1又は第2の段階或いはその両方中に目的の遺伝子又は配列を導入することができる。したがって、複数の遺伝子又は機能的なオペロンを標的植物内に導入することができる。多くの新規な遺伝子及び/又は制御因子をプラストームに組み込まなければならないことがあるので、とりわけ、これはトランスプラストミック植物における新しい代謝経路を生成する際に特に関心が持たれている。
本発明で説明した2つの段階の戦略のさらなる応用は、選択マーカーを第2の段階でゲノムから取り除いた後、同じ選択マーカーを別の形質転換で再利用する方法である。その後、選択マーカーを再度取り除き、このプロセスを繰り返すことができる。これは、同じマーカー遺伝子を使用して、潜在的に無限数の遺伝子又は機能的オペロンをプラスチドゲノムに挿入する手段を提供する。これは、プラスチド遺伝子の形質転換における選択マーカーの不足を打開するのに向けた重要な一歩である。
記載した方法(たとえばそれぞれrpoA、ycf3、petAを標的部位として利用した実施形態1、2、3)の様々な組合せを使用することによって、目的の遺伝子をプラストーム内の様々な標的部位に導入することができる。本明細書中に記載する方法はまた、光合成に関連する他の標的遺伝子たとえばpsbAの不活性化及び修復を利用して機能する。したがって、多数の潜在的な標的部位が存在する。相同組換えを使用して、マーカー遺伝子に依存しない部位に新規機能を導入することもできる。
通常使用される選択マーカー遺伝子はaadA遺伝子だけしかなく(Heifetz、2000)、高等植物のプラスチド形質転換において機能すると分かっている代替物はnptII遺伝子だけである(Carrer他、1993)。本発明のベクターは選択マーカー遺伝子の不足を打開する。本明細書中に記載する、プラスチド形質転換の新規な選択的阻害剤には、パラコート、モルファムコート、ジクワット、ジフェンゾコート、サイパーコートが含まれる。これらの物質は光化学系I受容体除草剤のグループに属する(Hock及びElsner、1995)。これらは光化学系Iの阻害剤ではないが、フェレドキシンやNADPではなく光化学系Iによって還元される。還元された阻害剤の自動酸化は、有害性の高い活性酸素を生成する。したがって、これらの除草剤の有害性は光と酸素に依存する。
本発明を、以下の詳細な実施例を参照することによってさらに説明する。これらの実施例は例示目的でのみ提供し、別段の指定がない場合は限定的なものとしない。本発明で使用する通常の組換えDNA及び分子クローン化技術は当技術分野で周知であり、Ausubel他、1999、Maniatis他、1989、Silhavy他、1984に記載されている。
rpoB遺伝子を不活性化させるための形質転換ベクターplC571の構築
タバコ植物の葉を液体窒素下で粉砕し、キアゲン(Qiagen)の「DNeasy Plant Mini Kit」を使用して全DNA(Nicotiana tabacum L.var.petit havanna)を単離した。
PEGに媒介された、DNAのプロトプラストへの膜貫通移送は、高等植物のプラスチド形質転換における再現性のある方法である(Golds他、1993、O’Neill他、1993)。Dovzhenko他、1998によると、プロトプラストの再分化は最近最適化された。
変異ΔrpoBトランスプラストミック植物の葉を液体窒素下で粉砕し、キアゲン「DNeasy Plant Mini Kit」を使用して全DNA(Nicotiana tabacum L.var.petit havanna)を単離した。
この選択システムの原理の証明のために、rpoB制御領域の除去を再構成し同時にマーカー制限部位を導入する、形質転換ベクターを構築した。この追加のマーカー制限部位は、対応する領域内の組換えプラストーム断片の区別を可能にし、残存野生型プラストームコピーの潜在的な選択(変異系が完全にホモプラストミックでない場合)を可能にするものである。
第2の形質転換の目的は、rpoB遺伝子の制御領域(翻訳開始点を含む)を再構成すること、aadAカセットを取り除くこと、マーカー制限部位を導入することを同時に行うことである。VBW培地で成長させた無菌ホモプラストミックΔrpoB変異体から採った若い葉を、バイオラッド(Bio−Rad)(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを使用して、プラスミドplC554でコーティングした金粒子を用いてボンバードした(詳細な手順は実施例3参照)。ボンバードメントの2日後、葉を小片に切り(約3×3mm)、固形のショ糖減RMOP培地(3g/リットルのショ糖を含む)に移した。3週間毎に再度葉片を切り新しい培地に移し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。緑色表現型を示し、光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択し、ホモプラストミック組織を得るためにショ糖減RMOP培地上でさらに追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミックトランスプラストミック系を固形B5培地上で根付かせ、増殖させた。
二次形質転換から回収した、無菌的に成長させた植物から単離した全DNAを使用してDNAゲルブロット分析を行った。
rpoA遺伝子の不活性化のための形質転換ベクターpGEM−rpoA−delの構築
タバコ葉緑体ゲノム(プラストームヌクレオチド79401〜82470に対応)内のrpoA読み枠を含む領域を、タバコの葉組織から単離したゲノムDNAから、Taqポリメラーゼ(キアゲン)を使用したPCRによって増幅した。以下の組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、p78 5’−SphI−TTA GTA ACA AGC AAA CCT TG−3’(プラストームヌクレオチド79401〜79420とアニーリング)と、p77 5’−SmaI−TAA TTA CTG AAT CGC TTC CCA−3’(プラストームヌクレオチド82470〜82450とアニーリング)である。
無菌タバコ植物からの若い葉(栽培は実施例1参照)を、バイオラッド(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを使用して、プラスミドpGEM−rpoA−delでコーティングした金粒子でボンバードした(詳細な手順は実施例3参照)。ボンバードメントの2日後、葉を小片に切り(約3×3mm)、500μg/mlのスペクチノマイシンを含む固形のRMOP培地に移した。2週間後に再度葉片を切り新しい培地に移し、その後3週間毎にそれ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。一次ΔrpoA形質転換体はスペクチノマイシン耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で緑色表現型を示した。形質転換されたプラスチドDNA分子を増幅し、野生型ゲノムを排除するために、一次形質転換体を用いて選択培地上で追加の3ラウンドの再分化を行った。分離により白色区域及び緑色区域の発生がもたらされるので、ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で、白色区域からの材料でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、固形VBW培地上に根付かせ増殖させた(Aviv及びGalun、1985、実施例1参照)。
分析した各植物につき3μgの全植物DNAを適切な制限酵素で消化し、TBEアガロースゲル(0.8%)で分離した。Ausubel他、1999に記載のように、DNAを変性させ、正に帯電させたナイロン膜(Hybond−N+、アマシャム)に移した。DIG Easy Hyb Buffer(ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ)中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをDIG Luminescent Detection Kit(ロシュ)を使用して検出した。室温で膜をX−OMAT LSフィルムに露出させた。
記載の選択システムを使用して任意の目的の遺伝子が挿入できることを実証するために、rpoAコード領域の除去を再構成し、同時にgusマーカー遺伝子を導入する形質転換ベクターを構築した。
第2の形質転換の目的は、rpoAコード領域を再構成し、同時にaadAカセットを取り除き、同時にgusマーカー遺伝子を導入することである。VBW培地で成長させた無菌ホモプラストミックΔrpoA変異体から採った若い葉を、バイオラッド(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを使用して、プラスミドplC598でコーティングした金粒子でボンバードした(詳細な手順は実施例3参照)。ボンバードメントの2日後、葉を小片に切り(約3×3mm)、固形のショ糖減RMOP培地(3g/リットルのショ糖を含む)に移した。3週間毎に再度葉片を切り新しい培地に移し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。緑色表現型を示し、光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択し、ホモプラストミック組織を得るためにショ糖減RMOP培地上でさらにいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミックトランスプラストミック系を固形B5培地上で根付かせ、増殖させた。
分析した各植物につき3μgの全植物DNAを適切な制限酵素で消化し、TBEアガロースゲル(0.8%)で分離した。Ausubel他、1999に記載のように、DNAを変性させ、正に帯電させたナイロン膜(Hybond−N+、アマシャム)に移した。DIG Easy Hyb Buffer(ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ)中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをDIG Luminescent Detection Kit(ロシュ)を使用して検出した。室温で膜をX−OMAT LSフィルムに露出させた。
ycf3の標的不活性化のための形質転換ベクターplC553の構築
タバコ葉緑体ゲノム中のycf3読み枠を含む領域を、タバコの葉組織から単離したゲノムDNAから、Taqポリメラーゼ(キアゲン)を使用したPCRによって増幅した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーの組を使用した。すなわち、oFCH63(5’−GAA GTT TCT TTC TTT GCT ACA GC−3’、プラストームヌクレオチド45033〜45053とアニーリング)とoFCH64(5’−GAA TTA CCA AAC CAT TTG ACC C−3’、プラストームヌクレオチド47667〜47647とアニーリング)である。
電気的コンピテント細胞の調製:1リットルのLB培地(1%(w/v)カゼイン加水分解物、0.5%(w/v)酵母抽出物、0.5%(w/v)NaCl)を、新鮮な終夜培養した大腸菌JM109細胞(プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン)を用いて1:100で接種した。細胞を37℃で、220rpmで振盪しながら、600nmで最適密度である0.5にした。細胞を20分間氷冷し、15分間遠心した(4000rpm、4℃)。上清を取り除き、ペレットを1リットルの氷冷無菌10%(v/v)グリセロールに再懸濁させた。細胞を上記のように2回遠心し、それぞれ500ml及び20mlの氷冷無菌10%(v/v)グリセロールに再懸濁させた。細胞をもう一度遠心し、ペレットを2mlの氷冷無菌10%(v/v)グリセロールに再懸濁させた。この懸濁液を80μlのアリコットで凍結し、−80℃で保存した。
タバコの種子(Nicotiana tabacum cv.petit havanna)の表面を滅菌し(70%エタノールに1分間、5%Dimanin C、バイエル(Bayer)、レバークーゼン、ドイツ)、滅菌H2Oで3回10分間洗浄し、B5培地上に置いた(調製法は下記参照)。植物を25℃で16時間光/8時間暗サイクルで成長させた(0.5〜1W/m2、オスラム(Osram)L85W/25 Universal−White蛍光ランプ)。
−ラプチャーディスク 900psi
−ヘリウム圧 1100psi
−真空 26〜27インチHg
−マクロキャリア、トップレベル
−葉片、第3レベル
を使用して、バイオラッド(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを用いて、ボンバードメントを行った。6枚の葉片をそれぞれ5.4μlの金懸濁液でボンバードした。ボンバードメント後、葉片を2日間25℃でRMOP培地上でインキュベートした。
PCR増幅によってプラスチド形質転換体を同定した。40個の独立した系の最初の再分化体から単離した全DNAを、個別のPCR反応の鋳型として使用した。使用した方法は以下のとおりである。新しいタバコの葉組織100mgを、mixer mill MM300(レッチェ(Retsch))を使用して、200μlのAP1緩衝液(DNeasy plant mini kit、キアゲン)/1μlのDX試薬(起泡性の阻害、キアゲン)中で、3mmのタングステンカーバイドビーズを用いて1.5mlミクロ遠心チューブに入れて、破壊した(2×25Hzで1分間)。その後、DNeasy plant mini kitを使用してDNAを精製した。トランスプラストミック植物を分析するために、5組のプライマー(配列を表1に示す)、すなわちoFCH59とoFCH60、oFCH52とoFCH53、oFCH52とoFCH60、oFCH53とoFCH59、oFCH60とoFCH27を利用した。oFCH52及びoFCH53は、野生型プラストームからは900bpの、形質転換されたプラストームからは1700bpの増幅産物を生じるはずであるが、oFCH59及びoFCH60は、形質転換された植物からは480bpの増幅産物を生じ、野生型からはまったく生じないはずである。同様に、oFCH52、oFCH60、及びoFCH53、並びにoFCH59は、形質転換された植物のみからそれぞれ867bp並びに1368bpの産物が増幅されるはずである。oFCH60とoFCH27の組合せでは、正しく形質転換されたプラストームからの2541bpの産物を増幅することによって、形質転換体が正しい挿入物を保有しているかどうかを判定することができる。
形質転換ベクターplC526は、ycf3遺伝子を再構成すること、aadAカセットを除去すること、GFP遺伝子を挿入することを同時に行うことを目的として、変異Dycf3系を形質転換させるように設計された。
第2の形質転換の目的は、ycf3遺伝子を再構成すること、aadAマーカーを取り除くこと、gfp遺伝子を導入することを同時に行うことであった。固形VBW培地上で、低い光条件下で成長させた無菌ホモプラストミックDycf3変異体から採った若い葉を、バイオラッド(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを使用して(詳細な手順は上記参照)、プラスミドplC526でコーティングした金粒子を用いてボンバードした。ボンバードメントの2日後、葉を小片に切り(約3×3mm)、固形のショ糖減RMOP培地(3g/リットルのショ糖を含む)に移し、2週間の間低い光条件下で培養した。3週間毎に再度葉片を切り新しい培地に移し強い光条件下で培養し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長できる形質転換体を選択し、ホモプラストミック組織を得るために、ショ糖減RMOP培地上でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、強い光条件下で固形B5培地上に根付かせ増殖させた。
PCR増幅によってプラスチドの形質転換を確認した。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができた一次形質転換体から単離した全DNAを、以下のプライマーの組を使用したPCR分析の鋳型として使用した。すなわち、oFCH76(5’−GTA GCA ATC CAT TCT AGA AT−3’、プラストームヌクレオチド46269〜46288とアニーリング)とoFCH53(5’−GAC TAT AGT TAA TGG ATA CTC−3’、プラストームヌクレオチド46812〜46792とアニーリング)である。このオリゴヌクレオチドプライマーの組は、野生型プラストームからは540bpの、第2ラウンドで正しく形質転換されたプラストームからは1400bpの増幅産物を生じ、改変されていない第1ラウンドの形質転換体からはまったく生じないはずである(p76アニーリングの部位が除去されているので)。
プラスチドにコードされるpetA遺伝子の不活性化のための形質転換ベクターplC558の構築
すべてのクローン化手順は、実施例1及びAusubel他、1999に記載の通常のプロトコルを使用して実施した。
第2の形質転換の目的は、petAの不活性化を修復し、同時にプラストームに新しい目的遺伝子(uidA又はaphA−6、潜在的にnptII)を挿入することである。したがって、petA遺伝子及び遺伝子カセット(5’/3’制御要素を含む)を、左/右フランキング配列の間にクローニングした。ベクターplC597(uidAカセット)は、ベクターplC558、petA遺伝子、uidA遺伝子カセットと同じフランキング配列を含む。
ベクターplC558を用いたパーティクルガンによるプラスチド形質転換及びその選択を、実施例3に記載のように実施した。ベクターplC558を用いたPEGに媒介されるプラスチド形質転換を、実施例1に記載のように実施した。
ベクターplC558を用いたパーティクルガンによるプラスチド形質転換及びその選択を、実施例3に記載のように実施した。ベクターplC588を用いたPEGに媒介されるプラスチド形質転換を、実施例1に記載のように実施した。形質転換体の選択は以下のように実施した。
a)減少させたショ糖含量(0.3%)のRMOP培地上で実施した。petAノックアウトの再構成を用いた形質転換体は、成長エネルギーとして光合成を利用できるはずである。
b)選択剤としてカナマイシンを含むRMOP培地上で実施(aph−6及びnptIIの遺伝子産物はカナマイシンを解毒する)。
形質転換体は、再分化の反復サイクル中、hcf(高クロロフィル蛍光)の減少を示した。
植物DNAの単離、PCR分析及びサザンブロットのため、実施例1に記載のように通常のプロトコルを使用した。aadA遺伝子を決定するために、プライマーoFCH59−aadA480−liとoFCH60−aadA480−re(5’−CAC TAC ATT TCG CTC ATC GCC−3’)を使用した。形質転換体が正しい挿入物を有するかどうかを決定するために、プライマーoFCH60−aadA480−reとoSK116−petA−re(5’−AAAATAGATTCATTAGTCCGATACC−3’)を使用した。プライマーoSK116−petA−reは、5’フランキング断片の上流(外側)に位置する。使用したPCRプログラムは以下のとおりである。94℃で3分間、1サイクル;94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で2分間、30サイクル;最終伸長、72℃で10分間。
植物DNAの単離、及びPCR分析のため、実施例1に記載のように通常のプロトコルを使用した。uidA遺伝子を決定するために、プライマーoSM61−GUS−N(5’−TCACACCGATACCATCAGCG−3’)とoSM62−GUS−C(5’−ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC−3’)を使用した。形質転換体が正しい挿入物を有するかどうかを決定するために、プライマーoSM61−GUS−N(5’−TCACACCGATACCATCAGCG−3’)とoSK138−petA−3’−re(5’−AATCGTAACCAGTC TCTACTGG−3’)を使用した。使用したPCRプログラムは以下のとおりである。94℃で3分間、1サイクル;94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で2分間、30サイクル;最終伸長、72℃で10分間。
植物の形質転換及びパラコート耐性の選択
実施例4に記載のように、4つの葉片をそれぞれ1μgのplC558(図8)を用いて形質転換させた。ボンバードメントの後、葉片を25℃で2日間、RMOP培地上でインキュベートした。
分析した各植物につき3mgの全植物DNAを適切な制限酵素で消化し、TBEアガロースゲル(1%)で分離した。Ausubel他、1999:分子生物学の手短なプロトコル(Short protocols in molecular biology)Wiley、第4版、ユニット2.9Aに記載のように、DNAを変性させ、正に帯電させたナイロン膜(Hybond−N+、アマシャム)に移した。DIG Easy Hyb Buffer(ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ)中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをDIG Luminescent Detection Kit(ロシュ)を使用して検出した。室温で膜をX−OMAT LSフィルムに露出させた。
ycf3遺伝子の標的不活性化のための形質転換ベクターplC577の構築
ycf3の第1エキソンとスプライシング部位(プラストームヌクレオチド46042〜46206に対応)をaadAコード領域で置き換えることによってycf3遺伝子を不活性化させるように設計された形質転換ベクターを構築した。このベクターはどのような3’制御配列も含まない(aadAマーカー遺伝子も内在ycf3遺伝子又はtRNA遺伝子も含まない)。さらに、どのようなプロモーター要素も導入されず、aadA遺伝子は内在ycf3上流制御要素によって転写及び翻訳されるものと期待される。
無菌タバコ植物(培養は実施例3参照)から採った若い葉を、バイオラッド(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを使用して、プラスミドplC577でコーティングした金粒子でボンバードした(詳細な手順は実施例3参照)。ボンバードメントの2日後、葉を小片に切り(約3×3mm)、500μg/mlのスペクチノマイシンを含む固形のRMOP培地に移した。2週間後に再度葉片を切り新しい培地に移し、その後3週間毎にそれ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。一次Δycf3形質転換体はスペクチノマイシン耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で緑色表現型を示した。形質転換されたプラスチドDNA分子を増幅し、野生型ゲノムを排除するために、選択培地上で一次形質転換体で3回の追加の再分化ラウンドを行った。分離により白色区域、緑色区域の発生がもたらされるので、ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で白色区域からの材料でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、固形VBW培地(Aviv及びGalun、1985、実施例3参照)上に根付かせ増殖させた。
PCR増幅によってプラスチド形質転換体を同定した。24個の独立した系の最初の再分化体から単離した全DNAを、PCRの鋳型として使用した。2組のプライマー(配列は実施例3を参照)、すなわちoFCH59とoFCH60、oFCH52とoFCH53を利用して、トランスプラストミック植物を分析した。oFCH52及びoFCH53は、野生型プラストームからは900bpの、形質転換されたプラストームからは1476bpの増幅産物を生じるはずであるが、oFCH59及びoFCH60は、形質転換された植物からは480bpの増幅産物を生じ、野生型からはまったく生じないはずである。結果は、14系列の形質転換体がプラスチドゲノム中に正しいaadA挿入物を保有することを示している。このデータはまた、色素欠損はycf3の除去と関連していることを示す、それぞれ系の表現型の出現と矛盾しない。
形質転換ベクターplC637は、ycf3遺伝子を再構成すること、aadA遺伝子を除去すること、カナマイシン耐性を与えるaphA−6遺伝子を挿入することを同時に行うことを目的として、変異Δycf3系を形質転換させるように設計された。
第2の形質転換の目的は、ycf3遺伝子を再構成すること、aadAマーカーを取り除くこと、カナマイシン耐性を与えるaphA−6遺伝子を導入することを同時に行うことであった。低い光条件下で、固形VBW培地上で成長させた無菌ホモプラストミックΔycf3変異体から単離した、包埋したプロトプラストを、バイオラッド(ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)のPDS−1000/He Biolistic particle delivery systemを使用して(詳細な手順は実施例3を参照)、プラスミドplC637でコーティングした金粒子を用いてボンバードした。ボンバードメントの2日後、格子を25μg/mlのカナマイシンを含む固形RMOP培地に移し、2週間の間低い光条件下で培養した。その後、2週間毎に格子を新しい培地に移し強い光条件下で培養し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。カナマイシン耐性を示し、緑色表現型を示す形質転換体を選択し、強い光条件下で固形B5培地に供して、ycf3が再構成されたプラストームを増幅させた(ycf3欠損プラストームは、B5培地上で強い光条件下で成長している場合には増幅されない)。
PCR増幅によってプラスチド形質転換を確認した。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができた一次形質転換体から単離した全DNAを、以下の2組のプライマーを使用したPCR分析の鋳型として使用した。すなわち、oFCH168(5’−TCA GTC GCC ATC GGA TGT TT−3’、aphA−6コード領域の5’部分に由来)とoFCH169(5’−ACC AAT CTT TCT TCA ACA CG−3’、aphA−6コード領域の3’部分に由来)、及びoFCH27(5’−TGC TCA AGA CTT TAG TGG ATC−3’、プラストームヌクレオチド44799〜44819とアニーリング)とoFCH168である。oFCH168及びoFCH169は、再構成された植物からは500bpの増幅産物を生じ、改変されていない第1ラウンドの形質転換体からはまったく生じないはずである。oFCH27とoFCH168の組合せでは、正しく形質転換されたプラストームからの約2300bpの産物を増幅することによって、第2形質転換体が正しいaphA−6挿入物を保有しているかどうかを判定することができる。3グリッドボンバードメントから、合計5個の独特のycf3再構築タバコプラスチド形質転換率が得られた。
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Claims (22)
- プラスチドが形質転換された双子葉植物、植物器官、植物組織を生成する方法であって、
(a)該植物、植物器官又は植物組織のプラスチドゲノムにおいて光合成に関与する遺伝子に追加の配列を挿入し、或いは該遺伝子の少なくとも一部を削除又は置換して、色素欠損、光合成欠損及び/又は改変された蛍光を有する表現型を生じさせる段階、
(b)該表現型を発現している植物、植物器官又は植物組織を分離又は選択する段階、
(c)該分離又は選択した植物、植物器官、又は植物組織の該プラスチドゲノムにおいて、該挿入配列を削除し、該置換配列を元の配列と置換し、又は削除した配列を再挿入して、該光合成に関する機能を修復させる段階、
(c’)段階(a)及び/又は(c)で、該植物、植物器官、又は植物組織のプラスチドゲノムに目的の遺伝子的改変を行い、該プラスチドを形質転換する段階、および
(d)前記修復された機能を発現しているプラスチドを有する、前記形質転換された植物、植物器官、植物組織を分離又は選択する段階
を含む、方法。 - 段階(a)及び/又は(c)での前記目的の遺伝子的改変が、前記植物、植物器官、又は植物組織のプラスチドゲノムへの目的の遺伝子の導入である、請求項1に記載の方法。
- 段階(a)が自然突然変異又は誘導突然変異によって行われる請求項1又は2に記載の方法。
- 段階(a)が遺伝的形質転換によって行われる請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 段階(a)で、前記プラスチドにおいて光合成に関与する遺伝子に外来遺伝子を挿入する、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記外来遺伝子が阻害剤に対する耐性を発現し、段階(b)を該阻害剤の存在下で実施する、請求項5に記載の方法。
- 段階(b)で最初にだけ阻害剤を加える請求項6に記載の方法。
- 段階(c)で、前記挿入された外来遺伝子を除去する請求項5から7の何れか一項に記載の方法。
- 前記挿入された外来遺伝子が阻害剤に対する耐性を発現し、前記遺伝子の除去が該耐性を排除する、請求項8に記載の方法。
- 段階(a)で、前記植物、植物器官又は植物組織の光栄養成長を改変又は破壊し、段階(c)で、該光栄養成長を回復させる、請求項1から請求項9の何れか一項に記載の方法。
- 段階(a)で行われる前記挿入、削除又は置換、及び/並びに段階(c)で行われる前記削除、置換又は再挿入が、相同組換えにより行われる、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 段階(b)で前記植物、植物器官、又は植物組織を混合栄養性で成長させるか又は培養する、請求項1から請求項11の何れか一項に記載の方法。
- 前記色素欠損表現型がクロロフィル欠損である請求項1から12の何れか一項に記載の方法。
- 前記光合成に関与する遺伝子が、RNAポリメラーゼをコードするプラスチド遺伝子である請求項1から請求項13の何れか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が、プラスチドrpoA遺伝子又はrpoB遺伝子であり、段階(b)及び/又は(d)の分離又は選択が、栄養条件化での表現型に基づいて行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記光合成に関与する遺伝子がプラスチドycf3遺伝子である、請求項15に記載の方法。
- 段階(b)及び/又は(d)の分離又は選択が、異なる光強度条件化での表現型に基づいて行われる、請求項16に記載の方法。
- 前記光合成に関与する遺伝子がpetAである、請求項1から13の何れか一項に記載の方法。
- 段階(b)及び/又は(d)の分離又は選択が、高クロロフィル蛍光表現型に基づいて行われる、請求項18に記載の方法。
- 光化学系I受容体除草剤を段階(b)で使用する請求項18又は19に記載の方法。
- 前記光化学系I受容体除草剤が、パラコート、モルファムコート(morphamquat)、ジクワット、ジフェンゾコート、及びサイパーコート(cyperquat)から選択される、請求項21に記載の方法。
- 段階(d)で光栄養条件を使用する、請求項1から請求項21の何れか一項に記載の方法。
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