ES2645434T3

ES2645434T3 - Método de transformación de plastidios en Asteraceae, vector para uso en el mismo y plantas así obtenidas

Info

Publication number: ES2645434T3
Application number: ES03773606.3T
Authority: ES
Inventors: Cecilia Lucia Clara Lelivelt; Jackie M. Nugent; Matthew S. Mccabe
Original assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Current assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2003-08-08
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2023-08-08
Also published as: AU2003282000B2; EP1527184A2; WO2004016793A3; MXPA05001460A; US8884099B2; EP1527184B1; US20060248608A1; EP2295583A2; CA2494986A1; US20100218277A1; AU2003282000A1; EP2295583A3; US7645918B2; WO2004016793A2; CA2494986C

Abstract

Método para la transformación de genomas de plastidio de lechuga, que comprende las etapas de: a) transformar protoplastos de lechuga con un vector de transformación que es portador de una secuencia de ADN de interés por medio de una transformación mediante polietilenglicol; b) colocar los protoplastos tratados de ese modo durante un período de tiempo en contacto con un medio de cultivo sin agente de selección; c) posteriormente añadir un agente de selección al medio de cultivo; d) renovar el medio de cultivo que comprende un agente de selección mediante la adición de medio de nuevo aporte con agente de selección o cambiar el medio de selección por un medio con un agente selectivo; e) crecimiento de los protoplastos que comprenden plastidios que han adquirido el ADN de interés en transformantes.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de transformacion de plastidios en Asteraceae, vector para uso en el mismo y plantas asf obtenidas Campo de la invencion

La invencion se refiere a un metodo para transformer los genomas de plastidios de lechuga.

Antecedentes de la invencion

Los plastidios son organulos autorreplicantes que contienen su propio ADN en un unico cromosoma circular, denominado su genoma. Los plastidios se encuentran en todas las celulas vegetales. Se heredan por v^a materna en la mayona de las plantas al igual que las mitocondrias en los animales y las plantas. Esto tambien se denomina herencia citoplasmica ya que estos organulos estan presentes en el citosol de los ovulos.

Los plastidios vegetales (por ejemplo, cloroplastos, amiloplastos, elaioplastos, etioplastos, cromoplastos, leucoplastos y proplastidios) son los organulos en los que tienen lugar los principales procesos bioqmmicos (es decir, la fotosmtesis). En general, las celulas vegetales contienen entre 100-10.000 copias del pequeno genoma circular de 120-160 kb del plastidio. Puesto que cada molecula tiene una repeticion invertida, es posible teoricamente obtener celulas vegetales con 20.000 copias de un(os) gen(es) de interes, despues de la transformacion de los plastidios.

La transformacion genetica del genoma del plastidio (plastoma) tiene importantes ventajas sobre la transformacion nuclear. En primer lugar, porque en la mayona de las especies vegetales, los plastidios se heredan por via materna, el cruzamiento exogamico de transgenes a malas hierbas u otros cultivos se minimiza. Por lo tanto, esta forma de ingeniena genetica de las plantas disminuye el riesgo de diseminacion del transgen en el medio ambiente a traves de la dispersion con el polen. Ademas, el genoma del plastidio es altamente poliploide, lo que permite la introduccion de muchas copias por celula, lo que puede conducir a niveles elevados de acumulacion de la(s) protema(s) deseada(s). El hecho de que los plastidios sean capaces de formar enlaces disulfuro y plegar protemas, hace que esta tecnica en teona este lista para la produccion de productos biofarmaceuticos en las plantas.

El principio de la transformacion de plastidios es la insercion de secuencias a traves de una recombinacion homologa. Los vectores para la transformacion de plastidios utilizan dos segmentos de ADN de direccionamiento que flanquean el gen o los genes de interes. Por medio de una recombinacion homologa estos segmentos pueden insertar el gen o los genes extranos en una posicion precisa, predeterminada en el genoma del plastidio. Los efectos de la posicion y el silenciamiento de genes, que son los principales problemas en los experimentos de transformacion nuclear, aun no han sido observados en los eventos de transformacion con plastidios.

Sin embargo, una transformacion con exito de cloroplastos de plantas de cultivo se describe hasta ahora solo para cultivos de solanaceas, tales como patata, tomate, tabaco (documento US-5.451.513; Svab et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530) y Brassicaceae, como Arabidopsis thaliana (documento Us-6.376.744). El documento WO 99/05265 describe la transformacion de plastidios en tabaco, mafz, agrostis, papaya y aguacate. El documento WO 01/81605 describe un metodo de transformacion de plastidios de tabaco. O'Neill et al. (The Plant Journal (1993); vol. 3; n° 5; paginas 729-738) describen la transformacion de cloroplastos de tabaco. No es obvio que las tecnicas utilizadas para estas especies se puedan utilizar facilmente en otras especies, tales como las Asteraceae, en particular la lechuga.

Por tanto, el objeto de la invencion es proporcionar un metodo de transformacion de plastidios alternativo que sea util en particular para transformar especies vegetales Asteraceae, tales como la lechuga (Lactuca sativa). La lechuga es un cultivo agronomico importante y por lo tanto es altamente deseable un metodo de transformacion util.

Compendio

La invencion proporciona de este modo un metodo para la transformacion de los genomas de plastidios de lechuga, que comprende las etapas de:

a) transformar protoplastos de lechuga con un vector de transformacion que es portador de una secuencia de ADN de interes por medio de una transformacion mediante polietilenglicol;

b) colocar los protoplastos tratados de este modo durante un penodo de tiempo, en contacto con un medio de cultivo sin agente de seleccion;

c) posteriormente anadir un agente de seleccion al medio de cultivo;

d) renovar el medio de cultivo que comprende un agente de seleccion mediante la adicion de medio de nuevo aporte con agente de seleccion o cambiar el medio de seleccion por un medio con un agente selectivo;

e) crecimiento de los protoplastos que comprenden plastidios que han adquirido el ADN de interes en transformantes.

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El vector de transformacion puede comprender:

- un casete de expresion que comprende opcionalmente un promotor activo en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformer, un sitio de insercion de ADN para recibir el ADN transformante de interes, opcionalmente uno o varios marcadores de seleccion que confieren un fenotipo seleccionable en celulas que tienen plastidios que se han transformado con el casete de expresion y, opcionalmente, una secuencia de ADN que codifica una region de terminacion de la transcripcion, activa en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformer,

- opcionalmente un conjunto de segmentos de ADN de direccionamiento situados a ambos lados del casete de expresion que permiten una recombinacion homologa doble del casete de expresion con el genoma del plastidio de interes, y

- una secuencia de ADN de interes insertada en el sitio de insercion del casete de expresion.

Preferiblemente, el vector comprende un promotor, un conjunto de segmentos de direccionamiento y uno o varios marcadores de seleccion. Sin embargo, estos elementos tambien se pueden proporcionar de otra manera. Por ejemplo, el ADN de interes se puede insertar en una posicion de este tipo en el plastoma que puede utilizar un promotor que ya este presente, tal como en un operon. Si no estan presentes los segmentos de direccionamiento, el ADN de interes se puede integrar en una posicion aleatoria. El ADN de interes se integra preferiblemente en el genoma del plastidio, pero tambien puede existir fuera del plastoma.

El ADN de interes puede estar integrado de forma estable o se puede expresar de forma transitoria.

Es sorprendente que cuando se utiliza el metodo de la invencion no se encuentran escapes en la transformacion de plastidios de lechuga. Los resultados de las transformaciones de plastidios, hasta ahora, mencionan la aparicion de escapes (debido a mutantes nucleares o espontaneos; Kofer et al. (1998) In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 34: 303-309).

Se ha encontrado sorprendentemente que no iniciar inmediatamente el proceso de seleccion sino mantener el material vegetal tratado en o sobre un medio de cultivo durante unos pocos dfas, mejora mucho la eficacia de una transformacion. Ademas, el procedimiento de seleccion no se debe iniciar demasiado tarde en el proceso de cultivo. Preferiblemente, la seleccion se inicia despues de un maximo de 2-5 dfas. El momento de iniciar el proceso de seleccion depende del metodo de transformacion. Otro aspecto importante de la invencion es mantener las celulas transformadas en estrecho contacto con el agente selectivo durante un penodo de tiempo, preferiblemente hasta la regeneracion. Ademas, se prefiere mantener la concentracion del agente selectivo a un nivel eficaz, tal como 500 mg/l de diclorhidrato de espectinomicina. Esto se logra preferiblemente mediante el uso de un medio lfquido que contiene el agente selectivo.

Detallado

La invencion proporciona un metodo para una transformacion eficaz y estable de plastidios de una planta de lechuga.

El vector que se utiliza en el metodo de la invencion tiene una estructura principal de vector y, ademas, una estructura artificial de ADN que comprende opcionalmente uno o varios conjuntos de segmentos de ADN de direccionamiento que son homologos a una secuencia en el genoma del plastidio, opcionalmente una secuencia de promotor, opcionalmente una secuencia de ADN que codifica el gen transformante introducido en un sitio de insercion, opcionalmente una secuencia terminadora y, opcionalmente, al menos una secuencia de ADN que codifica un marcador seleccionable.

Preferiblemente, el vector comprende los segmentos de ADN de direccionamiento, la secuencia de ADN que codifica el gen transformante, un promotor y un marcador seleccionable.

El promotor es cualquier promotor que este activo en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformar y para la lechuga, por ejemplo, se selecciona a partir del grupo (lechuga u otras especies vegetales) de promotor de operon de ARN ribosomico espedfico de cloroplastos, rrn (ARNr 16S), psbA, rbcL, trnV o rps16. Sin embargo, tambien se pueden utilizar regiones adicionales de promotores, para mejorar la transcripcion, la traduccion o ambos procesos, para obtener una expresion del marcador seleccionable y del gen de interes en los plastidios de lechuga. Tambien se pueden utilizar promotores bacterianos para expresar genes en los plastidios.

El terminador es cualquier terminador que este activo en la especie vegetal que se va a transformar y para la lechuga, por ejemplo, se selecciona a partir del grupo que consiste en la secuencia de terminacion psb A, rrn, rbcL, trnV o rps16. Estos y otros terminadores pueden ser espedficos para la lechuga u otras especies vegetales. Una secuencia de terminador no tiene que estar siempre presente en estructuras artificiales bicistronicas, teniendo dos marcos de lectura abiertos detras de un promotor. Secuencias adicionales de UTR (region no traducida), fusionadas a las secuencias que codifican el o los genes deseados, se pueden utilizar como lfder y/o trailer, para minimizar una recombinacion no deseada.

El marcador de seleccion se selecciona, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en espectinomicina,

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estreptomicina, kanamicina, higromicina y cloranfenicol, o de herbicidas vegetales como glifosato o bialafos. Entre estos marcadores se prefiere el gen aadA porque es un marcador no letal.

Alternativamente, se puede utilizar un marcador visual, tal como gfp (protema de fluorescencia verde). En ese caso, el agente selectivo no es un compuesto o una composicion, sino los medios que se utilizan para visualizar el marcador visual, tal como la fuente luminosa azul que conduce a la fluorescencia de la gfp.

Cuando solo se utilizan estos tipos de marcadores visuales para la seleccion de los transformantes, las etapas d) y e) del metodo se pueden realizar sin un agente selectivo. La seleccion se realiza entonces visualmente mediante la iluminacion de los transformantes putativos con una fuente luminosa apropiada y seleccionando los transformantes que muestran fluorescencia.

Los segmentos de ADN que permiten una recombinacion homologa doble del ADN de interes con el genoma del plastidio de interes tienen una secuencia de ADN que es homologa a una parte del genoma del plastidio. Los segmentos se seleccionan de tal manera que la integracion del gen transformante tiene lugar en una posicion deseada en el genoma. Para la lechuga, por ejemplo, el conjunto de segmentos de ADN se selecciona a partir de la region tm\(oriA)/tmA y la region 16S/trnV/ORF70B del genoma de cloroplasto de la lechuga.

Preferiblemente, el conjunto de segmentos de ADN se selecciona a partir de LCV1 A-B y LCV1 C-D, y LCV2 A-B y LCV2 C-D como se describe en los Ejemplos. La ventaja de estos segmentos es que se encontro que eran particularmente utiles para la lechuga.

El metodo descrito se puede utilizar para la preparacion de plantas que pueden expresar cualquier gen de interes. La tecnologfa de la invencion se puede utilizar para la transformacion de plastidios de cualquier planta, pero en particular para plantas de la familia Asteraceae, mas en particular, para la lechuga. La invencion se puede emplear por tanto para la produccion de polipeptidos que se pueden aislar a partir de la planta o de polipeptidos que son utiles para la propia planta. Un ejemplo de produccion de productos que se pueden aislar a partir de la planta se encuentra, por ejemplo, en el campo de los productos biofarmaceuticos, es decir, productos farmaceuticos producidos en organismos vivos, tales como plantas. La produccion en plantas tiene un alto potencial, ya que puede dar lugar a menores costes de produccion en comparacion con la produccion en animales o en microorganismos utilizando biorreactores.

Un nuevo campo prometedor en el que se puede utilizar esta invencion es la produccion de vacunas comestibles, pero se pueden prever otros productos farmaceuticos, ya sean terapeuticos o profilacticos, asf como (poli)peptidos que se pueden emplear en otros campos.

Ademas de usar la planta como una fabrica para la produccion de peptidos o polipeptidos, el producto expresado tambien puede tener una importancia agronomica. Ejemplos de ello son la resistencia a herbicidas, la resistencia a insectos, la resistencia a hongos, la resistencia bacteriana, la tolerancia al estres, por ejemplo, frente al fno, una cantidad elevada de sales o minerales, el rendimiento, la acumulacion de almidon, la acumulacion de acidos grasos, la fotosmtesis.

De acuerdo con la invencion, el tratamiento de transformacion es una transformacion mediante polietilenglicol. La transformacion mediante polietilenglicol es muy ventajosa ya que se puede transformar simultaneamente un numero elevado de celulas y puede tener lugar una seleccion eficaz de los plastidios transformados dentro de las celulas.

El penodo de tiempo durante el cual se coloca el material vegetal tratado en contacto con un medio de cultivo sin un agente de seleccion, depende del tratamiento de transformacion. Para la transformacion mediante polietilenglicol, el penodo de tiempo es de 1 a 14 dfas, preferiblemente de 3 a 7 dfas, mas preferiblemente de aproximadamente 6 dfas. Sin agente de seleccion se entiende que significa sin una cantidad eficaz del agente de seleccion. Durante este penodo puede estar presente una cantidad baja, es decir, ineficaz de agente selectivo.

Se ha encontrado que la etapa de colocar el material vegetal tratado en contacto con un medio de cultivo sin agente de seleccion es importante para la eficacia de la transformacion. Ademas para la transformacion de cloroplastos se prefiere mantener el material vegetal tratado en la oscuridad durante esa etapa. De esta manera no se producen cloroplastos nuevos y, por lo tanto, no se producen cloroplastos transformados lo que conduce a una mayor eficacia.

El material vegetal tratado se mantiene preferiblemente en contacto con un medio de cultivo con el agente de seleccion hasta la regeneracion de la planta o parte de planta a partir del material transformado.

El metodo es adecuado para materiales vegetales tales como protoplastos.

Se ha encontrado sorprendentemente que la eficacia de la transformacion se puede aumentar cuando el medio de cultivo que comprende el agente de seleccion es un medio lfquido. De esta manera, las celulas que se van a transformar estan en estrecho contacto con el agente selectivo. Ademas se ha encontrado sorprendentemente que no se detectaron escapes en los experimentos de transformacion.

Cuando el medio de cultivo se renueva despues del procedimiento de seleccion, esto puede significar que se anade

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medio de nuevo aporte con el agente selectivo (es dedr, de manera que el medio de seleccion no esta diluido) o que el medio de seleccion se cambia por medio con agente selectivo.

La memoria descriptiva describe ademas un vector de expresion para la transformacion de genomas de plastidios de especies vegetales, en particular especies de plantas Asteraceae, cuyo vector comprende:

- un casete de expresion que comprende opcionalmente un promotor activo en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformar, un sitio de insercion de ADN para recibir el ADN transformante de interes, opcionalmente uno o varios marcadores de seleccion que confieren un fenotipo seleccionable en celulas que tienen plastidios que se transforman con el casete de expresion y, opcionalmente, una secuencia de ADN que codifica una region de terminacion de la transcripcion activa en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformar,

- opcionalmente una secuencia de ADN de interes insertada en el sitio de insercion del casete de expresion.

Preferentemente, el vector comprende el promotor, uno o varios marcadores de seleccion y el conjunto de segmentos de ADN de direccionamiento. Tal vector comprende:

- un casete de expresion que comprende un promotor activo en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformar, un sitio de insercion de ADN para recibir el ADN transformante de interes, uno o varios marcadores de seleccion que confieren un fenotipo seleccionable en celulas que tienen plastidios que se transforman con el casete de expresion y, opcionalmente una region de terminacion de la transcripcion de la secuencia de ADN, activa en los plastidios de la especie vegetal que se va a transformar, y

- un conjunto de segmentos de ADN de direccionamiento situados a ambos lados del casete de expresion que permiten una recombinacion homologa doble del casete de expresion con el genoma del plastidio de interes.

Los diversos elementos del vector son preferiblemente como se han descrito anteriormente para el metodo. La memoria descriptiva describe tanto el vector en el que no se incorpora ningun gen que va a ser transformado, como el vector que comprende cualquier gen transformable.

Los vectores tal y como se describen proporcionan una transformacion estable de los plastidios de estructuras multicelulares, tales como plantas de lechuga.

La memoria descriptiva describe ademas plantas que son portadoras en sus celulas de plastidios que estan transformados, en particular plantas que son portadoras de plastidios transformados por medio del metodo de la invencion. Ademas, la memoria descriptiva describe la progenie de estas plantas en la que al menos parte de los plastidios transformados esta todavfa presente.

Lo que se describe en este documento se ilustra adicionalmente en los Ejemplos a continuacion. En estos ejemplos, como material de explante, se utilizan protoplastos de mesofilo de plantas de lechuga y a traves de una transformacion mediante PEG se obtienen colonias derivadas de protoplastos transplastomicos y una regeneracion de las plantas. Alternativamente, el callo transplastomico se obtuvo utilizando un bombardeo de partfculas de cotiledones escindidos de la lechuga. Las estructuras artificiales de ADN comprenden un casete de expresion que contiene el ADN transformante que se dirige a un lugar predeterminado en el genoma del plastidio y se inserta en el genoma del plastidio mediante recombinacion homologa. Los segmentos de direccionamiento en el casete comprenden secuencias preferidas del genoma del ADN de cloroplasto de la lechuga, es decir, la region tm\(oriA)/tmA o la region 16S/trnV/ORF70B del genoma del cloroplasto de lechuga. El ADN usado para la transformacion contiene ademas un gen marcador seleccionable no letal que confiere un fenotipo seleccionable a las celulas que tienen los plastidios con el ADN transformante, en este caso, espectinomicina. La secuencia codificadora, seleccionable no letal preferida es la region que codifica aadA de E. coli, que codifica la aminoglicosido-3-adeniltransferasa para conferir resistencia a la espectinomicina y a la estreptomicina. Ademas, el casete de expresion de ADN comprende al menos una secuencia de ADN adicional, que es la secuencia de ADN de interes, tal como un gen que codifica una protema verde fluorescente (gfp) (como un sistema modelo) o el gen de la hemaglutinina del virus de la gripe (HA). Las estructuras artificiales, ademas, estan provistas con un promotor y una secuencia terminadora funcional en los plastidios vegetales.

En los ejemplos que siguen se hace referencia a las siguientes figuras:

Figura 1. Secuencia diana del genoma de cloroplasto de lechuga LCV1 (que no incluye el vector de estructura principal) (SEQ \D NO: 1).

Figura 2. Mapa de LCV1 (7.545 pb).

Figura 3. Secuencia diana del genoma de cloroplasto de lechuga LCV1 (SEQ \D NO: 2) alineada con el

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genoma de cloroplasto de tabaco (GI Z00044) (SEQ ID NO: 3). SEQ ID NO: 4 y 5 son las protemas hipoteticas. SEQ ID NO: 41 es la protema ribosomica.

Figura 4. Etapas de la clonacion y cebadores (SEQ ID NOS: 6-9) para la construccion de LCV1. TCG = genoma de cloroplasto de tabaco.

Figura 5. Secuencia diana del genoma de cloroplasto de lechuga LCV2 (que no incluye el vector de estructura principal) (SEQ ID NO: 10).

Figura 6. Mapa de LCV2 (6.182 pb).

Figura 7. Secuencia diana del genoma de cloroplasto de lechuga LCV2 (SEQ ID NO: 11) alineada con el genoma de cloroplasto de tabaco (GI Z00044) (SEQ ID NO: 12).

Figura 8. Etapas de la clonacion y cebadores (SEQ ID NOS: 13-16) para la construccion de LCV2. TCG = genoma de cloroplasto de tabaco.

Figura 9. Mapa de LCV1 MSK18 (9.682 pb).

Figura 10. Mapa de LCV2-MSK18 (8.329 pb).

Figura 11. Plantas diploides transplastomicas de lechuga pLCV2-LEC1 en las etapas de floracion (panel superior izquierdo), microsporas (panel superior derecho) y conjunto de semillas (panel superior e inferior derecho).

Figura 12. Combinaciones de cebadores (SEQ ID NOS: 17-20) utilizados en el analisis con PCR de un callo transplastomico de lechuga.

Figura 13. Analisis molecular de callos de lechuga resistentes a la espectinomicina.

Panel A: productos de la PCR del gen de la ATPasa.

Carril 1. Marcador,

2. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1,

3. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1

4. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-1,

5. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-2,

6. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

7. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

8. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-2,

9 y 10 callos no transformados,

11 y 12 pLCV2-MSK18 Panel B: productos de la PCR del gen AadA.

Carril 1. Marcador,

2. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1,

3. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1

4. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-1,

5. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-2,

6. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

7. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

8. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-2,

9 y 10 callos no transformados,

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11 y 12 pLCV2-MSK18

Panel C: los productos de la PCR de la union trnl.

Carril 1. Marcador,

2. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1,

3. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1

4. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-1,

5. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-2,

6. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

7. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

8. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-2,

9 callo no transformado

Panel D: productos de la PCR de la union trnA.

Carril 1. Marcador,

2. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1,

3. TRSL5-01016 pLCV2-MSK18-1

4. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-1,

5. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-1-2,

6. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

7. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-1,

8. TRSL5-02002 pLCV2-MSK18-2-2,

9 callo no transformado

Figura 14. Secuencia de fragmentos de la union de integracion del lfmite izquierdo (P1-P2) (SEQ ID NO: 21) y del lfmite derecho (P3-P6) (SEQ ID NO: 22) amplificados con PCR procedentes de ADN transplastomico de lechuga. La secuencia en letras minusculas es aDn de cloroplasto lechuga externo a la region diana del vector LCV2. Panel superior: secuencia de consenso del fragmento del lfmite izquierdo P1-P2; Panel inferior: secuencia de consenso del fragmento del lfmite izquierdo P3-P6.

Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa de productos de la PCR procedentes de reacciones con las parejas de cebadores P1+P2, P3+P4 y P1+P4 y ADN molde procedente de una muestra B de callo transplastomico putativo resistente a la espectinomicina (TP) y de callo de tipo silvestre no transformado (WT).

Figura 16. Analisis con PCR de la integracion del inserto de callos transformados pLCV2-MSK18. Carril 1: marcador de ADN, carriles 2-7: TRSL05-02002 pLCV2-MSK18-1-1, TRSL05-02002 pLCV2-MSK18-1-2, TRSL05-02002 pLCV2-MSK18-1-3, TRSL05-02002 pLCV2-MSK18-2-1, TRSL05-02002 pLCV2-MSK18-2-2, TRSL05-02001 pLCV2-MSK18-1-1, respectivamente; carril 8 y 9: ADN de lechuga de control, carril 10: ADN plasmfdico pLCV2-MSK18.

Figura 17. Analisis con PCR de la union de integracion del lfmite izquierdo y derecho de un callo, obtenido despues de una transformacion mediante bombardeo de partfculas con plasmido pLCV2-MSK18. Panel A: union de trnl (union de integracion izquierda). Panel B: union de trnA (insercion del lfmite derecho. Carril 1: marcador lambda, carril 2: callo resistente a espectinomicina pLCV2-MSK18, carril 3, control de lechuga, carril 4: plasmido pLCV2-MSK18.

Figura 18. Analisis con PCR de lmeas de callos pLCV2-LEC1 y controles.

A1: productos de la PCR del gen ATPasa.

Carril 1; marcador

2: pLCV2-LEC1 1.1

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3: pLCV2-LEC1 2.1 4: pLCV2-LEC1 2.2 5: pLCV2-LEC1 3.1 6: pLCV2-LEC1 3.2

7: callo de lechuga no tratada de control 8: callo no transformado de control A2: productos de la PCR del gen ATPasa Carril 1: marcador

2: plasmido pLCV2-LEC1 3: agua

B1: productos de la PCR del gen AadA.

Carril 1; marcador

2: pLCV2-LEC1 1.1

3: pLCV2-LEC1 2.1

4: pLCV2-LEC1 2.2

5: pLCV2-LEC1 3.1

6: pLCV2-LEC1 3.2

B2: productos de la PCR del gen AadA

Carril 1: marcador

2: plasmido pLCV2-LEC1 3: agua

C: productos de la PCR de la union trnl (lfmite izquierdo) Carril 1; marcador

2: pLCV2-LEC1 1.1 3: pLCV2-LEC1 2.1 4: pLCV2-LEC1 2.2 5: pLCV2-LEC1 3.1 6: pLCV2-LEC1 3.2

7: ADN de lechuga no tratado de control 8: plasmido pLCV2-LEC1

D: productos de la PCR de la union trnA (lfmite derecho) Carril 1; marcador

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7: ADN de lechuga no tratado de control 8: plasmido pLCV2-LEC1 E: productos de la PCR del inserto Carril 1; marcador

7: callo de lechuga no tratado de control 8: callo no transformado de control

Figura 19. Analisis con PCR de la integracion del inserto en 24 regenerantes transplastomicos diferentes, originados a partir de 1 callo transplastomico TRSL05-02002 pLCV2-MSK18 1-2 (carriles A-L y M-X) y 2 plantas de lechuga de control (lechuga de control)

Figura 20. Analisis con PCR de la integracion del inserto en 7 regenerantes transplastomicos diferentes, originados a partir de 1 callo transplastomico numero pLCV2-LEC1 2.2. Carril 1: marcador, carriles 2-8: plantas regeneradas pLCV2-LEC1 2.2, carril 9: ADN del plasmido pLCV2-LEC1, carril 10: ADN de lechuga de control.

Figura 21. Casete de expresion de lechuga LEC1. Promotor de operon de ARN espedfico de lechuga LPrrn B; secuencia del terminador psbA espedfico de lechuga L3= psbA B.

Figura 22. Representacion esquematica de la PCR y la estrategia de clonacion empleada para la construccion de LEC1 junto con secuencias de cebadores (SEQ ID NOS: 23-30).

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcciones de vectores 2. Construccion de LCV1

El vector de cloroplasto de lechuga LCV1 consiste en 4571 pb de la secuencia del genoma de cloroplasto de lechuga con un unico sitio anadido Pac1/Asc1 de 16 pb (Figura 1), clonado en los sitios de restriccion Sac1/Kpn1 en el polienlazador de un vector pBluescript SK + estructura principal (Figura 2). La secuencia de lechuga se extiende desde la region intergenica rps7/3'--rps12 hasta la region intergenica 16SrRNA/trnI y se corresponde a las posiciones de nucleotidos 100021-104387 en el genoma del cloroplasto de tabaco (numero de orden GI Z00044). Una alineacion de esta secuencia de lechuga con la secuencia del genoma de cloroplasto de tabaco se proporciona en la Figura 3. La siguiente descripcion de la construccion de LCV1 se describe en la Figura 4.

Cuatro cebadores LCV1A, LCV1B, LCV1C y LCV1D se utilizaron para amplificar esta region en dos mitades (LCV1A-B y LCV1C-D) y para introducir un unico sitio de restriccion Pac1/Asc1 en la region intergenica ORF70B/trnV en la posicion correspondiente al nt 102367 en la secuencia del genoma de cloroplasto de tabaco. El ADN procedente del clon 6 de la genoteca Sac1 del genoma de cloroplasto de lechuga (Jansen y Palmer, Current Genetics 11: 553-564 (1987)) se utilizo como molde para el vector de LCV1. LCV1A y LCV1B amplificaron un fragmento de 2575 pb (secuencia de lechuga de 2551 pb + 24 pb de extension) LCV1A-B que abarcaba desde la region intergenica rps7/3'rps12 a la region intergenica ORF70B/trnV (correspondiente a 100021-102367 en el genoma del cloroplasto de tabaco). El cebador LCV1A contiene un sitio Sac1 y LCV1B contiene sitios Pac1/Asc1 de manera que los sitios Sac1 y Pac1/Asc1 se incorporan en los extremos 5' y 3', respectivamente, del fragmento LCV1A-B.

El fragmento de LCV1 A-B se clono en el vector plasirndico PCR2.1 de E. coli para crear PCR2.1 LCV1A-B. Estos clones fueron escrutados en busca de la orientacion usando Sac1 y SacI + Xbal. El inserto Sac1/Xba1 se clono en el polienlazador de pBluescript para crear pBSLCV1 A-B.

Los cebadores LCV1C y LCV1D amplificaron un fragmento de 2042 pb (secuencia lechuga de 2020 pb + 22 pb de extension) LCV1 C-D. El cebador LCV1C contiene sitios Pac1/Asc1 y el cebador LCV1D contiene un sitio de Kpn1 de modo que un sitio Pac1/Asc1 y un sitio Kpn1 se anaden a los extremos 5' y 3', respectivamente, del fragmento

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LCV1 C-D. El fragmento LCV1 C-D se clono en pCR2.1 para crear PCR2.1 LCV1 C-D. Para la etapa final de clonacion, PCR2.1 LCV1 C-D fue restringido con Asc1+Kpn1 para liberar un inserto de 2031 pares de bases que se ligo a pBS A-B, el cual fue linealizado con Asc1+Kpn1, creando LCV1.

2. Construccion de LCV2

LCV2 consiste en una secuencia del genoma de cloroplasto de lechuga de 2.253 pb (Figura 5) que se extiende desde la region intergenica 16SrRNA/trnI a la region intergenica trnAJ23S rRNA, clonada en el vector de la estructura principal PCR2.1 (Invitrogen) (Figura 6). Esta secuencia se corresponde a las posiciones de nucleotidos 104366106260 en el genoma del cloroplasto de tabaco (numero de orden GI Z00044). Una alineacion de esta secuencia de lechuga con la secuencia del genoma de cloroplasto de tabaco se proporciona en la Figura 7. La siguiente descripcion de la construccion de LCV2 se indica en la Figura 8.

Cuatro cebadores LCV2A, LCV2B, LCV2C y LCV2D se utilizaron para amplificar esta region en dos mitades (LCV2A-B y LCV2C-D) y para introducir sitios de restriccion unicos Pac1JAsc1 en la region intergenica entre los genes trnl y trnA en la posicion correspondiente al nucleotido 105370 en el genoma del cloroplasto de tabaco.

Para la primera mitad (A-B) del vector, el ADN procedente del clon 6 de la genoteca Sac1 del genoma de cloroplasto de lechuga (Jansen y Palmer, Current Genetics 11: 553-564 (1987)) se utilizo como molde. Los cebadores LCV2A y LCV2B amplificaron un fragmento de 1258 pb (1242 pb de la secuencia lechuga + 16 pb de extension) (LCV2A-B) que abarcaba desde la region intergenica 16SrRNAJtrnI a la region intergenica trnl/trnA. Este fragmento se clono en el vector de clonacion plasirndico de E. coli pCR2.1 (Invitrogen) para crear PCR2.1 LCV2A-B. El cebador LCV2B contiene sitios Pac1JAsc1 de manera que el fragmento LCV2A-B tiene sitios Pac1/Asc1 en el extremo 3'. Los clones PCR2.1 LCV2 A-B fueron escrutados para la orientacion mediante digestion con Kpn1/Asc1, que libera un fragmento de aproximadamente 1300 pb, y Xba1JAsc1 que linealizaba clones con la orientacion correcta para la clonacion subsiguiente.

Para la segunda mitad del vector, se utilizo ADN de cloroplasto procedente de la variedad de lechuga Evola (semillas Leen de Moss) como molde porque el gen trnA completo no estaba contenido en un solo clon en la genoteca del genoma de cloroplasto de lechuga. Los cebadores LCV2C y LCV2D amplificaron un fragmento de 1011 pb (995 pb de la secuencia de lechuga + 16 pb de extension) LCV2C-D. Esta secuencia se extiende desde la region intergenica trnl/trnA hasta la region intergenica trnAJ23S rRNA. El cebador LCV2C contiene sitios Pac1/Asc1 de modo que el fragmento LCV2C-D tiene sitios Pac1/Asc1 en su extremo 5'. Este fragmento se clono en PCR2.1 para crear PCR2.1 LCV2 C-D. Estos clones fueron escrutados para la orientacion usando Kpn1+Asc1, que linealiza clones con la orientacion requerida y Xba1+Asc1, que libera un fragmento de aproximadamente 1000 pb en clones con la orientacion requerida. Para generar LCV2, el inserto de 1,3 kb Asc1+Xba1 de PCR2.1 LCV2C-D se subclono en pCR2.1 LCV2A-B linealizado con Asc1+Xba1.

3. Construccion de LCV1-MSK18 y LCV2-MSK18

MSK18 es un casete de expresion adaptado a partir de pMSK18 (Hibberd et al., The Plant Journal 16, 627-632 (1998)). El plasmido MSK18 fue un regalo de John Gray (Dpto. de Ciencias Vegetales de la Universidad de Cambridge, Downing Street, Cambridge CB2 10 3EA, GB). Los detalles completos de la construccion de pMSK18 se han descrito previamente (Hibberd et al. 1998, supra). El casete de expresion MSK18 que consiste en la region que codifica mGFP (Haselhoff et al., Trends in Genetics 11, 328-329 (1997)) fusionada con un promotor trc bacteriano (Amman y Brosius, Gene 15 40, 183-190 (1985)), y una region que codifica aadA, obtenida a partir de pUC-atpX- AAD (Goldschmidt-Clermont, Nucleic Acids Research 19, 4083-4089 (1991)) fusionada con un promotor rrn del tabaco obtenido a partir de pZS197 (Svab y Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917 (1993)). Una UTR 3' de psbA de tabaco obtenida a partir de pSZ197 (Svab y Maliga, 1993 supra) se fusiona con el extremo 3' del gen aadA (Figura 9).

Usando pMSK18 como molde, se anadieron los sitios Pac1 y Asc1 mediante PCR amplificando el casete con cebadores que conteman los sitios de restriccion Pac1 (5') y Asc1 (3') en los extremos 5' y 3' del casete de expresion MSK18. Los cebadores utilizados para ello eran MSK18 A (directo) 5'- tagttaattaaTTGACAATTAATCATCCGGCTCGT-3' (SEQ ID NO: 31) y MSK18 B (inverso) 5'- tagggcgcgccTCGAATATAGCTCTTCTTTCTTA-3' (SEQ ID NO: 32). El producto de la PCR de MSK18 A-B se clono en PCR2.1 para crear PCR2.1 MSK18. PCR2.1 MsK18 se restringio con Pac1/Asc1 para liberar el inserto MSK18 que se clono en los sitios Pac1/Asc1 en LCV1 y LCV2 para crear LCV1-MSK18 (Figura 9) y LCV2-MSK18 (Figura 10).

Ejemplo 2

Construccion de LCV2-LEC1

El casete de expresion de lechuga 1 (LEC1, Figura 21) contiene el gen aadA, que confiere resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina en las plantas, y el gen de la hemaglutinina del virus de la gripe (HA) que codifica una vacuna potencial de una subunidad de la gripe. Ambos genes estan bajo el control de un unico promotor espedfico de lechuga (Prrn) y una secuencia terminadora (3' psbA). Un sitio de union al ribosoma de cloroplasto

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tambien precede a ambos genes. El casete de expresion se ensamblo en tres piezas usando una combinacion de amplificacion por PCR y extension por solapamiento (Figura 22).

Se amplifico el promotor del operon de ARN ribosomico espedfico de cloroplasto de lechuga (Prrn) a partir de ADN de cloroplasto de lechuga (fragmento 6, SacI de la genoteca cpDNA de Jansen; Jansen y Palmer, (Current Genetics 11: 553-564 (1987)) usando los cebadores A y B de PCR. El gen aadA y el sitio de union al ribosoma aguas arriba (rbs) se amplificaron a partir del vector de transformacion de cloroplasto de tabaco pZS197, usando los cebadores de PCR C y D. El gen HA y el rbs aguas arriba se amplificaron a partir de una estructura artificial de gen HA interno (HA con3) utilizando los cebadores de PCR E y F. Se amplifico una secuencia de terminacion psbA espedfica de lechuga (3'psbA) a partir de ADN de cloroplasto de lechuga (cv. Evola) utilizando los cebadores de PCR G y H. Los productos de la PCR A+B y C+D se fusionaron mediante extension con solapamiento, utilizando los cebadores de PCR A y D.

El producto A+D resultante de la PCR se clono en los sitios Sac1/NotI de pBS SK+ para crear pBS A+D. El producto de la PCR E+F se clono en los sitios Notl/BamHI de pBS SK+ para crear pBS E+F. El producto de la PCR G+H se clono en los sitios BamHI/Pstl de pBS E+F para crear pBS E+H. El inserto completo (E+H) se corto mediante restriccion con Notl/Pstl y se clono en los sitios Notl/Pstl en pBS A+D para crear pBS SK+ LEC1.

La expresion de aadA y HA en pBS SK+ LEC1 se sometio a ensayo en E. coli. Las celulas de E. coli transformadas eran resistentes a la estreptomicina, indicando que se expresaba el gen aadA. El analisis por transferencia Western de la expresion de HA con sueros anti-HA mostro una expresion de HA en E. coli. Se escindio todo el casete de expresion (Prrn/aadA/HA/psbA) de pBS SK+ LEC1 usando las enzimas de restriccion Pacl y Ascl y se clono en los sitios Pacl/Ascl en el vector de transformacion de cloroplasto de lechuga LCV2 para crear LCV2-LEC1.

Ejemplo 3

Obtencion de plantulas y una reserva in vitro de plantas

Se afslan protoplastos de plantas a partir de material foliar de plantas donantes. En este ejemplo se proporciona la obtencion de cultivos de brotes de hojas.

Las semillas se esterilizan mediante un lavado subsiguiente en etanol al 70%, solucion de NaOCl al 0,7% durante 20 minutos y lavado tres veces con agua desmineralizada esteril. Las semillas se siembran en medio Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, Physiol. Planta., 15: 473-497 (1962)) con sacarosa al 2%, sin hormonas. Preferiblemente, las semillas se pueden cultivar a 15°C durante 2 dfas en la oscuridad, despues de lo cual las semillas se transfieren a 25°C con luz (aproximadamente 3000 lux, fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad TL FTD 840). Cuando aparecen las primeras hojas verdaderas, las puntas del brote se transfieren al medio a base de Murashige y Skoog con sacarosa al 3%, sin hormonas. Estos cultivos de brotes esteriles se cultivan en condiciones de crecimiento similares.

Ejemplo 4

Aislamiento de protoplastos

Se usan cultivos de brotes de tres semanas de edad para el aislamiento de protoplastos. Las hojas se cortan en trozos pequenos y se preplasmolizan durante 1 h en la oscuridad en solucion Pg (54,66 g/l de sorbitol y 7,35 g/l de CaCl2.2H2O). La solucion PG se reemplaza entonces por una solucion enzimatica con 1% de celulasa y 0,25% de macerozima. La incubacion tiene lugar durante 16 h en la oscuridad a 25°C.

Posteriormente, la suspension se filtra a traves de un filtro de malla de nailon (41 pm) y se lava con un tercio de volumen de solucion CPW16S (Frearson et al., Developmental Biology 33: 130-137 (1973)) mediante centrifugacion a 700 rpm durante 8 minutos. De esta manera, los protoplastos intactos se recogen en la superficie del material sobrenadante. Los protoplastos se lavan en solucion W5 (9 g/l de NaCl, 18,38 g/l de CaCl2.2H2O, 0,37 g/l de KCl, 0,99 g/l de glucosa, 0,1 g/l de tampon morfolinoetanosulfonido (MES)) mediante centrifugacion a 600 rpm durante 5 minutos. Con el procedimiento descrito, se puede obtener un rendimiento de protoplastos de aproximadamente 1015 x 106 protoplastos por gramo de material foliar.

Ejemplo 5

Seleccion de callos obtenidos a partir de protoplastos con resistencia a espectinomicina

Los protoplastos de lechuga, obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 4, se diluyen en medio de cultivo A B5 (Gamborg et al. Exp. Cell Res. 50:151 (1968)): 375 mg/l de CaCh.2H2O, 18,35 mg/l de NaFeEDTA, 270 mg/l de succinato de sodio, 103 g/l de sacarosa, 0,1 mg/l de acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), 0,3 mg/l de 6- bencilaminopurina (BAP) y 0,1 g/l de MES y se ajustan a una densidad de cultivo de 6 x 104 protoplastos por ml.

La suspension de protoplastos se mezcla 1:1 con medio de cultivo A B5 con agarosa. Las perlas de agarosa se extienden en placas de Petri mas grandes con medio de cultivo A B5 lfquido en la parte superior de las mismas.

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Las placas de Petri se tapan con una lamina de plastico parafilm y se cultivan a 25°C en la oscuridad. Una semana despues del inicio del cultivo, el medio de cultivo se diluye con medio de cultivo A B5 lfquido de nuevo aporte y 0,1 g/l de MES. Los cultivos se transfieren a la luz (aproximadamente 3000 lux, fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, TL FTD 840).

Cuando los callos tienen aproximadamente un tamano de 0,5 mm, se transfieren al medio de crecimiento de callos SH2 (Schenk & Hildebrandt, Can. J. Bot. 50:199-204 (1972)) con 30 g/l de sacarosa, 5 g/l de agarosa, 0,1 mg/l de acido 1-naftalen acetico (NAA) y 0,1 mg/l de bencilaminopurina (BAP), y el agente de seleccion diclorhidrato de espectinomicina a concentraciones de 0-1000 mg/l. Se encontro que la concentracion optima de seleccion es de 500 mg/l. Los callos no resistentes aparecen como callos blancos. Tambien crecen mas lentamente en comparacion con los callos de control. Las condiciones de cultivo son las descritas anteriormente para los callos de protoplastos anteriores.

Ejemplo 6

Transformacion de protoplastos con polietilenglicol y seleccion mediante resistencia a antibioticos codificados por aadA

Los protoplastos de lechuga, obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 4, se ajustan a una densidad de aproximadamente 1-1,5 x 106 protoplastos/0,4-0,6 ml en tampon de transformacion (manitol 0,4 M, MgCh 15 mM, MES al 1% (p/v), pH 5,8). Posteriormente, se anaden 10 jl de suspension de plasmido (1 |jg de ADN/jl de H2O esteril) a los protoplastos asf como 0,4-0,6 ml de solucion PEG (40% p/v de PEG 6000, 2,36 g/l de Ca(NO3)2.4H2O y 7,28 g/100 ml de manitol). La incubacion se realiza a temperatura ambiente durante 5-30 minutos. Los protoplastos se lavan y se resuspenden en medio de cultivo A B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151 (1968)): 375 mg/l de CaCl2.2H2O, 18,35 mg/l de NaFeEDTA, 270 mg/l de succinato de sodio, 103 g/l de sacarosa, 0,1 mg/l de acido 2,4- diclorofenoxiacetico (2,4-D) y 0,3 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP).

La suspension de protoplastos se mezcla 1:1 con medio de cultivo A B5 con agarosa. Las perlas de agarosa se extienden en placas de Petri mas grandes con medio de cultivo A B5 lfquido encima de las mismas.

Las placas de Petri se tapan con una lamina de plastico parafilm y se cultivan a 25°C. Despues de 6 dfas, la seleccion de los microcallos se realiza anadiendo 500 mg/l del agente selectivo diclorhidrato de espectinomicina (concentracion final). Una semana despues del inicio del cultivo, el medio de cultivo se diluye con medio de cultivo A B5 lfquido de nuevo aporte, con adicion de diclorhidrato de espectinomicina y se cultiva con luz (aproximadamente 3000 lux, fotoperiodo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, TL FTD 840).

Cuando los callos tienen un tamano de aproximadamente 0,5 mm, se transfieren al medio de crecimiento de callos SH2 (Schenk & Hildebrandt, 1972, supra) con 30 g/l de sacarosa, 5 g/l de agarosa, 0,1 mg/l de acido 1-naftalen acetico (NAA) y 0,1 mg/l de bencilaminopurina (BAP), y el agente de seleccion diclorhidrato de espectinomicina en las concentraciones descritas anteriormente. Las condiciones de cultivo son como las descritas anteriormente.

Despues de 2 semanas, se transfieren callos al medio de regeneracion SHreg (Schenk y Hildebrandt, 1972, supra) con 15 g/l de sacarosa, 15 g/l de maltosa, 0,1 mg/l de NAA y 0,1 mg/l de BAP y diclorhidrato de espectinomicina en las concentraciones descritas anteriormente. Los callos resistentes a la espectinomicina aparecen como callos verdes entre los callos blancos (no resistentes).

Las plantas de regeneracion aparecen despues de aproximadamente 6 semanas y posteriormente, se transfieren al medio de enraizamiento (Schenk y Hildebrandt, supra) con 30 g/l de sacarosa y 8 g/l de agar con las concentraciones de diclorhidrato de espectinomicina mencionadas anteriormente. Alternativamente, en los vectores de transformacion en los que se anade gfp (protema fluorescente verde) como gen de interes, la fluorescencia de gfp se detecta utilizando un microscopio invertido con las combinaciones de filtros adecuadas. Los callos verdes se detectaron 4-5 semanas despues del inicio de cada experimento.

La Tabla 1 ofrece una vision general de los resultados obtenidos en experimentos de transformacion de protoplastos con tres plasmidos diferentes. Los callos resistentes a la espectinomicina se obtuvieron despues de una transformacion de los protoplastos con los plasmidos PLCV2-MSK18 y PLCV2-LECI. Aproximadamente el 40-50% de los protoplastos sobrevivieron al tratamiento con PEG. Las lmeas de callos de cada evento individual se mantienen en medio SHreg con el agente selectivo diclorhidrato de espectinomicina y se obtienen plantas regeneradas a partir de los plasmidos pLCV2-MSK18 y pLCV2-LEC1 (Tabla 1). Tambien se observaron diferencias de ploidfa entre callos individuales.

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Tabla 1. Seleccion de transformantes de plastidios

Tratamiento/Experimento: N° de pps tratados N° de callos verdes N° de callos regenerados

Control: Ninguno 0

Control + PEG: 1,26 x 106 0

pLCV1-MSK18: 1,26 x 106 0

pLCV2-MSK18/exp 1: 1,26 x 106 1 0

pLCV2-MSK18/exp 2: 2,40 x 106 1 0

pLCV2-MSK18/exp 3: 4,80 x 106 5 2 (1 ++, 1 +/-)

pLCV2-LEC1/exp 1: 3,60 x 106 5 3 (1 ++, 2 +/-)

El callo transgenico se ha obtenido utilizando vectores con secuencias homologas espedficas de ADN de cloroplasto de lechuga. La seleccion de las celulas transformadas con el agente selectivo no letal espectinomicina ha sido exitosa. La frecuencia de transformacion optima para la lechuga, determinada como el numero de callos verdes frente al numero de protoplastos sobrevivientes es de aproximadamente 1 en 3-6 x 105 protoplastos (Tabla 1).

Se encontro que las plantas obtenidas a partir de los experimentos de transformacion con pLCV2-LEC1 teman un nivel normal de ploidfa diploide y mostraban un crecimiento normal. El conjunto de semillas despues de la autopolinizacion se obtuvo a partir de estas plantas (Figura 11).

Ejemplo 7

Transformacion de protoplastos mediante electroporacion y seleccion con resistencia a antibioticos codificada por aadA

Protoplastos, obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 4, se suspenden en tampon de transformacion HBS (KCl 150 mM, CaCl2.2H2O 4 mM, HEPES 10 mM (pH 7,2)), y suficiente manitol para equilibrar osmoticamente los protoplastos. Esto depende del genotipo, pero se puede detectar facilmente de forma experimental. Partes alfcuotas de 1 x 106 protoplastos/0,5 ml de tampon HBS y manitol se ponen en un tubo conico de centnfuga, y se anade una solucion de ADN plasirndico. Las concentraciones de ADN plasirndico en el tampon de transformacion debenan estar preferiblemente en el intervalo de 10-100 pg/ml. La suspension de ADN de protoplastos se transfiere a la camara de electroporacion y se electropora utilizando un solo impulso electrico (por ejemplo, 325 pF, 300 V). El ajuste optimo puede variar con la especie y el tipo de celula, y se debe determinar en experimentos preliminares. Los parametros mas eficaces se determinan encontrando los ajustes del impulso que dan como resultado la muerte del 50% de los protoplastos, 24 h despues de los choques. Mas detalles del metodo estan descritos por G.W. Bates (Transformacion de plantas mediante electroporacion de protoplastos. De: Methods in Molecular Biology Vol 111: Plant Cell Culture Protocols, pags. 359-366 (1999)).

Despues de la electroporacion, el cultivo de protoplastos y la seleccion se realizan como se ha descrito en el ejemplo 6.

EJEMEPLO 8

Ajuste de los niveles umbrales de espectinomicina en los cotiledones

Para el ajuste de la concentracion optima de espectinomicina para una seleccion de las celulas con cloroplastos/plastidios, las cuales se transforman con estructuras artificiales que tienen el gen aadA como marcador seleccionable, se sembraron cotiledones de 4-10 dfas con el lado abaxial sobre medio MS (Murashige y Skoog, supra) con agar al 0,8%, 30 g/l de sacarosa, 100-200 mg/l de carbenicilina, 0,1 mg/l de bencilaminopurina (BAP), 0,1 mg/l de acido 1-naftalen acetico (1-NAA) a pH 5,8, y con diversas concentraciones de diclorhidrato de espectinomicina. Los cotiledones se obtuvieron como se ha descrito en el Ejemplo 3 y se cultivaron a 25°C con luz (aproximadamente 3000 lux, fotoperiodo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, TL fTd 840). Se encontro que una concentracion de 0,5-1 g/l de diclorhidrato de espectinomicina era suficiente para una seleccion eficaz, que conduda a un blanqueo completo y una perdida de crecimiento y regeneracion de los cotiledones de control.

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Ejemplo 9

Transformacion de material vegetal a traves de bioUstica y seleccion por resistencia a antibioticos codificada por aadA

Para el bombardeo de cotiledones, las semillas se sembraron como se ha descrito en el ejemplo 3. Alternativamente, trozos de hojas se pueden usar como material de explante para disparar, en condiciones similares. Se colocan cotiledones (de 3 a 12 dfas de edad) o trozos de hojas de plantulas de 10-14 dfas de edad sobre medio MS (Murashige y Skoog, supra) con 0,8% de agar, 0,3 mg/l de BAP y 0,1 mg/l de 2,4-D (pH 5,8) y se preincubaron durante 1-6 dfas antes de la transformacion con una pistola de partfculas.

Los cotiledones se cultivan a 25°C con luz (aproximadamente 3000 lux, fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, TL FTD 840).

Partfculas de oro (0,6 a 1,6 pm) se prepararon para la transformacion, mezclando 50 pl de suspension (60 mg/ml de glicerol al 50%) con 5 pg de aDn (1 pg/pl de H2O), 50 pl de CaCl2 (2,5 M) y 20 pl de espermidina (base 0,1 M). La mezcla de partfculas-ADN se incubo a temperatura ambiente durante 1-3 minutos y se centrifugo durante 3-10 s en una centnfuga Eppendorf. Despues de retirar el material sobrenadante, las partfculas recubiertas se lavan y se diluyen en 48-60 pl de etanol. Las partfculas (6-8 pl por vehnculo) se aplican a los recipientes de macrovehnculos y el bombardeo se realiza con el sistema de suministro de partfculas de biobalfstica PDS-1000/He (BioRad).

Los explantes se colocan a aproximadamente 6 cm de distancia de la diana y se bombardean usando un disco de ruptura de 1100 p.s.i. Los detalles del procedimiento han sido descritos por Klein et al. (Bio/Technology 6: 559-563 (1988)).

De dos a catorce dfas despues del bombardeo, los cotiledones se transfieren a medio MS1 lfquido (Murashige y Skoog, supra) con 30 g/l de sacarosa y se complementa con 100-200 mg/l de carbenicilina, 0,1 mg/l de bencilaminopurina (BAP) y 0,1 mg/l de acido 1-naftalen acetico (1-NAA) a pH 5,8 como se ha descrito anteriormente, con la adicion de un agente selectivo (por ejemplo, diclorhidrato de espectinomicina a una concentracion de 500 mg/l). Se incuban en medio liquido a 25°C con luz (aproximadamente 3000 lux, fotoperiodo 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, TL FTD 840) durante aproximadamente 1-8 dfas, despues de lo cual se transfieren a medio MS1 solido (vease anteriormente, con la adicion de 8 g/l de agar). Los cultivos se transfieren a medio de nuevo aporte cada 2 semanas.

Cuando aparecen callos verdes o brotes, se transfieren a medio MS1 sin carbenicilina, pero que incluye el agente selectivo diclorhidrato de espectinomicina.

La Tabla 2 presenta los resultados de los experimentos de transformacion con pLCV2-MSK18. Se encontro que un callo verde, resistente a espectinomicina se habfa formado sobre cotiledones bombardeados, aproximadamente 2,5 meses despues del inicio del experimento. El callo resistente a la espectinomicina se mantuvo sobre medio MS1 con el agente selectivo.

Tabla 2. Resultados de los experimentos de bombardeo de partfculas con pLCV2-MSK18 utilizando cotiledones o trozos de hoja.

Tipo de explante/tratamiento: Numero de explantes bombardeados Numero de explantes con callo resistente a la espectinomicina

Seleccion de cotiledon bombardeado: 180 1

Seleccion de cotiledon de control: 30 0

Seleccion de hoja bombardeada: 96 0

Seleccion de hoja de control: 16 0

Ejemplo 10

Analisis molecular de callos de lechuga resistentes a la espectinomicina

La resistencia a la espectinomicina de celulas vegetales puede ser el resultado, ademas de la transformacion con el vector LCV2-MSK18, de una mutacion espontanea del ADN de cloroplasto o la insercion del ADN en el genoma nuclear. Por lo tanto, se escruto el callo y las plantas regeneradas en busca de la integracion del segmento del lfmite homologo derecho e izquierdo como se describe en este Ejemplo. Ademas, se determino si el gen aadA, el gen gfp y HA estaban correctamente integrados en el ADN del cloroplasto.

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1. Analisis de los callos obtenidos a partir de transformaciones de protoplastos mediante PEG con pLCV2-MSK18

Un callo de lechuga resistente a la espectinomicina se analizo mediante PCR usando diferentes combinaciones de cebadores para confirmar la integracion del plasmido pLCV2-MSK18 en el genoma del cloroplasto.

Como control endogeno para la amplificacion del ADN de cloroplasto, se llevo a cabo un analisis con PCR del gen ATPasa (numero de orden: AF162208) utilizando el cebador directo 5-ACTAATAGTGGACAAATTGGC-3' (SEQ ID NO: 33) y el cebador inverso 5'-TTGcTTGATTGTATTTACTCG-3' (SEQ ID NO: 34). Para detectar la presencia del gen marcador seleccionable AadA, se uso la siguiente combinacion de cebadores: directo 5'- AAGTCACCATTGTTGTGCACG-3' (SEQ ID NO: 35) e inverso 5'-TATGACGGGCTGATACTGGGC-3' (SEQ ID NO: 36). Con el fin de demostrar la integracion ffsica del plasmido en el genoma del cloroplasto, se desarrollaron 2 combinaciones de cebadores que amplificaban regiones tnbridas del plasmido y del genoma de cloroplasto (vease la Figura 12). La primera combinacion de cebadores que consistfa en P1 y P2, amplifica la union que contiene la secuencia trnI del genoma de cloroplasto (integracion del lfmite izquierdo). La segunda combinacion de cebadores que consistfa en P3 y P4, amplifica la union que contiene la secuencia de trnA del genoma de cloroplasto (integracion del lfmite derecho).

El ADN total se aislo a partir de un callo resistente a la espectinomicina utilizando un kit de aislamiento de ADN comercialmente disponible procedente de Sigma (Genelute Plant Genome DNA Kit). La reaccion de PCR se llevo a cabo usando una cantidad total de 30 ng de ADN, despues de la cual los productos de la reaccion se analizaron en un gel de agarosa al 1%.

El resultado del analisis de 5 callos independientes resistentes a espectinomicina, obtenidos a partir de transformaciones de protoplastos mediante PEG, se muestra en la Figura l3 (datos de 2 callos no mostrados pero identicos a los otros 5). El fragmento de ATPasa de aproximadamente 424 pb solo esta presente en el material de callo y material de hoja de lechuga, y como se esperaba no era visible el ADN de pLCV MSK18 (Figura 13A). La amplificacion con PCR del gen aadA proporciono el fragmento esperado de aproximadamente 413 pb para el callo transgenico y el plasmido pLCV2-MSK18 (Figura 13B).

Para confirmar la integracion del vector pLCV2-MSK18 en el genoma de cloroplasto de lechuga, se utilizaron las dos combinaciones de cebadores que detectaban espedficamente cualquiera de las dos uniones que surgen despues de la integracion del plasmido mediante recombinacion homologa. La integracion en la union trnI se investigo utilizando los cebadores de PCR indicados anteriormente, lo que daba lugar tambien a una banda esperada de aproximadamente 2000 pb (Figura 13C). La Figura 13D muestra la amplificacion de la union trnA que da como resultado una banda esperada de aprox. 1500 pb en el callo resistente a espectinomicina. Los resultados de este analisis confirman la naturaleza transplastomica de los callos de lechuga pLCV2-MSK18 obtenidos, resistentes a la espectinomicina, y no se encontraron escapes.

Para confirmar adicionalmente la integracion, las uniones de integracion izquierda y derecha se amplificaron mediante PCR usando las parejas de cebadores P1+P2 y P3+P4. Los productos de la PCR procedentes de una muestra de callo resistente a espectinomicina se clonaron en PCR2.1 y se secuenciaron utilizando cebadores M13 directos y M13 inversos. Estas secuencias confirmaron que LCV2-MSK18 se integraba en el genoma de cloroplasto de lechuga (Figura 14).

Para eliminar la posibilidad de una amplificacion del ADN del plasmido LCV2-MSK18 no integrado, los cebadores P1 y P4 se disenaron a partir de secuencias de cloroplasto de lechuga externas a la region diana del vector (Figura 12). El analisis con PCR se llevo a cabo en ADN aislado a partir de 6 callos supuestamente transformados. En todos los casos, P1 y P4 proporcionan dos productos de PCR, una banda de 2476 pb correspondiente al tamano esperado de un producto amplificado procedente de un genoma de cloroplasto de tipo silvestre no transformado y una banda de 4623 pb correspondiente al tamano de un producto de pCr esperado procedente de un genoma de cloroplasto transformado. La Figura 15 muestra los resultados en detalle para un callo, y la Figura 16 muestra los resultados de la PCR sobre la integracion de insertos para 6 callos independientes.

2. Analisis molecular de callos resistentes a la espectinomicina, obtenidos despues de una transformacion bioHstica con pLCV2-MSK18

Se usaron combinaciones de cebadores similares, tales como las que se usaron para el callo resistente a la espectinomicina de los experimentos con protoplastos mediante PEG, para evaluar la naturaleza transplastomica del callo obtenido a partir del tejido bombardeado. La Figura 17 muestra los productos de la union de trnI y trnA, respectivamente. Se comprobo que el callo era de naturaleza transplastomica.

3. Analisis molecular de un callo transplastomico putativo, obtenido a partir de experimentos de transformacion de protoplastos mediante PEG con pLCV2-LEC1.

Para el analisis de los callos, obtenidos mediante experimentos de transformacion de protoplastos con pLCV2-LEC1, se podfan utilizar combinaciones de cebadores similares a las transformaciones del plasmido pLCV2-MSK18 para el gen aadA, el control endogeno y la integracion del inserto P1 + P4 (vease la Figura 13). Ademas, se realizo un analisis con PCR sobre la integracion en el lfmite izquierdo usando el cebador directo 5'-

ACTGGAAGGTGCGGCTGGAT-3' (SEQ ID NO: 37) y el cebador inverso 5'-TATGACGGGCTGATACTGGGC-3' (SEQ ID NO: 38). La integracion en el Ifmite derecho se realizo usando el cebador directo 5'- ATGCAAAAACTTCCCGGAAAT-3' (SEQ ID NO: 39) y el cebador inverso 5'-CTCGCCCTTAATTTTAAGGC-3' (SEQ ID NO: 40).

5 Los resultados de estos analisis se muestran en la Figura 18. Esta claro que los 5 callos independientes son verdaderamente transplastomicos y no se encontraron escapes.

4. Analisis molecular de plantas regeneradas a partir de un callo transplastomico, obtenido a partir de experimentos de transformacion de protoplastos mediante PEG con pLCV2-MSK18 y LEC1

La Figura 19 muestra los resultados de una PCR a partir de ADN obtenido a partir de varias plantas regeneradas a 10 partir de un callo transplastomico pLCV2-MSK18. La Figura 20 muestra el analisis con PCR de plantas regeneradas pLCV2-LECl. Esta claro que ambos tipos de plantas son realmente transplastomicas.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Metodo para la transformacion de genomas de plastidio de lechuga, que comprende las etapas de:

a) transformar protoplastos de lechuga con un vector de transformacion que es portador de una secuencia de ADN de interes por medio de una transformacion mediante polietilenglicol;

b) colocar los protoplastos tratados de ese modo durante un penodo de tiempo en contacto con un medio de cultivo sin agente de seleccion;

c) posteriormente anadir un agente de seleccion al medio de cultivo;

d) renovar el medio de cultivo que comprende un agente de seleccion mediante la adicion de medio de nuevo aporte con agente de seleccion o cambiar el medio de seleccion por un medio con un agente selectivo;

e) crecimiento de los protoplastos que comprenden plastidios que han adquirido el ADN de interes en transformantes.
2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el vector de expresion comprende:

- un casete de expresion que comprende opcionalmente un promotor activo en la lechuga, un sitio de insercion de ADN para recibir el ADN transformante de interes, opcionalmente uno o varios marcadores de seleccion que confieren un fenotipo seleccionable en celulas que tienen plastidios que se transforman con el casete de expresion y, opcionalmente, una secuencia de ADN que codifica una region de terminacion de la transcripcion activa en la lechuga,

- opcionalmente un conjunto de segmentos de ADN de direccionamiento situados a ambos lados del casete de expresion que permiten una recombinacion homologa doble del casete de expresion con el genoma del plastidio de interes, y

- opcionalmente una secuencia de ADN que codifica un gen de interes, insertada en el sitio de insercion del casete de expresion.
3. Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el vector comprende el promotor, la secuencia de ADN que codifica el gen de interes, uno o varios marcadores de seleccion y el conjunto de segmentos de direccionamiento de ADN.
4. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que los transformantes son portadores del ADN de interes en su genoma.
5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los plastidios que se van a transformar se seleccionan a partir del grupo que consiste en cloroplastos, amiloplastos, elaioplastos, etioplastos, cromoplastos, leucoplastos y proplastidios.
6. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en el promotor del operon de ARN ribosomico espedfico de cloroplasto rrn (ARNr 16S), psbA, rbcL, trnV o rps16.
7. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el ADN de interes es un gen que codifica un (poli)peptido (bio)farmaceutico terapeutico o profilactico, tal como una vacuna comestible.
8. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el ADN de interes se selecciona a partir del grupo que consiste en genes que codifican la resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a hongos, resistencia bacteriana, genes que conducen a una tolerancia del estres, por ejemplo frente al frio, una cantidad elevada de sales o minerales, genes que mejoran el rendimiento, la acumulacion de almidon, la acumulacion de acidos grasos, la fotosmtesis.
9. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que el terminador se selecciona a partir del grupo que consiste en una secuencia de terminacion psb A, rrn, rbcL, trnV o rps16.
10. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el marcador de seleccion se selecciona a partir del grupo que consiste en genes que confieren resistencia a la espectinomicina, estreptomicina, kanamicina, higromicina y cloranfenicol, glifosato, bialafos.
11. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el marcador de seleccion es un marcador visual, tal como un marcador fluorescente de tipo gfp (protema fluorescente verde).
12. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que las etapas d) y e) del metodo de transformacion se omiten y los transformantes se seleccionan mediante una iluminacion de los transformantes putativos con una fuente luminosa apropiada correspondiente al marcador visual y una seleccion del material vegetal que muestra fluorescencia.
13. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en el que los segmentos de ADN que permiten una recombinacion homologa doble del ADN de interes con el genoma del plastidio de interes tienen una secuencia de ADN que es homologa a una parte del genoma de plastidio.
14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que el conjunto de segmentos de ADN se selecciona a partir del grupo

5 que consiste en la region frnI(oria)/frnA y la region 16S/frnV/ORF70B del genoma de cloroplasto de lechuga.
15. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que el conjunto de segmentos de ADN se selecciona a partir de LCV1

A-B y LCV1 C-D, y LCV2 A-B y LCV2 C-D, en donde LCV1 A-B es un fragmento de 2575 pb amplificado por los cebadores LCV1A (SEQ ID NO: 6) y LVC1B (SEQ ID NO: 7), y LCV1 C-D es un fragmento de 2042 pb amplificado por los cebadores LCV1C (SEQ ID NO: 8) y LVC1D (SEQ ID NO: 9) (Figura 4) y en donde LCV2 A-B es un

10 fragmento de 1258 pb amplificado por los cebadores LCV2A (SEQ ID NO: 13) y LVC2B (SEQ ID NO: 14), y LCV2 C

D es un fragmento de 1011 pb amplificado por los cebadores LCV2C (SEQ iD NO: 15) y LVC2D (SEQ ID NO: 16) (Figura 8).
16. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que el penodo de tiempo durante el cual el material vegetal tratado se pone en contacto con un medio de cultivo sin agente de seleccion es de 1 a 14 dfas,

15 preferentemente de 3-7 dfas, mas preferiblemente de aproximadamente 6 dfas.
17. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la etapa c) se lleva a cabo en la oscuridad.