ES2252740T3 - Expresion mejorada en un plastido de planta. - Google Patents

Expresion mejorada en un plastido de planta.

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Abstract

NUEVAS COMPOSICIONES Y METODOS UTILES PARA LA INGENIERIA GENETICA DE CELULAS VEGETALES PARA SUMINISTRAR UNA EXPRESION AUMENTADA EN LOS PLASTIDIOS DE UNA PLANTA O CELULA VEGETAL DE UNA PROTEINA, LA CUAL PRODUCE UN FENOTIPO QUE ESTA PRESENTE CUANDO LA PLANTA O LA CELULA VEGETAL ES DEJADA CRECER EN AUSENCIA DE LOS MEDIOS PARA SELECCIONAR LAS CELULAS TRANSFORMADAS, DE EJEMPLICA LA EXPRESION DE LA PROTOXINA BACTERIANA BACILLUS THURINGIENSIS EN UN CLOROPLASTO VEGETAL.

Description

Expresión mejorada en un plástido de planta.
Esta invención se refiere a la aplicación de técnicas de ingeniería genética en plantas. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones y procedimientos para mejorar la expresión de un péptido de interés en el plástido de una célula vegetal.
Antecedentes
Los plástidos de las plantas superiores, es decir cloroplastos, amiloplastos y cromoplastos, tienen el mismo contenido genético, por ello se cree que derivan de un precursor común, conocido como un proplástido. El genoma del plástido es circular y su tamaño varía entre las especies de plantas desde aproximadamente 120 hasta aproximadamente 217 pares de kilobases (kb). El genoma típicamente incluye una larga repetición invertida, que puede contener hasta aproximadamente 76 pares de kilobases, pero que tiene más típicamente entre aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 pares de kilobases. Se ha descrito la repetición invertida presente en el genoma del plástido de varios organismos (Palmer, J. D. (1990) Trends Genet. 6:115-120).
Una ventaja de la transformación de plástidos en plantas frente a la transformación nuclear es que los plástidos de la mayoría de las plantas se heredan por vía materna, en consecuencia, los genes de plástidos heterólogos no se diseminan con el polen. Esta característica es particularmente atractiva para plantas transgénicas que tienen tratamientos agronómicos alterados, ya que la introducción de resistencia o tolerancia a condiciones naturales o químicas no se transmitirá a sus congéneres de tipo salvaje.
Los plástidos de las plantas también son centros biosintéticos importantes. Además de la fotosíntesis en cloroplastos, los plástidos son responsables de la producción de importantes compuestos tales como aminoácidos, carbohidratos complejos, ácidos grasos y pigmentos.
Los plástidos pueden también expresar dos o más genes de una única región promotora de plástido. Una secuencia de ADN expresada en un plástido puede así incluir una cantidad de genes estructurales individuales que codifican regiones bajo el control de una serie de componentes regulatorios. Por lo tanto, es posible introducir y expresar genes múltiples en una célula vegetal, ya sea desde una secuencia sintetizada por medio de ingeniería o desde un grupo de genes procariotas preexistentes.
Tal procedimiento de expresión hace posible la producción a gran escala y bajo costo de ciertas proteínas y productos químicos finos que no son producidos prácticamente por los procedimientos de transformación nuclear estándar. En la expresión nuclear por genes introducidos, cada secuencia codificadora debe ser creada bajo el control de una región reguladora separada, es decir, un cistrón. Como consecuencia, los niveles de expresión genética varían ampliamente entre las secuencias introducidas, y se necesita generar una cantidad de líneas de plantas transgénicas, con cruces necesarios para introducir todos los cistrones en una planta y obtener la expresión coordinada apropiada en la ruta bioquímica blanco.
Los plástidos pueden estar presentes en una célula vegetal en un número muy alto de copias, con hasta 50.000 copias por célula presentes para el genoma de cloroplasto (Bendich, A. J. (1987) BioEssays 6:279-282). Por lo tanto, pueden crearse células vegetales por medio de la transformación de plástidos para mantener un gen de interés introducido en un número muy alto de copias.
Por todas las razones anteriores, los plástidos de las plantas superiores representan un blanco atractivo para la ingeniería genética. Se ha descrito la transformación estable de plástidos en las algas verdes Chlamydomonas (Boynton y col. (1988) Science 240:1534-1538) y más recientemente en plantas superiores (Svab y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530: Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917); Staub, J. M. and Maliga, P. (1993), EMBO J. 12:601-606). El procedimiento descrito para la transformación de plástidos en plantas superiores depende de la administración por bombardeo de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y de la marcación del ADN al genoma del plástido por recomendación homóloga.
Existen muchos ejemplos en los que serían deseables mayores niveles de expresión que los posibles con expresión nuclear. Un ejemplo puede encontrarse en aquellas situaciones en las que se desea producir una sustancia nueva en una planta madura para su posterior extracción y purificación. Otros ejemplos de proteínas que pueden necesitar ser expresadas en niveles muy altos son aquellas que producen fenotipos resistentes o tolerantes en la planta. Un ejemplo de tal fenotipo es una toxina activa contra pestes de las plantas.
En particular, existe una necesidad continua de introducir genes descubiertos recientemente o alternativos de Bacillus thuringiensis en plantas de cosecha. Las proteínas Cry (d-endotoxinas) del Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida contra una cantidad de insectos Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros. Estas proteínas están clasificadas como CryI hasta CryV, en base a la homología en la secuencia de aminoácidos y la actividad insecticida. Muchas de las proteínas CryI se sintetizan como protoxinas (ca. 130-140 kDa) luego se solubilizan y procesan proteolíticamente para formar fragmentos de toxinas activos (ca. 60-70 kDa).
La pobre expresión de los genes de protoxinas del núcleo de plantas requirió hasta el momento el uso de versiones "truncadas" de estos genes. Las versiones truncadas codifican sólo los fragmentos de toxina activos. Otros intentos para mejorar la eficacia de la expresión incluyeron la resíntesis de los genes de toxinas de Bacillus thuringiensis para usar los codones preferidos para las plantas. En tales reconstrucciones tan extensas de estos largos genes cry (aproximadamente 3,5 kb) pueden surgir muchos problemas y los procedimientos son laboriosos y costosos.
También pueden surgir problemas por el hecho de que las pestes por insectos se convierten en endémicas, o por que las poblaciones existentes desarrollan resistencia a un nivel particular o a un tipo de toxina de Bacillus thuringiensis. Por consiguiente, existe un particular interés en producir niveles mayores y por lo tanto más efectivos de toxinas de Bacillus thuringiensis en plantas, interés que incrementará solo con el paso del tiempo.
Resumen de la invención
Con esta invención se proveen construcciones de expresión en plástidos que son útiles para ingeniería genética de células de plantas, y que proveen una mayor expresión de un péptido ajeno en plástidos de células de plantas. El plástido transformado es de preferencia un plástido metabólicamente activo, tales como los cloroplastos que se encuentran en tejidos de plantas verdes incluyendo hojas o cotiledones. El plástido es de preferencia uno que se mantiene en un alto número de copias en el tejido de la planta de interés.
Las construcciones de expresión en plásmidos para uso en esta invención incluyen una región promotora de plástido y una secuencia de ADN de interés para expresarla en los plástidos transformados. La secuencia de ADN de interés puede ser una región de codificación única, o puede contener un número de regiones codificadoras consecutivas, para expresarse como un operón, por ejemplo en el caso en que se desea la introducción de una ruta bioquímica ajena dentro de los plástidos.
La secuencia de ADN codificadora de la construcción codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de ADN nativo, mientras que tiene un uso de codones enriquecido para el contenido de adenina y timina. Como ejemplo, una secuencia de ADN nativo puede ser resintetizada para incluir un contenido de adenina y timina de preferencia por el plásmido de la planta. Mientras que el contenido en porcentaje de adenina y timina del genoma nuclear varía de organismo en organismo, en las plantas la utilización del codón generalmente comprende más emparejamientos de guanina y citosina que de adenina y timina, por consiguiente el contenido se considera enriquecido por guanina más citosina.
Las construcciones de expresión en plástidos de esta invención pueden estar ligadas a una construcción que tiene una secuencia de ADN que codifica un marcador seleccionable que puede expresarse en un plástido de una planta. La expresión del marcador seleccionable permite la identificación de células de plantas que comprenden un plástido que expresa el marcador.
En una forma de realización de preferencia, los vectores de transformación para la transferencia de la construcción dentro de la célula de la planta incluyen medios para insertar las construcciones de selección y expresión dentro del genoma del plástido. Esto comprende de preferencia regiones homólogas al genoma del plástido blanco que flanquean las construcciones.
También se provee con esta invención un procedimiento por el que se usa una construcción de expresión en plástido para producir un péptido de interés en una célula de una planta. El péptido se expresa en un plástido de la célula de la planta desde una secuencia de ADN codificadora del péptido que está enriquecida en adenina y timina.
Con esta invención se produce la toxina insecticida de Bacillus thuringiensis en plástidos de una célula de una planta desde la secuencia de ADN codificadora nativa, con niveles mejorados de expresión de un fenotipo resistente a los insectos, como puede medirse con ensayos de alimentación de insectos. La secuencia de ADN codificadora nativa de Bacillus thuringiensis puede ser la versión truncada específica para el fragmento activo. Esta invención también provee la expresión de toxina de Bacillus thuringiensis desde la secuencia no truncada que codifica la protoxina.
También son consideradas en esta invención las células de plantas y plantas producidas por un procedimiento de la invención y que comprenden una construcción de expresión en plástidos.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la integración de genes cry de los vectores pZS223 y pZS224 en el genoma de plástidos de tipo salvaje (Nt-ptDNA) para conseguir transplantomas Nt-pZS223 ptDNA y Nt-pZS224 ptDNA, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
Una construcción de expresión en plásmido de esta invención comprende un promotor funcional en el plástido de una planta, una secuencia de ADN que codifica un péptido de interés y una región de terminación de la transcripción capaz de terminar la transcripción en el plástido de una planta. Estos elementos se proveen como componentes operativos unidos en la dirección 5' 3' de la transcripción.
Se puede usar cualquier secuencia codificadora de ADN que esté enriquecida en su contenido de adenina y timina, y que pueda ser insertada en el genoma del plástido de una célula de una planta para proveer una expresión mejorada de un péptido de interés desde la secuencia de ADN codificadora.
En el desarrollo de las construcciones, los fragmentos que comprenden las regiones regulatorias y el marco de lectura abierto pueden ser sometidos a diferentes condiciones de procesamiento, tales como ligación, digestión con enzimas de restricción, PCR, mutagénesis in vitro, agregado de conectores y adaptadores. Por consiguiente, las transiciones de nucleótidos, transversiones, inserciones o deleciones pueden llevarse a cabo en ADN que se emplea en las regiones regulatorias o en ADN de las secuencias de interés para expresión en los plástidos. Los procedimientos para digestiones de restricción, tratamientos con fragmento Klenow, ligaciones y similares son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen por ejemplo por Maniatis y col. (en Molecular cloning: a laboratory manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Durante la preparación de las construcciones, varios fragmentos de ADN serán frecuentemente clonados en vector de clonación adecuado, que permite la amplificación del ADN, modificación del ADN o manipulación del ADN uniendo o eliminando secuencias o conectores. De preferencia, los vectores serán capaces de replicar hasta al menos una cantidad de copias relativamente alta en E. coli. Se encuentran fácilmente disponibles una cantidad de vectores para clonado, incluyendo vectores tales como pBR322, vectores de la serie PUC, vectores de la serie M13 y vectores pBluescript (Stratagene; La Jolla, CA).
Con el fin de proveer un medio para seleccionar las células deseadas de las plantas, los vectores para la transformación de plástidos típicamente contienen una construcción que provee la expresión de un gen de un marcador seleccionable. Los genes marcadores son secuencias de ADN capaces de expresarse en plantas y que expresan un polipéptido que atenúa o inactiva una sustancia selectiva o resiste una inhibición natural por esa sustancia, es decir, antibiótico, herbicida.
Alternativamente, un gen marcador puede proveer alguna otra respuesta reactiva visible, es decir, puede causar una apariencia diferente o un patrón de crecimiento relacionado con plantas o células de plantas que no expresan el gen marcador seleccionable en presencia de cierta sustancia, ya sea aplicada directamente a la planta o células de la planta o presente en el medio de cultivo de la planta o células de la planta.
En cualquier caso, las plantas o células de plantas que contienen tales genes marcadores seleccionables tendrán un fenotipo distintivo para fines de identificación, es decir, serán distinguibles de las células no tratadas. El fenotipo característico permite la identificación de células, grupos de células, tejidos, órganos, partes de plantas o plantas enteras que contiene la construcción.
La detección del fenotipo marcador hace posible la selección de células que tienen un segundo gen al que se le unió el gen marcador. Este segundo gen típicamente comprende un fenotipo deseable que no es fácilmente identificable en células transformadas, pero que está presente cuando la célula de la planta o derivado de la misma crece hasta la madurez, aún bajo condiciones en las que el fenotipo marcador seleccionable no es evidente por si mismo.
Se describió el uso de tal marcador para identificación de células de plantas que contienen una construcción en su plástido. Svab y col. (1993 supra). En los ejemplos que se proveen a continuación, un gen aadA bacteriano se expresa como marcador bajo el control regulatorio del promotor 5' y las regiones de terminación de la transcripción 3' del cloroplasto, específicamente la región rrn del promotor rRNA 16S de la planta de tabaco y la región de terminación 3' rps16. Pueden usarse numerosas regiones promotoras adicionales para conducir la expresión del gen marcador seleccionable, incluyendo varios promotores de plástido y promotores bacterianos que han demostrado su funcionamiento en los plástidos de plantas.
La expresión del gen aadA confiere resistencia a la espectinomicina y estreptomicina, y así permite la identificación de células de plantas que expresan este marcador. El producto del gen aadA permite el crecimiento y regeneración continua de las células cuyos cloroplastos comprenden el producto del gen marcador seleccionable. Las células que no contienen el producto del gen marcador seleccionable se decoloran. La selección para el gen marcador aadA se basa en la identificación de células de plantas que no se decoloran por la presencia de estreptomicina, o de más preferencia espectinomicina, en el medio de cultivo de la planta.
Se han desarrollado una cantidad de marcadores para su uso en células de plantas, tal como la resistencia al cloranfenicol, al aminoglicósido G418 e higromicina. Pueden también usarse como marcadores seleccionables otros genes que codifican un producto involucrado en el metabolismo del cloroplasto. Por ejemplo, los genes que proveen resistencia a herbicidas tales como glifosato, bromoxinilo o imidazolinona pueden tener particular utilidad. Tales genes se describieron (Stalker y col., J. Biol. Chem. (1985) 260:4724-4728 (EPSP resistente a glifosato); Stalker y col., J. Biol. Chem. (1985) 263:6310-6314 (gen de nitrilasa resistente a bromoxinilo); y Sathasivan y col., Nucl. Acids Res. (1990) 18:2188 (gen de resistencia a imidazolinona AHAS)).
Se describió la transformación estable de los genomas de plástidos del tabaco por bombardeo de partículas (Svab y col. (1990 supra) y Svab y col. (1993 supra)). Los procedimientos descritos en esas descripciones pueden emplearse para obtener plantas homoplásmicas para las construcciones de expresión en plásmidos.
Generalmente, el tejido bombardeado se cultiva durante aproximadamente 2 días en un medio promotor de la división celular, tras lo que el tejido de la planta se transfiere a un medio selectivo que contiene una cantidad inhibitoria de un agente selectivo particular, como también las hormonas y otras sustancias particulares necesarias para obtener regeneración para esa especie de planta particular. Posteriormente se subcultivan los brotes en el mismo medio selectivo para asegurar la producción y selección de brotes homoplásmicos.
La homoplasmia se verifica por medio de análisis southern. En los ejemplos que se proveen a continuación, el ADN celular total digerido de BamHI se prueba con varias sondas, específicamente, una parte del fragmento blanco del plástido, un fragmento aadA, un fragmento cry1A de 1,8 kb y un fragmento de 3,5 kb de la región codificadora de cry73. El análisis southern blot con estas sondas confirma la integración de los genes cry quiméricos en el genoma de plástidos del tabaco para producir líneas de transplastomas.
Como una alternativa a una segunda serie de formación de brotes, los brotes seleccionados inicialmente pueden dejarse crecer hasta plantas maduras y la segregación depende de la provisión de las plantas transformadas homoplásticas con la construcción del gen insertado.
Donde los procedimientos de transformación y regeneración se adaptaron para una especie de planta dada, ya sea por medio de transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo u otro procedimiento, la técnica establecida puede modificarse para uso en los procedimientos de selección y regeneración para producir plantas con plástidos transformados. Por ejemplo, los procedimientos descritos en este documento para el tabaco son fácilmente adaptables a otras especies solanáceas, tales como tomate, petunia y patata.
En Brassica, los protocolos de transformación y regeneración mediados por Agrobacterium generalmente incluyen el uso de tejido de hipocótilo, un tejido no verde que puede tener un contenido bajo de plástidos. Por consiguiente, para Brassica, los tejidos blanco de preferencia incluirán tejidos de hipocótilo derivado de microspora o con cotiledones (que son verdes y contienen numerosos plástidos) o explantes de tejidos de hoja. Mientras la velocidad de regeneración de tales tejidos puede ser baja, no se esperan los efectos posicionales, tal como se aprecian con la transformación mediada por Agrobacterium, así no sería necesario explorar numerosas plantas transformadas satisfactoriamente con el fin de obtener el fenotipo deseado.
Los vectores para uso en la transformación de plástidos de preferencia incluyen medios para proveer una transferencia estable de la construcción de expresión en plástido y de la construcción de marcador seleccionable dentro del genoma del plástido. Esto es más convenientemente provisto por regiones homólogas al genoma del plástido blanco. Las regiones homólogas flanquean la construcción a transferir y proveen para la transferencia al genoma del plástido por recombinación homóloga, por medio de un doble entrecruzamiento dentro del genoma. Se ha descrito la secuencia de ADN completa del genoma del plástido del tabaco (Shinozaki y col. (1986) EMBO J. 5:2043-2049). También se han descrito las secuencias de ADN completo de los genomas de plástidos de hepáticas (liverwort) (Ohyama y col. (1986) Nature 322:572-574) y de arroz (Hiratsuka y col. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:185-194).
Donde están presentes las regiones de homología en las regiones de repetición invertida del genoma del plástido (conocidas como IRA e IRB), se esperan dos copias del transgen por plástido transformado. Las regiones de homología dentro del genoma del plástido tienen un tamaño aproximado de 1 kb. Pueden también usarse regiones de homología más pequeñas, y tan pequeñas como 100 bp pueden ser útiles para recombinación homóloga en el genoma de plástidos. Sin embargo, la frecuencia de recombinación y por consiguiente la frecuencia de obtención de plantas con plástidos transformados decrece con el tamaño decreciente de las regiones de homología.
Se describen ejemplos de construcciones que tienen regiones de homología en el genoma del plástido en Svab y col. (1990 supra) y Svab y col. (1993 supra). Las regiones útiles para recombinación de genomas de plástidos en tabaco y Brassica son también identificadas en los siguientes ejemplos, pero la recombinación homóloga y construcciones de selección pueden prepararse usando muchas secuencias de ADN de plástidos, y en cualquier especie de planta blanco. En los ejemplos que se proveen en este documento, las regiones de homología que flanquean el plástidos del tabaco de la construcción de expresión en plástido dirigen la inserción de un transgen de Bacillus thuringiensis dentro del genoma del tabaco entre trnV y el operón rps12. Mientras que la integración en el genoma del plástido ocurre por recombinación homóloga y el sitio blanco está en una región de repetición invertida del genoma del plástido, se esperan dos copias del transgen por genoma del plástido. La selección se hace por el fenotipo marcador de resistencia a la espectinomicina expresado por el gen aadA. En los ejemplos el gen cry nativo, es decir, que tiene una región codificadora no modificada para la protoxina, se ubica dentro de la construcción de la expresión en plástido para la expresión de toxina de Bacillus thuringiensis desde el plástido de la planta.
Se ubica un gen de Bacillus thuringiensis sintético en la misma construcción de expresión que el gen de protoxina. El gen sintético se diseña de manera que tiene utilización de su subunidad pequeña de codón RuBPCO de tabaco, con un incremento sobre todo en el contenido de guanina más citosina hasta el 55% (con respecto al contenido del gen nativo del 39%) y fue truncado para dejar sólo aquellas secuencias que codifican el fragmento activo de la toxina. Se sabe que tal gen provee una expresión óptima desde el genoma nuclear de la planta. Tanto el gen bacteriano que fue resintetizado para una mayor expresión por transformación nuclear de la planta como el no resintetizado, gen de tipo salvaje no truncado para la protoxina se introducen por medio de un vector de transformación de cloroplastos
(Fig. 1).
Inesperadamente, se comprueba que la expresión de la toxina mejora notablemente desde la secuencia codificadora nativa del gen, en oposición a lo que ocurre con una versión del gen resintetizado para lograr los codones de preferencia del genoma de la planta. Las líneas de tabaco que contienen la secuencia codificadora nativa demuestran una fuerte bioactividad insecticida, como se la mide con ensayos de alimentación de insectos. Las líneas de tabaco que tienen un gen cryIA(c) sintético no demuestran bioactividad observable. Como en ambos casos las construcciones se introducen de una manera controlada por recombinación homóloga por el vector del plástido, las diferencias no pueden explicarse por efectos posicionales.
En las plantas transformadas que contienen la secuencia codificadora nativa, la toxina de Bacillus thuringiensis está presente como un componente de hasta un 5% o más del total de proteínas de la hoja, un nivel que es mucho mayor que el que presentan las hojas de plantas que se producen por transformación nuclear. En plantas que contienen el gen resintetizado de manera de acercar los codones de preferencia al genoma de la planta, el ARNm de la toxina aparece degradado, y en la hoja aparece muy poca o ninguna toxina.
El hecho de que un gen de toxina de Bacillus thuringiensis nativo se exprese en un nivel tan alto en el plástido, mientras que una construcción idéntica que contiene el gen de Bacillus thuringiensis resintetizado para expresión nuclear eficiente se exprese tan pobremente en el plástido, sugiere que el contenido de adenina más timina del transgén del plástido influencia fuertemente la expresión. Como se notó anteriormente, el contenido de guanina más citosina del gen sintético estaba incrementado hasta 55%, lo que es una relación alta comparada con el contenido de menos del 40% en el genoma del plástido. Esta diferencia puede causar procesamiento ineficiente del ARNm, o llevar a un incremento en su tasa de degradación. El gen de Bacillus thuringiensis nativo tiene un porcentaje de guanina más citosina
que se asemeja más al del genoma del plástido, y que favorece más la utilización de codones del gen del plástido.
El contenido de adenina más timina de los respectivos genes puede no explicar completamente las dramáticas diferencias en la expresión de las toxinas proteicas nativa y sintética de Bacillus thuringiensis. Un factor adicional que podría postularse es que se introducen señales de procesamiento de ARN del plástido indeseadas o altamente ineficientes en el gen cryIA(c) sintético. Tales señales, si están presentes, podrían reducir fuertemente o aún eliminar la expresión de la toxina.
En cualquier caso, actualmente se demuestra que la utilización de codón del gen de Bacillus thuringiensis nativo alcanza un nivel de expresión mucho más alto en la expresión en plástido que la que es posible con la secuencia resintetizada del mismo gen, demostrando así que el gen con utilización de codón bacteriano puede alcanzar niveles de expresión altos en el plástido de una planta. Los resultados anteriores eliminan la necesidad de resintetizar una cierta clase de genes para lograr altos niveles de expresión en plantas.
La secuencia de ADN de interés puede tener una utilización de codón natural alta en adenina y timina, como en el caso del gen de Bacillus thuringiensis, o puede alternativamente resintetizarse para enriquecer el contenido de adenina más timina. De hecho, mientras que la construcción y los procedimientos descritos en este documento pueden emplearse con una variedad de secuencias codificadoras de ADN bacteriano nativo, puede obtenerse un intervalo mayor de genes blanco potenciales para lograr niveles altos de expresión en plástidos resintetizando genes, por ejemplo genes nucleares de plantas, para incrementar el contenido de adenina y timina de la secuencia codificadora.
La invención descrita generalmente se comprenderá mejor tomando como referencia los siguientes ejemplos.
Ejemplos
En la descripción experimental a continuación, todas las temperaturas se expresan en grados centígrados (º), los pesos en gramos (g), miligramos (mg) o microgramos (\mug), las concentraciones se expresan como molar (M), milimolar (mM) o micromolar (\muM) y todos los volúmenes se expresan en litros (l), mililitros (ml) o microlitros (\mul), a menos que se indique de otra manera.
Ejemplo 1 Vectores de transformación de plástidos
Las construcciones y procedimientos para uso en la transformación de plástidos en plantas superiores se describen en Svab y col. (1990 supra), Svab y col. (1993 supra) y Staub y col. (1993 supra). Las secuencias de ADN completas del genoma de plástidos del tabaco son descritas por Shinozaki y col. (1986 supra). Todas las referencias de ADN de plástidos en la siguiente descripción son para el número de nucleótidos del tabaco.
El gen cryIA(c) se obtiene del plásmido pBtkHD73 (Toagosei Chemical Co., Japan). Este gen se procesa además por digestión con SmaI/NsiI y se le inserta un adaptador sintético (hebra inicial: 5'-CCCCGATCCATGGATAA
CAATCCGAACATCAATGAATGCA-3'; hebra final: 5’-TTCATTGATGTTCGGATTGTTATCCATGGATCCGGG-3'). La región no traducida 5' entera del gen cryIA(c) luego se elimina y se introduce un sitio NcoI en el codón de iniciación natural (posición 163 de la secuencia de nucleótidos (Adang y col. (1985) Gene 36:289-300)). Se introduce un sitio BamHI justo encima del sitio NcoI. Se lleva a cabo mutagénesis de oligonucleótidos para introducir sitios BglII y SalI directamente adyacentes al codón de terminación del gen cryIA(c), para facilitar la eliminación del ADN 3' no deseado de la región codificadora. La secuencia remanente incluye la región codificadora entera de la protoxina.
Se construye un gen sintético cryIA(c) que codifica el fragmento activo de la toxina apareando y ligando 70 y 90 oligonucleótidos base, en un procedimiento como el descrito (Wosnick y col. (1987) Gene 60;115-127). El gen sintético se diseña de manera que tenga la utilización de codón de la subunidad pequeña RuBISCO del tabaco, incluyendo un contenido de guanina más citosina de 55%, con un sitio NcoI en el codón de iniciación y un sitio Sa1I en el codón de terminación, mientras que continúa codificando la secuencia de aminoácidos de la toxina. Este gen sintético está también truncado, de manera que la región codificadora solo provee la secuencia de aminoácidos para el fragmento activo de la protoxina.
Se usa un vector de transformación de plástidos que lleva un gen clonado en un casete de expresión Prrn(L)rbcL(S)/Trps16, con sitios de restricción de policonexión. Los fragmentos Prrn(L)rbcL(S) se describen en Svab y col. (1993 supra). Para asegurar además la estabilidad de los ARNm, se clona el fragmento Trps16 a continuación de la región codificadora del gen clonado. El fragmento Trps16 comprende la región regulatoria 3' del gen rps16 desde los nucleótidos 5.087 hasta 4.939 en el ADN del plásmido del tabaco.
Los genes quiméricos son de preferencia insertados dentro del vector para dirigir su transcripción en dirección del operón rrn. Así, en el genoma del plástido, los genes quiméricos se transcriben desde la región regulatoria 5' Prrn(L)rbcL(S) que comprende el largo fragmento promotor del operón rrn desde los nucleótidos 102.561 hasta 102.677 del genoma del plástido del tabaco, que está fusionado con una secuencia líder sintética designada tras el líder del gen rbcL entre los nucleótidos 57.569 hasta 57.584 en el ADN del plástido.
El vector de transformación de plástidos también lleva un gen de resistencia a la espectinomicina seleccionable (aadA) bajo el control de señales de expresión del gen psbA. Las secuencias regulatoria y codificadora también están flanqueadas por regiones homólogas de ADN de plásmido cuyos límites son bp 138.447 (EcoRI) hasta 140.219 (HincII) y 140.219 (HincII) hasta 141.382 (BglII) del genoma del plástido del tabaco (Shinozaki y col. (1986 supra)). Esto dirige la inserción de genes ajenos localizados entre las regiones de los flancos dentro del plástido entre el gen trnV y el operón rps12/7.
Este vector de transformación de plástidos se digiere con endonucleasas de restricción NcoI/SalI para eliminar la región codificadora del gen clonado, que luego se reemplaza con un fragmento NcoI/SalI que contiene la región codificadora cryIA(c), dando como resultado un vector designado pZS223 (Fig. 1). El gen de protoxina cryIA(c) de tipo salvaje es clonado de manera similar como un fragmento NcoI/SalI, dando como resultado un plásmido designado pZS224. Mediante esta aproximación el ADN 3' de Bacillus thuringiensis de la región que codifica la proteína se omite en ambos plásmidos, pZS223 y pZS224.
La inserción de los respectivos genes cry de los vectores pZS223 y pZS224 dentro del genoma del plástido de tipo salvaje (Nt-ptADN) para dar los transplantomas Nt-pZS223 y pZS224 respectivamente, se muestra en la Fig. 1. Las abreviaturas usadas en la Fig. 1 son las siguientes: 16S, gen ARNr 16S; trnV, gen trnV; aadA, gen de resistencia a espectinomicina; cry1A y cry73 son los genes de d-endotoxina de Bacillus thuringiensis sintético y nativo, respectivamente. Los sitios de clivaje con endonucleasas de restricción se designan de la siguiente manera: B, BamHI; Bg, Bg1II; H, HindIII; N, NcoI; RI, EcoRI; RV, EcoRV; S, Sa1I.
Ejemplo 2 Transformación de plástidos de plantas
La transformación estable de genomas de plástidos del tabaco por medio de bombardeo de partículas se describe en Svab y col. (1990 supra) y Svab y col. (1993 supra). Los procedimientos allí descritos pueden emplearse para obtener plantas transformadas con las construcciones de expresión en plástidos descritas en este documento. Tales procedimientos incluyen generalmente bombardeo con ADN de un explante del huésped blanco, de preferencia un explante obtenido de un tejido que es rico en plástidos metabólicamente activos, tales como tejidos de plantas verdes incluyendo hojas o cotiledones.
Se esterilizan las semillas de tabaco (N. tabacum v. Xanthi N/C) en una solución de clorox 50% (hipoclorito de sodio 2,5%) durante 20 minutos y se aclaran 4 veces en agua estéril. Se las plaquea de manera aséptica en un medio con sales 0,2x MS y se las deja germinar. Se hace crecer los semilleros en medio de agar solidificado MS con 30 g/l de sucrosa (Murashige y col. (1962) Physiol. Plant 15:493-497).
Se recubren microproyectiles de tungsteno (1,0 \muM) con ADN de plásmido de acuerdo con Maliga (Maliga, P. (1993) Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual, eds. Pal Maliga, Daniel Klessig, Anthony Cashmore, Wilhelm Gruissem and Joseph Varner; Cold Spring Harbor Press) y se usan para bombardear hojas maduras, ubicadas de forma abaxial en medio RMOP; sales MS, BAP 1 mg/l, NAA 0,1 mg/l, sucrosa 30 g/l y fitagar 0,7%. Svab y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530 (usando el sistema Bio-Rad PDS 1000 He (Sanford y col.; An improved, helium-driven Biolistic device, Technique 3:3-16)). Los plásmidos pZS223 y pZS224 se usan como ADN del plásmido de recubrimiento.
El tejido bombardeado posteriormente se cultiva durante aproximadamente 2 días en un medio promotor de la división celular, luego de esto el tejido de la planta se transfiere a un medio selectivo que contiene una cantidad inhibitoria del agente selectivo particular. Los explantes transformados forman brotes verdes en aproximadamente 3-8 semanas. Posteriormente se subcultivan hojas de estos brotes en el mismo medio selectivo para asegurar la producción y selección de brotes homoplásmicos.
Ejemplo 3 Análisis gel blot de ADN de las líneas transplastómicas
Las plantas transformadas seleccionadas para el marcador de la expresión del gen marcador aadA se analizan para determinar si el contenido total del plástido de la planta fue transformado (transformantes homoplásticos). Típicamente, tras dos series de formación de brotes y selección con espectinomicina, aproximadamente 50% de los plantines transgénicos que son analizados son homoplásticos, como se determina por análisis Southern blot del ADN del plástido. Los plantines homoplástidos se seleccionan para su cultivo posterior.
Tras una segunda serie de formación de brotes y selección con espectinomicina, se obtienen 2 líneas transplastómicas para cada construcción, Nt-pZS223 y Nt-pZS224. Se verifica que estas líneas son homoplásmicas. Se usa análisis Southern blot para confirmar la integración de los genes cry quiméricos en el genoma del plástido del tabaco. La preparación, electroforesis y transferencia de ADN a los filtros es como se describe (Svab y col.; (1993 supra).
La desaparición completa del fragmento BamHI del tabaco nativo de 3,3 kb en los transformantes Nt-pZS223 y Nt-pZS224 con una sonda cubriendo la región de integración y la aparición de bandas del tamaño esperado para los fragmentos de ADN insertados en esos transformantes, 5,5 kb y 7,3 kb, respectivamente (ver Fig. 1), establece que las plantas transformadas son homoplásmicas para las construcciones usadas. Usando sondas con filtros idénticos con los genes aadA, cryIA(c) protoxina y cryIA(c) sintético se demostró un ligamiento de los genes aadA y cryIA(c) con los fragmentos BamHI esperados 5,5 y 7,3 kb así como la falta de estos genes en el control negativo.
Ejemplo 4 Bioensayos en insectos
Como se describe, el desarrollo de líneas de plantas transformadas Nt-pZS223 y Nt-pZS224 se consigue en medio suplementado RMOP con 500 mg/l de dihidrocloruro de espectinomicina. Las plantas se subclonan en el mismo medio selectivo, por el procedimiento de acuerdo con Svab y col. (1990 supra). Las plantas seleccionadas son posteriormente enraizadas en medio MS que contiene 1 mg/l IBA, 500 mg/l de dihidrocloruro de espectinomicina y 0,6% de fitagar.
Se obtienen huevos de Helicoberpa zea y Heliothis virescens de USDA-ARS en Stoneville, MS. y se los deja incubar. Las larvas neonatas se colocan en Tobacco Budworm Diet de Bioserve (Frenchtown, N. J.), y se incuban en un fotoperíodo 16:8 a 28ºC durante 5 días. La larva se desarrolla durante este tiempo hasta el estadio segundo tardío o tercero temprano.
A los 5 días, se extirpan hojas completamente expandidas de las plantas de tabaco y se colocan en 3 ml de agar al 2% en una bandeja de cría de 32 pocillos de CD International (Pitman, NJ). Se coloca una larva por pocillo, se sella y se incuba durante 5 días a las mismas condiciones. En el día 10 se estima el material de la hoja consumido por el insecto y se verifica la mortalidad de los insectos. Las larvas se consideran muertas si no muestran movimiento tras estimularlas con un forceps.
Ejemplo 5 Actividad de alimentacion con insecticida
Para determinar la presencia y cantidad relativa de d-toxina activa de Bacillus thuringiensis en las líneas homoplásticas de tabaco para protoxina nativa y construcciones de expresión del gen cryIA(c) "truncada" sintética, se prueba la eficacia de estas plantas con el tercer estadio larvario de Heliotis virescens (gusano del brote del tabaco) y Helicoverpa zea (gusano de la mazorca/gusano del capullo de algodón) (ver tabla). Ambos insectos de prueba son sensibles a la toxina cryIA(c) con H. zea siendo 10 veces más resistente que H. virescens (MacIntosh y col. (1990)J, Invertebr. Pathol. 56:258-266).
Se elige el tercer estadio larvario para el bioensayo ya que los insectos son más resistentes a la toxina en este estadio que en el primer estadio larvario permitiendo así una comparación más estricta entre el control y las plantas de prueba. Se usan como controles positivos en el bioensayo las líneas del tabaco designadas 4083 y 4084, derivadas de transformación nuclear con el mismo gen cryIA(c) sintético que el usado en pZS223 y que mostraron ser altamente tóxicas para el tercer estadio de larvas de H. virescens. Como control negativo sirve Nicotiana tabacum var. "Petite Havana" ya que este es la base genética usada para generar las líneas transplastómicas.
La Tabla 1 es un resumen de los ensayos de alimentación de insectos con tabaco con Bacillus thuringiensis. Los datos demuestran que la línea transplastómica Nt-pZS224 es muy tóxica para H. virescens y H. zea ya que causa el 100% de mortalidad a estos insectos mientras producen menos de un 2% total de daño en la hoja. Este resultado se compara favorablemente con los resultados para el control positivo 4083 y 4084 de plantas de tabaco. La planta 4083-2-4 cuando se ensayó con H. zea causa 100% de mortalidad pero con un nivel mucho mayor de daño por alimentación en la hoja que la línea de tabaco Nt-pZS224 indicando menor producción de toxinas. La línea de tabaco 4084-4-1 se comportó de manera comparable a Nt-pZS224 en alimentación, a pesar de que no se comparan con los niveles de toxinas producidos en Nt-pZS224 cuando se miden como un componente de la proteína total de la hoja.
La línea de tabaco Nt-pZS224 no muestra bioactividad detectable.
TABLA 1 Resumen de ensayos de alimentación de insectos con tabaco BT
Cloroplasto Vector Plantas Heliothis % de hoja Helicoverpa % de hoja
probadas virescens\perp\perp comida zea\perp\perp% comida
Gen de toxina pZS223 223-3 SIN mortalidad 100% SIN mortalidad 100%
sintética 223-5 SIN mortalidad 75% SIN mortalidad 100%
223-12 NT* SIN mortalidad 100%
223-13 SIN mortalidad 75% NT*
Gen de protoxina pZS224 224-5 Mortalidad 2% Mortalidad 100% 2%
de tipo salvaje 100%
224-9 Mortalidad 2% Mortalidad 100% 2%
100%
Controles
Nucleares
Gen de toxina pCGN4083 4083-1-2 Mortalidad 2% NT*
sintética 100%
4083-2-4 NT* Mortalidad 100% 40%
pCGN4084 4084-8-5 Mortalidad 2% NT*
100%
4084-1-1 NT* Mortalidad 100% 2%
Controles sin
Transformar Control 1 Mortalidad 25% 75% SIN mortalidad 100%
Control 2 SIN mortalidad 100% NT*
Control 3 Mortalidad 50% 75% NT*
\perp\perp Se probaron 10 larvas de tercer estadio por planta
NT* Planta no probada

Claims (13)

1. Una construcción que comprende los siguientes componentes unidos de forma operativa en la dirección de 5' a 3' de transcripción:
(a) un promotor funcional en un plástido de una planta;
(b) una secuencia de ADN que codifica un péptido de interés; y
(c) una región de terminación de la transcripción capaz de terminar la transcripción en un plástido de una planta
en la que la secuencia de ADN que codifica dicho péptido de interés tiene un contenido de adenina y timina dado y en la que dicha secuencia de ADN codificadora de (b) codifica la misma secuencia de aminoácidos que dicha secuencia de ADN nativa y tiene un contenido de adenina y timina enriquecido comparado con la secuencia de ADN nativa.
2. La construcción de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicha construcción comprende además (d) un gen que codifica un marcador para selección de células de plantas que comprenden un plástido que expresa dicho marcador y (e) regiones de homología de ADN con el genoma de dicho plástido, en la que dichas regiones de homología en (e) flanquean dichos componentes (a), (b), (c) y (d) de dicha construcción.
3. La construcción de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicho plástido de planta es un cloroplasto.
4. La construcción de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN codificadora comprende un contenido de adenina y timina mayor del 50%.
5. La construcción de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN codificadora codifica dos o más péptidos de interés.
6. Una célula de planta o célula de progenie de planta, un tejido de planta o planta derivada del mismo que contiene la construcción de acuerdo con la Reivindicación 1.
7. Un procedimiento para producir un péptido de interés en la célula de una planta, dicho procedimiento comprendiendo la expresión de dicho péptido en un plástido de dichas células de plantas desde una construcción de acuerdo con la Reivindicación 1.
8. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que dicha construcción además comprende (d) un gen que codifica un marcador para la selección de células de plantas que comprenden un plástido que expresa dicho marcador y (e) regiones de ADN con homología con el genoma de dicho plástido en el que dichas regiones de homología (e) flanquean dichos componentes (a), (b), (c) y (d) de dicha construcción.
9. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que dichos plástidos de plantas son cloroplastos.
10. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que dicha secuencia codificadora de ADN comprende un contenido de adenina y timina mayor del 50%.
11. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que dicha secuencia codificadora de ADN codifica dos o más péptidos de interés.
12. El procedimiento de la Reivindicación 8 en el que dicho péptido se expresa como un componente que representa aproximadamente el 5% o más de las proteínas totales de dicha célula de planta o célula de progenie de planta, tejido de planta o planta derivada del mismo.
13. La célula de planta o planta derivada de progenie de planta, tejido de planta o planta derivada del mismo de la Reivindicación 6 que expresa el péptido de interés en sus plástidos desde la construcción de acuerdo con la Reivindicación 1.
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