CN101605903B - 丙氨酸消旋酶基因对植物赋予线虫抗性的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了丙氨酸消旋酶编码多核苷酸，其能够赋予植物提高的线虫抗性。具体地，本发明涉及生产具有提高的线虫抗性的转基因植物的方法、包含编码丙氨酸消旋酶的多核苷酸的表达载体，和转基因植物及其产生的种子。

Description

丙氨酸消旋酶基因对植物赋予线虫抗性的用途
与相关申请交叉引用
本申请要求2007年2月6日提交的美国临时申请序列号60/899,746的优先权。
发明领域
本发明涉及线虫的控制，尤其是大豆胞囊线虫的控制。本文公开了生产具有提高的线虫抗性的转基因植物的方法、包含编码功能蛋白质的多核苷酸的表达载体，和转基因植物及其产生的种子。
发明背景
线虫是以超过2,000种蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微观蠕虫样动物。一种常见的线虫类型是根结线虫(RKN)，其进食在多种植物物种的根上造成特征性的虫瘿。其它食用根的线虫为更具宿主特异性的胞囊和损伤型线虫。
线虫存在于整个美国，但是主要的问题是在温暖潮湿的西南地区和砂类土中。大豆胞囊线虫(SCN)(Heterodera glycines)在1954年于美国北卡罗来纳州首次发现。这是最严重的大豆植物害虫。一些地区受到严重的SCN感染，以至于不进行控制手段时大豆生产在经济上不再可能。尽管大豆是受SCN攻击的主要经济作物，但是SCN总共寄生大约五十种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和野草。
线虫破坏的征兆包括叶的生长迟缓和黄化，以及植物在热周期中的萎蔫。然而，线虫(包括SCN)可引起显著的产量损失而没有明显的地上症状。另外，被SCN感染的根是短小的或发育迟缓的。线虫感染可减少根上固氮根瘤的数量，并可使得根对其它土壤带有的植物病原体的攻击更加易感。
线虫生活周期有三个主要的阶段：卵、幼虫(juvenile)和成虫。生活周期在线虫物种之间变化。例如，在最适条件下SCN生活周期通常可在24到30天内完成，而其它物种完成生活周期可耗时长达一年或更久。在春天温度和湿度水平变得适宜时，从土壤中的卵孵化出蠕虫状的幼虫。这些幼虫是唯一能够感染大豆根的线虫生命阶段。
SCN的生活周期曾是许多研究的主题，并因此可被用作理解线虫生活周期的例子。穿透大豆根后，SCN幼虫穿过根移动直至它们接触维管组织，在那里它们停止移行并开始进食。线虫注射分泌物，所述分泌物改变某些根细胞并将它们转化为专门的进食位点。根细胞在形态学上被转化为大的多核合胞体(或在RKN的情况下为巨大细胞)，所述多核合胞体被用作线虫的养分来源。积极进食的线虫进而从植物偷取必需的养分，导致产量损失。线虫进食时膨胀，并且最终雌性线虫变得巨大以至于它们突破根组织并暴露于根的表面。
作为成虫而言不肿胀的雄性SCN线虫从根移出进入土壤，并使柠檬形的雌性成虫受精。雄性随后死亡，而雌性保持结合在根系上并继续进食。肿胀雌性中的卵开始发育，最初位于体外的块或卵袋中并且之后位于体腔内。最后，雌性成虫的整个体腔被卵充满，雌性线虫死亡。被卵充满的死亡雌性身体称作胞囊。胞囊最后移动并被发现游离于土壤中。胞囊的壁变得非常强韧，为其中含有的约200到400只卵提供极佳的保护。SCN卵在胞囊中存活直至适当的孵化条件发生。尽管许多卵可在第一年内孵化，但是许多也会在胞囊中存活若干年。
线虫依靠自己的力量每年仅能穿过土壤移动几英寸。然而，线虫感染可以以多种方式传播很大的距离。能够移动受感染土壤的任何事物都能传播感染，包括农场机器、车辆和工具、风、水、动物和农场工人。种子大小的土壤颗粒通常污染被收获的种子。因此，在未被污染的土地中种植来自被感染土地的被污染的种子时，线虫感染能够传播。甚至存在某些线虫物种可以通过鸟类传播的证据。这些原因中只有一些能够预防。
管理线虫感染的传统实践包括：在被线虫感染的土地中维持适当的土壤养分和土壤pH；控制其它植物疾病，以及昆虫和野草害虫；只有在未被感染的田地中劳作后，才使用卫生实践如耕作、种植和栽培被线虫感染的田地；在被感染的田地中劳作后，用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在被感染土地上生长的种子种植未被感染的田地，除非已经适当地清洁了种子；用交替的宿主作物和非宿主作物轮作受感染的田地；使用杀线虫剂；和种植有抗性的植物品种。
已经提出了植物遗传转化的方法，从而赋予对植物寄生线虫的提高的抗性。美国专利号No.5,589,622和No.5,824,876涉及鉴定线虫结合后在植物的进食位点中或其附近特异表达的植物基因。
丙氨酸消旋酶(EC 5.1.1.1)催化丙氨酸L-和D-对映体的互变，并代表细菌细胞壁生物合成中涉及的第一个关键步骤。D-丙氨酸是所有细菌中细胞壁肽聚糖(胞壁质)的关键组分，并通过L-丙氨酸的消旋产生。大肠杆菌(E.coli)中丙氨酸消旋酶的活性归因于两种不同的基因产物。一种丙氨酸消旋酶(Alr)是组成型/低丰度的，并由alr编码(Neidhardt等人，J.Biol.Chem.1989，15：264(5)：2393-6)。另一种丙氨酸消旋酶DadX由D-或L-丙氨酸诱导并被葡萄糖阻抑，其由DadX基因编码(Hennig等人，Mol GenGenet 1985，198(2)：315-22)。
虽然有前述内容，但是存在鉴定安全有效的下述组合物和方法的需要，所述组合物和方法用于控制植物寄生线虫，和用于生产对植物寄生线虫具有提高的抗性的植物。
发明概述
本发明人发现，在植物中表达包含丙氨酸消旋酶基因的转基因能够对植物赋予线虫抗性。本发明提供了转基因植物和种子，和在作物植物中克服或至少减轻线虫侵袭的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用下述表达载体转化的转基因植物，所述表达载体包含编码丙氨酸消旋酶的分离的多核苷酸。优选地，丙氨酸消旋酶编码多核苷酸在线虫诱导的合胞体中被过表达。
本发明的另一实施方案提供了对丙氨酸消旋酶转基因而言是纯种(true breeding)的转基因种子。
本发明的另一实施方案涉及表达盒或表达载体，其包含与编码丙氨酸消旋酶的多核苷酸有效连接的转录调节元件，其中多核苷酸的表达对转基因植物赋予线虫抗性。优选地，表达载体还包含与丙氨酸消旋酶编码多核苷酸有效连接的启动子，该启动子能够指导丙氨酸消旋酶编码多核苷酸在被线虫感染的植物的根或合胞体中表达。
在另一实施方案中，本发明提供了具有提高的线虫抗性的转基因植物的生产方法，其中该方法包括将下述表达载体引入植物中的步骤，所述表达载体包含与丙氨酸消旋酶编码多核苷酸有效连接的启动子，其中多核苷酸的表达对植物赋予提高的线虫抗性。
附图概述
图1显示DadX同源物与DadX蛋白质(SEQ ID NO：6)的氨基酸同一性百分比。
图2显示Alr同源物与Alr蛋白质(SEQ ID NO：8)的氨基酸同一性百分比。
图3显示DadX基因的DNA和蛋白质序列。
图4显示Alr基因的DNA和蛋白质序列。
图5a和5b显示MTN3、POX和TPP启动子的DNA序列。
优选的实施方案的详述
本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及其中所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域技术人员的习惯用法加以理解。
在本申请通篇范围内，参考了多种专利和科学出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容通过引用方式完整地并入本申请，旨在更充分地描述本发明涉及的本领域状态。当使用缩写和术语时，它们是本领域中标准的并且通常用于专业的期刊中，如本文所引用的那些。如本文所用的以及在所附的权利要求中，单数形式(“a”、“an”或者“the”)包括复数，除非上下文中明确表明不同。本文使用词语“或”表示具体列表的任一成员，并且也包括该列表成员的任何组合。
术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右或处于……范围。术语“约”与数字范围一起使用时，它通过扩张边界高于和低于所述数值而修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值，即在该数值之上或之下(较高或较低)达10％的偏差。
本文使用词语“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)、天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。其可以是单链的或双链的。这类核酸或多核苷酸包括但不仅限于结构基因的编码序列、反义序列，和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列。多核苷酸可编码具有农艺学价值的性状或表型性状。
在本文使用时，“分离的”多核苷酸基本不含通过重组技术生产时的其他细胞材料或培养基，或基本不含化学合成时的化学前体。
术语“基因”被广泛地用于表示与生物功能相关的任何核酸区段。因此，基因在基因组序列中包括内含子和外显子，或如在cDNA中一样仅包含编码序列和/或其表达所需的调节序列。例如，基因表示表达mRNA或功能RNA或编码特异蛋白质的核酸片段，所述核酸包含调节序列。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于表示连续氨基酸残基的多聚体。
本文使用术语“有效连接”或“功能连接”是指单一核酸片段上核酸序列的结合，所述结合使得一条核酸序列的功能被另一条影响。例如，如果两条DNA的位置放置使得调节DNA影响编码DNA的表达，则调节DNA被称作与表达RNA或编码多肽的DNA“有效连接”。
本文使用术语“特异表达”是指被限定于一个或数个植物组织(特异限定)和/或一个或数个植物发育阶段(时间限定)的基因产物的表达。公认几乎不存在真正的特异型：启动子似乎优选地在一些组织中启动，而在其他组织中可无活性或仅有很小的活性。该现象已知为渗漏表达(leakyexpression)。然而，本文定义的特异表达是指在一个或数个植物组织中或植物的特异位点中的表达。
如本文中所用的术语“启动子”指与目的核苷酸序列连接时能够控制该目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一般(尽管不必要)位于目的核苷酸的5′(例如上游)(例如接近结构基因的转录起始位点)，所述目的核苷酸向mRNA的转录受所述启动子的控制，并为用于启动转录的RNA聚合酶和其他转录因子提供特异性结合位点。
本文使用术语“转录调节元件”是指能够调节有效连接的多核苷酸转录的多核苷酸。其包括但不仅限于启动子、增强子、内含子、5’UTR和3’UTR。
本文使用术语“载体”是指能够转运与之相连的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其表示环状双链DNA环，可向其中连接另外的DNA区段。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。载体可以是二元载体或T-DNA，其包含左边界和右边界并可在之间包含目的基因。本文使用术语“表达载体”是指能够在适当的宿主细胞中指导具体核苷酸表达的载体。表达载体包含与目的核酸有效连接的调节核酸元件，其任选地与终止信号和/或其他调节元件有效连接。
本文使用术语“同源物”是指通过出身自共同的祖先DNA序列而与第二基因相关的基因。术语“同源物”可应用于被物种形成事件分离的基因(例如直向同源物)之间的关系，或被遗传重复事件分离的基因(例如旁系同源物)之间的关系。
本文使用术语“直向同源物”是指来自不同物种，但是通过物种形成从共同的祖先基因进化而来的基因。直向同源物在进化过程中保留了相同的功能。直向同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质。本文使用术语“旁系同源物”是指通过基因组重复而相关的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或新功能，但是这些功能可以是相关的。
本文使用术语“在严格条件下杂交”旨在描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少60％相似或同一的核苷酸序列通常保持互相杂交。在另一实施方案中，所述条件使得彼此至少约65％、或至少约70％、或至少约75％或更相似或同一的序列通常保持互相杂交。这类严格条件是本领域技术人员已知的，并如下所述。严格条件的优选的、非限制性的例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下杂交，然后在0.2X SSC、0.1％SDS中于50-65℃下洗涤一次或多次。
术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸序列或多肽序列环境下指这两个序列中的这些位置，其中当所述序列在指定比较窗口范围(例如全局比对中的整个序列或在局部比对中的相似性区域)内为最大对应进行比对时，相同的符号对归集在一起。当序列同一性百分数用来指蛋白质时，可认识到的是不同一的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因此没有改变分子的功能属性。当序列因保守性置换而不同时，序列同一性百分数可以向上调整以针对所述置换的保守性本质进行修正。将因此类保守性置换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。一般，这种方法包括将保守性置换判定为部分匹配而非错配，因而增加序列相似性的百分数。
如本文中所用，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”指通过如此方式确定的值，即首先在全局或局部比较窗口中的两个最佳比对序列中在每个组成位置处注明相同的核酸碱基或氨基酸残基是否在这两个序列中出现，若出现，指定为匹配，或若不出现，则指定为不匹配。由于所述比对通过优化匹配碱基数目而建立，与此同时允许在任一位置处的错配以及允许引入任一大小的空位或零值或空白区域，如此提高所述比对的显著性及质量，因而这种计算确定了匹配条件存在的位置总数，并且随后将这个数字除以比较窗口内的位置总数，并且最后将结果乘以100以产生序列同一性百分数。可以使用相同原理对蛋白质序列计算“序列相似性百分数”，其中将保守性置换计算为部分错配而非完全错配。因此，例如，在给予相同氨基酸评分1并且给予非保守性置换评分0的情况下，给予保守性置换0-1之间的评分。对保守性置换的评分可以从本领域已知的氨基酸矩阵例如Blosum或PAM矩阵中获得。
比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以使用数学算法实现两个序列之间同一性百分数或相似性百分数(对于蛋白质)的确定。此类数学算法的优选、非限制性实例是Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。可以使用这些数学算法的计算机实现以比较序列来确定序列同一性或鉴定同源物。这类实现包括但不仅限于下文所述的程序。
本文使用术语“保守区”或“保守结构域”是指异源多核苷酸或多肽序列中的下述区域，在所述区域中不同的序列之间存在相对高的序列同一性程度。可例如使用Clustal W算法通过多序列比对鉴定“保守区”。
本文使用术语“细胞”或“植物细胞”是指单个细胞，也包括细胞群体。群体可以是包含一种细胞类型的纯净群体。同样，群体可包含多于一种细胞类型。本发明含义中的植物细胞可以是分离的(例如在悬浮培养物中)或包含在植物组织、植物器官或任何发育阶段的植物中。
关于植物的术语“组织”(或“植物组织”)表示多个植物细胞的排列，包括植物的分化组织和未分化组织。植物组织可组成植物器官的部分(例如植物叶的表皮)，但是也可组成肿瘤组织(例如愈伤组织)和培养物中的多种细胞类型(例如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原球茎样体(protocorm-like bodies)等)。植物组织可以在植物体中(in planta)、在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。
关于植物的术语“器官”(或“植物器官”)表示植物的部分，可包括但不仅限于例如根、果实、枝条、茎、叶、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。
如本文中所用，术语“植物”根据上下文可以理解为意指完整植株、植物细胞、植物器官、植物种子及其子代。词汇“植物”也指任一植物，尤其种子植物，并且可以包括，但不限于作物植物。植物部分或植物器官包括，但不限于茎、根、枝条、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、微孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。本发明方法中可以使用的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物和低等植物的种类同样宽泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼、裸蕨植物、苔藓植物和多细胞藻类。
本文使用术语“转基因的”旨在表示下述细胞和/或植物，其含有转基因，或其基因组通过引入转基因被改变，或其整合了外源基因或多核苷酸。可通过若干种方法生产转基因细胞、组织、器官和植物，包括通过人工干涉，例如通过本文所述的方法向靶细胞中引入包含多核苷酸(通常为DNA)的“转基因”，或将转基因整合到靶细胞的染色体中。
本文使用术语“纯种”是指如果所述植物对于性状是纯合的时的对于特定性状的植物品种，所述纯合达到下述程度：将纯种变种自花传粉时，在后代中未观察到显著量的性状的独立分离。
本文使用术语“野生型”是指在实验含义中未经遗传修饰或处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或整株植物。
本文使用术语“对照植物”或“野生型”植物是指为了在转基因或遗传修饰的植物中鉴定增强的表型或期望性状的目的，用于和转基因或遗传修饰的植物进行比较的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官或整株植物。在一些情况下，“对照植物”可以是下述转基因植物株系，其包含空载体或标记物基因，但是不含有要被评价的转基因或遗传修饰的植物中存在的目的重组多核苷酸。对照植物可以是与被测试的转基因或遗传修饰的植物相同的株系或品种，或其可以是另一株系或品种，例如已知具有特异表型、特征或已知基因型的植物。合适的对照植物可包括用于产生本文转基因植物的亲本株系的在遗传上未改变或非转基因的植物。
本文使用术语“抗线虫感染”或“具有线虫抗性的植物”是指植物避免被线虫感染，杀死线虫或阻碍、减少或终止线虫发育、生长或繁殖的能力。这可通过主动过程(例如通过产生对线虫有害的物质)或被动过程(例如具有降低的给线虫的养分值，或不产生由线虫进食位点诱导的结构如合胞体或巨细胞)实现。植物的线虫抗性水平可以以多种方式测定，例如通过计数在感染后能够在植物上建立寄生的线虫，或通过测量线虫的发育时间、雄性和雌性线虫的比例或产生的线虫卵或胞囊的数量。对线虫感染具有提高的抗性的植物是与下述另一植物相比对线虫感染更具抗性的植物，所述另一植物具有相似或优选地相同的基因型但是缺少赋予提高的线虫抗性的基因，例如为对照植物或野生型植物。
术语“进食位点”或“合胞体位点”可互换使用，并且在本文中用于表示线虫侵袭后在植物根中形成的进食位点。该位点被线虫用作营养来源。合胞体是胞囊线虫的进食位点，巨细胞是根结线虫的进食位点。
在一个实施方案中，本发明提供了用包含分离的丙氨酸消旋酶编码多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，其中多核苷酸的表达赋予植物提高的线虫抗性。优选地，丙氨酸消旋酶编码多核苷酸选自：具有SEQ ID NO：5或7中定义的序列的多核苷酸；编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有SEQID NO：6或8中定义的序列；与具有SEQ ID NO：5或7中定义的序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；编码多肽的多核苷酸，所述多肽与具有SEQ ID NO：6或8中定义的序列的多肽具有至少70％的序列同一性；在严格条件下与具有SEQ ID NO：5或7中定义的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：6或8中定义的序列的多肽；编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽具有SEQ ID NO：12到44任一中定义的序列，以及编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：12到44任一中定义的任何序列具有至少90％的序列同一性。
本文定义的丙氨酸消旋酶编码多核苷酸还包括SEQ ID NO：5或7的丙氨酸消旋酶编码多核苷酸或编码下述多肽的多核苷酸的同源物、直向同源物、旁系同源物和等位基因变体，所述多肽具有SEQ ID NO：6或8或如SEQ ID NOs：12到44任一中定义的序列。本文使用术语“等位基因变体”是指含有多态的多核苷酸，所述多态导致核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列中的改变，并存在于自然种群(例如植物物种或变种)中。这类天然等位基因变异通常可导致编码蛋白质的多核苷酸中1-5％的变异，或编码的蛋白质中1-5％的变异。可通过对大量不同植物中的目的核酸进行测序来鉴定等位基因变体，可通过使用例如杂交探针鉴定这些植物中的相同基因遗传基因座来容易地完成所述测序。多核苷酸中任何和所有这类核酸变异和导致的蛋白质的氨基酸多态或变异旨在属于本发明的范围，所述蛋白质的氨基酸多态或变异由天然等位基因变异导致并且不改变编码的蛋白质的功能活性。为了克隆本发明多核苷酸的等位基因变体或同源物，可使用本文给出的序列信息。例如，可使用SEQ ID NO：1、2、3和4所述的引物克隆等位基因变体或同源物。
还在另一实施方案中，植物可以是选自单子叶植物和双子叶植物的植物。植物可来自选自以下的属：玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉和黑麦草。植物可以是选自以下的属：豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、油菜(oilseed rape)、甜菜、甘蓝、花椰菜、椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
本发明还提供了对丙氨酸消旋酶编码多核苷酸而言是纯种的转基因种子，和来自包含丙氨酸消旋酶编码多核苷酸的转基因植物的部分，和来自这类植物的后代植物，包括杂种和近交种。本发明还提供了用于植物育种的方法，例如用于制备杂交的能育转基因植物。该方法包括将包含本发明特定表达载体的能育转基因植物与其自身或第二植物(例如缺少该特定表达载体的植物)杂交，从而制备包含该特定表达载体的杂交的能育转基因植物的种子。然后种植该种子，获得杂交的能育转基因植物。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。杂交的能育转基因植物可具有通过母本或通过父本遗传的特定表达载体。第二植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂种。还包括在本发明中的是任何这些杂交的能育转基因植物的种子。
本发明的另一实施方案涉及下述表达载体或表达盒，其包含与丙氨酸消旋酶编码多核苷酸有效连接的转录调节元件，其中多核苷酸的表达赋予转基因植物提高的线虫抗性。在一个实施方案中，转录调节元件是能够调节有效连接的多核苷酸组成型表达的启动子。“组成型启动子”是指能够在植物的所有或几乎所有发育阶段、所有或几乎所有植物组织中表达其控制的可读框或调节元件的启动子。组成型启动子包括但不仅限于来自植物病毒的35S CaMV启动子(Franck等人，Cell 21：285-294，1980)、Nos启动子(An G.at al.，The Plant Cell 3：225-233，1990)、泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632，1992和18：581-8，1991)、MAS启动子(Velten等人，EMBO J.3：2723-30，1984)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，Mol Gen.Genet 231：276-85，1992)、ALS启动子(WO96/30530)、19SCaMV启动子(US 5,352,605)、超级启动子(US 5,955,646)、玄参花叶病毒启动子(US 6,051,753)、水稻肌动蛋白启动子(US 5,641,876)和Rubisco小亚基启动子(US 4,962,028)。
在另一实施方案中，转录调节元件是被调节的启动子。“被调节的启动子”是指非组成型地、而是以时间和/或空间的方式指导基因表达的启动子，并包括组织特异型启动子和诱导型启动子。不同的启动子可指导基因或调节元件在不同组织或细胞类型中表达，或在不同的发育阶段表达，或响应不同的环境条件表达。
“组织特异型启动子”是指下述被调节的启动子，其不在所有植物细胞中表达，而是仅在特异器官(例如叶或种子)的一种或多种细胞类型中、特异组织(例如胚或子叶)中、或特异细胞类型(例如叶薄壁组织或种子贮存细胞)中表达。这些还包括在时间上被调节的启动子，例如在早期或晚期胚胎发生中、发育的种子或果实中的果实成熟期间、在完全分化的叶中或在序列发生时被调节的启动子。合适的启动子包括来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP-启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet.225(3)：459-67，1991)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、来自芸苔属(Brassica)的Bce4-启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，Plant Journal，2(2)：233-9，1992)，以及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中赋予种子特异表达的启动子。应注意的合适启动子是来自大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中所述的启动子(来自大麦大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱(Sorghum)kasirin-基因和黑麦裸麦醇溶蛋白的启动子)。适合在植物根组织中优先表达的启动子包括例如来自玉米尼克烟酰胺合酶(nicotianamine synthase)基因的启动子(US 20030131377)和稻RCC3启动子(US 11/075,113)。在植物绿色组织中优先表达的合适启动子包括来自下述基因的启动子，所述基因例如玉米醛缩酶基因FDA(US20040216189)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1)：42-48，2000)。
“诱导型启动子”是指下述被调节的启动子，其可由外界刺激例如化学品、光、激素、胁迫或病原体(例如线虫)在一种或多种细胞类型中开启。如果希望基因表达以时间特异的方式发生，则化学诱导型启动子是特别合适的。这类启动子的例子是水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，Plant J.2：397-404，1992)、来自核酮糖-1，5-双-磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚基的光诱导型启动子，和乙醇诱导型启动子(WO93/21334)。应答生物或非生物胁迫条件的合适启动子是下述启动子，例如病原体诱导型PRP1-基因启动子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22：361-366，1993)，来自番茄的热诱导型hsp80-启动子(US 5187267)，来自马铃薯的冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)，玉米的干旱诱导型启动子(Busk等人，Plant J.11：1285-1295，1997)，来自马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch，Plant Mol.Biol.33：897-909，1997)或来自拟南芥属的RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozalei等人，Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)，许多冷诱导型启动子例如来自拟南芥属的cor15a启动子(Genbank登录号No U01377)，来自大麦的blt101和blt4.8(Genbank登录号Nos AJ310994和U63993)，来自小麦的wcs120(Genbank登录号No AF031235)，来自玉米的mlip15(Genbank登录号No D26563)，来自芸苔属的bn115(Genbank登录号No U01377)和创伤诱导型pinII-启动子(欧洲专利号No.375091)。
优选的启动子是根特异的、进食位点特异的、病原体诱导型或线虫诱导型启动子。
本发明的又一实施方案涉及生产包含丙氨酸消旋酶编码多核苷酸的转基因植物的方法，其中所述方法包括下述步骤：向植物中引入包含丙氨酸消旋酶编码多核苷酸的表达载体；并针对提高的线虫抗性选择转基因植物。
用于将多核苷酸引入植物基因组中和从植物组织或植物细胞再生植物的多种方法已知于例如Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRCPress，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；White FF(1993)Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编辑，Academic Press，15-38；Jenes B等人(1993)Techniques for Gene Transfer；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编辑，Academic Press，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73中。
转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物射弹方法(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人Plant Cell 2：603，1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中温育干胚，以及显微注射。在这些直接转化方法的情况下，使用的质粒不需要满足任何具体的要求。可使用简单质粒，例如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184的质粒等等。如果要从被转化的细胞再生完整的植物，则另外的可选择标记物基因优选地位于质粒上。直接转化技术同样适用于双子叶和单子叶植物。
可以通过借助于土壤杆菌的细菌感染(例如EP 0 116 718)、借助于病毒载体的病毒感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO93/03161)或借助于花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US 4,684,611)完成转化。基于土壤杆菌的转化技术(特别是对于双子叶植物而言)是本领域公知的。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌感染后被转移至植物。T-DNA(转移的DNA)被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的二元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如White FF，Vectors for Gene Transfer inHigher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等人Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225中。
转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管丙氨酸消旋酶编码多核苷酸可被插入落入这些广泛种类中的任何植物或植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。
丙氨酸消旋酶编码多核苷酸可被直接转化进质体基因组中。质体表达利用优于核表达的基因的巨大拷贝数以允许高的表达水平的优点，在所述质体表达中，通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的数千个拷贝的环状质体基因组中。在一个实施方案中，将核苷酸插入质体靶向载体中，并转化进期望的植物宿主的质体基因组中。获得针对含有核苷酸序列的质体基因组是同质的植物，其优先地能够将核苷酸高表达。
质体转化技术例如广泛地描述于美国专利号NO.5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462中和WO 95/16783与WO 97/32977中，以及McBride等人(1994)PNAS 91，7301-7305中，其均通过参考整体并入本文。用于质体转化的基本技术涉及例如使用生物射弹或原生质体转化(例如氯化钙或PEG介导的转化)，将可选择标记物侧翼的克隆的质体DNA区与核苷酸序列一起引入合适的靶组织中。称作靶向序列的1到1.5kb侧翼区促进与质体基因组的同源重组，并因此允许对原质体系(plastome)的特异区域进行置换或修饰。起初，赋予大观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因中的点突变被用作转化的可选择标记物(Svab等人，PNAS 87，8526-8530，1990；Staub等人，Plant Cell 4，39-45，1992)。这些标记物之间克隆位点的存在允许创建用于引入外来基因的质体靶向载体(Staub等人，EMBO J.12，601-606，1993)。通过用显性可选择标记物替换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因获得转化频率的重大提高，所述显性可选择标记物为编码大观霉素-解毒酶氨基糖苷-3′-腺嘌呤基转移酶的细菌aadA基因(Svab等人，PNAS 90，913-917，1993)。可用于质体转化的其他可选择标记物是本领域已知的，并包括在本发明的范围内。
植物或转基因植物可以是任何植物，例如但不仅限于树木、切花、观赏植物、蔬菜或作物植物。植物可来自选自以下的属：苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)，或植物可选自谷物和树木，所述谷物包括小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、玉米、稻、甘蔗，所述树木包括苹果、梨、温柏(quince)、李、樱桃、桃、油桃、杏、番木瓜、芒果、杨、松、红杉(sequoia)、雪松和橡树。本文使用的术语“植物”可以是双子叶作物植物，例如豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、油菜(oilseed rape)、甜菜、甘蓝、花椰菜、椰菜、莴苣和拟南芥。在一个实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物。
优选地，植物是作物植物。作物植物是农业中使用的所有植物。因此，在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物，优选是禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、稻属(Oryza)、大麦属(HOrdeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)、稷属(Panicum)、穇属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属(Lolium)植物。当植物是玉蜀黍属(Zea)时，优选的物种是玉米(Z.mays)。当植物是小麦属(Triticum)时，优选的物种是普通小麦(T.aestivum)、斯佩尔特小麦(T.speltae)或硬粒小麦(T.durum)。当植物是稻属(Oryza)时，优选的物种是稻(O.sativa)。当植物是大麦属(Hordeum)时，优选的物种是大麦(H.vulgare)。当植物是黑麦属(Secale)时，优选的物种是黑麦(S.cereale)。当植物是燕麦属(Avena)时，优选的物种是燕麦(A.sativa)。当植物是甘蔗属(Saccharum)时，优选的物种是甘蔗(S.officinarum)。当植物是高梁属(Sorghum)时，优选的物种是蜀黍(S.vulgare)、两色蜀黍(S.bicolor)或苏丹草(S.sudanense)。当植物是狼尾草属(Pennisetum)时，优选的物种是御谷(P.glaucum)。当植物是狗尾草属(Setaria)时，优选的物种是谷子(S.italica)。当植物是黍属(Panicum)时，优选的物种是野生稷(P.miliaceum)或柳枝稷(P.virgatum)。当植物是穇属(Eleusine)时，优选的物种是穇子(E.coracana)。当植物是芒属(Miscanthus)时，优选的物种是芒(M.sinensis)。当植物是羊茅属(Festuca)时，优选的物种是苇状羊茅(F.arundinaria)、紫羊茅(F.rubra)或草甸羊茅(F.pratensis)。当植物是黑麦草属(Lolium)时，优选的物种是多年生黑麦草(L.perenne)或多花黑麦草(L.multiflorum)。或者植物可以是小黑麦属(Triticosecale)。
或者在一个实施方案中，植物是双子叶植物，优选地是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑橘科(Citrus)的植物。在一个实施方案中，植物是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)或十字花科(Brassicaceae)的植物。因此，在一个实施方案中，植物是豆科(Fabaceae)，优选地是大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)。优选的豆科(Fabaceae)物种是截形苜蓿(M.truncatula)、紫苜蓿(M.sativa)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)、花生(A.hypogea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinusluteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)或兵豆(Lens culinaris)。更优选的是大豆(G.max)、花生(A.hypogea)和紫苜蓿(M.sativa)物种。最优选的是大豆(G.max)。当植物是茄科(Solanaceae)时，优选的属是茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)或辣椒属(Capsicum)。优选的茄科物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯(S.tuberosum)。因此，在一个实施方案中，植物是十字花科(Brassicaceae)，优选的是芸苔属(Brassica)或萝卜属(Raphanus)。优选的十字花科(Brassicaceae)物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥菜(B.juncea)或芜青(B.rapa)物种。更优选的是欧洲油菜(B.napus)物种。当植物是藜科(Chenopodiaceae)时，优选的属是甜菜属(Beta)，优选的物种是甜菜(B.vulgaris)。当植物是菊科(Asteraceae)时，优选的属是向日葵属(Helianthus)，优选的物种是向日葵(H.annuus)。当植物是锦葵科(Malvaceae)时，优选的属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当属是棉属(Gossypium)时，优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)，最优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)。秋葵属(Abelmoschus)的优选的物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当植物是亚麻科(Linaceae)时，优选的属是亚麻属(Linum)，优选的物种是亚麻(L.usitatissimum)。当植物是大戟科(Euphorbiaceae)时，优选的属是木薯属(Manihot)、麻风树属(Jatropa)或Rhizinus，优选的物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或R.comunis。当植物是旋花科(Convolvulaceae)时，优选的属是番薯属(Ipomea)，优选的物种是I.batatas。当植物是蔷薇科(Rosaceae)时，优选的属是蔷薇属(Rosa)、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)，优选的物种是杂种荷兰草莓(Fragaria xananassa)。当植物是葫芦科(Cucurbitaceae)时，优选的属是香瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)，优选的物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbita pepo)。当植物是山茶科(Theaceae)时，优选的属是山茶属(Camellia)，优选的物种是茶(C.sinensis)。当植物是茜草科(Rubiaceae)时，优选的属是咖啡属(Coffea)，优选的物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当植物是梧桐科(Sterculiaceae)时，优选的属是可可树属(Theobroma)，优选的物种是可可树(T.cacao)。当植物是柑橘属(Citrus)时，优选的物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)和柑橘物种的杂种等等。在本发明的一个优选的实施方案中，植物是大豆、马铃薯或玉米植物。
本发明的转基因植物可用于控制植物寄生线虫对作物的侵袭的方法中，所述方法包括从包含表达盒的种子种植所述作物的步骤，所述表达盒包含与编码丙氨酸消旋酶的多核苷酸有效连接的转录调节元件，其中所述表达盒被稳定地整合进种子的基因组中，并且植物具有提高的线虫抗性。
本发明还提供了赋予植物线虫抗性的方法，包括步骤：a)用本发明的表达盒转化植物细胞，b)从该细胞再生植物，和c)针对线虫抗性选择这类植物。更特别地，在植物中提高线虫抗性的方法包括向植物中引入表达载体的步骤，所述表达载体包含与本发明的多核苷酸有效连接的转录调节元件，其中多核苷酸的表达赋予植物提高的线虫抗性，其中丙氨酸消旋酶编码多核苷酸选自以下：具有SEQ ID NO：5或7中定义的序列的多核苷酸；多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO：6或8中定义的序列的多肽；多核苷酸，其与具有SEQ ID NO：5或7中定义的序列的多核苷酸具有至少70％的序列同一性；编码多肽的多核苷酸，所述多肽与具有SEQ ID NO：6或8中定义的序列的多肽具有至少70％的序列同一性；多核苷酸，其在严格条件下与具有SEQ ID NO：5或7中定义的序列的多核苷酸杂交；在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有在SEQ ID NO：6或8中定义的序列的多肽；编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有SEQ ID NO：12到44任一中定义的序列，和编码多肽的多核苷酸，所述多肽与SEQ IDNO：12到44任一中定义的任何序列具有至少90％的序列同一性。
本发明可被用于减少植物寄生线虫引起的作物破坏或对植物赋予线虫抗性。线虫可以是任何植物寄生线虫，例如长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、滑刃总科(Aphelenchoidida)、粒科(Anguinidae)、刺科(Belonolaimidae)、环科(Criconematidae)、异皮线虫科(Heterodidae)、纽带科(Hoplolaimidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、小垫刃科(Paratylenchidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)、小垫刃线虫科(Tylenchulidae)、垫刃科(Tylenchidae)等等的线虫。优选地，寄生线虫属于诱导巨细胞或合体细胞的线虫科。诱导巨细胞或合体细胞的线虫存在于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科、根结线虫科、短体线虫科或小垫刃线虫科。尤其存在于异皮线虫科和根结线虫科中。
因此，本发明靶向的寄生线虫属于选自以下的一个或多个属：伪根瘤线虫属(Naccobus)、仙人掌胞囊线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、Punctodera、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)。在一个优选的实施方案中，寄生线虫属于选自以下的一个或多个属：伪根瘤线虫属、仙人掌胞囊线虫属、长形胞囊线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、Punctodera或根结线虫属。在一个更优选的实施方案中，寄生线虫属于选自以下的一个或多个属：球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属。在一个甚至更优选的实施方案中，寄生线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属(Heterodera)中一个或两个的属。在另一个实施方案中，寄生线虫属于根结线虫属。
当寄生线虫是球胞囊线虫属(Globodera)时，寄生物种优选地来自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(G.virginiae)。在另一个优选的实施方案中，寄生球胞囊线虫属(Globodera)线虫包括至少一种物种马铃薯白线虫、烟草球胞囊线虫或马铃薯金线虫。当寄生线虫是胞囊线虫属(Heterodera)时，物种可优选地来自燕麦胞囊线虫(H.avenae)、胡萝卜胞囊线虫(H.carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(H.ciceri)、十字花科胞囊线虫(H.cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(H.delvii)、褐藻胞囊线虫(H.elachista)、菲氏胞囊线虫(H.filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(H.gambiensis)、大豆胞囊线虫、豌豆胞囊线虫(H.goettingiana)、荞麦异皮线虫(H.graduni)、啤酒花胞囊线虫(H.humuli)、大麦异皮线虫(H.hordecalis)、麦类胞囊线虫(H.latipons)、燕麦异皮线虫(H.major)、苜蓿胞囊线虫(H.medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(H.rosii)、甘蔗胞囊线虫(H.sacchari)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、蜀黍胞囊线虫(H.sorghi)、三叶草胞囊线虫(H.trifolii)、荨麻胞囊线虫(H.urticae)、木豆胞囊线虫(H.vigni)和玉米胞囊线虫(H.zeae)。在另一个优选的实施方案中，寄生胞囊线虫属线虫包括至少一种物种大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫(H.cajani)、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫。在一个更优选的实施方案中，寄生线虫包括至少一种物种大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫。在一个最优选的实施方案中，寄生线虫是物种大豆胞囊线虫。
当寄生线虫是根结线虫属(Meloidogyne)时，寄生线虫可选自高粱根结线虫(M.acronea)、M.arabica、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.lini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)。在一个优选的实施方案中，寄生线虫包括至少爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫。
因此，本发明包括对植物赋予线虫抗性的方法，所述方法包括步骤：a)制备表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的本发明的多核苷酸；b)用所述表达盒转化受体植物；c)产生所述受体植物的一个或多个转基因后代；和d)针对线虫抗性选择后代。优选地，启动子是根优选或线虫诱导型启动子，或在线虫进食位点(例如合体细胞或巨细胞)中介导表达的启动子。
尽管已按照某些实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员应当知晓可对组合物、方法和本文所述方法的步骤或步骤顺序进行改变而不偏离本发明的概念、思想和范围。
实施例
实施例1：克隆丙氨酸消旋酶编码基因
使用表1所示的PCR引物从大肠杆菌(E.coli)基因组DNA中克隆Alr(SEQ ID NO：7)和DadX(Seq ID NO：5)——两种形式的丙氨酸消旋酶。
表1：用于克隆ARLNCP编码基因的引物。
  引物名称   序列   目的   SEQIDNO：
  引物1-DadX   GCGGCGCGCCACCATGACCCGTCCGATACAGGC   DadX5’引物   1
  引物2-DadX   GCCTCGAGTTACACCGTCACAACCGGGACGC   DadX3’引物   2
  引物1-Alr   GCGGCGCGCCACCATGCAAGCGGCAACTGTTGTG   Alr 5’引物   3
  引物2-Alr   GCCTCGAGTTAATCCACGTATTTCATCGCGAC   Alr 3’引物   4
实施例2：用于转化和产生转基因根的载体构建
对实施例1中产生的PCR产物测序，并将其克隆进含有合胞体优选的(线虫诱导的)启动子的大量表达载体中。合胞体优选的启动子包括大豆MTN3 SEQ ID NO：9(p-47116125)(USSN 60/899,714)、拟南芥过氧化物酶POX SEQ ID NO：10(p-At5g05340)(USSN 60/876,416)和拟南芥TPP海藻糖-6-磷酸磷酸酶SEQ ID NO：11(p-At1g35910)(USSN 60/874,375)。还使用组成型超级启动子。用于转化的选择标记物是来自拟南芥的突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，其赋予对除草剂ARSENAL(imazepyr，BASFCorporation，Mount Olive，NJ)的抗性。突变的AHAS的表达由拟南芥肌动蛋白2启动子驱动。
表2：包含SEQ ID NO：5或7的表达载体
  载体   表达载体的组成(启动子::ARLNCP编码基因)
  RSH118   MTN3::DadX
  RSH120   POX::DadX
  RSH122   TPP::DadX
  RSH117   超级启动子::DadX
  RSH125   MTN3::Alr
  RSH127   POX::Alr
  RSH129   TPP::Alr
  RSH124   超级启动子::Alr
实施例3：转基因大豆发根(hairy-root)的产生和线虫生物测定
通过电穿孔将载体RSH118、RSH120、RSH122、RSH117、RSH125、RSH127、RSH129和RSH124转化进毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)K599菌株中。使用已知的方法使用转化的土壤杆菌菌株诱导大豆发根形成。还通过使用未转化的毛根土壤杆菌产生来自大豆栽培种Williams 82(SCN易感)和Jack(抗SCN)的非转基因发根，作为测定中线虫生长的对照。
对用载体转化的转基因发根和作为对照的来自Williams 82与Jack的非转基因发根进行生物测定，评价线虫抗性。用表面去污的大豆胞囊线虫(SCN)3号小种的第二阶段幼虫(J2)接种至少占据半个孔的每种株系的发根培养物。然后将平板密封并放回25℃下黑暗中的培养箱内。从每种二元载体转化和用于生物测定的株系产生若干独立的发根株系。线虫接种后四周，计数每个孔中的胞囊数。
构建体RSH118、RSH120、RSH122和RSH125的生物测定结果显示对于多种转基因株系胞囊计数的统计学显著(p值＜0.05)的减少，和测试的大部分转基因株系中减少的胞囊计数的普遍趋势。
本领域技术人员仅使用常规实验就会明白或能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等价物。这类等价物旨在被以下的权利要求包括。

Claims (20)

1.控制植物寄生线虫对作物的侵袭的方法，所述方法包括从包含表达盒的种子生长所述作物的步骤，所述表达盒包含编码丙氨酸消旋酶的多核苷酸及与其有效连接的转录调节元件，其中所述表达盒被稳定地整合进种子的基因组中，并且植物具有提高的线虫抗性。
2.权利要求1的方法，其中多核苷酸选自：
a)如SEQ ID NO：5或7所定义的多核苷酸；和
b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽如SEQ ID NO：6或8中定义。
3.权利要求2的方法，其中多核苷酸如SEQ ID NO：5或7中定义。
4.权利要求2的方法，其中多核苷酸编码如SEQ ID NO：6或8中定义的多肽。
5.权利要求1的方法，其中所述植物还被定义为单子叶植物。
6.权利要求1的方法，其中所述植物还被定义为双子叶植物。
7.权利要求1的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉、烟草、胡椒、油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜、椰菜、莴苣和拟南芥。
8.包含丙氨酸消旋酶编码多核苷酸及与其有效连接的转录调节元件的表达载体，其中多核苷酸的表达赋予转基因植物提高的线虫抗性。
9.权利要求8的表达载体，其中多核苷酸选自：
a)如SEQ ID NO：5或7中定义的多核苷酸；和
b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽如SEQ ID NO：6或8中定义。
10.权利要求9的表达载体，其中转录调节元件是调节多核苷酸的根特异或合胞体特异表达的启动子。
11.权利要求8的表达载体，其中多核苷酸如SEQ ID NO：5或7中所定义。
12.权利要求8的表达载体，其中多核苷酸编码如SEQ IDNO：6或8中定义的多肽。
13.具有提高的线虫抗性的转基因植物的生产方法，其中所述方法包括步骤：
a)向植物中引入包含丙氨酸消旋酶编码多核苷酸的表达载体；和
b)选择具有提高的线虫抗性的转基因植物。
14.权利要求13的方法，其中植物是单子叶植物。
15.权利要求14的方法，其中植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉和黑麦草。
16.权利要求13的方法，其中植物是双子叶植物。
17.权利要求16的方法，其中植物选自豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉、烟草、胡椒、油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜、椰菜、莴苣和拟南芥。
18.权利要求17的方法，其中植物是大豆。
19.权利要求13的方法，其中多核苷酸如SEQ ID NO：5或7中定义。
20.权利要求13的方法，其中多核苷酸编码如SEQ ID NO：6或8中定义的多肽。
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