CN101679995A - 线虫几丁质酶基因用于控制植物寄生性线虫的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含编码线虫几丁质酶的多核苷酸、具有增加的线虫抗性的转基因植物、此类转基因植物的种子、包含编码线虫几丁质酶的多核苷酸的表达载体、和向农作物植物赋予线虫抗性的方法。

Description

线虫几丁质酶基因用于控制植物寄生性线虫的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年3月15日提交的美国临时申请系列号60/894,987的优先权益。

发明领域

本发明涉及线虫的控制，特别地大豆胞囊线虫(soybean cystnematode)的控制。本文中公开了产生具有增加的线虫抗性的转基因植物的方法、包含编码功能性蛋白质的多核苷酸的表达载体以及转基因植物和其产生的种子。

发明背景

线虫是以2,000多种蔬菜、水果和观赏植物的根、叶和茎为食的微小蠕虫样动物，其在世界范围造成估计一千亿美元的农作物损失。一种常见的线虫是根结线虫(RKN)，其摄食在根上引起特征性虫瘿。其他摄食根的线虫是倾向于为更具宿主特异性的胞囊-和根斑-线虫类。

线虫目前遍布美国，但在南部和西部的温暖、潮湿区域和沙壤土中问题最大。大豆胞囊线虫(SCN，Heterodera glycines)最早于1954年在美国的North Carolina发现。其是大豆植物最严重的害虫。一些区域受到大豆胞囊线虫(SCN)严重侵害以致在无控制措施的情况下大豆的经济生产不再具有可能性。虽然大豆是受SCN攻击的主要经济农作物，但SCN寄生总共大约50种宿主，包括大田农作物、蔬菜、观赏植物和杂草。

线虫损伤的标志包括矮化及叶黄化以及在炎热时期植物的萎蔫。然而，线虫，包括SCN，可在无任何明显的地上症状的情况下造成重大的产量损失。此外，被SCN感染的根会变短或生长受阻。线虫感染还可减少根上固氮根瘤的数目，并且可使根更易被其他土壤传播的植物病原体攻击。

线虫的生活周期具有3个主要阶段：卵、幼虫(juvenile)和成虫。该生活周期在线虫的种间是变化的。例如，SCN生活周期通常在最适宜条件下可在24至30天完成，然而其他物种可花费长达1年或更长时间来完成生活周期。当在春天温度和湿度水平变得充足时，蠕虫状的幼虫从土壤中的卵孵出。这些幼虫是能够感染大豆根的唯一线虫生命阶段。

SCN的生活周期已成为许多研究的主题，并由此可用作理解线虫生活周期的有用实例。在穿刺入大豆根后，SCN幼虫在根中移动直至它们接触维管组织，这时，它们停止迁移并且开始摄食。线虫注射分泌物改变某些根细胞并且将它们转化成专门的摄食位置。根细胞在形态学上被转化成巨大的多核合胞体(或在RKN的情况下转化成巨细胞)，其用作线虫的营养物来源。活跃摄食的线虫由此从植物偷取必需营养物，从而导致产量损失。当线虫摄食时，它们膨胀，最终雌性线虫变得如此巨大以至它们的身体冲破根组织而暴露在根的表面。

雄性SCN线虫迁移出根进入土壤并且使柠檬样成年雌虫受精。然后雄虫死亡，然而雌虫保持附着于根系统并且继续摄食。膨胀的雌虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊中，后来在线虫体腔中。最后整个成年雌虫体腔充满卵，雌性线虫死亡。死亡的雌虫的充满卵的身体称为胞囊。胞囊最后脱离根，在土壤中游离存在。胞囊的壁变得非常坚硬，这为内部包含的大约200至400粒卵提供了优良的保护作用。SCN的卵可在胞囊中存活直至合适的孵化条件出现。虽然许多卵可在第一年内孵化，但还有许多卵可以在该胞囊内生存数年。

线虫靠其自己的能力每年只可在土壤中移动数英寸。然而，线虫感染可通过许多方式传播相当远的距离。可移动感染的土壤的任何事物都能够传播感染，包括农业机械、运载工具和工具、风、水、动物和农人。种子颗粒大小的土壤通常污染收获的种子。结果，当来自感染的田地的污染的种子被种植在未感染的田地中时，线虫感染可获得传播。

控制线虫感染的常规实践包括：在线虫感染的土地中保持适当的土壤养分和土壤pH水平；控制其他植物疾病以及昆虫和杂草害；使用卫生措施例如只在完成非感染的田间工作后才耕犁、种植和栽培线虫感染的田地；在完成感染的田间工作后使用高压水或蒸气彻底清洁装备；除非已适当地清洁种子，否则不使用感染的田地中生长的种子来种植未感染的田地；轮作感染的田地并且用非宿主农作物轮替宿主农作物；使用杀线虫剂；和种植抗性植物品种。

几丁质是存在于真菌、昆虫和线虫中的聚合物，其由β-1，4连接的N-乙酰葡糖胺残基的链形成。在许多情况下，几丁质在多种组织中起结构作用。已证实几丁质是许多线虫，包括植物寄生虫爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)，以及多种动物寄生虫，包括两个盘尾丝虫属(Onchocerca)物种、猪蛔虫(ascaris suum)和捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)，的卵壳的组分。其他研究已表明几丁质还可存在于一些线虫的其他组织中。已在类圆线虫(strongyloidnematode)有齿食道口线虫(Oesophagostomum dentatum)的取食器(feeding apparatus)中检测到几丁质。凝集素结合研究已表明，几丁质还存在于猪蛔虫的角质层中。几丁质酶(EC 3.2.1.14)催化几丁质和壳糊精(chitodextrin)中N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷1，4-β-连接的随机水解。

美国专利5,554,521和5,633,450公开了编码来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)QMB1466的几丁质酶的质粒至烟草和番茄植物的转化，以增加冷损伤抗性和甜味。

美国专利7,087,810公开了分离编码玉米(Zea mays)的几丁质酶的基因和所述基因的改组变体(据称其在体外减慢秀丽隐杆线虫(C.elegans)的发育)。

Ornatowski，等人(2004)In vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 40，260-265公开了使用编码烟草天蛾(Manduca sexta)(烟草天蛾幼虫)几丁质酶的基因对胚性大豆(embryonic soybean)的转化。表达昆虫几丁质酶的植物不表现增加的对SCN的抗性。

因此，持续需要鉴定可以用于控制植物寄生性线虫和用于产生具有增加的抗植物寄生性线虫抗性的植物的、安全有效的组合物及方法。

发明概述

本发明人已发现，当编码SCN几丁质酶的多核苷酸在大豆根中以转基因形式表达时，转基因大豆植物显示增加的对SCN的抗性。

因此，在第一实施方案中，本发明提供用包含编码线虫几丁质酶的分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，其中该多核苷酸的表达向植物赋予增加的线虫抗性。

本发明的另一个实施方案提供由转化了包含编码线虫几丁质酶的转基因的表达载体的转基因植物产生的种子。该种子对于该编码线虫几丁质酶的多核苷酸是纯合等位基因的。

本发明的另一个实施方案涉及包含与编码线虫几丁质酶的多核苷酸有效连接的启动子的表达载体，其中多核苷酸的表达向转基因植物赋予线虫抗性，其中多核苷酸选自：(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

本发明的另一个实施方案涉及用于增加植物的线虫抗性的方法，其中方法包括步骤：将包含与编码线虫几丁质酶的多核苷酸有效连接的启动子的表达载体导入植物，然后就增加的线虫抗性选择转基因植物。

附图概述

图1的表显示本文中提及的基因和启动子的SEQ ID NO。

图2显示大豆胞囊线虫几丁质酶的DNA(SEQ ID NO：1)和蛋白质(SEQID NO：2)序列。

图3显示拟南芥At5g12170启动子序列(SEQ ID NO：3)。

图4显示拟南芥TPP海藻糖-6-磷酸磷酸酶At1g35910启动子序列(SEQID NO：4)。

图5显示甜菜胞囊线虫(H.schachtii)几丁质酶的部分DNA(SEQ IDNO：5)和蛋白质(SEQ ID NO：6)序列。

图6显示全长大豆胞囊线虫几丁质酶(SEQ ID NO：2)与部分甜菜胞囊线虫几丁质酶(SEQ ID NO：6)的氨基酸比对，和以表格形式总结的核苷酸同源性。

优选实施方案的详述

通过参考以下本发明优选实施方案的详细描述和其中包括的实施例可更容易地理解本发明。要理解，本文中使用的术语只是为了描述特定的实施方案的目的而不旨在构成限制。除非另外指出，本文中使用的术语按照相关领域内的普通技术人员的常规用法理解。必须指出，除非上下文清楚地指出，如本说明书中和权利要求中所使用的，单数形式“a”或“an”或“the”包括对复数的提及。如本文中所使用的，单词“or”是指特定列表中的任一成员，并且还包括列表中的成员的任何组合。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物及这些出版物中引用的参考文献以其全文通过引用合并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的状况。

术语“大约”在本文中用于表示大致、粗略地、大概或在......区域内。当术语“大约”与数字范围一起使用时，其通过在所述界限数值上下延展该界限来修饰该范围。通常，术语“大约”在本文中用于向上或向下(更高或更低)修饰数值使之高于和低于所述值10％。

如本文中所使用的，术语“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”意指包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DN)、RNA分子(例如，mRNA)、天然发生的、突变的、合成的DNA或RNA分子、以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链的或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列。多核苷酸可编码有农艺学价值的性状或表型性质。

如本文中所使用的，“分离的”多核苷酸基本上不含其他细胞材料或培养基(当通过重组技术生产时)，或基本上不含化学物质前体(当化学合成时)

术语“基因”作广义使用，指与生物学功能相关的核酸的任何区段。因此，基因可以包含内含子和外显子(如在基因组序列中)，或仅编码序列(如在cDNA中)和/或其表达所需的调控序列。例如，基因可以指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质并包括调控序列的核酸片段。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示连续氨基酸残基的聚合物。

本文中使用的术语“有效连接的”或“功能性连接的”是指复数个核酸序列在单个核酸片段上的连接，这种连接使得一个序列的功能受另一个的影响。例如，如果调控性DNA与表达RNA或编码多肽的DNA所处的位置使得调控性DNA能够影响编码DNA的表达，则该两个DNA被称作是“有效连接的”。

本文中使用的术语“特异性表达”是指基因产物的表达被局限于一个或少数几个植物组织(空间限制)和/或一个或少数几个植物发育阶段(时间限制)。已知真正的特异性是非常少见的：启动子似乎优先在一些组织中被开启，而在其他组织中，可以无活性或只存在极小的活性。该现象被称作渗漏表达。然而，本文中定义的特异性表达涵盖在植物的一个或少数几个植物组织或特定部位中的表达。

本文中使用的术语“启动子”是指当连接至目的核苷酸序列时能够控制目的核苷酸序列转录为mRNA的DNA序列。启动子典型地(虽然不是必需地)位于至mRNA的转录受该启动子控制的目的核苷酸的5’(例如，上游)(例如，靠近结构基因的转录起始位点)，并且提供用于特异结合RNA聚合酶和其他转录因子以便起始转录的位点。

本文中使用的术语“转录调控元件”是指能够调控有效连接的多核苷酸的转录的多核苷酸。其包括但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR和3’UTR。

如本文中所使用的，术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接入其中的环状双链DNA环。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。载体可以是二元载体或包含左边界和右边界并且可在其间包含目的基因的T-DNA。本文中使用的术语“表达载体”是指能够在适当的宿主细胞中指导特定核苷酸表达的载体。表达载体包含与目的核酸有效连接的调控核酸元件，所述目的核酸任选地与终止信号和/或其他调控元件有效连接。

本文中使用的术语“同源物”是指一个基因与第二基因由于遗传自共同的祖先DNA序列而相关。术语“同源物”可以应用于由物种形成事件而分离的基因之间的关系(例如，直系同源物)或应用于由基因复制事件而分离的基因之间的关系(例如，旁系同源物)。

如本文中所使用的，术语“直系同源物”是指来自不同物种但通过物种形成由共同祖先基因进化而来的基因。直系同源物在进化过程中保持相同的功能。直系同源物编码具有相同或相似功能的蛋白质。如本文中所使用的，术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或新功能，但这些功能可以是相关的。

术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的情况下指当在指定的比较窗口——例如，整个序列(如在全局比对中)或相似的区域(在局部比对中)上，就最大对应性比对这两个序列时，两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数用于多肽时，应意识到，不相同的残基位置常常区别仅在于保守氨基酸置换，即，氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，从而不改变分子的功能特性。当序列相异在于保守置换时，可将序列同一性百分数向上调整以针对置换的保守性质进行校正。差异在于这样的保守置换的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。用于实施该调整的方法对于本领域普通技术人员来说是熟知的。通常，这涉及将保守置换评分为部分匹配而不是完全错配，从而增加序列相似性百分数。

如本文中所使用的，“序列同一性百分数”或“百分数序列同一性”是指通过在比较窗口中(全局性地或局部地)比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中所述序列在比较窗口中的部分可包含空位以实现两个序列的最佳比对。原则上，该百分数通过如下方式计算：确定以下位置的数目，在该位置处两个序列上出现相同的核酸碱基或氨基酸残基，由此产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，然后将结果乘以100，产生序列同一性百分数。对于蛋白质序列，“序列相似性百分数”可使用相同的原理来计算，其中保守置换计算为部分而非完全错配。因此，例如，当相同的氨基酸被赋予分值1并且非保守置换被赋予分值0时，保守置换被赋予0和1之间的分值。保守置换的评分可根据本领域内已知的氨基酸矩阵例如BLOSUM或PAM矩阵来获得。

用于比较的序列比对方法在本领域内是熟知的。可使用数学算法来进行两个序列之间的百分数同一性或百分数相似性(对于蛋白质)的测定。此类数学算法的优选、非限定性实例是Myers和Miller(Optimalalignments in linear space，Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)的算法、Needleman-Wunsch全局比对(global alignment)(J Mol Biol.48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对(local alignment)(Journal of MolecularBiology，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。此类数学算法的计算机执行工具可用于比较序列以确定序列同一性或鉴定同源物。

“杂交”可用于显示两个核酸分子之间的相似性或同一性的水平，并且还可在Southern或Northern分析中检测相同或相似核酸分子的存在。优选、非限定性严格条件的实例是在大约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次。如本文中所使用的，术语“在严格条件下杂交”意在描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下，彼此至少大约60％相似或同一的核苷酸序列通常保持彼此杂交。

本文中使用的术语“保守区域”或“保守结构域”是指异源多核苷酸或多肽序列中的区域，在该区域中所述不同序列之间具有相对高程度的序列同一性。可以例如使用生物技术领域技术人员已知的任何算法，通过多序列比对来鉴定“保守区域”。

本文中使用的术语“细胞”或“植物细胞”是指单细胞，也包括细胞群体。群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。同样，群体可以包含多种细胞类型。本发明中植物细胞可以是分离的(例如，在悬浮培养中)或包含在处于任何发育阶段的植物组织、植物器官或植物中。

与植物相关的术语“组织”(或“植物组织”)是指多个植物细胞的排列，包括植物的已分化的和未分化的组织。植物组织可以是植物器官的部分(例如，植物叶的表皮)，但也可以是瘤组织(例如，愈伤组织)和各种类型的培养细胞(例如，单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、拟原球体(protocorm-likebody)等)。植物组织可以在植物中(in planta)、在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。

与植物相关的术语“器官”(或“植物器官”)是指植物的部分，其可包括但不限于，根、果实、枝、茎、叶、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。

取决于上下文，本文中使用的术语“植物”可理解为指完整植物、植物细胞、植物器官、植物种子和它们的后代。单词“植物”还指任何植物，特别地种子植物，并可包括但不限于，农作物植物。植物部分包括但不限于，茎、根、枝、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小胞子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。

一般地，可用于本发明方法中的植物种类广至易于接受转化技术的高等和低等植物种类，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、木贼类、裸蕨类、苔藓类和多细胞藻类。

本文中使用的术语“转基因”意指细胞和/或植物包含转基因、或其基因组已通过转基因的导入而发生改变，或已整合了外源基因或多核苷酸。转基因细胞、组织、器官和植物可通过几种方法产生，所述方法包括通过人工干预，例如本文中描述的方法，将包含多核苷酸(通常为DNA)的“转基因”引入靶细胞中或将转基因整合至靶细胞的染色体内。

本文中使用的术语“纯合等位基因的”(true breeding)是指当一个植物品种就一个特定性状而言在遗传上是纯合的，且该纯合性达到当该纯合等位基因品种自花授粉时在后代中观察不到该性状的显著量的独立分离的程度时，对于该特定性状而言，该植物品种是纯合等位基因的。

本文中使用的术语“野生型”是指在实验意义上未经过遗传修饰或处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物。

本文中所使用的“对照植物”是指为了鉴定转基因植物或遗传修饰植物中增强的表型或期望的性状，用于与转基因植物或遗传修饰植物相比较的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物。“对照植物”在一些情况下可以是包含空载体或标记基因但不包含目的重组多核苷酸(该目的重组多核苷酸存在于正被评估的转基因或遗传修饰植物中)的转基因植物品系。对照植物可以是与受试转基因植物或遗传修饰植物属于相同的品系或品种的植物，或其可以是另一品系或品种，例如已知具有特定表型、特征或已知基因型的植物。适宜的对照植物包括用于产生本文转基因植物的亲本品系的遗传上未被改变的或非转基因的植物。

本文中使用的术语“抗线虫感染抗性”或“具有线虫抗性的植物”是指植物能够避免线虫感染、杀死线虫、或阻碍或减少或终止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可通过主动方式(例如通过产生对线虫有害的物质)，或通过被动方式(如，对于线虫具有降低的营养价值，或不产生由线虫摄食位置诱导的结构，如合胞体细胞或巨细胞)来实现。植物的线虫抗性水平可通过多种方法确定，例如计数能够在植物上确立寄生的线虫，或测量线虫的发育时间、雄性和雌性线虫的比例、或产生的胞囊或线虫卵的数目。具有增加的抗线虫感染抗性的植物是这样的植物，该植物与具有相似或优选地相同的基因型但缺乏赋予线虫抗性增加的基因(一种或多种)的另一种植物，例如对照或野生型植物相比，更加抗线虫感染。

术语“摄食位置”、“合胞体”或“合胞体位置”可互换使用并且在本文中是指在线虫侵染后在植物根中形成的摄食位置。该位置用作线虫的营养物来源。合胞体是胞囊线虫的摄食位置，巨细胞是根结线虫的摄食位置。

本文中使用的“几丁质酶”是指来源于植物寄生性线虫的任何降解几丁质的蛋白质，当转化入易感植物时，其提供或增加对所述线虫的抗性。SEQID NO：2中所示的大豆胞囊线虫几丁质酶相应于Genbank登录号AF468679。SEQ ID NO：6中所示的甜菜胞囊线虫几丁质酶片段相应于Genbank登录号CD750591。图6中的比对显示大豆胞囊线虫几丁质酶和甜菜胞囊线虫几丁质酶片段在氨基酸1至189上有显著的序列同一性和相似性，表明该几丁质酶基因在线虫物种间是保守的。通过使用生物技术领域技术人员已知的技术，可以基于与SEQ ID NO：2中所示的大豆胞囊线虫几丁质酶和/或SEQ ID NO：6中所示的甜菜胞囊线虫几丁质酶片段的全局或局部序列同一性来鉴定适用于本发明的其它线虫几丁质酶。

在第一实施方案中，本发明提供用表达载体转化的转基因植物，所述表达载体包含编码线虫几丁质酶的分离的多核苷酸，其中多核苷酸的表达为植物提供了增加的线虫抗性。优选，该线虫几丁质酶多核苷酸选自：(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或SEQID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

根据本发明，线虫几丁质酶多核苷酸编码具有酶促活性的几丁质酶，并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸或与包含SEQ ID NO：5的多核苷酸的线虫几丁质酶基因有至少大约50-60％、或至少大约60-70％、或至少大约70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、或至少大约95％、96％、97％、98％、99％或更大的同一性或相似性。另外，根据本发明，线虫几丁质酶多核苷酸编码功能性线虫几丁质酶多肽，该多肽与SEQ ID NO：2的多肽或与包含SEQ ID NO：6的多肽的线虫几丁质酶有至少大约50-60％、或至少大约60-70％、或至少大约70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、或至少大约95％、96％、97％、98％、99％或更大的同一性或相似性。SEQ ID NO：1的线虫几丁质酶多核苷酸和包含SEQ ID NO：5的多核苷酸的线虫几丁质酶基因的等位基因变体、以及SEQ ID NO：2的多肽或包含SEQ ID NO：6的多肽的线虫几丁质酶的等位基因变体，也可用于本发明的转基因植物和方法中。如本文中所使用的，术语“等位基因变体”是指包含多态的多核苷酸，该多态导致由该核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列发生变化并且该多态存在于天然群体(例如，植物物种或品种)中。此类天然等位基因变异典型地可在编码蛋白质的多核苷酸中导致1-5％的变异性，或在所编码的蛋白质中导致1-5％的变异性。

备选地，适用于本发明的分离的线虫几丁质酶多核苷酸可在严格杂交条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸、SEQ ID NO：5的多核苷酸、编码SEQID NO：2的多肽的任何多核苷酸、或编码包含SEQ ID NO：6的多肽的线虫几丁质酶的任何多核苷酸杂交，只要该多核苷酸编码功能性几丁质酶即可。

本发明还提供了包含上述线虫几丁质酶多核苷酸的转基因种子，来自转基因植物的部分、以及来自转基因植物的后代，包括杂种和近交系(inbred)。本发明还提供了植物育种方法，以例如制备杂交的能育转基因植物。该方法包括将包含本发明的特定表达载体的能育转基因植物与其自身或与第二植物(例如缺乏该特定表达载体的植物)杂交，从而制备杂交的包含该特定表达载体的能育转基因植物的种子。然后种植种子以获得杂交的能育转基因植物。该杂交的能育转基因植物可以使该特定表达载体通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传。第二植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂种。本发明还包括任何此类杂交的能育转基因植物的的种子。

本发明的另一个实施方案涉及包含与编码线虫几丁质酶的多核苷酸有效连接的启动子的表达载体，其中多核苷酸的表达为转基因植物提供了线虫抗性，其中该多核苷酸选自：(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ IDNO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或与SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

根据本发明，启动子能够调控有效连接的多核苷酸的组成型表达。“组成型启动子”是指能够在植物的所有或几乎所有发育阶段中，在所有或几乎所有植物组织中表达其控制的开放阅读框或调控元件的启动子。组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的35S CaMV启动子(Franck等人.，1980Cell 21：285-294)、Nos启动子、遍在蛋白启动子(Christensen等人Plant Mol.Biol.12：619-632(1992)和18：581-8(1991))、MAS启动子(Velten等人，EMBO J.3：2723-30(1984))、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，Mol Gen.Genet 231：276-85(1992))、ALS启动子(WO96/30530)、19S CaMV启动子(US 5,352,605)、super-启动子(US 5,955,646)、玄参花叶病毒启动子(US6,051,753)、水稻肌动蛋白启动子(US 5,641,876)和1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基启动子(US 4,962,028)。

备选地，启动子是调控型启动子。“调控型启动子”是指非组成型地，但以时间和/或空间的方式指导基因表达的启动子，其包括组织特异性和诱导型启动子。不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或在响应不同的环境条件中指导基因或调控元件的表达。

“组织特异性启动子”是指不在所有植物细胞中表达而只在特定器官(例如叶或种子)、特定组织(例如胚或子叶)或特定细胞类型(例如叶薄壁组织细胞或种子储藏细胞或线虫摄食位置)的一种或多种细胞类型中表达的调控型启动子。此类启动子还包括时间调控型启动子，例如在早期或晚期胚胎发生中，在发育的种子或果实中在果实成熟期间，在完全分化的叶中，或在系列事件开始时受调控的启动子。适当的启动子包括来自菜籽油菜的napin-基因启动子(US 5,608,152)、来自蚕豆的USP-启动子(Baeumlein等人.，1991 Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆球蛋白-启动子(US 5,504,200)、来自芸苔属的Bce4-启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人.，1992 Plant Journal，2(2)：233-9)以及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、水稻等中提供种子特异性表达的启动子。可以提及的适宜启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中描述的启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白-基因、水稻的谷蛋白基因、水稻的水稻素(oryzin)基因、水稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁的kasirin-基因和黑麦的黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。适合用于在植物根组织中偏爱性表达的启动子包括例如来源于玉米烟酰胺合酶基因的启动子(US 20030131377)和水稻RCC3启动子(US 11/075,113)。适用于在植物绿色组织中偏爱性表达的启动子包括来自基因例如玉米醛缩酶基因FDA(US 20040216189)、醛缩酶和正磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)基因(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1)：42-48，2000)的启动子。

“诱导型启动子”是指可在一种或多种细胞类型中由外来刺激例如化学物质、光、激素、胁迫或病原体例如线虫开启的调控型启动子。如果基因表达想要以时间特异性的方式发生，那么化学诱导型启动子是特别合适的。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人.，1992 Plant J.2：397-404)、来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基的光诱导型启动子(ssRUBISCO)和乙醇诱导型启动子(WO93/21334)。此外，适宜的响应生物或非生物胁迫条件的启动子是这样的启动子，例如病原体诱导型PRP1-基因启动子(Ward等人.，1993 Plant.Mol.Biol.22：361-366)、来自番茄的热诱导型hsp80-启动子(US 5187267)、来自马铃薯的冷诱导型α淀粉酶启动子(WO 96/12814)、玉米的干旱诱导型启动子(Busk等人，Plant J.11：1285-1295，1997)、来自马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch，Plant Mol.Biol.33：897-909，1997)或来自拟南芥的RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozalei等人Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)、许多冷诱导型启动子例如来自拟南芥的cor15a启动子(Genbank登录号U01377)、来自大麦的blt101和blt4.8(Genbank登录号AJ310994和U63993)、来自小麦的wcs120(Genbank登录号AF031235)、来自棉花的mlip15(Genbank登录号D26563)、来自芸苔属的bn115(Genbank登录号U01377)和伤口诱导型pinII-启动子(欧洲专利号375091)。

在优选实施方案中，将线虫几丁质酶与根特异性、摄食位置特异性，例如合胞体或巨细胞特异性，或病原体诱导型启动子有效连接。更优选，将线虫几丁质酶基因与线虫诱导型启动子有效连接。

本发明还涉及用于在植物中增加线虫抗性的方法，其中该方法包括步骤：将上述表达载体导入植物，然后在所得的转化植物群体中选择显示增加的线虫抗性的转基因植物。可使用体外测定法例如发根测定法、美国专利5,770,786中描述的测定法等来实施线虫抗性选择步骤。用于选择具有增加的线虫抗性的转基因植物的优选测定法示于下面的实施例3中。

用于将多核苷酸导入植物的基因组和用于从植物组织或植物细胞再生植物的多种方法是已知的，例如见于Plant Molecular Biology andBiotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，pp.71-119(1993)；White FF(1993)Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Ed.：Kung和WuR，Academic Press，15-38；Jenes B等人.(1993)Techniques for GeneTransfer；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Ed.：Kung和R.Wu，Academic Press，pp.128-143；Potrykus(1991)Annu RevPlant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73。

转化方法可包括直接和间接转化方法。适当的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA吸收、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪进行的生物轰击方法(“微粒轰击”，Fromm ME等人.(1990)Bio/Technology.8(9)：833-9；Gordon-Kamm等人.(1990)Plant Cell 2：603)、电穿孔、干燥胚在含有DNA的溶液中的温育以及显微注射。在此类直接转化方法的情况下，所使用的质粒不必满足任何特殊要求。可使用简单质粒，例如pUC系列的质粒、pBR322、M13mp系列的质粒、pACYC184等。如果要从经转化的细胞再生完整植物，则优选于质粒上存在额外的选择标记基因。直接转化技术等同地适用于双子叶和单子叶植物。

转化还可通过利用农杆菌(Agrobacterium)进行细菌感染(例如EP 0116 718)、通过病毒载体进行病毒感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO95/34668；WO 93/03161)或通过花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US4,684,611)来实现。基于农杆菌的转化技术(特别地对于双子叶植物)在本领域内是熟知的。农杆菌株系(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)包含在用农杆菌感染后可以被转移至植物的质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件。T-DNA(被转移的DNA)可以整合入植物细胞的基因组。T-DNA可位于Ri-或Ti-质粒上或分开地包含在所谓的二元载体中。用于农杆菌介导的转化的方法描述于例如HorschRB等人.(1985)Science 225：1229f中。农杆菌介导的转化最适合于双子叶植物，但也已被采用于单子叶植物。通过农杆菌进行的植物转化描述于例如White FF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，由S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等人.Techniques for GeneTransfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，由S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，pp.128-143；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225。

转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。虽然可将本发明的核苷酸序列插入落在这些广泛类型中的任何植物和植物细胞，但其特别可以用于农作物植物细胞。

本发明的核苷酸可被直接转化入质体基因组。质体表达(其中基因通过同源重组插入存在于每个植物细胞中的数千个拷贝的环状质体基因组中)与核表达的基因相比具有巨大拷贝数目的优势，由此允许高表达水平。在一个实施方案中，将核苷酸插入质体靶向载体，然后转化入期望的植物宿主的质体基因组。获得对于包含该核苷酸序列的质体基因组而言是同质(homoplasmic)的植物，并且该植物优选地能够进行该核苷酸的高表达。

质体转化技术例如详尽地描述于美国专利5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462、WO 95/16783和WO 97/32977中，以及McBride等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305中，全部以其全文通过引用合并入本文。用于质体转化的基本技术包括，例如使用生物轰击或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)，将位于选择标记和本发明核苷酸序列侧翼的克隆的质体DNA区域导入适宜靶组织。称为靶向序列的该1至1.5kb侧翼区域促进与质体基因组的同源重组，从而允许置换或修饰质体基因组(plastome)的特定区域。最初，赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因中的点突变被用作转化的选择标记(Svab等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub等人.(1992)Plant Cell 4，39-45)。这些标记之间克隆位点的存在允许产生用于外源基因导入的质体靶向载体(Staub等人.(1993)EMBO J.12，601-606)。转化频率的显著增加可通过用显性选择标记(编码壮观霉素解毒酶氨基葡糖苷-3’-腺苷转移酶的细菌aadA基因)置换隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因来获得(Svab等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc.USA90，913-917)。用于质体转化的其他选择标记在本领域内是熟知并且包括在本发明的范围之内。

植物或转基因植物可以是任何植物，例如，但不限于树、切花类花卉植物(cut flower)、观赏植物、蔬菜或农作物植物。植物可来自选自下列的属：苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、小黑麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)，苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)，毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、Salpiglossis、Browaalia、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)，或植物可选自谷类，包括小麦、大麦、高梁、黑麦、小黑麦、玉米、稻、甘蔗，和树，包括苹果树、梨树、温柏树、李树、樱桃、桃树、油桃、杏树、木瓜树、芒果树、白杨、松树、红杉、雪松和橡树。本文中使用的术语“植物”可以是双子叶农作物植物例如豌豆、紫花苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、油菜(oilseed rape)、甜菜、甘蓝、花椰菜、青花椰菜(broccoli)、莴苣和拟南芥。在一个实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物。

优选，植物是农作物植物。农作物植物是用于农业的所有植物。因此，在一个实施方案中，植物是单子叶植物，优选禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)的植物，优选禾本科的植物。因此，在另一个实施方案中植物是玉蜀黍属(Zea)、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、黍属、蟋蟀草属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodiam)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属(Lolium)的禾本科植物。当植物为玉蜀黍属的植物时，优选物种是玉蜀黍(Zea mays)。当植物属于小麦属的植物时，优选物种是普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(T.speltae)或硬粒小麦(T.durum)。当植物属于稻属的植物时，优选物种是稻(O.sativa)。当植物属于大麦属时，优选物种是大麦(H.vulgare)。当植物属于黑麦属(Secale)时，优选物种是黑麦(S.cereale)。当植物属于燕麦属(Avena)时，优选物种是燕麦(A.sativa)。当植物属于甘蔗属时，优选物种是甘蔗(S.officinarum)。当植物属于高梁属时，优选物种是高粱(S.vulgare)、两色蜀黍(S.bicolor)或苏丹草(S.sudanense)。当植物属于狼尾草属时，优选物种是珍珠粟(P.glaucum)。当植物属于狗尾草属时，优选物种是谷子(S.italica)。当植物属于黍属时，优选物种是黍(P.miliaceum)或柳枝稷(P.Virgatum)。当植物属于蟋蟀草属时，优选物种是龙爪稷(E.coracana)。当植物属于芒属，优选物种是芒(M.sinensis)。当植物属于羊茅属时，优选物种是苇状羊茅(F.arundinaria)、紫羊茅(F.rubra)或牛尾草(F.pratensis)。当植物属于黑麦草属时，优选物种是黑麦草(L.perenne)或多花黑麦草(L.multiflorum)。备选地，植物可以是Triticosecale。

备选地，在一个实施方案中，植物是双子叶植物，优选豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑橘科(Citrus)的植物。在一个实施方案中，植物属于豆科、茄科或十字花科的植物。因此，在一个实施方案中，植物属于豆科，优选属于大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、野豌豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Len)。豆科的优选物种是截形苜蓿(M.truncatula)、紫花苜蓿(M.sativa)、大豆(G.max)，豌豆(P.sativum)、花生(A.hypogea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)或兵豆(Lens culinaris)。更优选的是物种大豆、花生和紫花苜蓿。最优选是物种大豆。当植物属于茄科时，优选属是茄属、番茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或中国辣椒(C.chinense)。更优选是马铃薯。因此，在一个实施方案中，植物属于十字花科，优选芸苔属(Brassica)或萝卜属(Raphanus)属。十字花科的优选物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥菜(B.juncea)或芜青(B.rapa)。更优选是欧洲油菜。当植物是藜科时，优选属是甜菜属，优选物种是甜菜(B.vulgaris)。当植物属于菊科时，优选属是向日葵属(Helianthus)并且优选物种是向日葵(H.annuus)。当植物属于锦葵科时，优选属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当属是棉属时，优选物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)，最优选物种是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当植物属于亚麻科时，优选属是亚麻属(Linum)并且优选物种是亚麻(L.usitatissimum)。当植物属于大戟科时，优选属是木薯属(Manihot)、麻风树属(Jatropa)或Rhizinus并且优选物种是木薯(Manihot esculenta)、麻疯树(Jatropa curca)或R.comunis。当植物属于旋花科时，优选属是药薯(Ipomea)，并且优选物种是甘薯(I.Batatas)。当植物是蔷薇科时，优选属是蔷薇属、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)并且优选物种是杂种草莓(Fragaria x ananassa)。当植物属于葫芦科时，优选属是香瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)并且优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrulluslanatus)或西葫芦(Cucurbita pepo)。当植物属于山茶科时，优选属是山茶属(Camellia)并且优选物种是茶(C.sinensis)。当植物属于茜草科时，优选属是咖啡属(Coffea)并且优选物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当植物属于梧桐科时，优选属是可可树属(Theobroma)并且优选物种是可可树(T.cacao)。当植物属于柑桔属时，优选物种是如甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)以及柑桔属物种的杂种等。在本发明的优选实施方案中，植物是大豆、马铃薯或棉花植物。

本发明的转基因植物可用于控制植物寄生性线虫对农作物的侵染的方法中，所述方法包括种植来自包含本发明的表达载体的种子的所述农作物，其中表达载体被稳定地整合入种子的基因组。

本发明可以用于减少植物寄生性线虫造成的农作物破坏或向植物赋予线虫抗性。线虫可以是任何植物寄生性线虫，特别地长针科(Longidoridae)、毛刺科(Trichodoridae)、滑刃科(Aphelenchoidida)、粒科(Anguinidae)、刺科(Belonolaimidae)、环科(Criconematidae)，异皮科(Heteroderidae)、纽带科(Hoplolaimidae)、根结科(Meloidogynidae)、针科(Paratylenchidae)、短体科(Pratylenchidae)、小垫刃科(Tylenchulidae)、垫刃科(Tylenchidae)等科的线虫。优选，寄生性线虫属于诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫见于长针科、毛刺科、异皮科、根结科、短体科或小垫刃科，特别是异皮科和根结科。

因此，本发明靶向的寄生性线虫属于选自Naccobus、棘皮线虫属(Cactodera)、长异皮线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)的一个或多个属。在优选实施方案中，寄生性线虫属于选自Naccobus、棘皮线虫属、长异皮线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属的一个或多个属。在一个更优选的实施方案中，寄生性线虫属于选自球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属的一个或多个属。在更优选实施方案中，寄生性线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属的一个或两个属。在另一个实施方案中，寄生性线虫属于根结线虫属。

当寄生性线虫属于球胞囊线虫属时，该物种优选选自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、墨西哥球胞囊线虫(G.mexicana)、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、G.mali、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(G.virginia)。在另一个优选实施方案中，寄生性球胞囊线虫包括马铃薯白线虫、烟草球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个物种。当寄生性线虫属于胞囊线虫属时，该物种可以优选选自燕麦胞囊线虫、胡萝卜胞囊线虫(Heterodera carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(Heterodera ciceri)、十字花科胞囊线虫(Heteroderacruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(Heterodera delvii)、微褐藻胞囊线虫(Heterodera elachista)、菲氏胞囊线虫(Heterodera filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(Heterodera gambiensis)、大豆胞囊线虫、豌豆胞囊线虫(Heterodera goettingiana)、荞麦胞囊线虫(Heterodera graduni)、啤酒花胞囊线虫(Heterodera humuli)、大麦胞囊线虫(Heteroderahordecalis)、麦类胞囊线虫(Heterodera latipons)、燕麦胞囊线虫(Heterodera major)、苜蓿胞囊线虫(Heterodera medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(Heterodera oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(Heteroderapakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(Heterodera rosii)、甘蔗胞囊线虫(Heterodera sacchari)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、蜀黍胞囊线虫(Heterodera sorghi)、三叶草胞囊线虫(Heterodera trifolii)、荨麻胞囊线虫(Heterodera urticae)、Heterodera vigni和玉米胞囊线虫。在另一个优选实施方案中，寄生性胞囊线虫属线虫包括大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个物种。在更优选实施方案中，寄生性线虫包括大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个物种。在最优选实施方案中，寄生性线虫是物种大豆胞囊线虫。

当寄生性线虫属于根结线虫属时，寄生性线虫可以选自高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、Meloidogyne arabica、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、甘蓝根结线虫(Meloidogyne artiellia)、短尾根结线虫(Meloidogyne brevicauda)、山茶根结线虫(Meloidogynecamelliae)、奇氏根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne cofeicola)、Meloidogyne esigua、禾草科根结线虫(Meloidogyne graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(Meloidogyne indica)、Meloidogyneinornata、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、Meloidogyne lini、苹果根结线虫(Meloidogyne mali)、小头根结线虫(Meloidogynemicrocephala)、小突根结线虫(Meloidogyne microtyla)、纳西根结线虫、萨拉斯根结线虫(Meloidogyne salasi)和Meloidogyne thamesi。在优选实施方案中，寄生性线虫包括爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫中的至少一个物种。

虽然已就某些实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域普通技术人员很显然的是，可对本文中描述的组合物、方法和方法的步骤或步骤的顺序上进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。

实施例

实施例1：自大豆胞囊线虫克隆编码几丁质酶的基因

通过从头合成产生用于转化大豆的几丁质酶基因，然后将其克隆入包含下面描述的启动子的基本载体。大豆胞囊线虫几丁质酶的DNA序列获自Genbank登录号AF468679。

实施例2：用于转化的载体构建体

为了评估克隆的几丁质酶编码基因的功能，将相应于SEQ ID NO：1的多核苷酸的基因片段克隆在启动子的下游以产生表1中描述的表达载体。合胞体偏好启动子包括拟南芥pAt5g12170启动子SEQ ID NO：3(US临时申请60/899,693和PCT/EP2008/051329)、拟南芥TPP 6-磷酸海藻糖磷酸酶启动子SEQ ID NO：4(pAt1g35910)(US临时申请60/874,375和PCT/EP2007/063761)。将组成型Super-启动子(U.S.5,955,646)也与SEQ IDNO：1的线虫几丁质酶多核苷酸有效连接。载体中的植物选择标记是来自拟南芥的、提供对除草剂ARSENAL(imazapyr，BASF Corporation，Florham Park，NJ)的耐受性的、突变乙酰羟酸合酶(AHAS)基因。突变的选择标记AHAS基因由拟南芥AHAS启动子驱动。

表1.包含SEQ ID NO：1的表达载体

载体	表达盒的组成(启动子::编码几丁质酶的基因)
		RCB678	Super启动子::SEQ ID NO：1
RCB686	pAt5g12170::SEQ ID NO：1
		RCB690	pAt1g35910::SEQ ID NO：1

实施例3：转基因根的制备和线虫生物检定

利用专利根外植体测定法检测线虫抗性。该测定法可见于共同拥有的共同待决申请USSN 12/001,234，通过引用和通过下面的描述而合并入本文。

将来自大豆栽培品种的干净大豆种子进行表面消毒，然后在农杆菌接种之前7天萌发。切取的子叶用于转化。在将外植体切离幼苗后，立即将切口端浸入包含上述不同载体构建体的厚毛根农杆菌集落。将外植体置于陪替培养皿中的1％琼脂上共培养6天。在转化和共培养后，将大豆外植体转移至具有选择剂的根诱导培养基。

在根诱导后2至3周，取下伸长的根，将根外植体转移至适当的选择培养基。转基因根在一周内在培养基上增殖良好，并且进行传代培养。切除主根尖来诱导次生根的生长。

在传代培养后1至5天，在多孔板中，用表面消毒的线虫幼虫接种根以进行目的基因或启动子构建体的测定。大豆栽培品种Williams 82对照载体和Jack对照载体根用作对照。用表面去污的SCN小种3的二龄幼虫(J2)接种各品系的根培养物。

从每个二元载体转化产生几个独立的根品系，然后将品系用于生物测定。在线虫接种后4周，计算各孔中的胞囊。构建体RCB678、RCB686和RCB690的生物测定结果显示：在多个转基因品系上胞囊计数的统计学显著性减少(p-值＜0.05)和在大部分受试转基因品系中总体的胞囊计数减少趋势。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司(BASF Plant Science GmbH)

<120>线虫几丁质酶基因用于控制植物寄生性线虫的用途

<130>PF 58957

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1053

<212>DNA

<213>大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)

<400>1

atgaacaggt tttttacatt attatttttt gtattatttt tcaatgccgc aattaatttt   60

gtcagttcac atcgcattgt cggttattat cagggcatac gtccattgac aaatgatcaa  120

gccaagaagt tgacccatct tatcctggca ttttcaaccc ctgactctca aggcaatttg  180

agtccattga gctctgtgct taaacaggcg ctaaaagcgg gtaaatccgc taatggtgcg  240

ctcaaagtga tgattgccat tggaggaggt ggctttgatc cggccatatt tacttcgtta  300

gcatcaaaca gtggcacacg taaaagcttt attaataaca ttgtttctta tctgaaaacc  360

aatgagctgg acggttgcga catcgactgg gagttcccaa cttctagtga caaggcaatc  420

tttgtgacat ttctgcgcga cttaaaaaag gcgatggcac ccagcggcgc tgtgcttagc  480

atggcatcgg cagcaagtgc cttctatttg gaccctggtt acgatttgcc aggcattgag  540

agtgccgtcg atttcattaa cgtgatgtgc tatgactatt atggaagctg gaccaaaaca  600

tcgactgggc caaactcgcc actgtttaag ggtggcagtg ccgacccatc ggacacattg  660

aacagcaatt ggacaatgaa ttatcactta atgaaagtgt ataatcgagc aaagttgaac  720

atgggtgtgc cattctacgg aaaatcttgg accaatgttg gagcaccact aaacggtgac  780

ggactttggc gtcagttggg cacttatggc accgaattag cctggcgtaa catgggcaaa  840

agttttgaca tgaccaagac aacgtatcat aaaacggcca aaactgcata catttatgat  900

acagctacca aaaatttttt aacctttgac aacccacaat cactgaagga caaggcaaaa  960

tatgttgcgg aaaagggcat tggtgggata atgatatggt caattgatca agatgacgac 1020

aaattgtctt tattgaattc tgtttcatat tga                              1053

<210>2

<211>350

<212>PRT

<213>大豆胞囊线虫

<400>2

Met Asn Arg Phe Phe Thr Leu Leu Phe Phe Val Leu Phe Phe Asn Ala

1               5                   10                  15

Ala Ile Asn Phe Val Ser Ser His Arg Ile Val Gly Tyr Tyr Gln Gly

            20                  25                  30

Ile Arg Pro Leu Thr Asn Asp Gln Ala Lys Lys Leu Thr His Leu Ile

        35                  40                  45

Leu Ala Phe Ser Thr Pro Asp Ser Gln Gly Asn Leu Ser Pro Leu Ser

    50                  55                  60

Ser Val Leu Lys Gln Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ser Ala Asn Gly Ala

65                  70                  75                  80

Leu Lys Val Met Ile Ala Ile Gly Gly Gly Gly Phe Asp Pro Ala Ile

                85                  90                  95

Phe Thr Ser Leu Ala Ser Asn Ser Gly Thr Arg Lys Ser Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Asn Ile Val Ser Tyr Leu Lys Thr Asn Glu Leu Asp Gly Cys Asp Ile

        115                 120                 125

Asp Trp Glu Phe Pro Thr Ser Ser Asp Lys Ala Ile Phe Val Thr Phe

    130                 135                 140

Leu Arg Asp Leu Lys Lys Ala Met Ala Pro Ser Gly Ala Val Leu Ser

145                 150                 155                 160

Met Ala Ser Ala Ala Ser Ala Phe Tyr Leu Asp Pro Gly Tyr Asp Leu

                165                 170                 175

Pro Gly Ile Glu Ser Ala Val Asp Phe Ile Asn Val Met Cys Tyr Asp

            180                 185                 190

Tyr Tyr Gly Ser Trp Thr Lys Thr Ser Thr Gly Pro Asn Ser Pro Leu

        195                 200                 205

Phe Lys Gly Gly Ser Ala Asp Pro Ser Asp Thr Leu Asn Ser Asn Trp

    210                 215                 220

Thr Met Asn Tyr His Leu Met Lys Val Tyr Asn Arg Ala Lys Leu Asn

225                 230                 235                 240

Met Gly Val Pro Phe Tyr Gly Lys Ser Trp Thr Asn Val Gly Ala Pro

                245                 250                 255

Leu Asn Gly Asp Gly Leu Trp Arg Gln Leu Gly Thr Tyr Gly Thr Glu

            260                 265                 270

Leu Ala Trp Arg Asn Met Gly Lys Ser Phe Asp Met Thr Lys Thr Thr

        275                 280                 285

Tyr His Lys Thr Ala Lys Thr Ala Tyr Ile Tyr Asp Thr Ala Thr Lys

    290                 295                 300

Asn Phe Leu Thr Phe Asp Asn Pro Gln Ser Leu Lys Asp Lys Ala Lys

305                 310                 315                 320

Tyr Val Ala Glu Lys Gly Ile Gly Gly Ile Met Ile Trp Ser Ile Asp

                325                 330                 335

Gln Asp Asp Asp Lys Leu Ser Leu Leu Asn Ser Val Ser Tyr

            340                 345                 350

<210>3

<211>1476

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

gctcgcgtta gttccactca aggagtatcc tttcttcctt gcgcaactct ccaccttcgg    60

gtaaagtacc atctctagca tcttgagtct tgatcaactt ctgttttgct tactctcaaa   120

atgcattaat ttttttttat actagatcat agtattatat ctcttaatct acctattgaa   180

atctacttaa tgtttttact aaaacctacg tgtttctctt tagagaattt tgtgctatgc   240

atgaattaga ggttagtaat gtgtaatact tcataagtct agatttattt gttggttaac   300

acgtttagta attcacacac acacaccacc ttagatattt tactgtgaat tagaaaaaga   360

tacatagtta ggagtgtttt tttaaaaaaa ttcaatcatg agaaaattag aggtgtgatg   420

ttatacatta tgaaaatgca aagggcagat acgaataaat tagaaacttg tttaacgggt   480

cagagttggc ttctagtctc tttcgacttg gatacttctt cttctacaat tgggacatta   540

ttgtaggcgc attatatcat ttctctacat gcaatgaatg tacatacatt aattcacatt   600

tatttttgga ataatcatat gagtgatcga agtttgtatt tatatattca atcttcacaa   660

actactttta tttaaaaatc atttgcaaaa tgctatttta ttgacaaaaa gatatatgct   720

ataaaataaa ataaaattca caaactatag tcattaatac aaaaagaaat cattgaatat   780

ggtagagggg aaacaaaaaa aaaacacgac gatgtaagtt ggtggaacca cattatcaaa   840

ataaaagaag gtggtggaac caaattgaat aaagtccgtc catatcatta tccgtccctt   900

aggagcctct aattagtaat attcttatgg gtccactgtg gcttagagga cttgattaaa   960

accattctta tttagtgcta actttgtgag ggttggaata acgaaccaag ctgattcaaa  1020

ccattccaaa acaaagttgt cacatatttc aaaaccaaag tttaccggac agagaaatat  1080

ggtgtgtttt tctcaaacca agctaaatgg aatccattgt aaaccaaaat gttcacacct  1140

acctattctt ttggagtccc ttttccatgt gtttgctgtc tgctagtcaa gtttcattag  1200

ctgattgcct tgcatcatat tcttggatca actttttttt tttttttttt tggggtaatt  1260

aacaaaatgc ttaaatttct caagactata ggatcacatt acctgtgtgc ttaacataac  1320

ttttagatag gctagagaat tgatctatta caagataatc aataatttac agaagaaaac  1380

attctttttt ttgttctatt tccttcatgt aggtatgtag ctgtatatta tactatcttg  1440

tattttcgat atcgtgctgg aactgtcaca gatgca                            1476

<210>4

<211>1999

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>4

gtagtgccct tcatggatac caaaagagaa aatttgattt agtgcataca tataacaata     60

taacgccgca taataatact gtataaaaca gtcatgtaac gatatgacag cagtaataca    120

gttccaagag acgttataat cgtatgcaat catatgcttg cgtagatttt ccaacagttt    180

tgtttcgttg ataggaggaa ctcaacactc tagggtagtg attggtagac actattagca    240

caaaaaatat taattttact ctgatgttta ccaaaaaagt taccaatcaa atatttaaga    300

gatcgtactc ttccacggcg actctaaaaa ccaaagatat aggttagact cataactact    360

ttataaagaa aatgtttaac gataactacc gagatctaat aaataaacct tcattttcaa    420

gtatattata tttgcttctt ttgtttatat atcaaaccaa gttctggttt ataaaaatat   480

tagataaaac tcgtctaaat aggtaggtgt aaaataaaat tttaaatttt tatcgataat   540

atttaaaatt tgaaaagtta ataatgatcc acacattttt tctaatattt aatttagtaa   600

tttttgtatt aaataaaatt tcaatcatat acattcgatt tttctataca ttttaactat   660

ctatttctgc ataataaact gtattttcat tttatacgct tcatcttatg gatgatattt   720

aaattttaaa tagtaattca tacacttttt aatatttaat ttagtatttt cttaaatcca   780

aattttaatc ttacaattta aatatctact ttaacataat acaaatacaa tttaatttca   840

ttgtattaaa ttcaaatata atttgattat aataaaatac aatttaattc taaaaagtcc   900

atcttagatt ttaattttcc tttttagttt tgaaaattaa aaatttaaat ttattagata   960

tatatgttac tttttcagtt ttcctattta tttaagaaaa aaatattttt taacacatgt  1020

caacttgtaa acaatagact gaacacgtca ttttatatta tgtttagttt tgaaaattaa  1080

agttaattaa atatttatat ttcttttttt tagcttttct aattattttt aaaatagtaa  1140

atatttttaa tacaaatcaa tatctgaaca atagatttga tacataacat aatcctataa  1200

attattaact tggaaaacga tagtttatat aataaaatta ttttcttaag ttctctaacc  1260

ataacaatta aactatattt tagcgaagaa aagaagagaa taccgagaga acgcaacttg  1320

cactaaaagc taccactttg gcaaatcact catttatatt attatatact atcacctcaa  1380

ttcaatcgaa acctcaaaat aacactaata tatacacaaa gaaacaacag aataacaccg  1440

aagaatatag gtttaggaaa atccagaatt tgttgagact aaagagatca aattttcgat  1500

acaaggtttt gctcaatttg tattttcata ataaaattct ttatttcacc atagacttac  1560

atgattagtt tttcttttaa taaaaaaaaa cacgcgacat gaaaattata ttatctcagt  1620

gttgtcgaat ttgaatttga attttgagtt aaatactaca catttgttga caacttatta  1680

aactttacaa gtctgctaca aatattgtca aatatttact aattaatgga ccaaaatcct  1740

ctaacttgca aatttgtatc tacatcaact taaaaattag gaatatgcga cccaaaaaaa  1800

aaaaaactag gaataataat aaaaaaatgg aatgatgtgg aggaagctct ttactctttg  1860

agaggaagtt tataaattga ccacacattt agtctattat catcacatgt attaagactt  1920

gacaacttgt ctttctcaca ccaaacccct ctcctctgtt tcataacatc tgctctttct  1980

tttttttcct aagccccta                                               1999

<210>5

<211>583

<212>DNA

<213>甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)

<400>5

tcaaacgaaa aattaaaatg aacaggtttt ttacattttt attatttttt gtattatttt     60

tcaatggcgc aattaatttt gtcagttcac atcgcattgt cggttattat cagggaatac    120

gtccattgac aaatgatcaa gccaagaagt tgacccatct tatcctggca ttttcaaccc    180

ctgacgctca gggcaatttg agtccattga gtgctgtgct taaacaagca ttaaaagcgg    240

gtaaatccgc taatggtgcg ctcaaagtga tgattgccat cggaggaggt ggctttgatc    300

cgtccatatt tacttcgtta gcatcaaaca gtggcacacg taaaagcttt attaataaca    360

ttgtttctta tctgaaaacc aatgagctgg acggttgcga catcgattgg gagttcccaa    420

cttctaatga caaggcaatc tttgtgacat ttctgcgcga cttaaaaaag gcattggcac    480

ccagcggcgc tgtgcttagc atggcatcgg cagcaagtgc cttctatttg gaccccggtt    540

tcgatttgcc aggcattgag agtgccgtcg atttcattaa cgt                      583

<210>6

<211>188

<212>PRT

<213>甜菜胞囊线虫

<400>6

Met Asn Arg Phe Phe Thr Phe Leu Leu Phe Phe Val Leu Phe Phe Asn

1               5                   10                  15

Gly Ala Ile Asn Phe Val Ser Ser His Arg Ile Val Gly Tyr Tyr Gln

            20                  25                  30

Gly Ile Arg Pro Leu Thr Asn Asp Gln Ala Lys Lys Leu Thr His Leu

        35                  40                  45

Ile Leu Ala Phe Ser Thr Pro Asp Ala Gln Gly Asn Leu Ser Pro Leu

    50                  55                  60

Ser Ala Val Leu Lys Gln Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ser Ala Asn Gly

65                  70                  75                  80

Ala Leu Lys Val Met Ile Ala Ile Gly Gly Gly Gly Phe Asp Pro Ser

                85                  90                  95

Ile Phe Thr Ser Leu Ala Ser Asn Ser Gly Thr Arg Lys Ser Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Asn Ile Val Ser Tyr Leu Lys Thr Asn Glu Leu Asp Gly Cys Asp

        115                 120                 125

Ile Asp Trp Glu Phe Pro Thr Ser Asn Asp Lys Ala Ile Phe Val Thr

    130                 135                 140

Phe Leu Arg Asp Leu Lys Lys Ala Leu Ala Pro Ser Gly Ala Val Leu

145                 150                 155             160

Ser Met Ala Ser Ala Ala Ser Ala Phe Tyr Leu Asp Pro Gly Phe Asp

                165                 170             175

Leu Pro Gly Ile Glu Ser Ala Val Asp Phe Ile Asn

            180                 185

Claims (19)

1.用包含编码线虫几丁质酶的分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物，其中多核苷酸的表达向植物赋予增加的线虫抗性。

2.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸选自：

(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；

(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；

(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；

(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；

(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

3.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸具有SEQ ID NO：1中定义的序列。

4.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽。

5.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％的序列同一性。

6.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％的序列同一性。

7.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸包含SEQ ID NO：5中定义的序列。

8.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸编码包含具有SEQ IDNO：6中定义的序列的多肽的线虫几丁质酶。

9.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。

10.权利要求1的转基因植物，其中多核苷酸编码包含与具有SEQ IDNO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的线虫几丁质酶。

11.权利要求1的植物，其中植物是单子叶植物。

12.权利要求1的植物，其中植物是双子叶植物。

13.权利要求12的植物，其中植物选自豌豆、紫花苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜、青花椰菜、莴苣和拟南芥。

14.权利要求13的植物，其中植物是大豆。

15.种子，其，就包含编码线虫几丁质酶的多核苷酸的转基因而言，是纯合等位基因的。

16.权利要求15的种子，其中多核苷酸选自：：

(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；

(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；

(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；

(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；

(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

17.包含与分离的多核苷酸有效连接的启动子的表达载体，所述分离的多核苷酸选自：

(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；

(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；

(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；

(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；

(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

18.用于在植物中增加线虫抗性的方法，其中方法包括步骤：

a)将包含与编码线虫几丁质酶的多核苷酸有效连接的启动子的表达载体导入植物，和

b)选择具有增加的线虫抗性的转基因植物。

19.权利要求18的方法，其中多核苷酸选自：

(a)具有SEQ ID NO：1中定义的序列的多核苷酸；

(b)编码具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(c)包含SEQ ID NO：5中定义的序列的多核苷酸；

(d)编码包含SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽的多核苷酸；

(e)编码线虫几丁质酶并且与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(f)编码线虫几丁质酶并且包含与SEQ ID NO：5的多核苷酸具有至少50％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；

(g)编码线虫几丁质酶并且与具有SEQ ID NO：2中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的多核苷酸；

(h)编码线虫几丁质酶并且包含与具有SEQ ID NO：6中定义的序列的多肽有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；

(i)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

(j)编码线虫几丁质酶并且在严格条件下与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。

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