CN116075218A - 具有改善的线虫抗性的植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表现出具有改善的线虫抗性的新颖植物。本发明还涉及所述植物的种子和部分。本发明进一步涉及制造和使用这类种子和植物的方法。本发明还涉及新颖SmD1等位基因，该等位基因产生与这种改善的线虫抗性相关的经修饰的SmD1蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及表现出具有改善的线虫抗性的新颖植物。本发明还涉及所述植物的种子和部分。本发明进一步涉及制造和使用这类种子和植物的方法。本发明还涉及新颖SmD1等位基因，该等位基因产生与这种改善的线虫抗性相关的经修饰的SmD1蛋白。
背景技术
定栖体内寄生线虫，如根结线虫(RKN；根结线虫属物种(Meloidogyne spp.))和异皮线虫(CN；异皮线虫属物种(Heterodera spp.)和孢囊线虫属物种(Globodera spp.))对许多农作物造成相当大的损害。线虫的大部分生命周期在植物根中度过，在植物根中这些线虫诱导多核肥大的摄食细胞形成，分别称为巨细胞和合胞体。这些巨细胞被小的分裂细胞包围，并且在根内形成新的器官，称为根结或根瘿，然后充当代谢库，线虫一生都从该代谢库中获取营养。这导致植物根系统功能的严重缺陷，极大地降低了植物营养吸收的效率，并且最终影响产量(Singh等人,2013；Mejias等人,2019)。
为了防止产量损失，通常依赖于作物管理和轮作、使用杀线虫剂以及植物遗传学而进行线虫防控。然而，许多杀线虫剂溶液已经退出市场。此外，杀线虫剂溶液的使用已经大幅减少，以解决人类健康、食品安全问题(例如关于作物收获时的残留物)、以及环境可持续性(例如保护土壤寿命)。此外，现有基于植物遗传学的解决方案廖廖无几，却仍对一些线虫无效。例如，许多根结线虫(Meloidogyne)物种(例如，象耳豆根结线虫(M.enterolobii)、南方根结线虫、花生根结线虫以及爪哇根结线虫)可以克服携带广泛用于线虫管理的Mi-1.2和N抗性基因的西红柿和胡椒基因型的抗性(Kiewnick等人,2009)。
因此，需要替代的方案以进一步改善植物(特别是西红柿植物)中的线虫防控。
发明内容
本发明解决了提供新颖植物的需要，这些新颖植物表现出对线虫(尤其是根结线虫属的线虫)的抗性增加。
在第一个实施例中，本发明提供了包含SmD1等位基因的植物，该等位基因编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，该错义突变产生赋予了改善的线虫抗性的经修饰的SmD1蛋白。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1至108的任一位置处的错义突变。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处的错义突变。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处的苏氨酸取代为异亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物选自包含西红柿、烟草、胡椒、小南瓜、西瓜、甜瓜、黄瓜以及大豆的列表。
在另一个实施例中，本发明提供根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是近交、双单倍体或杂种植物。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是砧木。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物包含两个拷贝的所述SmD1等位基因。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白赋予对根结线虫属线虫，优选地南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫以及爪哇根结线虫的改善的抗性。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是番茄(Solanum lycopersicum)。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在另一个实施例中，所述SmD1等位基因可获得自2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB的番茄系19TEP250122。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物部分，其中所述植物部分包含所述SmD1等位基因。
在另一个实施例中，本发明提供了产生如前述实施例中任一项所述的植物或植物部分的种子。
在另一个实施例中，本发明提供了改善植物线虫抗性的方法，该方法包括以下步骤：
a)获得突变植物群体；
b)选择突变植物，该突变植物包含编码SmD1蛋白的经修饰的SmD1等位基因，该蛋白在其氨基酸序列中含有错义突变。
使用产生经修饰的SmD1蛋白的SmD1等位基因已被证明可增加对线虫的耐受。这证明，错义突变允许维持植物原位中经修饰的SmD1蛋白的所需活性，同时防止所述SmD1蛋白被线虫效应子识别，从而提高植物应对有害生物的能力。因此，本发明有望用于改善植物对线虫有害生物抗性的未来育种计划中。
附图说明
图1：由拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AT4G02840.1(SEQ ID NO:4)和AT3G07590.1(SEQ ID NO:5))、本氏烟(Nicotiana benthamiana)(NbS00005390g0012.1(SEQ ID NO:6)、NbS00006569g0006.1(SEQ ID NO:7)和NbS00054309g0007.1(SEQ ID NO:8))以及番茄(Solyc09g064660.2.1(SEQ ID NO:1)和Solyc06g084310.2.1(SEQ ID NO:3))编码的本发明的SmD1氨基酸序列，以及来自大豆植物(Glycine max)(Glyma.02G096000.1(SEQ ID NO:9))、辣椒(Capsicum annuum)(CA06g26820(SEQ ID NO:10)和Capana06g000068(SEQ ID NO:11))、中国南瓜(Cucurbita moschata)(CmoCh02G018520.T1(SEQ ID NO:12))、甜瓜(Cucumis melo)(MELO3C018220.2.1(SEQ ID NO:13))、黄瓜(Cucumis sativus)(Cs.gy14.3.1.022189.T1(SEQ ID NO:14))、西瓜(Citrilluslanatus)(Cla023415_T(SEQ ID NO:15))、多毛番茄(Solanum habrochaites)(Sh.LY101.2.1.003421.T1)(SEQ ID NO:16))以及潘那利番茄(Solanum pennellii)(Sopen09g026350.1(SEQ ID NO:17))SmD1等位基因的直系同源序列的序列比对和百分比同一性矩阵。使用软件Clustal Omega(Sievers等人,2011)来计算序列比对和百分比同一性矩阵。
图2：与相应对照植物相比，具有受损的SmD1基因表达的拟南芥属(A)、本氏烟(B)以及西红柿(C)植物对线虫的易感性水平的评估。(D)SmD1沉默西红柿植物的植物根系评估。(A)每种基因型使用四十株植物，并且用学生t检验(Student’s t-test)(P<0.05)对这些结果进行统计分析。(B)每种处理使用十二株植物，并且用曼-惠特尼检验(Mann-Whitneytest)(α＝5％)对这些结果进行统计分析。(C)每种基因型分别使用十八至二十株植物，并且用曼-惠特尼检验(α＝5％)对这些结果进行统计分析。
图3：在其SmD1b基因中含有错义突变的西红柿植物的植物根系(A)和对线虫的易感性水平(B)的评估。用曼-惠特尼检验(α＝1％)对这些结果进行统计分析。
序列简述
SEQ ID NO:1：由SmD1b基因Solyc09g064660.2.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：包含位于SEQ ID NO:1的位置14处的T14I错义突变的经修饰的氨基酸序列
SEQ ID NO:3：由SmD1a基因Solyc06g084310.2.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：由SmD1b基因AT4G02840.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:5：由SmD1a基因AT3G07590.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:6：由SmD1基因NbS00005390g0012.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:7：由SmD1基因NbS00006569g0006.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:8：由SmD1基因NbS00054309g0007.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:9：由SmD1基因Glyma.02G096000.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：由SmD1基因CA06g26820编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:11：由SmD1基因Capana06g000068编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：由SmD1基因CmoCh02G018520.T1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:13：由SmD1基因MELO3C018220.2.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:14：由SmD1基因Cs.gy14.3.1.022189.T1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:15：由SmD1基因Cla023415_T编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:16：由SmD1基因Sh.LY101.2.1.003421.T1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:17：由SmD1基因Sopen09g026350.1编码的氨基酸序列
SEQ ID NO:18：编码SEQ ID NO:1的核酸序列
SEQ ID NO:19：编码SEQ ID NO:2的核酸序列
SEQ ID NO:20：Solyc09g064660.2.1SmD1b基因的基因组序列
SEQ ID NO:21：经修饰的Solyc09g064660.2.1SmD1b基因的基因组序列
SEQ ID NO:22/23：扩增Solyc09g064660.2.1基因区的引物对
SEQ ID NO:24：编码SEQ ID NO:3的基因组序列
SEQ ID NO:25：编码SEQ ID NO:4的基因组序列
SEQ ID NO:26：编码SEQ ID NO:5的基因组序列
SEQ ID NO:27：编码SEQ ID NO:9的基因组序列
SEQ ID NO:28：编码SEQ ID NO:10的基因组序列
SEQ ID NO:29：编码SEQ ID NO:11的基因组序列
SEQ ID NO:30：编码SEQ ID NO:12的基因组序列
SEQ ID NO:31：编码SEQ ID NO:13的基因组序列
SEQ ID NO:32：编码SEQ ID NO:14的基因组序列
SEQ ID NO:33：编码SEQ ID NO:15的基因组序列
SEQ ID NO:34：编码SEQ ID NO:16的基因组序列
SEQ ID NO:35：编码SEQ ID NO:17的基因组序列
具体实施方式
定义
如果下文没有另外说明，在本申请范围内所使用的技术术语和表述一般被给予在植物育种和栽培相关领域中通常应用于其上的意义。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，提及“一种植物”包括一种或多种植物，并且提及“一种细胞”包括多种细胞、组织等的混合物。
如本文使用的，术语“约”，当指代一个值或指代质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法。
“栽培”植物在本发明的范围内应理解为是指不再是呈天然状态，而是已经通过人类的照料进行发育和驯化并且供农业使用和/或人类消费的植物，并且不包括野生种质。举个例子，在实施例中，“栽培植物”是杂种植物。可替代地或另外地，如本发明所述的“栽培西红柿”植物能够长出黄色、橙色或红色果实。可替代地或另外地，栽培西红柿植物是番茄植物。
在本发明的范围内“等位基因”应理解为是指与基因的不同形式相同的或有关的不同遗传单位的可替代或变体形式，它们在遗传中是可替代的，因为它们处于同源染色体的同一基因座处。这类可替代或变体形式可以是单核苷酸多态性、插入、倒置、易位或缺失的结果，或是基因调控(由例如化学或结构修饰引起的)、转录调控或翻译后修饰/调控的结果。在二倍体细胞或生物体中，一个给定基因或遗传元件的两个等位基因典型地占有同源染色体对上相应的基因座。在本发明的上下文中，SmD1基因的可替代或变体等位基因编码经修饰的SmD1蛋白，该蛋白包含与改善的线虫抗性表型有关的错义突变。SmD1基因可替代或变体等位基因相对于野生型SmD1基因定义。例如，SED ID NO:20的野生型SmD1b基因序列编码SEQ ID NO:1的野生型SmD1b蛋白。因此，SEQ ID NO:21的变体SmD1b等位基因编码SEQID NO:2的经修饰的SmD1b蛋白。
相对而言，术语“改善的线虫抗性”在本文中应理解为意指如本发明所述的植物，例如，包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白的SmD1等位基因，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，与缺乏所述等位基因的植物相比，表现出增加的线虫抗性。在本发明的范围内，具有“改善的线虫抗性”的植物应理解为，意指使用曼-惠特尼检验(α＝1％、2.5％或5％)或学生检验(P<0.05)，与对照植物相比，具有统计学上显著增加的线虫抗性的植物(例如，如实例部分所述，表现出卵块数量的显著减少)。
在线虫抗性的上下文中，术语“中间体抗性”是指包含如本发明所述的等位基因的植物，并且当与携带野生型相应等位基因(西红柿参考基因组-HEINZ)的易感对照植物相比时，在根节数和/或卵块数方面显示出统计学上显著差异。
“对照植物”在本发明范围内可以是具有与本发明的栽培植物相同的遗传背景的植物，其中该对照植物不具有与改善的线虫抗性相关的本发明的等位基因。对照植物可以是属于相同植物品种的植物，并且不包含本发明的等位基因。使对照植物在与本发明的栽培植物相同的条件下生长相同的时间长度。本文根据UPOV的定义理解植物品种。因此，对照植物可以是近等基因株系、近交株系或杂种，条件是它们具有与本发明的植物相同的遗传背景，除了该对照植物不具有与改善的线虫抗性相关的本发明等位基因中的任一个。在优选的实施例中，“对照植物”是“对照西红柿植物”。
术语“性状”是指特征或表型。在本发明的上下文中，线虫抗性性状是改善的线虫抗性性状。性状可以是以显性或隐性方式或是以部分或不完全显性方式遗传的。性状可以是单基因的或多基因的，或者可以是由一种或多种基因与环境相互作用而产生的。植物的性状可以是纯合的或杂合的。
术语“杂种”、“杂种植物”以及“杂种子代”是指由在基因上不同的亲本产生的个体(例如，在基因上是杂合的或主要是杂合的个体)。
术语“近交株系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交株系可以通过几个循环的兄弟/姐妹育种或自交或双单倍体产生来获得。
术语“双单倍体株系”是指由花药培养得出的稳定的近交株系。在特定培养基和环境中培养的一些花粉粒(单倍体)可以发育成含有n个染色体的小植物。然后使这些小植物“加倍”并且包含2n个染色体。这些小植物的子代称为“双单倍体”并且基本上不再分离(稳定的)。
术语“栽培品种”或“品种”是指与天然存在的品种不同的园艺衍生品种。在本发明的一些实施例中，栽培品种或品种是具有商业价值的。
术语“砧木”是指用作接穗植物托的植物。典型地，砧木植物和接穗植物具有不同的基因型。在实施例中，如本发明所述的植物用作砧木植物。
术语“遗传上固定的”是指已经稳定掺入通常不含该遗传元件的植物基因组中的遗传元件。当遗传上固定时，遗传元件可以通过有性杂交以容易和可预测的方式传播给其他植物。
下文中的术语“植物”或“植物部分”是指可从如本发明的所述的植物(例如西红柿)获得的植物部分、器官或组织，包括但不限于叶、茎、根、花或花部分、果实、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、细胞或组织培养物、或仍展现出如本发明所述的线虫抗性性状的植物(特别是当生长为产生果实的植物)的任何其他部分或产品。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物。
“植物种子”是生长成为如实施例中任一项所述的植物的种子。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或培养细胞的形式，或作为高等组织化单位(诸如例如，植物组织、植物器官或全株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花芽或胚。
如本文使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。该术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。该术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
如本文使用的，术语“育种”及其语法变体是指产生子代个体的任何过程。育种可以是有性的或无性的，或其任意组合。示例性非限制性育种类型包括杂交、自交、双单倍体衍生物生成及其组合。
如本文使用的，短语“建立的育种群体”是指由育种计划(例如，商业育种计划)中的亲本产生和/或用作亲本的潜在育种伙伴的集合。建立的育种群体的成员典型地在基因和/或表型方面得到充分表征。例如，可能已经评估感兴趣的几个表型性状，例如在不同的环境条件下、在多个位置和/或在不同的时间。可替代地或另外，可能已经鉴别一个或多个与表型性状的表达相关的遗传基因座，并且可能已经就该一个或多个遗传基因座方面以及就与该一个或多个遗传基因座相关的一个或多个基因标记方面对育种群体的一个或多个成员进行基因型分析。
如本文使用的，短语“二倍体个体”是指具有两组染色体的个体，典型地，一组来自它的两个亲本中的每一个。然而，应理解在一些实施例中，二倍体个体可以从相同的单一生物体接收它的“母本”和“父本”组的染色体，如当植物自体授粉以产生植物的继代时。
“纯合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应的基因座处的相同的等位基因。在本发明的上下文中，在特定基因座上包含两个相等拷贝的特定等位基因(例如编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白的SmD1等位基因)的植物在相应基因座是纯合的，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，该错义突变产生赋予了改善的线虫抗性的经修饰的SmD1蛋白。
“杂合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应的基因座处的不同的等位基因。在本发明的上下文中，在特定基因座上包含一个拷贝的特定等位基因(例如，编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白的SmD1等位基因)的西红柿植物，在相应基因座是杂合的，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，该错义突变产生赋予了改善的线虫抗性的经修饰的SmD1蛋白。
“显性”等位基因在本发明的范围内应理解为是指当以杂合或纯合状态存在时决定表型的等位基因。
“隐性”等位基因是指当仅以纯合状态存在时决定表型的等位基因。
“错义突变”应理解为是指点突变，其中单个核苷酸的改变产生编码不同氨基酸的密码子。
“回交”在本发明的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本之一重复往回杂交的方法。不同的轮回亲本可以被用在随后的回交中。
“基因座”在本发明的范围内应理解为是指染色体上包含对性状有贡献的基因或任何其他遗传元件或因子的区域。
如本文使用的，“标记基因座”是指染色体上包含存在于个体基因组中并且与一个或多个感兴趣的基因座相关的核苷酸或多核苷酸序列的区域，该区域可能包含对性状有贡献的基因或任何其他遗传决定子或因子。“标记基因座”还指染色体上包含与基因组序列互补的多核苷酸序列(如用作探针的核酸的序列)的区域。
如本文使用的，短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本发明披露的主题的上下文中是指配子融合以产生子代(例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子)。在一些实施例中，“有性杂交”或“异体受精”是一个个体被另一个体受精(例如，植物中的异花授粉)。术语“自交”在一些实施例中是指通过自体受精或自花授粉产生种子；即花粉和胚珠来自同一株植物。
如本文使用的，短语“基因标记”是指个体基因组中与一个或多个感兴趣的基因座相关的特征(例如，存在于个体基因组中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些实施例中，基因标记在感兴趣的群体中是多态性的，或基因座被多态性占据，这取决于上下文。基因标记包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(indel)(即，插入/缺失)、简单序列重复(SSR)、限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标记、多样性阵列技术(DArT)标记以及扩增片段长度多态性(AFLP)以及许多其他实例。基因标记可以例如用于对染色体上包含对表型性状的可变性有贡献的等位基因的遗传基因座进行定位。短语“基因标记”还可以指与基因组序列互补的多核苷酸序列，如用作探针的核酸的序列。
“基因标记”可以物理地定位于染色体上与它关联的遗传基因座内部或外部(即，对应地是基因内的或基因外的)的位置。换句话说，尽管在对应于感兴趣的基因座的基因或功能突变在染色体上的位置(例如，在基因外部的控制元件内)还没有被鉴别并且基因标记与感兴趣的基因座之间存在非零重组比率时典型地使用基因标记，但本发明披露的主题还可以使用物理地处于遗传基因座的边界内的基因标记(例如，在对应于基因的基因组序列内部，如但不限于基因的内含子或外显子内的多态性)。在本发明披露的主题的一些实施例中，一个或多个基因标记包含在一个与十个之间的标记，并且在一些实施例中，一个或多个基因标记包括多于十个基因标记。
如本文使用的，术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组基因标记的基因型”包括个体的单倍型中存在的一个或多个基因标记基因座的具体等位基因。如本领域中已知的是，基因型可以涉及单个基因座或多个基因座，无论这些基因座是相关还是不相关的，和/或是连锁还是非连锁的。在一些实施例中，个体的基因型涉及一个或多个相关的基因，因为这些基因中的一个或多个参与感兴趣的表型(例如，如本文定义的数量性状)的表达。因而，在一些实施例中，基因型包括个体内在数量性状的一个或多个遗传基因座处存在的一个或多个等位基因的汇总。在一些实施例中，基因型以单倍型(下文进行定义)表示。
如本文使用的，术语“种质”是指群体或其他个体组(例如，物种)的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，一组植物，其充当各种等位基因的储存库。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域；这样，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。
如本文使用的，短语“核酸”是指可对应于核苷酸串的任何物理单体单元串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA、cDNA或RNA聚合物)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含对于生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等等。在一些实施例中，核酸可以是单链、双链、多链或其组合。除非另外指示，否则本发明披露的主题的特定核酸序列任选地包含或编码除了明确指示的任一序列以外的互补序列。
如本文使用的，术语“多数”是指多于一个。因此，“多数个体”是指至少两个个体。在一些实施例中，术语多数是指多于整体的一半。例如，在一些实施例中，“群体中的多数”是指多于那个群体的成员的一半。
如本文使用的，术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后代。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自交(即，同一株植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。这一个或多个后代可以是例如F1、F2或任何继代。
术语“受体植物”在本文中用于指示将接受从供体植物获得的DNA的植物，该DNA包含用于改善线虫抗性的突变等位基因。
“供体植物”在本发明的范围内应理解为意指提供与改善的线虫抗性相关的可替代的或变体等位基因的植物。
如本文使用的，短语“质量性状”是指受一个或几个展现大多数表型作用的基因控制的表型性状。因此，质量性状通常被简单地遗传。植物中的性状实例包括但不限于花色和几种已知的抗病性，例如像，真菌斑点抗性或西红柿花叶病毒抗性。
“基于标记的选择”在本发明的范围内应理解为是指例如使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中该核酸与所希望的性状相关联，以鉴别出携带令人希望的(或不希望的)性状的基因的植物，使得在选择性育种计划中可以使用(或避免)那些植物。
单核苷酸多态性(SNP)是DNA中单个位点的变异，是基因组中最常见的变异类型。单核苷酸多态性(SNP)是当基因组(或其他共有序列)中的单个核苷酸—A、T、C或G—在生物物种的成员或个体的成对染色体之间不同时发生的DNA序列变异。例如，来自不同个体的两个测序的DNA片段，AAGCCTA至AAGCTTA，含有单个核苷酸的差异。在这种情况下，存在两个等位基因：C和T。SNP阵列的基本原理与DNA微阵列相同。这些是DNA杂交、荧光显微镜法和DNA捕获的融合。SNP阵列的三个组分是包含核酸序列(即，扩增的序列或靶标)的阵列，一个或多个标记的等位基因特异性寡核苷酸探针，以及记录并解释杂交信号的检测系统。
所希望的等位基因的存在或不存在可以通过使用双链DNA染料的实时PCR或荧光报告探针法来确定。
“PCR(聚合酶链反应)”在本发明的范围内应理解为是指产生基因组的DNA或一个或多个子集的相对较大量的具体区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。
“PCR引物”在本发明的范围内应理解为是指DNA的具体区域的PCR扩增中所使用的相对较短的单股DNA片段。
“表型”在本发明的范围内应理解为是指在基因上控制的性状的一个或多个可区分的特征。
如本文使用，短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组、蛋白质组和/或代谢组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。
“多态性”在本发明的范围内应理解为是指一个群体中存在两种或更多种不同形式的基因、基因标记或遗传性状或例如通过可替代的剪接、DNA甲基化等可获得的基因产物。
“选择性育种”在本发明的范围内应理解为是指使用具有或显示令人希望的性状的植物作为亲本的育种程序。
“测试”植物在本发明的范围内应理解为是指用于在基因上表征将被测试的植物中的性状的植物。典型地，使待测试的植物与“测试”植物杂交，并且对杂交子代中的性状的分离比率进行评分。
如本文使用的“探针”是指能够识别并且结合于具体靶分子或细胞结构并且因而允许靶分子或结构的检测的一组原子或分子。特别地，“探针”是指可以用于通过分子杂交来检测互补序列的存在并且对其定量的经过标记的DNA或RNA序列。
如本文使用的术语“杂交”是指常规的杂交条件，优选地是指以下杂交条件，即：使用5x SSPE、1％SDS、1x登哈特溶液作为溶液和/或杂交温度在35℃与70℃之间，优选地65℃。杂交后，优选地首先用2x SSC、1％SDS并且随后用0.2x SSC在35℃到75℃之间的温度下、特别地在45℃到65℃之间、但尤其在59℃下进行洗涤(关于SSPE、SSC和登哈特溶液的定义，参见上述引文中的Sambrook等人)。如例如上文Sambrook等人所述的高严格杂交条件是特别优选的。如果如上所述地在65℃发生杂交和洗涤，则例如存在特别优选的严格杂交条件。例如杂交和洗涤在45℃下进行的非严格杂交条件是不太优选的并且在35℃下是更不太优选的。
根据本发明，术语“对应于位置X的所述位置”(X是在本申请的相应上下文中可找到的任何数字)不仅包括随后提及的SEQ ID NO中的相应位置，还包括对应于SmD1等位基因或编码SmD1蛋白的任何序列，其中，在与参考SEQ ID NO比对之后，相应位置可能具有不同的数字，但对应于参考SEQ ID NO所指示的数字。SmD1等位基因或SmD1蛋白序列的比对可以通过以合理的方式应用各种比对工具，例如通过应用以下描述的工具来实现。
“序列同一性”。在两个或更多个核酸或蛋白序列的背景下，术语“同一的”或“同一性”是指如使用以下序列比较算法之一或通过目测进行测量，当比较和比对最大相应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。如果彼此进行比较的两个序列长度不同，则序列同一性优选地涉及与较长序列的核苷酸残基具有同一性的较短序列的核苷酸残基的百分比。如本文使用的，考虑了空位的数目以及每个空位的长度(在这两个序列的优化比对中需要引入它们)，这两个序列之间的百分比同一性/同源性是这些序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)。序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成，如下文所述的。例如，常规地可以通过使用计算机程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，针对Unix的版本8，遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group)，大学研究园区(University Research Park)，威斯康星州麦迪逊市科学先驱路575号(575Science Drive Madison,WI)53711)来确定序列同一性。Bestfit使用Smith和Waterman,应用数学进展2(Advances in Applied Mathematics2)(1981),482-489的局部同源性算法以便找到两个序列之间具有最大序列同一性的区段。当使用Bestfit或另一序列比对程序来确定一个特定的序列是否与本发明的一个参考序列具有例如95％的同一性时，优选地对参数进行调整从而在参考序列的整个长度上对同一性的百分比进行计算并且允许参考序列中同源性空位占核苷酸总数的高达5％。当使用Bestfit时，优选地将所谓的任选的参数保留在它们预设(“默认”)值。在一个给定的序列和上述本发明的序列之间的比较中出现的偏差可能是由例如添加、缺失、取代、插入或重组引起的。优选地还可以使用程序“fasta20u66”(版本2.0u66，1998年9月，由WilliamR.Pearson和弗吉尼亚大学编写；还参见W.R.Pearson(1990),Methods in Enzymology[酶学方法]183,63-98所附的实例以及http://workbench.sdsc.edu/)进行这种序列比较。出于这个目的，可以使用“默认”参数设定。
两个核酸序列基本上相同的另一个指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语：“特异性杂交”是指分子在严格条件下仅与特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在该序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“基本上结合”是指在探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低杂交介质的严格度来调适，以实现靶核酸序列的所希望的检测。
在核酸杂交实验(如DNA杂交和RNA杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”Elsevier[爱思唯尔集团],纽约。通常，对于在限定的离子强度和pH值下的具体序列，高严格杂交和洗涤条件被选择为比热熔点低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与其靶子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
热熔点是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH值下)。非常严格条件被选择为等于特定探针的熔融温度(T.sub.m)。针对互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实例是具有1mg肝素的50％甲酰胺、在42℃下、将该杂交过夜进行。高严格洗涤条件的实例是0.15MNaCl，在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下，0.2x SSC洗涤，持续15分钟(关于SSC缓冲液的说明，参见Sambrook，下文)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对例如超过100个核苷酸的双链体进行中等严格洗涤的实例是在45℃下，1x SSC，持续15分钟。对例如超过100个核苷酸的双链体进行低严格洗涤的实例是在40℃下，4-6x SSC，持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，并且温度典型地是至少约30℃。通过加入去稳定剂例如甲酰胺也可以实现严格条件。通常，在具体的杂交测定中，信噪比是针对非相关的探针所观测到的2倍(或更高)指示检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性而生成核酸拷贝时，发生这种情况。
植物、种子、果实
在第一个实施例中，本发明提供了包含SmD1等位基因的植物，该等位基因编码与SEQ ID NO:1具有至少90％或91％，优选地92％、93％或94％，更优选地95％、96％或97％，甚至更优选地98％或99％的氨基酸序列同一性的SmD1蛋白，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，该错义突变产生赋予了改善的线虫抗性的经修饰的SmD1蛋白。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1至108的任一位置处的错义突变。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处的错义突变。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处的苏氨酸取代为异亮氨酸。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述SmD1等位基因是SmD1b等位基因。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中编码经修饰的SmD1蛋白的所述SmD1等位基因是人工生成的。在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物不是唯一通过必须生物过程获得。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述SmD1等位基因与SEQ ID NO:20具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核酸序列同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物选自包含西红柿、烟草、胡椒、小南瓜、西瓜、甜瓜、黄瓜以及大豆的列表。
在另一个实施例中，本发明提供根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是近交、双单倍体或杂种植物。
在另一个实施例中，根据本发明的植物是雄性不育的。在另一个实施例中，根据本发明的植物是细胞质雄性不育的。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是砧木。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物包含两个拷贝的所述SmD1等位基因。
在另一个实施例中，所述经修饰的SmD1蛋白赋予中间体抗性赋予对根结线虫属、异皮线虫属以及孢囊线虫属线虫，优选地根结线虫属，更优选地南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫以及爪哇根结线虫的中间体抗性。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是番茄。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述经修饰的SmD1蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述SmD1b等位基因包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的核酸序列。在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述SmD1b等于基因由SEQ ID NO:19或SEQID NO:21的核酸序列组成。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中所述SmD1b等位基因可获得自2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB的番茄系19TEP250122。
在另一个实施例中，本发明提供了如前述实施例中任一项所述的植物，其中在线虫侵染的情况下，当与缺乏所述SmD1等位基因的相同栽培植物相比时，具有卵块的雌性数量减少25％，优选地减少50％。
另一个实施例提供了可从如前述实施例中任一项所述的栽培西红柿植物(优选的栽培西红柿植物，更优选的栽培番茄植物)获得的植物部分、器官或组织，包括但不限于叶、茎、根、花或花部分、果实、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、细胞或组织培养物、或仍展现出如本发明所述的改善的线虫抗性性状的植物(特别是当生长为产生果实的植物)的任何其他部分或产品。
在另一个实施例中，本发明提供由如前述实施例中任一项所述的植物产生的果实。在另一个实施例中，本发明提供由如前述实施例中任一项所述的西红柿植物产生的西红柿果实。
在另一个实施例中，本发明提供了产生如前述实施例中任一项所述的植物的种子。在另一个实施例中，本发明提供产生如前述实施例中任一项所述的西红柿植物的西红柿种子。
等位基因、标记
本发明还涉及植物中突变SmD1等位基因，优选的与线虫抗性性状相关的突变SmD1b等位基因。在另一个实施例中，本发明涉及编码SEQ ID NO:1的SmD1蛋白的突变SmD1等位基因，该等位基因的野生型版本为SEQ ID NO:20，或编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白的野生型SmD1等位基因，其中所述突变SmD1等位基因编码具有产生改善的线虫抗性表型的错义突变的经修饰的SmD1蛋白。在另一个实施例中，SEQ IDNO:21是突变SmD1等位基因，该等位基因编码SEQ ID NO:2的经修饰的SmD1蛋白。在另一个实施例中，本发明的西红柿SmD1等位基因位于染色体9上。在本发明的另一个实施例中，如本发明所述的一种西红柿SmD1b等位基因可获得自、获得自或衍生自具有番茄系19TEP250122(该番茄系于2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB)或其子代或祖先，并且包含本发明的所述SmD1b等位基因的供体植物。
在另一个实施例中，本发明涉及编码SEQ ID NO:1或2的分离的核酸序列。在另一个实施例中，所述分离的核酸序列是SEQ ID NO:18、19、20或21。
本发明披露了用于检测栽培西红柿植物，特别是栽培番茄植物中线虫抗性性状等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含表示为SEQ ID NO:22的正向引物和SEQ ID NO:23的反向引物的一对PCR寡核苷酸引物。该试剂盒允许检测本发明的SmD1b等位基因，其中对所得扩增子进行测序，并且检测本发明的T14I(ACT-->ATT密码子)突变。在该背景下，T14I突变可以用作SNP标记。
本发明还披露了如本发明所述的这些SNP标记用于在栽培植物(特别是番茄植物，更特别是栽培蕃茄植物)中进行线虫抗性性状等位基因的诊断性选择和/或基因分型的用途。
本发明还披露了如本发明所述的SNP标记用于在植物(特别是栽培西红柿植物，更特别是如本发明所述的蕃茄植物)中鉴定的线虫抗性性状等位基因存在和/或用于在栽培植物(特别是栽培西红柿植物，更特别的是如本发明所述的且如本文所述的蕃茄植物)中监测的线虫抗性性状等位基因渗入的用途。
本发明还披露了可在PCR反应中获得的多核苷酸(扩增产物)，该PCR反应涉及一种寡核苷酸引物或SEQ ID NO 22和SEQ ID NO23的PCR寡核苷酸引物对，该寡核苷酸引物在统计学上相关，并且因此与线虫抗性性状或与所披露的标记之一共分离，该扩增产物对应于可从番茄系19TEP250122(该系于2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB)或其子代或祖先(包含本发明的SmD1b等位基因)在利用相同引物或引物对的PCR反应中获得的扩增产物，条件是相应的等位基因仍然存在于所述植物中和/或可以被认为是其等位基因。
本文还考虑了与所述扩增产物的序列具有至少60％、特别是至少65％、特别是至少70％、特别是至少75％、特别是至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、特别是至少95％的序列同一性的多核苷酸，和/或展现出与可在上述PCR反应中获得的所述扩增产物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
然后，如本发明所述和上文所述的扩增产物可用于产生或开发可用于鉴定线虫抗性性状等位基因的新引物和/或探针。
因此，在一个实施例中，本发明还涉及衍生的标记，特别是衍生的引物或探针，这些标记由如本发明所述的且如上文所述的扩增产物通过本领域已知的方法开发，这些衍生的标记与改善的线虫抗性性状等位基因遗传连锁。
本发明还涉及鉴定栽培西红柿植物，优选地栽培番茄植物的方法，该栽培西红柿植物表现出改善的线虫耐受，并且具有至少一个拷贝的SmD1等位基因，该等位基因编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白，其中所述SmD1蛋白包含产生经修饰的SmD1蛋白的错义突变，该方法包括以下步骤：
a)获得突变植物群体；
b)筛选所述群体中所述SmD1等位基因的存在。
育种方法
在另一个实施例中，本发明涉及提供栽培植物(优选的栽培西红柿植物，更优选的栽培植物番茄)、植物部分或种子的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)用如前述实施例中任一项所述的第1植物与缺乏本发明的SmD1等位基因的第2植物杂交，
b)获得子代植物，以及
c)任选地选择所述子代植物，其特征在于所述植物表现出改善的线虫抗性。
在另一个实施例中，本发明提供了用于产生栽培植物，优选的栽培西红柿植物，更优选栽培番茄植物的方法，该栽培植物表现出改善的线虫抗性，该方法包括以下步骤：
a)用如前述实施例中任一项所述的第1植物(包含至少一个拷贝的本发明的SmD1等位基因)与缺乏所述SmD1等位基因的第2栽培植物杂交；
b)选择表现出改善的线虫抗性的子代植物；
其中，通过用SEQ ID NO 22和23引物对检测本发明的SmD1等位基因的存在进行步骤b)的选择，随后对所得扩增子进行测序。
在另一个实施例中，本发明涉及如前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤a)的第一植物为番茄系19TEP250122，该系于2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB。
在另一个实施例中，本发明涉及提供栽培植物，优选的栽培西红柿植物，更优选的栽培番茄植物方法，该栽培西红柿植物产生展现出改善的线虫抗性，该方法包括以下步骤：
a)用如前述实施例中任一项所述的第1植物与缺乏本发明的SmD1等位基因的第2植物杂交，
b)获得子代栽培植物，以及
c)任选地选择所述子代植物，其特征在于所述植物在线虫侵染的情况下，当与缺乏所述SmD1等位基因的相同栽培植物相比时，具有卵块的雌性数量减少25％，优选地减少50％。
在另一个实施例中，考虑了如前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤a)的第一西红柿植物为番茄系19TEP250122(该系于2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB)或其子代或祖先。
在另一个实施例中被认为是用于产生栽培植物，优选的栽培西红柿植物，更优选栽培番茄植物的方法，该栽培植物表现出改善的线虫抗性，该方法包括以下步骤：
a)提供如前述实施例中任一项所述的植物的种子，
b)使所述种子发芽并从中生长成熟可育的植物，
c)诱导a)下所述植物的自花授粉，生长果实并从中收获可育种子，以及
d)从c)下收获的种子生长植物，并且选择改善的线虫抗性的植物。
本发明的另一个实施例提供用于通过向植物引入核苷酸序列，来提供表现出改善的线虫抗性植物的方法，该核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，该错义突变产生赋予了改善的线虫抗性的经修饰的SmD1蛋白。本发明的另一个实施例提供方法，该方法用于通过向西红柿植物中引入编码SEQ ID NO:2的SmD1蛋白的核苷酸序列，来提供表现出改善的线虫抗性的西红柿植物。本发明的另一个实施例提供方法，该方法用于通过向西红柿植物中引入SEQ ID NO:19或21的核苷酸序列，来提供表现出改善的线虫抗性的西红柿植物。
在另一个实施例中，本发明提供了改善植物线虫抗性的方法，该方法包括以下步骤：
a)获得突变植物群体；
b)选择突变植物，该突变植物包含编码SmD1蛋白的经修饰的SmD1b等位基因，该蛋白在其氨基酸序列中含有错义突变。
经修饰的SmD1等位基因还可以通过诱变引入，例如通过化学诱变，例如通过EMS诱变。可替代地或随后，经修饰的SmD1等位基因还可以通过使用定向诱导基因组局部突变技术(tilling)来鉴定和/或引入。
经修饰的SmD1等位基因还可以通过靶向诱变引入，例如通过同源重组、锌指核酸酶、基于寡核苷酸的突变诱导、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)系统或编辑基因组的任何替代技术。
可替代地，经修饰的SmD1b等位基因还可以通过转基因或顺式基因(cis-genic)方法经由可以包含在载体中的核苷酸构建体引入。
用途
在另一个实施例中，本发明涉及如前述实施例中任一项所述的栽培植物(优选地西红柿植物，更优选地栽培番茄植物)、植物部分或种子用于生长植物并且产生以及收获农作物和/或果实的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及如前述实施例中任一项所述的栽培植物(优选地西红柿植物，更优选地栽培番茄植物)用于产生用于新鲜市场或用于食品加工的果实的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及如前述实施例中任一项所述的栽培西红柿植物(优选地栽培番茄植物)、植物部分或种子的用途，其中该栽培西红柿植物(优选地栽培番茄植物)、植物部分或种子为番茄系19TEP250122(该系于2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB)或其子代或祖先。
在另一个实施例中，本发明涉及如前述实施例中任一项所述的栽培植物(优选地栽培西红柿植物，更优选地栽培番茄植物)、植物部分或种子用于播种田地、温室或塑料大棚的用途。在另一个实施例中，本发明涉及如前述实施例中任一项所述的栽培植物(优选地栽培西红柿植物，更优选地栽培番茄植物)、植物部分或种子用作砧木植物的用途。
本发明还涉及可从如前述实施例中任一项所述的植物获得的线虫抗性-繁殖材料用于生长植物的用途，其中所述线虫抗性可在标准测定，特别是如下面实例4中所述的测定中评估。
在另一个实施例中，本发明涉及本发明的SmD1等位基因向缺乏所述等位基因的植物赋予改善的线虫抗性性状的用途。
本发明还涉及入前述实施例中任一项所述的植物将线虫抗性性状渗入缺乏所述性状的植物中的用途。
基于本发明的描述，拥有如本文所述的番茄系19TEP250122(该系于2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB)或其子代或祖先(包含一个拷贝的本发明的SmD1等位基因)的技术人员，使用本领域熟知的育种技术能毫无困难地将本发明的所述等位基因转移到其他各种类型的西红柿植物中。可替代地，基于本发明的描述，包括披露了SmD1等位基因，这些等位基因具有产生与线虫耐受表型相关的经修饰的SmD1蛋白的错义突变，技术人员使用本领域熟知的技术能毫无困难地复制本发明。
种子保藏详情
申请人已经于2019年11月29日将番茄系19TEP250122的2500粒种子以NCIMB登录号为43529保藏在NCIMB(国家工业、食品和和海洋微生物保藏中心)中。保藏的种子获得自分离本发明的SmD1等位基因的群体。因此，50％的保藏种子对于突变等位基因是纯合的，25％的保藏种子对于突变等位基因是杂合的，并且25％的保藏种子对于野生型SmD1等位基因是纯合的。
申请人要求根据EPC第32(1)条或其他国家或条约的相应法律和规则(专家证人条款)仅向专家发布保藏的材料，直到专利授权的提及公布为止，或者如果申请被驳回、撤回或者视为撤回的，自申请日起20年。
实例
实例1：鉴定作为线虫效应子靶标的植物蛋白SmD1
在酵母双杂交实验中观察到，使用南方根结线虫效应子MiEFF18(Minc18636；Nguyen等人2018)作为诱饵，西红柿植物蛋白SmD1是线虫效应子的潜在靶标。这种相互作用首先在西红柿中得到证明，其中两种西红柿SmD1基因(Sl06g084310.2.1和Sl09g064660.2.1)的SmD1蛋白100％相同(SEQ ID NO:1和3)。然后，将在拟南芥中验证拟南芥属基因AT4G02840的SmD1b蛋白(SEQ ID NO:4)的相互作用。捕获的SmD1蛋白及其对应基因在表1中示出。
表1：分别编码保守SmD1蛋白和SmD1b蛋白的西红柿和拟南芥属的各自直系同源基因标识。
在酵母双杂交实验中，与线虫效应子相互作用的SmD1蛋白的部分显示为前108个氨基酸。图1披露了SmD1氨基酸序列的比对，突出了植物种类之间的高度保守性。
实例2A：拟南芥smd1突变对线虫易感性的影响
为了验证SmD1基因对线虫易感性的作用，检索拟南芥smd1a(AT3G07590)和smd1b(AT4G02840)突变植物(在Columbia背景下)(Elvira-Matelot等人,2016)，并且评估当暴露于南方根结线虫时，它们的易感性水平。
发现与野生型Columbia植物或smd1a突变相比，拟南芥smd1b突变体对南方根结线虫的易感性显著降低(图2A)，表明AtSmD1b主要参与线虫易感机制。
实例2B：本氏烟SmD1沉默对线虫易感性的影响
为了确认SmD1基因对线虫易感性的重要作用，产生了对其SmD1基因沉默的本氏烟植物，并且评估当暴露于南方根结线虫时，它们的易感性水平。
再次发现，当与对照烟草植物相比，对其SmD1基因沉默的本氏烟植物对南方根结线虫的易感性显著降低(图2B)，表明NbSmD1基因类似地参与线虫易感机制。
实例2C：西红柿SmD1沉默对线虫易感性的影响
最后，还在西红柿中确认了SmD1基因对线虫易感性的重要作用。在圣皮埃尔(Saint-Pierre)背景中产生了对其SmD1基因沉默的西红柿植物，并且评估了当暴露于南方根结线虫时，它们的易感性水平。再次发现，当与对照西红柿植物相比，对其SmD1基因沉默的西红柿植物对南方根结线虫的易感性显著降低(图2C)，表明SlSmD1基因类似地参与线虫易感机制。
然而，对其SlSmD1基因沉默的西红柿植物也表现出商业上不利的表型，根系显著减少(图2D)，普遍矮化，并且最终果实产量较低。因此，用在其SmD1基因中的无义突变或KO型突变修饰的植物，尽管对线虫更具抗性，但由于在植物中缺乏SmD1蛋白的起作用版本，很可能表现出不想要的特征。
实例3：鉴定商业相关的西红柿SmD1b突变体
为了获得表现出增加的线虫抗性同时保持作物经济价值的西红柿植物，使用EMS在M82背景下产生这些突变体，并且以定向诱导基因组局部突变方法筛选，以鉴定具有产生SmD1蛋白错义突变的经修饰的SmD1基因的西红柿植物。将一种在其SmD1b基因中具有错义突变的所得定向诱导基因组局部突变西红柿系(系编号123，18TEP250123，突变纯合子，保藏系19TEP250122的祖先植物，具有位于SEQ ID NO:1的位置14处的错义突变)用南方根结线虫接种，并且在感染后六周确定形成卵块的雌性和根重量，并且与对照M82系编号117(18TEP250117，+/+，WT)相比。
根的形态和重量分析显示出编号123突变系的根系的净增加(图3(A))。在相同时间下，编号123突变系显示出，形成卵块的雌性的数量显著降低(曼-惠特尼检验，α＝2.5％)50％(图3(B))。
为验证SmD1b(Solyc09g064660)中突变的纯合性，使用引物SlSmD1b-M82-F(ATTTTGAACAACCCCTGGCG(SEQ ID NO:22))和SlSmD1b-M82-R(ACTCTACGACCTCACCACTT(SEQID NO:23))对每种系的6株植物进行基因分型。420bp扩增子的测序结果显示，所有编号117植物都具有野生型SmD1b等位基因，而所有编号123植物都具有导致错义突变(T14I)的纯合的SmD1b突变等位基因(ACT-->ATT密码子)。
表2：基因组、编码序列和蛋白质序列中突变的位置。
总之，显示出SmD1b错义突变(T14I)导致对南方根结线虫的抗性增加，同时保持了植物中SmD1蛋白的功能。鉴于SmD1蛋白在植物种类中的高度保守结构，预期直系同源SmD1b基因中的类似错义突变将提供与编号123突变西红柿品系中观察到的类似作用。
实例4：评估西红柿植物中线虫耐受性的方案
南方根结线虫(Calissane菌株)在温室西红柿植物(圣皮埃尔番茄(Solanumlycopersicum cv St Pierre))中繁殖。如先前所述，收集了新孵化的第二阶段幼体(J2)(Caillaud和Favery,2016)。将无菌西红柿种子(cv M82)播种在混有沙子的土壤中(1:1)；在4℃下48小时后，在24℃下将样品转移至具有16h光周期的生长室中。将7天龄植株分别转移至土壤/沙中的小盆中。用每株植物150个南方根结线虫J2接种一月龄西红柿幼苗。感染后6周收集根，并且用0.5％伊红染色。在感染后6周，确定形成卵块的雌性和根重量。
文献目录
·Caillaud and Favery,2016,In vivo imaging of microtubuleorganization in dividing giant cell.In Plant Cell Division:Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology,Marie-Cécile Caillaud(ed.),SpringerScience+Business Media New York,vol.1370,DOI10.1007/978-1-4939-3142-2_11.
·Elvira-Matelot et al.,2016,The nuclear ribonucleoprotein SmD1interplays with splicing,RNA quality control,and posttranscriptional genesilencing in Arabidopsis,The Plant Cell 28(2),DOI:10.1105/tpc.15.01045.
·Kiewnick et al.,2009,Effects of the Mi-1and the N root-knotnematode-resistance gene on infection and reproduction of Meloidogyneenterolobii on tomato and pepper cultivars,J.Nematol.41(2),pages 134-139.
·Mejias et al.,2019,Plant proteins and processes targeted byparasitic nematode effectors,Front.Plant Sci.July 2019 10:970,doi:10.3389/fpls.2019.00970,eCollection 2019.
·Nguyen et al.,2018,A root-knot nematode small glycine and cysteine-rich secreted effector,MiSGCR1,is involved in plant parasitism.New Phytol.,217:687-699.Doi:10.1111/nph.14837.
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·Singh et al.,2013,Plant-parasitic nematodes of potentialphytosanitary importance,their main hosts and reported yield losses,EPPOBulletin 43(2),pages 334-374.
PCT
序列表
<110> SYNGENTA CROP PROTECTION AG
INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE POUR L'AGRICULTURE,
L'ALIMENTATION et L'ENVIRONNEMENT
UNIVERSITE COTE D'AZUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
QUENTIN, Michael
FAVERY, Bruno
BONNET, Gregori
MEJIAS, Joffrey
TRUONG, Nhat-My
ABAD, Pierre
<120> 具有改善的线虫抗性的植物
<130> 81967-EP-REG-ORG-E-1
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 1
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20 25 30
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35 40 45
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Gly Arg
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<212> PRT
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 2
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20 25 30
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65 70 75 80
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Pro Met Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg
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Gly Arg
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<212> PRT
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 3
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<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 4
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<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
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Gly Arg
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<212> PRT
<213> 本氏烟（Nicotiana benthamiana）
<400> 6
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<213> 本氏烟（Nicotiana benthamiana）
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<213> 本氏烟（Nicotiana benthamiana）
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<211> 116
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 9
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<212> PRT
<213> 辣椒（Capsicum annuum）
<400> 10
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Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg
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<211> 114
<212> PRT
<213> 辣椒（Capsicum annuum）
<400> 11
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Gly Arg
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<212> PRT
<213> 中国南瓜（Cucurbita moschata）
<400> 12
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Ile Glu Leu Lys Asn Gly Thr Val Val His Gly Thr Ile Thr Gly Val
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<212> PRT
<213> 甜瓜（Cucumis melo）
<400> 13
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<213> 黄瓜（Cucumis sativus）
<400> 14
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<213> 西瓜（Citrullus lanatus）
<400> 15
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<212> PRT
<213> 多毛番茄（Solanum habrochaites）
<400> 16
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Gly Arg
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 野生种潘那利番茄（Solanum pennellii）
<400> 17
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Ile Glu Leu Lys Asn Gly Thr Val Val His Gly Thr Ile Thr Gly Val
20 25 30
Asp Val Ser Met Asn Thr His Leu Lys Ala Val Lys Ile Thr Leu Lys
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Gly Lys Asn Pro Val Thr Leu Asp His Leu Ser Val Arg Gly Asn Asn
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Gly Arg
<210> 18
<211> 345
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 18
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aacggcaccg ttgttcatgg aaccattaca ggtgtggatg ttagcatgaa cacacatctg 120
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ggtcgtgggc gcggtcgtgg gcgtggacgt ggtcgaggcc gctaa 345
<210> 19
<211> 345
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 19
atgaagctcg tcagattttt gatgaagctg aacaacgaga ttgtctcaat tgagctcaaa 60
aacggcaccg ttgttcatgg aaccattaca ggtgtggatg ttagcatgaa cacacatctg 120
aaggctgtca aaattacgct aaaaggaaag aatccagtga cattggatca cctgagtgtg 180
aggggtaaca acatccgtta ttacatcctc cctgacagct taaatcttga gacgttactg 240
gtggaagaaa cacctagggt gaagccaaag aagccaacag ctggaaagcc tatgggacgt 300
ggtcgtgggc gcggtcgtgg gcgtggacgt ggtcgaggcc gctaa 345
<210> 20
<211> 4172
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 20
tcttatattc ttagcattaa atagtgtgag acgacggccc acgtttagtc caatggacgt 60
tcccagacga ggcatataat aagacatcac ttgtgtattt tgaacaaccc ctggcgctcc 120
ttgccctaaa ctaaagccct agattagtgt gttttcaatt tcttcagcaa gcaacaatga 180
agctcgtcag gttcatgcga tatcttcatt tttttgagtt tcttttccag tgagcttagc 240
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aaatattaaa ttttatctgt ataaaatttt gattacctag ttgttgctat acgggtaact 2400
tataacactt gttagttgat tatatgagca taaaccatgt tgcctccact tgtttgtgga 2460
ttttcattgt ctatgtgagg cgtgagtaag ttcttatttc ccagctcgag cttaacttcc 2520
aggtacttag gtcagaaagc gtacgacacg tctagttcta taggctggtt gcatttgata 2580
tttgagcatg tagaactagc gcaaagagtg agaagtaagt ggctatatga tgttgtgtac 2640
tctgactttt gctgtgcaat gttaactaat cttaaattca actagatgag gagctaaagc 2700
tgtgtcgaac tactgttatt cactatgcat gaatacttga gcttatgcta gcgtgcgatc 2760
aacttatagc ttattatgtt gtacccaagt tttatgaaaa cagcacctag tgttgcgttt 2820
ataattctta tctgttgttg taatcttgtt gtgaatgtta tctgtattca ttgtactata 2880
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cccttcagga aagcctatgg gacgtggtcg tgggcgcggt cgtgggcgtg gacgtggtcg 3900
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gctaacatta atttcgtttc ccgttcaatt tagtcacctt atgcatgttt tgagagttga 4140
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<210> 21
<211> 4172
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 21
tcttatattc ttagcattaa atagtgtgag acgacggccc acgtttagtc caatggacgt 60
tcccagacga ggcatataat aagacatcac ttgtgtattt tgaacaaccc ctggcgctcc 120
ttgccctaaa ctaaagccct agattagtgt gttttcaatt tcttcagcaa gcaacaatga 180
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ctttctttct ttcttagcta taatcatcaa tgtaatttct taagccaata tgtgaattat 420
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gctggaatca tttggtccaa gagctctctt attttctatg caaaaccatg ttgtctttat 2280
ccctttgttt ccaaagatga gcattagttg ctcatctcgg caaatgtaac actaattgac 2340
aaatattaaa ttttatctgt ataaaatttt gattacctag ttgttgctat acgggtaact 2400
tataacactt gttagttgat tatatgagca taaaccatgt tgcctccact tgtttgtgga 2460
ttttcattgt ctatgtgagg cgtgagtaag ttcttatttc ccagctcgag cttaacttcc 2520
aggtacttag gtcagaaagc gtacgacacg tctagttcta taggctggtt gcatttgata 2580
tttgagcatg tagaactagc gcaaagagtg agaagtaagt ggctatatga tgttgtgtac 2640
tctgactttt gctgtgcaat gttaactaat cttaaattca actagatgag gagctaaagc 2700
tgtgtcgaac tactgttatt cactatgcat gaatacttga gcttatgcta gcgtgcgatc 2760
aacttatagc ttattatgtt gtacccaagt tttatgaaaa cagcacctag tgttgcgttt 2820
ataattctta tctgttgttg taatcttgtt gtgaatgtta tctgtattca ttgtactata 2880
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catagcattt tcctttctct gttggttgtc ctttccatgc ttttgacttt tattccttga 3360
ggggttgctt atacttacag aaaattgcta gatataatag ggatatagaa atttgtattc 3420
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tattgaagtt gctaaattga gagctgtgag ttaaagtttc taaaggcagt tacattttta 3540
caggtgtgga tgttagcatg aacacacatc tgaaggctgt caaaattacg ctaaaaggaa 3600
agaatccagt gacattggat cacctgagtg tgaggggtaa caacatccgt tattacatcc 3660
tccctgacag cttaaatctt gagacgttac tggtggaaga aacacctagg gtgaagccaa 3720
agaagccaac agctggtatt gttaaggact acgttcagat gtttttgtgc attgtcggtg 3780
tatggtaaaa tttccttatt acttggacat ccttctaata cgctcttgct ttgattgttc 3840
cccttcagga aagcctatgg gacgtggtcg tgggcgcggt cgtgggcgtg gacgtggtcg 3900
aggccgctaa atgcattccg gctggtctat ttttttgcag tcttgcctat gtaaacatgt 3960
gtacggattg atagatttgc tgttagtttt tatcctgtag aaaaaagatg gatctcatgc 4020
aacaatttat tttggatctt tgaagtcagg agcatgttat ctcgttgcat catattgtct 4080
gctaacatta atttcgtttc ccgttcaatt tagtcacctt atgcatgttt tgagagttga 4140
gtcacattta gtgtcgattg agaatttagc tc 4172
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
attttgaaca acccctggcg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
actctacgac ctcaccactt 20
<210> 24
<211> 2935
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum）
<400> 24
tccaatggat gaggcagccc atgtgctaat acgacgtcgt tatagtgttt tttgaataac 60
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aatttgaatt ttaagttggg agttgatgct ttaaagtaat atagatagat atagacaact 1860
actttatcat ctgcaagaaa atcatacagt agcttctttg tctggcagta gagatgcctt 1920
agcaaactta gataggcttc ttatggcaag ttgcatcgaa aatatcaaat tttgcaagga 1980
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ggtagatata ttcgggatat agaaatatgt atttgagcat atcagtatgt gttttgatat 2220
taactaggca cagcggctat taaatctgtc tccttattga agttgctaga ttgagagctg 2280
tgagttatag cttctaaagg cagttacatt tttacaggtg tggatgttag catgaacaca 2340
catctgaagg ctgtcaaaat tacgctaaaa gggaagaatc cagtgacgct ggatcacctg 2400
agtgtgaggg gtaacaacat ccgttattac atcctccctg acagcttaaa tcttgagaca 2460
ctgctggtgg aagaaacacc tagggtgaag ccaaagaagc caacagctgg tattgtcata 2520
ttgttaagga ctatgttggg atttttttgt gccttgtggg tgtatggcta aatttcctta 2580
ttgcttggac atccttctta tatactcttc ctttgattgt tcctcttcag gaaagcctat 2640
gggacgtggt cgtgggcgcg gtcgtgggcg tggacgtggt cgaggccgct aaatgcattc 2700
cagctgctct taatttttgc agtgttgcct atgtaaacat gtgtacggat ggagagattt 2760
gctcttagtt tttcccagta gaaaaaagat ggatctcatg cacaatttat tttggatctt 2820
tgaagtcagg agcatgttat ctcgttgcat catattgtct gctaacgtta cttttgtatc 2880
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<210> 25
<211> 1860
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 25
attgctgctt ttcctcctcc cgctcttgct tcttgccatt gctgtttcga gctctcctca 60
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atagacctag aaatgcattg tgggtgttga atctctcttg tttgcaataa gtgaatgata 720
atggtggtct agtcagatgg agatgataca ttttattttg ctttatagtt gggtgtatga 780
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gatgcagatg attagattta gcacatgaaa gtcactctta tctctttcct tgtaaagaaa 1080
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ctgattgatc taatacaagt ggtctctgct gttaatgttt ggtttggttt cctttttctg 1200
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ctctgaaagg gaagaatcca gttacattag accacttaag tgtcagggga aacaacattc 1380
gctattatat tcttccggac agtttgaatc tggagacttt gctggttgaa gacactccaa 1440
gaatcaaacc caaaaagcca actgcaggta acaaaacatt tcttttttct gaactatgcc 1500
tttgtttttg tttttgtttt tgcttagact catctttcta ttgttctctt tggtatcagg 1560
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gtaaaagatc tatcttgtag tgagatttgg tgtcactaag acaaattctt gttatctctt 1740
taagttttca tgaatttgag atttgaaacg ttattgccaa acatacatca ctcaatatgt 1800
tttattattg acttgatcac tttattacat agtctgataa aacgtgggga gttcgagaaa 1860
<210> 26
<211> 1082
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 26
acacctttcg ctgtttcctc gtcaatttct ttgtttggtt gttctttctt cgcatccaaa 60
gatgaagctc gtcaggtact gtttcgttct cagttcttct tttctttaga aaattcatgt 120
tgttcttaat cttagttagc tcctggcatg gaatccattc ccaatattga gcctgagctg 180
atttgtgtta tatggttttg attggatcga gtaggttttt gatgaagtta aacaatgaaa 240
ctgtgtctat cgagctgaag aatgggactg tggtccatgg aaccatcact ggtaagttct 300
tattgttagc ttccggtttc tttgtagctc ttctcatctt ttcttctctc tcgatttctc 360
cgttgctagg tcttatacaa gtcgcgatct gttcccttat tttcaattgg ccctaatcgc 420
gtccttgtga tcacatgaat aggttgagta aacacacagt tagagccagt agtcataaag 480
gtatatttat tgaagtttaa gcttgatgat ttgggcaggt gttgatgtga gcatgaacac 540
tcacttgaag acagtgaaga tgagcctgaa ggggaaaaac ccagtaacac ttgatcatct 600
tagcttgagg ggtaataata ttcgctacta cattcttcct gatagcttga acctcgagac 660
tttacttgtg gaagacactc ctagagttaa acctaagaag cctgttgctg gtactgcttc 720
attcattttt ggtgtttgta atattcgtct tcataagcta aaagacttct ttatcagtcc 780
atttattcgt tctctctttc tttcttcttt agggaaagct gttggacgcg gtcgcggacg 840
tggccgtggg cgtggtcgcg gcagaggtcg ttagatgtag cagcgctctg gaacatgttg 900
aaggtttgtg agtttaattt ttaggagaat gtacgagtta tgtaactagc aactctggca 960
aaggaaagat ttgattgaga aatagtatga ttgatgctct agtaaggagt tactttgtaa 1020
tggaattcca tggataacaa gatttggctt tacatgttat aagagcatct acaagtagag 1080
aa 1082
<210> 27
<211> 2315
<212> DNA
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 27
agaagaagta aagatagaca atagattgaa aagtggaaat tcaaaattca aaatcacaaa 60
attgtccctt aaacccttac aaaagaaccg cttcttcttc tgttcatctc tcccactctc 120
acttttaatt ttttgcccta aaaccctcgc taccgccgtg gtggccgccg aaggtaagtt 180
ttcatcttct ctgatctgca tcgttgctat tgccttctaa atttctgcat tattatttta 240
atttgtgcaa aagaaaatgt tcacaccctt gtttttgttt tctctgtatt gcttcacaga 300
aggagagtag agagcgcaat cgagtcttca tcttcgactc accatgaagc tcgtcaggtt 360
tttctctttc tttgttgcgt tatctgttaa ttgcgttttt attttttttt cattttctga 420
gatcaaagtc taataatata cgaacactgt atgagtaggt ttttaatgaa gttgaacaat 480
gaaaccgtgt caattgagct caagaatggc actattgttc atggcaccat tacaggtttc 540
ttttctttct ctaatttttt cccccagtgt tgtacaagtg tagaaccatt tacaagcaac 600
atattagagt tgaattcagt gtagtttcga gcttgattgt gaggcattta attatttgca 660
agggttctct ctactcttca ggtgattact gattagaata gattatactt cagtaccttc 720
aactttttag gcattttctt ggtctggtat gggtaaacat atataaaaga ccatctcatt 780
gggtcgcggg tttctattag catgaaagtg gagagggatt ggggatttgg cttccaaaat 840
taattttctt tggcagctga ataactacaa aggtttcctt tactgagtag ttcattctgg 900
gggtaatttg gagtataatt agactgtgct gctgtgtagg atgataattt tgagatactg 960
caatttctta tagttcttat aatggtatga gacaagctaa ctcagtgggc tttggatgat 1020
ggtttattct tgtattaagt ttttggcaga taatttgtgg ggaaatgatc ctttcctgga 1080
agatctcagg acctcaatca cctgtctact aagcttctca ctcaacaaat ttctcttctc 1140
atggctcagt attttcttga aatttcaact tttagaggaa cttgcatgat agtgaaacta 1200
ctgaactaga cttcctgacc atcttacact cttacaattt acagttttac ttgattctag 1260
taatatcttc cctagttcaa atagatcaat ttggattccc ccccacccac acccactcta 1320
agatgtaact ttaccattgt ttgattgaaa ttattgcaat caatctcttc cgtgaaattt 1380
cctattggac acccatctga gttgagtttg atccagccac gtgggtgtgt agataataaa 1440
tctttgattt agtcagtcct tttactatct tgcttctttc tagttgaact acaccagcaa 1500
ctttaagaga ggaagtctta gcttactgat tctgggactt ttgccacagg tgttgatatc 1560
agtatgaaca cacatttgaa aacagttaaa ctaactctga aagggaaaaa tccagtcact 1620
ctagatcatc tcagtgtgag gggtaacaac atccgttact atattcttcc tgacagcttg 1680
aatcttgaga ccttgctggt ggaagagaca cccaagatca aacccaagaa gccaactgct 1740
ggtactgttt atagtttgac tacaaaattt tcatccatac tcaattcact ctaattgttt 1800
cttggtgagt tccccaggtt ttaattttag catattttca ttacatttcc aggcaaacct 1860
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<212> DNA
<213> 辣椒（Capsicum annuum）
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taatgagaaa ggggtgccta tggagtgtca agacaccatg tgcaatctct aaattaccct 3120
taaagaaggg ccagccttgg tgtgtaaatt agggggctgc cttggagtgt gtaaagctct 3180
tcaaaacact tcttcacttg tgctctcagg tagtcattaa ggcaagcctc caagcaaccc 3240
tccacacacg gaattgctct cttgaatgtt caaaacgggt cctccatgca tgctcttgtg 3300
tcctcgaggt gatcaaagct tgagttttta agtgttggcc tccaaggatg tcatcaaaag 3360
ctatgttggc cgtttggatc gtatcatctt catcccactt caatcattct tcgactctgg 3420
agctcctttc aaattccatt aggaattcat tcgcaagtgc agagctattc tgcttgtcat 3480
ccctgtaatt tatgtctata gcattgtaat tcctctctgt taatgtgtta attgcactct 3540
gtttcaatat aaataatatc tcttgttcac cttttgtggt tctacaagtt aaattgctac 3600
acaatccgaa gaaattgaag tgttctatat tcactatata taacaattca acaatttcct 3660
tcataagaaa ttttttgcca gtactatgga cgcttattgt aagctctcca actctgaaat 3720
aatacctttt caagaaacgg atgcagggag acatggtcag gaaactcgag tcttcaatga 3780
atctctacac atttatccca aactagttgg ggtcacctat aagagtatcc taatttgttg 3840
tgcttttttc agaccatttc attaattcac acttcatata ctgatataca aatctctaaa 3900
ttaaaaaaca aaaacataga aattgtggga gcgaacataa gattcttatt ggagtatctt 3960
tttagtcatt ttcttaatat ttttgataag tttaacctca atccacatat tatttgcttt 4020
aaaacttaaa actatgttag gtttgtgttg gaaaaaaaaa cttaagagga acggaagtag 4080
agaggaaaat taagagataa ttctttgcaa gtaagcagga ataggaagca aaagtggata 4140
ggttttgtat tcttatatct gaaatttttc agtgtatctg aaatttaact taaaaaggaa 4200
atgtttgtct tctgttccaa tcataccaaa caaccagaag tacaacgctt ctctccactt 4260
aagggaggta aatcagtgaa taacccgtac tctaatgaag gggaaagtaa atcagtaaat 4320
gaaaaatgct tcatttaagg gaggtgaatc cgtagaatct ctctcaactt gagattgata 4380
tagtattttc taatacttct aagttttcac gggtaactgt caccatattt tatacatcag 4440
tagaaaatat aaagattttt tgtacctctt atattcttat tattatcttt atgttgtata 4500
atattagcct gagatgaatt taaatggagt aacatgatca acgaggattc atatagccga 4560
gtcaaacttg tttggaactg aggtggtgtt tcttctgtgt cgttgtaaga ccttccccat 4620
aattttgtcg ataaaatggg ttgataatgt aatgctcttc agaagtttaa gttatcttgc 4680
acttggttcc agatcattat gccaccattg ttctcattcc ccacaagtga aaagttctat 4740
gctggaagca tttggtccaa gagctttctt aatttctatg caagacccta ctatcttcat 4800
ccacttgttt ccaagatgtg cattagttgc tcttatccca caaatatagc attaattggc 4860
aaaacctatg ttaaatggtc aatttctcta tataaaattc tgattacctt gtttttgcta 4920
tactgtaact tataatactt gtatagttga tcatataagc aagattcctt cacttgtttg 4980
tggattgtcc ttatctatgt gaggtgtgag caagctatta tttcccagct tgaggttaaa 5040
gttccaggta cttacggtca gaaagtcgac acatcaagtg tagttatata ggctggtcga 5100
tatgatattt gggcatgtag aactatccaa aagagtgaga agtaagtggc atatatgata 5160
tcgtgtactc cgacagtcac ttttgtcatg caatgttact gatcatagat tcaactggac 5220
aagaagctaa gttatgtcca actcctgtta ttcagtgagt atgtatgaat ggtcgagctt 5280
aagcgggcac aaaatcaact tgtagcttta catgttgtac cctggtttta tgacaacaac 5340
tcttaatgtt gtatttataa ttcttttctg ttgtctaatc ttgttgtcaa tgctatttat 5400
gtttatctta ctgtattttt tgtacaactg aggagtagcc tcttatccct tattttcttt 5460
ttggtgcacc cattaggtac ctttgtgcat tgaggattgg gtgtcattca tagaaaatca 5520
tatctttagg taggctttct acattttggt atacttctta tatacggtcg tgctttgtac 5580
cgaaacattt ttaaaattag taattacttt atcctccaaa aaaaacatct gtagcttctt 5640
tatctggcag tagagatgct acttggcaaa attaggtagg cttcttatgg aaagtgccag 5700
ggcttgtgct ggttgcagga tgcatctgaa atgtcattgg ccagaagggc agcaaagata 5760
agggaacacc ctttgctgct agctttctcc ctttttcttt tcaccgtcca aatccaaatt 5820
gtggatcctt atttgcatgg atgcttaatt gattgccatc tctacagaaa tttctttctg 5880
ttttagataa ctagactcca acaacaacat tcccaatgaa atttcactac aaaatatacc 5940
acatatagag acctacatgc ttccgacttt tatttcgtgt acggttgctt atgctaacag 6000
aaaattgcta gatatatttg ggatatataa atttgtgttc gagcatcagt atgtgttttg 6060
atattaacta ggcacaatgg ctattcaatc cgtctcctta ctgactttac taaattgaga 6120
gctgtgagtt aatgtttcta aagcgagtta tatttttaat atttataggt gtggatgtga 6180
gcatgaacac acacctgaag gctgtcaaaa ttacgctaaa ggggaagaat ccagtgacgt 6240
tggatcacct gagcgtgagg ggtaacaaca tccgttatta catcctccca gacagcttaa 6300
atcttgagac gctgctggtg gaagatacac ccagggtgaa gccaaagaag ccaacagctg 6360
gtatgttcag acgtttcttt ttctttttcc tttgtaattg ctaaaaaagt aatgttcaga 6420
agtattttta tgcctcctgg ctgtatggtt aaatttcctt gatgcttaga cgtatactaa 6480
tttcctcttt ctctgattct tctttctcag gaaagccttt gggacgtggt cgtgggcgcg 6540
gccgtggacg tggacgtggt cgaggccgct aa 6572
<210> 30
<211> 2367
<212> DNA
<213> 中国南瓜（Cucurbita moschata）
<400> 30
gtaatggttg tacctgtacg cgccagctgc agtattttct cataccaagc accccacttc 60
tttatttgtt tatttattat acgtaatttt ctttttcgtc cttttattct ttatattatc 120
atttatatcc acttattttc tccatttact tatcaggcgt accacatact tgaaattgta 180
caaatttccc ctcccgcctc ctttgtttgt ccgtgcttga aaccctacat tttgcaattc 240
ccccgccatc atgaagcttg ttaggtatgc tcttcttttt tcttactctg agcttctttt 300
ttctcgaact actcgttgtt tgatgtattt agtggtcgtt ttatgtttag aaacttggtt 360
ttgatgaatt cacaggtttt tgatgaagct caacaatgag acagtttcaa tcgagctgaa 420
aaatggaacc gttgtccatg gcaccatcac aggtttccat ttctctttca ctcactaact 480
cgcactgcat aaaaacttca ttaatcttgt taaaccctta aaccctagat ttacgaactt 540
actggcagag gttttttaaa ctttaacttc cattctgttt tcatctttgt acgccactat 600
attggaagtt gtagaatatc tcagtgcaaa gtgataattg gaatttggat tcttttgtca 660
atttagagtg gtttatgata taccacaagc cttctggctc ttgataacct tggaatacgt 720
agatgtttct cggcgacatt gctacaaact gggggtgaca acccaacttg ggaactttat 780
tttagcttct cttggggtgt tgaggcttct gtaagtaaga gactgcacaa acatcctgtc 840
tatcctgggg agattcataa cttattttaa ccaaaggact tttcagcttt agcaggtttt 900
ggatagttca atgaaagtgg ttttagtgga gatacagttg gatgaatcaa tggatcctac 960
tactttgtct tggccagctt ctaattgaac cctattgatc ttttctgcaa aggcaatcca 1020
actaccaatt tctctattta aaagagccaa caagcactcc acaattatcc tccaatgtaa 1080
cctttggttt aggtttcata gcaaattctt gtggttccac cccatatgcc gaccatcacc 1140
tctcaccgtg accatttaag gagggcacta tttctctact tatagaagag ccaaacccca 1200
agacccaatg gaagggaagt ccaactccat ttcgatcaag tatcttatat cccccatccc 1260
cacaccccaa aaaaaaaaaa aaaaagttgg tgattatgat gagattgcat tttgttgtgg 1320
acacctccta tccagcttcc acttgatgta tttttctatg tgctgctggt tctgaaacta 1380
attattgttg tcttttctta caactgtttt tatggaagag ttctactcaa tgtcatagtt 1440
ttagctggtc acaccttctg ttgtaggatt tcacttgaaa ctataaataa gtgtcaatat 1500
atacaatatg cttgaataac ataccttgca gtgcattatg acttggccta attgaataag 1560
ggtcatgtaa ataacaaatg acttggagag aatggattca agccatgttg gttacctact 1620
taggatttat tatcctatga cttaccttgg caacagaata tagtagggtc agtcagttgt 1680
cgcaggttgg atctgaaatg aatggatatg aaaaaaaatg aaaaataaaa acctatcttg 1740
cacttacagc ttgtgaaatt tgtttggcct aatatgttga agcatctaaa ttacgctcta 1800
cgttcctgtt ttctataatt tatttctaaa acatgctcag atgagtatta ttattatttt 1860
ttttttaaaa aagaacaatg acggcatgaa cttgatgtag aagctcttac tctttttgct 1920
taaaaccaag cattggtcaa ggttagaagt cattgacggg ctgattttct tgtatcactt 1980
aggtgtggat atcagcatga atacacattt gaaggctgta aagcttactc taaaggggaa 2040
aaatccagtt accatggatc atttaagtgt gaggggaaac aacatcagat attatattct 2100
acctgacagc ttgaatcttg agactttact tgttgaagag acacccaggg tcaagcccaa 2160
gaaaccaact gcaggtatgc gctgtctttg cattttgcct gtactttatg gtgttttctg 2220
aaagtcaaat tgtttatact gaatcgtatg ccacccagtg tcaaatatgt tgcttatgta 2280
tttccccatt cttttgcaac tatagggaag cctttggggc gtggacgagg acgaggccgt 2340
gggcgtggtc gtggtcgtgg acgctag 2367
<210> 31
<211> 3599
<212> DNA
<213> 甜瓜（Cucumis melo）
<400> 31
cttcattttc ttcaatctat tagaaacaaa gaaagaaaga aaggaaagaa atagggacaa 60
ccgcagcaat ctcccaattt cctctccccc gcttctgttg tttgaaaccc tacattcttc 120
ctttcctctc caatcatgaa gcttgttagg tatcttcttc tctttttcta tttttgccct 180
ctttttttcc tcgatctaca tccaaatgac gtttttcgtt ttcaaaatct tggttttcat 240
acaggttttt gatgaagctc aacaatgaga ctgtctcaat cgagctcaaa aatggaactg 300
ttgtccatgg aactatcaca ggtctttcta cctctctttc attaaatctt cttaaaccct 360
agatttacca actttgcggc tgaggggttt ttaacttcca acttctcttc tattttcttc 420
tttgaacttc actgtattgg aatttgtaca acatttcagt atgttccccc agtgtacaac 480
tctcactact attgctttcg tctcatttcc atttcccgac cttttaaagc taactaaaat 540
gttctctatc ccgctcccat ttttaattta aaaaattagt attcaactca tgggttgctt 600
aggagaaatt aagttccttg tcttctggac gtttggagga tgagatgttt ttctctgtat 660
tgtttttatt tttattattt tcataataat ttgaactttt gattactgtc tctactgatg 720
ctgaataagc attctatttc atgacatatc tgtagattta aacaaatgtt taaaatatcc 780
tacaatttat tctttcccgt ttgatttgat ggaattgttt cgtgaattta cttcttcttt 840
cttttttttt tttttttttt ttgaaatgga aacaaaacaa gtatttatac ttatacaatc 900
atcttgaact gtttctcacc tgcactagaa tgatgttacg ttagtctgat taaacatgaa 960
cttctgctga atcccagcat ttttggactc ggcagcccat atgccattct ttggttaatt 1020
atatgtgtgt gtttttaatt ttgttttgca taagagactg cgcaataact gaaagagaag 1080
caacttgtaa cttgaactgt tcccagtggt agaaacatag tcaattgagc agtagcaaat 1140
tatctttgtt tgtagccttt gtcctcctac actgcctcta acaacttgaa ctattcttaa 1200
ccttccctgg aatagcaata acttaatctt gattaatcaa aacttcttct gaactccatt 1260
atttttgggt tccgtatccc attggccatt cttatatgaa tttttaccct tttttatctt 1320
ttggtgagag actatgttac aagtgaagca aaaattctaa cctagggtaa tcttcgtgct 1380
ggtggagaaa acctgggagc tataaaaaaa agagccttcc gataaaagtt aaatcatgtt 1440
cataagtaga ctgtaattac aacacattat cttctatttg aaaaaccatc gtaaaaatgt 1500
gtatggtaca ctattaaaaa tatattctaa aatagatatt tttcctctca aaatattcgt 1560
agaagtagta gtgcagattt tatcctacat ctaacccatc aggctgtgaa tgttttaaaa 1620
aataatcgtc acccaagcta gttaggcaaa agataaacca gttttgttga aaatgaaaaa 1680
cgatgctcta tagacaaaag gacagtggag gtaaaggtaa ttttgggatt ccccatttga 1740
ataatagagg aacaaaccag gggagacaac ccagcttggg aacttttttt agattctctt 1800
ggggggttga ggcttctatt agtagccaac ctcacaaaca tcttaacctt cctaggggtg 1860
cccaacatcc aaactgattt gactttacaa atgcatattt tgctttagca aggtctcaga 1920
gagtttagtg aaggtgatct tagaggagaa acaatttaat gaatcaatga attttacctc 1980
tatgtcttgg ccagcttctg attgaaaagt atcgatcttt cctataaagg ctatccaact 2040
ttccaatttc tctgtgagaa gagccaacaa gcattccaca attattcccc aagactatcc 2100
atggttttgg tttcatcgtc gtttctggtt ctagatggca accatcactt tttgcaacta 2160
tttaagaagt agcgcattat ttctttactt actaaaagag ccaaccaatg gaaaggaagt 2220
ccagctccat tttaatgggt gacttaggat tcgatgaatt atgattagtt tgcattttgt 2280
tgttgacaac cccctataca tcttccactc aatgtatttt gctatgctgc tgctactgaa 2340
actagttatt taccggcaga gttttcacga ctcattattt tagttggtta cctcttttgt 2400
tggaggattt cagttgagat tgtacgcaat gttttaaaag gctaaaggca gcctcttcca 2460
aagttgtaag tctctttggt taaaaatact ttaccaagta ttgctgggca acacttgata 2520
atcaggtaaa agtaaatata aaaaaaaaaa ggaaaaatca ctcttcccaa tttccaccta 2580
gacaaaaatt ctaaaatgat atctttaact ttactaatat tatttgattg acttatccca 2640
gaaatattat atcgtgacaa actaatatta ttcaataaac tattacaaag aggtgtaagt 2700
ctatgcatgc aatatgcttg ataacctaca ttgcacttta ccttgtgaaa tcttgttttc 2760
gactatgata cattaatcaa tgatttgttt taaaaaactc gatgaaattt catgaactta 2820
aagtagaagt acgcactctt ttctcttaaa acctaagtat tggtcaaggt tagaagtcgc 2880
tgatgggttg attttgagtg gttttcttgt attacttagg tgtcgatatc agcatgaata 2940
cgcatttgaa ggctgtgaag cttactctaa agggaaaaaa tccagttacc atggatcatt 3000
taagtgtgag aggtaacaac atcagatatt atatcctacc tgacagcttg aatcttgaaa 3060
ctttacttgt tgaagagaca cccagggtca agcccaagaa accaactgca ggtttgtgtt 3120
cttgcattct ggcctgtact ttatggtcat tttctgtggc aagtccaatt gtttatactg 3180
aatcatatca tttgctactc attatcaaat gtattgctta tgcatttcta cactctactc 3240
caactacagg aaggcctttg ggacgtggac gagggcgcgg ccgtgggcgt ggtcgtggac 3300
gtggacgcta gatttgatgc agtttcaatt tttgagacct gtagtgtaaa cacttgcatt 3360
gtagggaaag attatgaatt ttgggacacg aaaaagtggt attgcaattc actgttcaat 3420
ctcgtatgta gtttattaca atgctattcg gttgtttttc atatgataga tgtagccttg 3480
ctatgtttcc tggtgcttgg gatctgttaa tggtttgctc taatatcatc acaatgataa 3540
atcgagtatg tctctatctc gttttttact tttaatccca atagatttgg tagtcatgc 3599
<210> 32
<211> 3302
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus）
<400> 32
cctctccccc gcttcgttgt ttgaaaccct acattcttcc tttcctctcc aatcatgaag 60
cttgttaggt atcttcttct ctttttctat ttttgccctc tttttcttct cgatctacat 120
ccaaatgccg tttttcattt ctgaaatctt cgttttcata caggtttttg atgaagctca 180
acaatgagac tgtctctatc gagctcaaaa atggaactgt tgtccatgga accatcacag 240
gtctttctgc ttctctttct ttaaatcttg ttaaacccta gatttaccaa ctttgcggct 300
cagggttctt taacttccaa cttctgttct attttcttct ttgaacttca ctgcgttgga 360
atttgtacaa catttcagta tgttcaccag tgtacgactc tcactactat tgctttcgtc 420
tcacttccat ctcccgacct ttgaaagcta acggaagggt tctttatccc gctcccattt 480
ttaattttaa aaattagtat tcaacttatg agttgcttac ggcaaattaa attccttgtc 540
ttctggacgt tgggaggatg agatgttttt ctctctattg tttttatttt tattattttc 600
attttcaaaa taatttgaac ttttgattac tctctactga tgctgaatat gcattctatt 660
tcatgatata tttgtagatt taaacaaatg tttaaaatgt cccgtcattt tttcatggaa 720
tgactcctac aattcattct ttcccatttg atttgatgga attgtttttt caaccaagtg 780
aatatacttt tttttttttt gaaacggaaa caaaccaagt gaatatactt ctacaattaa 840
cttgaggtga gaaacctgca ctagaatgat gttactatag tctgattaag catgaacttc 900
tgctgaaccc cagcattttt ggactcggta gcccatatgc cattctttgg ttaattgtat 960
gtgtgttttt aaatttgttt tgcataagag actatgcaat aactgaaaga gaagcaactt 1020
gtaactgaac tgtgcccagt ggtggaaaca tagtcaattg agcagtcgca aattatatgc 1080
gcctttgtcc tcctacactg cctctaacta catgaactat ttttaacctt ccctggaata 1140
gcaataactt agttttgatt aatcttcttc tgagttccat tagttttggg ttctgtagac 1200
cattagccat tcttacatga atttttaccc ttttttatct tctgatgaga gactatgtta 1260
caagtgaagc aaaaagtcta acctaggttt aatcttgggg ggagaaaacc ctaggagcta 1320
taaaaaaaag agccttctga taaaagttaa atcatattca ttagtagact gtaactacaa 1380
cagattatct tctatttgaa aaaccatcgt aaaaatgtgt atggtacact attaaaaata 1440
gaatctaaga tagatacttt ttctctcaaa atatttatag aagtagtagt gcagatttta 1500
ttttacatcc aactcatcag gctgtgaatg ttttgaaaaa taattgtaac ccaagctagt 1560
taggcaaaag ataaaccagt ttgttgaaaa tgaaagacca tcctctatag acaaaaggat 1620
agtggagata aaggtaattt tgggattacc cattggaata atagaggaac aaaccagggg 1680
agacaaccca gtttgggaat ttttttctag attctcttgg ggggttgagg tttctattag 1740
tagccaacct cacaaacatg ttaaccttcc taggggtgtc aaacatccaa actgatttga 1800
ctttacaaag gcgttttcag ctttagcaag gtctgagaga gtttagtgaa ggtgatctta 1860
gaggacaaac aatttaatga atcaatggat tctacttcta tgtcttggtc agcttctaat 1920
tgaaaggtat cgaactttcc tataaagtca atccaacttt ccaatttccc tgtgaaaaga 1980
gccaacaagc attccacagt tatcccccaa gactacctat ggttttggtt tcattgtcgt 2040
tgtttctggt tctagatgat cacttttcac aactgtttaa gaagtagcac atcatttctc 2100
tacttacaaa aagagctgac caatggaagg gaagtccgac tctattttaa tgggtgactt 2160
actgatttgg tgaattatga ctagtttgca ttttgctgtt gacaaccccc tatacatctt 2220
ccacttaatg tatttttcta cgctgctggt actgaaacta gttatttacc ggcagagttt 2280
ttttttcaca aggagttgta acagaagagt tgagactctt gtcataactt atgactcata 2340
attttagttg gttacctctt ttgttggagg atttcagttg agattatacg caatgtttta 2400
aaaggctaaa ggcagcctct tccagcatag ccccaaggtg aggtgttatg agttgtaagt 2460
ctctttggtt aaaaatattt taccaaatat tgttaggcaa cacttaataa tcatgtaaaa 2520
gttaataaaa agaaaaaagg aaaatcactc gtcccaattt ccacctagac agaagttcta 2580
aaatgatatc tttaacttta ctaatattat ttgattgact tctcctagaa atattagatt 2640
gcgacaaact aatattattc aataaaatta ttacaaagag gtgtaagtct ctatctatgc 2700
aatatgcttg atgacctaca ttgcactttg cgttgtgaaa tcttgttttc gactatgata 2760
tgttaatcaa tgatttgttt taaaaaaatt caatgacatt tcatgaactt aaagtagaag 2820
tacgcactct tttctcttaa aacctaagta ttggtcaagg ttagaagtcg ctgatgggtt 2880
gattttgagt gtttttcttg tattacttag gtgtggatat cagcatgaat acgcatttga 2940
aggctgtgaa gctaactcta aagggaaaaa atccagttac catggatcat ttaagtgtga 3000
gaggtaacaa catcagatat tatatcctac ctgacagctt gaatcttgaa actttacttg 3060
ttgaagagac acccagggtc aagcccaaga aaccaactgc aggtttgtgt tcttgcattc 3120
tggcctgtac tttatggtca ttttctgctg caagtccaat tgtttatact gaatcatatc 3180
atttgctact cattatcaaa tgtattgctt atgcatttct acactatgct ccaactacag 3240
ggaggccttt ggggcgggga cgagggcgcg gccgtggacg tggtcgtgga cgtggacgct 3300
ag 3302
<210> 33
<211> 3151
<212> DNA
<213> 西瓜（Citrillus lanatus）
<400> 33
atgaagctca acaatgagac tgtctcaatc gagctcaaaa atggaactgt tgtccacggc 60
actatcacag gtctctctaa ctctctttct taaatcttgt taaaccctag atttaccaac 120
tttgcggccg tggtttttct cccaacttcc aacttccaac ttccaacttc caacttccat 180
tccattttct tctttgaact tcactgtatt agaagttgta gaatatttca gtatgtccgc 240
cagtgtacaa ctctcactat tctttacttt cgtctcatga ccatctgtga acgtttgaaa 300
gctaactgaa gggttctggc aagcgtgcac ttggagaacc accttcccac tcccattttt 360
aagtttaaaa attagtatta tcatcaattc ttttaaaagt aaattagtat tgaactcatg 420
ggttgcttac gtgaaattaa atccttgtct tttgggtgtt gggaggatga gacattttct 480
ctgtatattt tttattgtat taatttaaat tatcataaca atttgaacta ttgattgctg 540
tctactgatg ctgaatatca attctatttc atgacatatc agtagattta aacaaatgct 600
tagaatgtcc tctcacattt tgatttaatg tcttctacaa tgccttcttt cccccttgtt 660
ctgtagggaa tgtttcttaa accaagtgaa tatacttaaa ctttaacttg tactgttttt 720
tatctgcact agaatgatat tagcttagtc tgattaaaca ttaacttctg ctgaacccca 780
gcatttttgg gataaggact acccaataaa tgaaagagag gcaacttata acttgaactg 840
tgcccactgc ccagtggtgg aaacatcaat tgaacgcaaa taacctttat tcgtcattag 900
ccttcatcct cgtacactac ctctatcacc atcacctata acttgaactg tttttcatct 960
gccctagaat ggcattaact tagtctgatt aaacaaaaat tctgcctaac tccattgttt 1020
tttggttctg tagcccatat tccattcttt tgtgaattgc gactattttc ttttcttgtg 1080
aaagagtatg gtacaactaa aagagaagct aaaagactaa tctagggtag cctagggaat 1140
ggtagagaaa accctgccca tggagctata gaagatgtgc cttccaataa gagttaaatc 1200
atattcataa gaggactcta attacaatag aatatcttgt atttgaaaaa ctattgtaaa 1260
aatgtgtgtg gtacactgtt acaaatagaa tctaaaatag atattttttt cccttaaaaa 1320
aattgtagaa gcacaattcc gaaagatttt atcttcacat ataagccacc aggctgtcga 1380
ctgcttccaa aaatgaccgt caaccaagct agataggcaa aagataaacc atttttgttg 1440
aaaatgaaag accatcctct acagaaaaaa ggacagtgga ggtaaaggta attttgggat 1500
tccccgttgg aataacagag gaacaaacca ggggagagaa cccagtttgg gaaccttttt 1560
tgagcttgtc ttgggatgtt gaggtcttcc taggcgtgtc aaacttccaa actgatttaa 1620
ccgaaggcgt tttgagcttt agcaaggtct cagagagttt agtaaggtga ttttagagaa 1680
gagacaattg aatgaatcaa tggtttctac ctctatgtct tcgacagctt ctaattgaac 1740
tgtaacattc tttcctatga aggcaatcca actgacaatt tctctatgaa aggagcaaac 1800
aagcactcca caattatccc ccaaaattac ctaaggatat ggttttggtt tcattgtcta 1860
tttttctggt ttgaccccat agatgccaac catcactttt cataactatt taagatgtag 1920
ggcattattt ctctacttct gtaaatatcc aatggaaggg aagtccaatt ccattttaat 1980
gggtgcctta ggatttggtg aattatgatt atattgcatt ttgttgtaga caacaaccct 2040
ctatacctct tttgttggag gactttagtt tagattataa gccatgtttt aataggctaa 2100
aggcagtcct ctggaagaga cgaggtgtag cctcatggtg ttatgaagca ttaagtctca 2160
aatttgatta atcttttttt accaagtatt gctaaacaaa acttaataat catgttaaag 2220
ttaaaagaaa aaaagaaaaa tcactcttcc caatttccac ctggacaaaa attctaaaat 2280
gatatctttt acctcactac tattatccga ttgacttatc ctagaaattt tagactgtga 2340
caaaataata ttattcgaca aattattaca aagaggtgta agcctcaata ccttttgaaa 2400
acattggcta taaataagtg tctctatata tgcaatatgc ttgatgacct atattgcact 2460
tatgccttgt gaaatcttga ttttgactga agcatctaag ttactttacc tgtttcatct 2520
gtgttcgaca aattatttct aagacattct ctagcgctac ttagatgaat atcattgagc 2580
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ttaattcttt gtttcaattc aatgacactg catcaactta aagtagaagt atgtactctt 2700
tttctcttaa aacctaagta ttggtcgagg ttagaagtca catatggttg attttgagcg 2760
gtttttcttg tattacttag gtgtggatat cagcatgaat acacatttga aggctgtgaa 2820
acttactcta aaggggaaaa atccagttac catggatcat ttaagtgtga ggggtaacaa 2880
catcagatat tatattctac ccgacagctt gaatcttgag actttacttg ttgaagagac 2940
acccagggtc aagcccaaga aaccaactgc aggtatgtcc tgtccttgca ttctggcatg 3000
tactttagtc aaattgttta tactgaatca tatgctatcc attatcaaat gtgttgctta 3060
tgcatttcta cactctactc caactacagg gagacctttg ggacgtggac gaggacgtgg 3120
ccgtgggcgt ggtcgtgggc gtggacgcta g 3151
<210> 34
<211> 3913
<212> DNA
<213> 多毛番茄（Solanum habrochaites）
<400> 34
acgtttagtc caatggatga ggcagcccat gtgctaatgc gacgtcgtta tagtgttttt 60
tgaataaccc tggcgctctt tgccctaaac ctgaggtcgt gttcgatctg cgcttcgact 120
taagccctag tgtctcttca atttcttcag caacaatgaa gctcgttagg ttcatgcgat 180
atcttcattt tttgagtttc ttttccagtg tgcttagcaa tggatttaac ttttaccttt 240
tttgtgcaga tttttgatga agctgaacaa cgagactgtc tcaattgagc tcaaaaacgg 300
caccgttgtt catggaacca ttacaggtca ccctccctct ctttctgtct atttctttat 360
tagctatatt taggtatttc cctgtcaagt ctaaaatgaa caatctgcac gtatgtaatt 420
gctgaattgc tcgctccaat aggtaaatag aatgtgcttg tataaaattc atttcctggg 480
ttgacaagtt ttttggtagt gtcgctaact gaaagtctag ttgctgggtg gtatatggaa 540
gttgctgaac tacaacaaca atatactacc cagtgtaatt ccacaagtgg tgaggtcttg 600
ggagacagag tgtttgcctt acccctacct cgtagtgttt aagtgactgt ttccaataga 660
ttctcatgtt taaataaagc atttccaaac cattttttta ataaaggata tataaaaata 720
agtgctcatg acagacaagt gaggttttgc tcaagtggtt gagcacttcc accgtcaact 780
agtaggttga gggtttgggt cagaggatag atgggaacac tattgatcct tctaggctcc 840
tgggggtggg gtggaaaaaa cggagcaaca acaacaacga aagcaagttg ctaaactgtc 900
tttggtttat gccacaagtt aagttagttc atagcgaatg ttaactgcaa tagtttactt 960
cactctcctt cacttccact gtgagtcact atgtatgtcc ataaatgcat ggaagctagg 1020
actgagaggc tatagaaagt atacgaggta acccgtctca atctgtctac tcctctcact 1080
gcccttctga atatgtctct gattcacacg tattatctct acttttgtcc tccttcaact 1140
atgaagttcc tttcaaatac caattggaat tcattctcaa gtgcagagct atttctgcct 1200
atcatcactg taatttatgt ctatactcta accgtagttc ctctcagtta atgcgttaat 1260
tatactctgc ttcaataaga ataacatctc tcgttcactt tttgtggctc taaaaattgg 1320
attattacac aactcgaaga attttgaagt gtcactataa taattcaaca attccttcaa 1380
tgaatttgta tgcatttaaa taaactatga tgtctcaatc ccaaactagt tggtatgtct 1440
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atactgaaaa tacaaatttc tatattgaaa aacaaaagaa aaaaaaaaga aattatggga 1560
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cccattgata tattctttgc cttaaaactt aaactatgtt tgactggggt ggaagtgggg 1680
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tgtttagcgt gggggctgaa gggtaagtca ggggtaaatt agtaatttga cttttaagtt 1800
aggagttgct ttaaagtaat atagatagat atagataatt actttatcct ctgcaagaaa 1860
atcgtacagt agcttcttta tctggcagta gagatgcctt agcaaactta gataagcttc 1920
ttatggcaag tgccagggct tgtgctggtt gcatcgaaaa tgtcaaattt tgcaaggaaa 1980
atagccatat atgtattgca gagtttatct ctattctaga taactgtagt agtcaaaagt 2040
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tcctttccat gcttttgact gttattcctt gaggggttgc ttatacttac agaaaattgg 2160
tagatatatt cgggatatag aaatatgtat ttgagcatat cagtatgtgt tttgatatta 2220
actaggcaca gcggctatta aatctgtctc cttattgaag ttgctagatt gagagctgtg 2280
agttatagct tctaaaggca gttacatttt tacaggtgtg gatgttagca tgaacacaca 2340
tctgaaggct gtcaaaatta cgctaaaagg gaagaatcca gtgacgctgg atcacctgag 2400
tgtgaggggt aacaacatcc gttattacat cctccctgac agcttaaatc ttgagacgct 2460
gctggtggaa gaaacaccta gggtgaagcc aaagaagcca acagctggta ttgtcatatt 2520
gttaaggact atgttgggat ttttttgtgc cttgtgggtg tatggctaaa tttccttatt 2580
gcttggacat ccttctaata tattcttcct ttgattgttc ctcttcagga aagcctatgg 2640
gacgtggtcg tgggcgcggt cgtgggcgcg gacgtggtcg tggccgctaa atgcattcca 2700
gctgctctta ttttttgcag tgttgcctat gtaaacatgt gtacggatgg agagatttgc 2760
tcttagtttt tcccagtaga aaaaagatgg atctcatgca caatttattt tgtatctttg 2820
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taacaacaag cgagttttta attaaatgaa aatgagatac tctatcagat gttgatatgg 3240
ctatttatgt aacttttcga tactcaaatc aatcgggccc attccttcta tcttaattcc 3300
tcttctggta tataaaaata gagaagcaaa tcatctcgag agctgcaaac gaaaaccctc 3360
atcggcacaa ggtgcttgtg gtctctttca atggcgaaga ataactcgtt gaagtcgacc 3420
gcagtggtat tcggagccct agcatttggg tggctggcga ttgagcttgc tttcaaacca 3480
tggcttgata aagcccgagc ttccatggac aagtctgacc catctcgcga ccccgacgat 3540
caaagttcag aaactggcaa gtctcaggtc gatgttgatc cgaacaactg atttgatttt 3600
tgggttctaa accccaaaat ccaaatatat gtgcttgaat tttacttcat aataaataat 3660
tatgacttgt taatttctgt ttttcctcag tttctagccg tccctgtatt ttattttgtt 3720
ggttaaagtg aaagaaaaaa aaaagaattg gtagaagttt aatacaattc aagaggtaag 3780
ttcaagataa ttgttccgtt tttatgtttc tgtccatttg tatttgtata aaatgatatt 3840
ttgacattta acgtgttgct gttgatttat catataaaaa tttgtctaca caaatgagaa 3900
tgagaaagag ggc 3913
<210> 35
<211> 4290
<212> DNA
<213> 野生种潘那利番茄（Solanum pennellii）
<400> 35
taaaagtagg tgatttttat aattttacat acatagatac ctaagaggtg ctattattct 60
tatattctta gcattaaata gtgtgagacg cggcccacgt ttagtccaat ggacgttccc 120
agacgaggcg tataataaga catcacttgt gttttttaaa caacccctgg cgctccttgc 180
cctaaactaa agccctagat tagtgtgttt tcaatttctt cagcaagcaa caatgaagct 240
cgtcaggttc atgcgatatc ttcatttttt ttgagtttct tttccagtga gcttagcaat 300
ggattttaac tttacttttt tgtgcagatt tttgatgaag ctgaacaacg agactgtctc 360
aattgagctc aaaaacggca ccgttgttca tggaaccatt acaggtcacc ctccttatct 420
ttctttcttt gctaaattga acaatgtaat ttctcaagcc aatatgtgaa ttaaataatg 480
tgtttgtatg aatttcaagt tatttggaag tgtcgctaac tgaactacaa caacaacata 540
ataattccac aagtggtgag gtcgtagagt taaagaggtt ctttccaata gattttcatg 600
cttaaataaa gcatttccaa acaatttttg taaaggatat acaaaaatta gtgctcatga 660
cagacaagtg aggttttgct caagtggttg agcactggta ggttgagggt ttgggtcaga 720
ggatagatcg gaacactatt gatccttcta agctcctagg ggtggggtgg aaaaacggag 780
cagcaacaac aacgaaacca agttgctaaa ctatctttgg tttatgccac gagttaagtt 840
agtttggtaa ctgcaatagt ttacttcact ctccttcact tccgctgtga gtcactatgt 900
atgtccatga atgcatcgaa gctagggctg agaagctata gaaagtatat gtggtaactc 960
gtctcaatct gtctactcct ctcactgccc ttctgaattt gttatcttct tatcctctct 1020
gattcacacg tattatctct acttcagtcc ttcaactatg aagttccttt caaataccaa 1080
taggaattca ttctcaagtg cagagctatt tctacctatc atcactgtaa tttatgtcta 1140
gactctagat cactgtagtt catctctgtc aatgcattta ctgtactctg ggtcaataaa 1200
aataacatca ctcgttccct ttttttgtag ctctaaaagt tggattatta cacaactcga 1260
agaaatttga agtgtcacta taataattag tatgcattta aatacaactg tgatgtctca 1320
atcccaaact agttggtttg tctatatgag tgttctctat tttttctgct ttattcggac 1380
catttcatta attcacagtt cgtatactga aaatacaaat ctctaaatta aaaaacaaaa 1440
caaaaaacta agaaattatg ggagtgaaca tgggattctt atcatctttt tgtcattttc 1500
ttaatatttc tcttaaatta accccattca tatattcttt gctttgaaac ttaaactatg 1560
tttggctggg gtggaaaaaa gaagcttaag aggaatggaa gtaagaggtt aagagttaat 1620
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tggatttttc agtttatctg aattttgatg gaaaaaggaa atgtatttgt cttatttctg 1740
ttccagccat accaaacaac ctgaactaca tcgcttctat acacataagg gaggaaaatc 1800
actgaataac caatacacca cataacggga aagtaaatca gtgaccaatg cttcacttaa 1860
gggaggtaga tcagaagaat ctgtcttgac ttcatattga gatagtagaa tttgtaatac 1920
ttctaaattt tcacgggtaa ctgtcaccat taatttgata catcagtaga aagtataaag 1980
aatttttggt acttttatac tgctaatatt ttcaatgttg tgtaatatta gcctgagata 2040
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taggtcgata atgtaatgat cttcagaaat ttaagtctgc acatggttcc acatcattat 2220
gccaccattg ttctcaggtc cctacaagtg aaacattcta tgctggaatc atttggtcca 2280
agagctcttt tattttctat gcaaaaccat gttgtcttta tccttttgtt tccaaagatg 2340
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aaattttatc tgtataaaat tttgattacc tagttgttgg tatacgggta acttataaca 2460
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atgtagaact agcgcaaaga gtgagaagta agtggctata tgatgttgtg tactctgact 2700
tttgctgtgc aatgttaact aatcttaaat tcaactagat gaggagctaa agttgtgtcg 2760
aacaactatt attcactatg catgaatact tgagcttatg cgagcgtgcg atcaacttat 2820
agcttattat gttgtaccca agttttatga aaacaacacc tagtgttgcg tttataattc 2880
ttatccgttg ttgtaatctt gttgtgaatg ttctatgtaa ttcattgtac tatagatttt 2940
ttaccattga ggagtagcca tttatccctt atttcttttt ggtgctccca tgatatacct 3000
ctatgcattg aagataagtg tcattcatag aatgatcgaa catcatatct ttaggtaggc 3060
gttctgcttt ttggtatact tatacaggcg tgctttgtgc ctacatttaa aaaaataata 3120
attgctttat cctctaaaaa agatcatcat actgtagctt ctttgtctgg ctgtagagat 3180
gccttagcaa acttagatcg gcttcttatg gcaagtgcca gggcttgtgc tggttgcatc 3240
gaaaatgtca aatttgcatg gaaaatagcc actatgtatt gcagagttta tctctgttct 3300
agataacttt agtaggcaga agtagatatt ttgtcctgtt ctcatatttt gagacctata 3360
gcattttcca tgcttttgac ttttattcct tgaggggttg cttatacttg cagaaaattg 3420
ctagatatca gtatgtgttt tgatattaac taggcacatc ggctattaca tctgtctcct 3480
tattgaagtt gctaaattga gagctgtgag ttaaagtttc taaaggcagt tacattttta 3540
caggtgtgga tgttagcatg aacacacatc tgaaggctgt caaaattacg ctaaaaggga 3600
agaatccagt gacgttggat cacctgagtg tgaggggtaa caacatccgt tattacatcc 3660
tccctgacag cttaaatctt gagacgttac tggtggaaga aacacctagg gtgaagccaa 3720
agaagccaac agctggtatt gttaaggact acgttcagat gtttttgtgc attgtgggtg 3780
tatggttaaa ttgccttttt gcttggacat ccttctaata cgctcttgct ttgattgttc 3840
ctcttcagga aagcctatgg gacgtggtcg tgggcgcggt cgtgggcgtg gacgtggtcg 3900
aggccgctaa atgcattcca gctggtctat ttttttgcag tcttgcctat gtaaacatgt 3960
gtacggattg atagatttgc tcttagtttt tatcctgtag aaaaaagatg gatctcatgc 4020
aacaatttat tttggatctt tgaagtcagg agcatgttat ctcgttgcat catattgtct 4080
gctaacatta atttcgtttc gcgttcaatt tagtcacctt atgcatgttt tgagagttga 4140
gtcacattta atgtcgattg agaattcagc tccttcttat gaattatact tcttatagga 4200
aatagccttc tttggtgtga ctcggagggg gaatattgtt cctcttactt ccccttttag 4260
tctgtttcaa aaaaaatgtc actttcttct 4290
Claims (18)
1.一种植物，所述植物包含SmD1等位基因，所述等位基因编码与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白，其中所述SmD1蛋白包含错义突变，所述错义突变产生赋予了改善的线虫抗性的经修饰的SmD1蛋白。
2.如权利要求1所述的植物，其中所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1至108的任一位置处的错义突变。
3.如权利要求1或2所述的植物，其中所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处的错义突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的植物，其中所述经修饰的SmD1蛋白包含对应于SEQID NO:1的氨基酸位置14的位置处的苏氨酸取代为异亮氨酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的植物，其中所述SmD1等位基因通过诱变获得。
6.如权利要求1-5中任一项所述的植物，其中所述植物选自包含西红柿、烟草、胡椒、小南瓜、西瓜、甜瓜、黄瓜以及大豆的列表。
7.如权利要求6所述的植物，其中所述植物是近交、双单倍体或杂种植物。
8.如权利要求6或7所述的植物，其中所述植物是砧木。
9.如权利要求1-8中任一项所述的植物，其中所述植物包含两个拷贝的所述SmD1等位基因。
10.如权利要求1-9中任一项所述的植物，其中所述经修饰的SmD1蛋白赋予对根结线虫属线虫，优选地南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫以及爪哇根结线虫的改善的抗性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的植物，其中所述植物是番茄。
12.如权利要求11所述的植物，其中所述经修饰的SmD1蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的番茄植物，其中所述SmD1等位基因可获得自2019年11月29日以NCIMB登录号43529保藏于NCIMB的番茄系19TEP250122。
14.一种如权利要求1-13中任一项所述的植物的植物部分，其中所述植物部分包含所述SmD1等位基因。
15.一种种子，所述种子产生如权利要求1-14中任一项所述的植物。
16.一种改善植物线虫抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)获得突变植物群体；
b)选择突变植物，所述突变植物包含编码SmD1蛋白的经修饰的SmD1等位基因，所述蛋白在其氨基酸序列中含有错义突变。
17.一种鉴定栽培西红柿植物，优选地栽培番茄植物的方法，所述栽培西红柿植物表现出改善的线虫耐受并且具有至少一个拷贝的SmD1等位基因，所述等位基因编码与SEQ IDNO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的SmD1蛋白，其中所述SmD1蛋白包含产生经修饰的SmD1蛋白的错义突变，所述方法包括以下步骤：
a)获得突变植物群体；
b)筛选所述群体中所述SmD1等位基因的存在。
18.一种用于检测在栽培西红柿植物，特别是栽培番茄植物中线虫抗性性状SmD1等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含表示为SEQ ID NO:22的正向引物和SEQ ID NO:23的反向引物的一对PCR寡核苷酸引物。
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