JP3354929B2 - アラビドプシス属の植物を使用した植物・ネマトーダ相互作用に関する遺伝子およびプロモーターの単離および／または試験方法 - Google Patents
アラビドプシス属の植物を使用した植物・ネマトーダ相互作用に関する遺伝子およびプロモーターの単離および／または試験方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （関連分野） 本発明は植物におけるネマトーダの培養方法に関す
る。本方法はネマトーダ耐性遺伝子および給送構造特異
的遺伝子およびプロモーターのスクリーニングおよび単
離に特定の用途を見いだした。
る。本方法はネマトーダ耐性遺伝子および給送構造特異
的遺伝子およびプロモーターのスクリーニングおよび単
離に特定の用途を見いだした。
（関連技術） 世界中に存在する植物寄生ネマトーダは、アメリカだ
けでも年間約5.8×109ドルの損失と見積もられているよ
うに（セイザー（Sasser）およびフレックマン（Freckm
an），（1987）、経済的に重要なほとんど全ての穀物植
物の病気を引き起こす。熱帯地帯ではネマトーダにより
起こる損害は、主にルート・ノット・ネマトーダ（メロ
イドギネ（Meloidogyne））によるものであるが、ヨー
ロッパではグロボデラ（Globodera）およびヘテロデラ
（Heterodera）属のチスト・ネマトーダが重大な病原で
あり、ポテト、菜種、サトウキビの栽培の重要な制限因
子であると考えられている。また、増えつづける穀物損
害は遊離性ネマトーダ（例えば、プラチレンカス（Prat
ylenchus）ssp等）にも寄因する。例えば、ポテト、サ
トウキビ、トマト、大豆およびオイルラディッシュ等、
計画的育成から生じた耐性穀物種は非常に僅かである
（ドロプキン（Dropkin）,1988）。
けでも年間約5.8×109ドルの損失と見積もられているよ
うに（セイザー（Sasser）およびフレックマン（Freckm
an），（1987）、経済的に重要なほとんど全ての穀物植
物の病気を引き起こす。熱帯地帯ではネマトーダにより
起こる損害は、主にルート・ノット・ネマトーダ（メロ
イドギネ（Meloidogyne））によるものであるが、ヨー
ロッパではグロボデラ（Globodera）およびヘテロデラ
（Heterodera）属のチスト・ネマトーダが重大な病原で
あり、ポテト、菜種、サトウキビの栽培の重要な制限因
子であると考えられている。また、増えつづける穀物損
害は遊離性ネマトーダ（例えば、プラチレンカス（Prat
ylenchus）ssp等）にも寄因する。例えば、ポテト、サ
トウキビ、トマト、大豆およびオイルラディッシュ等、
計画的育成から生じた耐性穀物種は非常に僅かである
（ドロプキン（Dropkin）,1988）。
植物と病原体の共進化を通して、植物はこれらの病原
体に対する制御メカニズムを発達させてきた。植物の感
染には、病原体が植物の制御メカニズムを打ち破るか抑
制しなければならない。遺伝学的言葉で言うと、特異的
植物・病原体相互作用は「ジーン・フォ・ジーン」モデ
ルで説明しうる。このモデルでは、病原体の無発病力性
遺伝子（Ｅ）によってコードされているエリシター分子
（ｅ）が植物の耐性遺伝子（Ｒ）によってコードされて
いるレセプター分子（ｒ）と相互作用し防御メカニズム
を切替える。このメカニズムは過敏的応答（HR）を通し
て発現型的に観測しうる。即ち、感染部位の周りの宿主
の局所的死がさらに病原体で拡がるのを阻害する。この
ようなジーン・フォ・ジーンの関係の遺伝学については
細菌および菌類病原体に関して優れた報告がある（ガブ
リエル（Gabriel）およびロルフェ（Rolfe））。ウォー
レン（Whalen）等（1991）の最大のデータはこれらの種
が関連しないにも関わらずアラビドプシス（Arabidopsi
s）と大豆由来の耐性遺伝子のホモロジーを示してい
る。ジーン・フォ・ジーンモデルは植物・ネマトーダ相
互作用に関しても示唆されてきた（ジョーンズ（Jone
s）等、1981;ターナー（Turner）等、1983）。さらに、
特定のネマトーダ種に対して耐性であり、かつその耐性
が単一の優性遺伝子座に存在する培養物に見られる過敏
性応答は（リック（Rick）およびホーブス（Fobes）,19
84;デラート（Delleart）およびメイジャー（Meijer）,
1986;オムウェガ（Omwega）等,1990）、ジーン・フォ・
ジーンの関係が植物・ネマトーダ相互作用でも機能して
いることを示している。特定の種のネマトーダに対する
耐性が土壌に存在する事がモノゼニック培養条件を維持
している（例えば、ミューラー（Ｍller）,1978;ポー
ル（Paul）等,1990,サンフト（Sanft）およびウィス（W
yss）,1990）。これらの種の内のいくつかでは優性耐性
遺伝子がマッピングされているが（例えば、ポテト、バ
ロン（Barone）等,1990;トマト、ウイリアムソン（will
iamson）,1990）、これらの穀物植物のゲノムの複雑性
並びに実験室条件下での植物・ネマトーダ相互作用の複
雑性が今日までこれらの遺伝子の単離を妨げている。
体に対する制御メカニズムを発達させてきた。植物の感
染には、病原体が植物の制御メカニズムを打ち破るか抑
制しなければならない。遺伝学的言葉で言うと、特異的
植物・病原体相互作用は「ジーン・フォ・ジーン」モデ
ルで説明しうる。このモデルでは、病原体の無発病力性
遺伝子（Ｅ）によってコードされているエリシター分子
（ｅ）が植物の耐性遺伝子（Ｒ）によってコードされて
いるレセプター分子（ｒ）と相互作用し防御メカニズム
を切替える。このメカニズムは過敏的応答（HR）を通し
て発現型的に観測しうる。即ち、感染部位の周りの宿主
の局所的死がさらに病原体で拡がるのを阻害する。この
ようなジーン・フォ・ジーンの関係の遺伝学については
細菌および菌類病原体に関して優れた報告がある（ガブ
リエル（Gabriel）およびロルフェ（Rolfe））。ウォー
レン（Whalen）等（1991）の最大のデータはこれらの種
が関連しないにも関わらずアラビドプシス（Arabidopsi
s）と大豆由来の耐性遺伝子のホモロジーを示してい
る。ジーン・フォ・ジーンモデルは植物・ネマトーダ相
互作用に関しても示唆されてきた（ジョーンズ（Jone
s）等、1981;ターナー（Turner）等、1983）。さらに、
特定のネマトーダ種に対して耐性であり、かつその耐性
が単一の優性遺伝子座に存在する培養物に見られる過敏
性応答は（リック（Rick）およびホーブス（Fobes）,19
84;デラート（Delleart）およびメイジャー（Meijer）,
1986;オムウェガ（Omwega）等,1990）、ジーン・フォ・
ジーンの関係が植物・ネマトーダ相互作用でも機能して
いることを示している。特定の種のネマトーダに対する
耐性が土壌に存在する事がモノゼニック培養条件を維持
している（例えば、ミューラー（Ｍller）,1978;ポー
ル（Paul）等,1990,サンフト（Sanft）およびウィス（W
yss）,1990）。これらの種の内のいくつかでは優性耐性
遺伝子がマッピングされているが（例えば、ポテト、バ
ロン（Barone）等,1990;トマト、ウイリアムソン（will
iamson）,1990）、これらの穀物植物のゲノムの複雑性
並びに実験室条件下での植物・ネマトーダ相互作用の複
雑性が今日までこれらの遺伝子の単離を妨げている。
制限断片長多型（RFLP）地図および染色体歩行（ブリ
ーカー（Bleecker）等、1991）、Ｔ−DNA挿入突然変異
誘発（フェルドマン（Feldmann）,1991）またはトラン
スポゾン・突然変異誘発（アルトマン（Altmann）等,19
91）を利用した植物遺伝子単離技術の進歩の多くは小さ
なあぶらな科の植物アラビドプシス・サリアナ（Arabid
opsis thaliana）を用いて行われた。この種に関するゲ
ノムサイズ、短い世代時間および豊富な古典的遺伝学が
この進歩の基礎となっている。目的の遺伝子の単離に関
する重要な因子は、ある特徴に関して劣性の系列からそ
の遺伝子の優性的存在を発現型でスクリーニングしうる
ことである。耐性遺伝子の同定におけるアラビドプシス
（Arabidopsis）の主要な欠点は、この種に感染しうる
植物病原体の数に制限があることである。現在知られて
いる例は僅かな細菌（シンプソン（Simpson）およびジ
ョンソン（Johnson）,1990;ウォーレン（Whalen）等,19
91）および菌類（コック（Kock）およびスルサレンコ
（Slusarenko）,1990）に限られている。ネマトーダが
サトウキビやナタネ等の耕種学的に重要なあぶらな科の
植物における主要な病原であるという事実にも関わら
ず、土壌またはモノゼニック条件のいずれにおいても植
物寄生体ネマトーダによるアラビドプシスへの感染の成
功は文献的に報告されていない。ネマトロジーおよび植
物組織培養で使用されている標準条件は土壌または組織
培養においてアラビドプシスへのネマトーダの感染を誘
導しない（未発表の結果、MOGIN,ライデン、ML;植物病
理学科、キエル大学、ドイツ；ロサムステッドExpt.ス
テーション、ハーペンデン、UK）。
ーカー（Bleecker）等、1991）、Ｔ−DNA挿入突然変異
誘発（フェルドマン（Feldmann）,1991）またはトラン
スポゾン・突然変異誘発（アルトマン（Altmann）等,19
91）を利用した植物遺伝子単離技術の進歩の多くは小さ
なあぶらな科の植物アラビドプシス・サリアナ（Arabid
opsis thaliana）を用いて行われた。この種に関するゲ
ノムサイズ、短い世代時間および豊富な古典的遺伝学が
この進歩の基礎となっている。目的の遺伝子の単離に関
する重要な因子は、ある特徴に関して劣性の系列からそ
の遺伝子の優性的存在を発現型でスクリーニングしうる
ことである。耐性遺伝子の同定におけるアラビドプシス
（Arabidopsis）の主要な欠点は、この種に感染しうる
植物病原体の数に制限があることである。現在知られて
いる例は僅かな細菌（シンプソン（Simpson）およびジ
ョンソン（Johnson）,1990;ウォーレン（Whalen）等,19
91）および菌類（コック（Kock）およびスルサレンコ
（Slusarenko）,1990）に限られている。ネマトーダが
サトウキビやナタネ等の耕種学的に重要なあぶらな科の
植物における主要な病原であるという事実にも関わら
ず、土壌またはモノゼニック条件のいずれにおいても植
物寄生体ネマトーダによるアラビドプシスへの感染の成
功は文献的に報告されていない。ネマトロジーおよび植
物組織培養で使用されている標準条件は土壌または組織
培養においてアラビドプシスへのネマトーダの感染を誘
導しない（未発表の結果、MOGIN,ライデン、ML;植物病
理学科、キエル大学、ドイツ；ロサムステッドExpt.ス
テーション、ハーペンデン、UK）。
（図面の簡単な説明） 第１図 アラビドプシス サリアナ（Arabidopsis thal
iana）へのヘテロデラ シャクチ（Heterodera schacht
ii）の感染に関する寒天のタイプの影響。ネマトーダの
接種は発芽後10日目に行った。種々の寒天を溶かすのに
使用した培地は本発明の至適培地である。結果はダイチ
ン寒天での平均感染数（ｎ＝45）に対するパーセンテー
ジで表した。DA＝ダイチン寒天、BA＝ディフコ・バクト
寒天、TGA＝一級寒天、GR＝ゲルライト。寒天濃度は全
て0.8％（W/V）で行った。ゲルライトは保水能が高いの
で0.25％で行った。
iana）へのヘテロデラ シャクチ（Heterodera schacht
ii）の感染に関する寒天のタイプの影響。ネマトーダの
接種は発芽後10日目に行った。種々の寒天を溶かすのに
使用した培地は本発明の至適培地である。結果はダイチ
ン寒天での平均感染数（ｎ＝45）に対するパーセンテー
ジで表した。DA＝ダイチン寒天、BA＝ディフコ・バクト
寒天、TGA＝一級寒天、GR＝ゲルライト。寒天濃度は全
て0.8％（W/V）で行った。ゲルライトは保水能が高いの
で0.25％で行った。
第２図 アラビドプシス サリアナのランズバーグ エ
レクタ（Landsberg erecta）へのヘテロデラ シャクチ
の感染に関する培地の影響。種々の培地ど成育させる植
物当たりの雌株数（ｎ＝45）;0.5MS＝1/2ムラシゲ・ア
ンド・スコーグ（1962）培地、DB＝ドロプキン・アンド
・ボーン（1965）培地、レデイ（1965）培地、シモンズ
＝本発明の培地。
レクタ（Landsberg erecta）へのヘテロデラ シャクチ
の感染に関する培地の影響。種々の培地ど成育させる植
物当たりの雌株数（ｎ＝45）;0.5MS＝1/2ムラシゲ・ア
ンド・スコーグ（1962）培地、DB＝ドロプキン・アンド
・ボーン（1965）培地、レデイ（1965）培地、シモンズ
＝本発明の培地。
第３図 アラビドプシス サリアナのランズバーグ エ
レクタへのヘテロデラ シャクチの感染に関するダイチ
ン寒天濃度の影響。培地は本発明のシモンズ培地を使用
した。植物（ｎ＝45）当たりの成功感染平均数。
レクタへのヘテロデラ シャクチの感染に関するダイチ
ン寒天濃度の影響。培地は本発明のシモンズ培地を使用
した。植物（ｎ＝45）当たりの成功感染平均数。
第４図 アラビドプシス サリアナのランズバーグ エ
レクタへのヘテロデラ シャクチの感染に関するスクロ
ース濃度の影響。培地は本発明のシモンズ培地を使用し
た。植物（ｎ＝45）当たりの成功感染平均数。
レクタへのヘテロデラ シャクチの感染に関するスクロ
ース濃度の影響。培地は本発明のシモンズ培地を使用し
た。植物（ｎ＝45）当たりの成功感染平均数。
第５図 バイナリーベクターpMOG452。本プラスミドはp
MOG23の誘導体であり、ネマトーダのフィーディング構
造における遺伝子発現に使用するプロモーターを「フィ
ッシュ」するための無プロモーターGUS構築物を含んで
いる。
MOG23の誘導体であり、ネマトーダのフィーディング構
造における遺伝子発現に使用するプロモーターを「フィ
ッシュ」するための無プロモーターGUS構築物を含んで
いる。
第６図 ディスアームド・ヘルパープラスミドの構築に
使用されるTi−プラスミドpTiB6のフラグメントの制限
地図。
使用されるTi−プラスミドpTiB6のフラグメントの制限
地図。
第７図 アラビドプシスのトランスホーメーションに使
用するアグロバクテリウム（Agrobacterium）MOG101株
のディスアームド・ヘルパーを作製するのに使用される
中間ベクターpMOG579。
用するアグロバクテリウム（Agrobacterium）MOG101株
のディスアームド・ヘルパーを作製するのに使用される
中間ベクターpMOG579。
（発明の概要） 本発明はモノゼニック条件下で植物寄生ネマトーダに
よるアラビドプシス（Arabidopsis）属の植物の根の感
染方法であって、 （ａ）ネマトーダ阻害物質を除いた栄養培地に溶解した
高純度ゲルマトリクスの存在下で植物寄生ネマトーダを
根に接触させる、 （ｂ）フィーディング（feeding,栄養供給）構造を形成
することによりネマトーダを根に感染させる、 以上（ａ）および（ｂ）のステップを含む方法を提供す
る。
よるアラビドプシス（Arabidopsis）属の植物の根の感
染方法であって、 （ａ）ネマトーダ阻害物質を除いた栄養培地に溶解した
高純度ゲルマトリクスの存在下で植物寄生ネマトーダを
根に接触させる、 （ｂ）フィーディング（feeding,栄養供給）構造を形成
することによりネマトーダを根に感染させる、 以上（ａ）および（ｂ）のステップを含む方法を提供す
る。
本発明の別の態様は植物寄生ネマトーダに対する相対
的耐性を有するアラビドプシスのエコタイプまたは変異
体のスクリーニング方法であって、 （ａ）上述の方法を用いて植物寄生ネマトーダを該エコ
タイプに感染させる、 （ｂ）該エコタイプの根に形成したネマトーダのフィー
ディング構造を計数する、 以上（ａ）および（ｂ）のステップを含む方法である。
的耐性を有するアラビドプシスのエコタイプまたは変異
体のスクリーニング方法であって、 （ａ）上述の方法を用いて植物寄生ネマトーダを該エコ
タイプに感染させる、 （ｂ）該エコタイプの根に形成したネマトーダのフィー
ディング構造を計数する、 以上（ａ）および（ｂ）のステップを含む方法である。
さらに、本発明の望ましい態様はネマトーダ阻害物質
を含まない適当な栄養培地中の根支持物質および植物寄
生ネマトーダで感染させ、少なくとも一つのネマトーダ
のフィーディング構造を有する根を含むアラビドプシス
属の植物のメノゼニック植物根システムである。より望
ましい態様には根支持物質が高純度ゲルマトリクスであ
るモノゼニック植物根システムが含まれる。さらに望ま
しい態様は、前記高純度ゲルマトリクスが栄養培地中の
0.8％ダイチン寒天溶液を含み、より望ましくは該培地
が１％スクロースを含む本発明に従うモノゼニック植物
根システムである。
を含まない適当な栄養培地中の根支持物質および植物寄
生ネマトーダで感染させ、少なくとも一つのネマトーダ
のフィーディング構造を有する根を含むアラビドプシス
属の植物のメノゼニック植物根システムである。より望
ましい態様には根支持物質が高純度ゲルマトリクスであ
るモノゼニック植物根システムが含まれる。さらに望ま
しい態様は、前記高純度ゲルマトリクスが栄養培地中の
0.8％ダイチン寒天溶液を含み、より望ましくは該培地
が１％スクロースを含む本発明に従うモノゼニック植物
根システムである。
本発明は、あるエコタイプのアラビドプシス由来の植
物寄生ネマトーダに対する耐性に関する遺伝子の単離方
法であって、 （ａ）上述のいずれかの方法で同定された植物寄生ネマ
トーダに対し比較的高い耐性を有するエコタイプを選択
する、 （ｂ）該比較的高い耐性のエコタイプを前記植物寄生ネ
マトーダの感染を比較的受けやすく、かつスクリーニン
グ可能な遺伝子マーカーに関して明確な遺伝子的バック
グランドを有する別のエコタイプと交配する、 （ｃ）該耐性に関する遺伝子を単離するために該スクリ
ーニング可能なマーカーと該遺伝子の十分に密度な結合
が得られるまで、該交配物の最も高い耐性の子孫と該比
較的低い耐性のエコタイプとの一連のバッグ・クロッシ
ングを通して該スクリーニング可能なマーカーの１つを
植物寄生ネマトーダに対する耐性に関する該遺伝子に結
合する、 （ｄ）該結合に基づいて該植物寄生ネマトーダに対する
耐性に関する該遺伝子を単離する、 以上（ａ）乃至（ｄ）のステップを含む方法に特定の用
途を見いだした。
物寄生ネマトーダに対する耐性に関する遺伝子の単離方
法であって、 （ａ）上述のいずれかの方法で同定された植物寄生ネマ
トーダに対し比較的高い耐性を有するエコタイプを選択
する、 （ｂ）該比較的高い耐性のエコタイプを前記植物寄生ネ
マトーダの感染を比較的受けやすく、かつスクリーニン
グ可能な遺伝子マーカーに関して明確な遺伝子的バック
グランドを有する別のエコタイプと交配する、 （ｃ）該耐性に関する遺伝子を単離するために該スクリ
ーニング可能なマーカーと該遺伝子の十分に密度な結合
が得られるまで、該交配物の最も高い耐性の子孫と該比
較的低い耐性のエコタイプとの一連のバッグ・クロッシ
ングを通して該スクリーニング可能なマーカーの１つを
植物寄生ネマトーダに対する耐性に関する該遺伝子に結
合する、 （ｄ）該結合に基づいて該植物寄生ネマトーダに対する
耐性に関する該遺伝子を単離する、 以上（ａ）乃至（ｄ）のステップを含む方法に特定の用
途を見いだした。
さらに本発明の実施態様は、前段の方法を使用して得
た、植物寄生ネマトードに対する相対的耐性に関連する
遺伝子を含む。
た、植物寄生ネマトードに対する相対的耐性に関連する
遺伝子を含む。
さらに、本発明の態様にはアラビドプシス属の植物か
らネマトーダのフィーディング構造において遺伝子発現
を遂行しうるプロモーターを単離する方法であって、 （ａ）植物中で活性なプロモーターを含まないスクリー
ニングまたは選択可能なマーカーをコードする構造遺伝
子コード配列を含む組み換えポリヌクレオチドでアラビ
ドプシス属の植物細胞をトランスホームする、 （ｂ）ステップ（ａ）でトランスホームした細胞から形
質転換植物全体を生成する、 （ｃ）ステップ（ｂ）で得られた植物の根に上述の方法
のいずれか１つを用いて該根にフィーディング構造を作
りうる植物寄生ネマトーダを感染させる、 （ｄ）根にフィーディング構造を有する植物を選択す
る、 （ｅ）該フィーディング構造中に該選択またはスクリー
ニング可能なマーカーが存在する植物の根を選択する、
および （ｆ）ステップ（ｅ）で選択した植物のゲノムから該構
造遺伝子コード配列の発現を起こし、かつ、該選択また
はスクリーニング可能なマーカーをコードする構造遺伝
子コード配列の上流に存在するプローモーターを単離す
る、 以上（ａ）乃至（ｆ）のステップを含む方法が含まれ
る。また、本発明は該方法で得られたプロモーターを含
む。
らネマトーダのフィーディング構造において遺伝子発現
を遂行しうるプロモーターを単離する方法であって、 （ａ）植物中で活性なプロモーターを含まないスクリー
ニングまたは選択可能なマーカーをコードする構造遺伝
子コード配列を含む組み換えポリヌクレオチドでアラビ
ドプシス属の植物細胞をトランスホームする、 （ｂ）ステップ（ａ）でトランスホームした細胞から形
質転換植物全体を生成する、 （ｃ）ステップ（ｂ）で得られた植物の根に上述の方法
のいずれか１つを用いて該根にフィーディング構造を作
りうる植物寄生ネマトーダを感染させる、 （ｄ）根にフィーディング構造を有する植物を選択す
る、 （ｅ）該フィーディング構造中に該選択またはスクリー
ニング可能なマーカーが存在する植物の根を選択する、
および （ｆ）ステップ（ｅ）で選択した植物のゲノムから該構
造遺伝子コード配列の発現を起こし、かつ、該選択また
はスクリーニング可能なマーカーをコードする構造遺伝
子コード配列の上流に存在するプローモーターを単離す
る、 以上（ａ）乃至（ｆ）のステップを含む方法が含まれ
る。また、本発明は該方法で得られたプロモーターを含
む。
（本発明の詳細な説明） もしも、培地が以下の条件、 ａ）マトリクスは十分な保水能を有するがアラビドプシ
スの根への感染性幼若ネマトーダの侵入に対して十分な
機械的支持体を提供する物であり、また、生理学的pHで
使用する栄養培地に溶解し、ゲル化の前にオートクレー
ブ可能で、かつ望ましくは感染した根系のルーチン分析
のために透明である、 ｂ）栄養培地は植物寄生ネマトーダを含む根の水栽培に
適した物である、 ｃ）基本的にネマトーダ阻害物質は含まない、 を満足する高純度マトリクス（組織培養用寒天など）を
含む根支持物質を含むならば、モノゼニック条件下、ア
ラビドプシス サリアナの根において、ある範囲のネマ
トーダ種（この中には包嚢ネマトーダのヘテロデラ シ
ャクチ、H.トリホリ（trifolii）、H.カジャニ（cajan
i）、ルート・ノット・ネマトーダのメロニドジン イ
ンコグニタ（Meloidogyne incognita）およびM.アレナ
リア（arenaria）および移動性ネマトーダのプラチリン
カス ペネトランス（Pratylenchus penetrans）があ
る）が生育しうることが分かった。望ましいゲルマトリ
クスには適当な栄養培地に溶かした組織培養用寒天（例
えば、ダイチン寒天）が含まれる。適当な培地は、ムラ
シゲ（Murashige）およびスコーグ（Skoog）培地（196
2）、または植物の根におけるネマトーダ培養に使用さ
れる培地（ドロプキン（Dropkin）およびボーン（Boon
e）、1966）など従来の組織培養培地から選択しうる。
特に優れた結果は、以後シモンズ培地と呼ばれる2.5mK
K+、1.27mM Ca2+、0.2mM Mg2+、2.54mM NO3 -、0.5mM H2
PO4 -、0.2mM SO4 2-、２μM Na2+、1.8μM Mn2+、0.14
μM Zn2+、60nM Cu2+、24nM Co2+、24μM Cl-、９μM B
O3 3-、60nM MoO4 2-、20μM Fe3+NaEDTA、pH6.4、１％
（W/V）スクロースおよび0.8％（W/V）ダイチン寒天を
含む培地を用いて得られる。さらに、培養培地の至適化
は特定のネマトーダ・アラビドプシス相互作用の感染速
度を促進することで行いうるが、この事も本発明の範囲
内にある。本明細書に記述されている全てのネマトーダ
は前記培地において単一の根系に対する多重感染を示
し、アラビドプシスの根に寄生しつつ完全な生活環を作
り上げる。幼若グロボデラ ロストチエンシス（Globod
era rostochiensis）は、このようなモノゼニック条件
でその根に感染しうるが、感染部位の強いネクロシスが
ネマトーダの発育を妨げる。幼若ヘテロデラ ゲッチン
ギアナ（Heterodera goettingiana）は寒天中でアラビ
ドプシスの根により強く活性化されるが、侵入部位で根
が破壊され幼若体の発育は見られない。
スの根への感染性幼若ネマトーダの侵入に対して十分な
機械的支持体を提供する物であり、また、生理学的pHで
使用する栄養培地に溶解し、ゲル化の前にオートクレー
ブ可能で、かつ望ましくは感染した根系のルーチン分析
のために透明である、 ｂ）栄養培地は植物寄生ネマトーダを含む根の水栽培に
適した物である、 ｃ）基本的にネマトーダ阻害物質は含まない、 を満足する高純度マトリクス（組織培養用寒天など）を
含む根支持物質を含むならば、モノゼニック条件下、ア
ラビドプシス サリアナの根において、ある範囲のネマ
トーダ種（この中には包嚢ネマトーダのヘテロデラ シ
ャクチ、H.トリホリ（trifolii）、H.カジャニ（cajan
i）、ルート・ノット・ネマトーダのメロニドジン イ
ンコグニタ（Meloidogyne incognita）およびM.アレナ
リア（arenaria）および移動性ネマトーダのプラチリン
カス ペネトランス（Pratylenchus penetrans）があ
る）が生育しうることが分かった。望ましいゲルマトリ
クスには適当な栄養培地に溶かした組織培養用寒天（例
えば、ダイチン寒天）が含まれる。適当な培地は、ムラ
シゲ（Murashige）およびスコーグ（Skoog）培地（196
2）、または植物の根におけるネマトーダ培養に使用さ
れる培地（ドロプキン（Dropkin）およびボーン（Boon
e）、1966）など従来の組織培養培地から選択しうる。
特に優れた結果は、以後シモンズ培地と呼ばれる2.5mK
K+、1.27mM Ca2+、0.2mM Mg2+、2.54mM NO3 -、0.5mM H2
PO4 -、0.2mM SO4 2-、２μM Na2+、1.8μM Mn2+、0.14
μM Zn2+、60nM Cu2+、24nM Co2+、24μM Cl-、９μM B
O3 3-、60nM MoO4 2-、20μM Fe3+NaEDTA、pH6.4、１％
（W/V）スクロースおよび0.8％（W/V）ダイチン寒天を
含む培地を用いて得られる。さらに、培養培地の至適化
は特定のネマトーダ・アラビドプシス相互作用の感染速
度を促進することで行いうるが、この事も本発明の範囲
内にある。本明細書に記述されている全てのネマトーダ
は前記培地において単一の根系に対する多重感染を示
し、アラビドプシスの根に寄生しつつ完全な生活環を作
り上げる。幼若グロボデラ ロストチエンシス（Globod
era rostochiensis）は、このようなモノゼニック条件
でその根に感染しうるが、感染部位の強いネクロシスが
ネマトーダの発育を妨げる。幼若ヘテロデラ ゲッチン
ギアナ（Heterodera goettingiana）は寒天中でアラビ
ドプシスの根により強く活性化されるが、侵入部位で根
が破壊され幼若体の発育は見られない。
H.シャクチに対する耐性に関する74種のエコタイプの
アラビドプシスの予備的スクリーニングから感染率の範
囲が分かった（植物当たり1.7乃至11.1個の雌株の範
囲）。このことは、アラビドプシスのエコタイプの遺伝
子的背景がネマトーダの病原性に影響していることを示
している。そこで、我々は現在の分子生物学的手法で該
植物から優性の耐性遺伝子を同定および単離する可能性
を予測した。モノゼニック条件での感染の成功数は簡単
に評価しうる（染色または破壊的根分析無しに）。この
事はスクリーニングにおける土壌の使用を排除し、さら
に、モノゼニック培養システムに組み込まれる。ネマト
ーダ耐性を検定して高く評価された植物は、直ちに種子
収穫に向けて開花条件に誘導しうる。根の中で形成する
フィーディング構造は低倍率で観察でき、混入細胞の少
ない単離物を簡単に得ることができる。これらのフィー
ディング構造は、特異的にこれらの構造内で発現される
RNAの優れた原料となる。この事は、望ましくは分子濃
縮操作（デッキンソン（Dickinson）等、1991）を用い
たこれらのRNAに対応する遺伝子の単離を可能にする。
（アンチ）センス遺伝子がフィーディング構造の発達ま
たは維持に必要な遺伝子を指向する（アンチ）センス法
を用いて、これらを特異的に阻害しうる。別に、そのよ
うな必須遺伝子に関連するプロモーターをネマトーダの
正常なフィーディング構造の発達または正常なフィーデ
ィング行動を阻害する遺伝子の発現を促進するのに使用
しうる。
アラビドプシスの予備的スクリーニングから感染率の範
囲が分かった（植物当たり1.7乃至11.1個の雌株の範
囲）。このことは、アラビドプシスのエコタイプの遺伝
子的背景がネマトーダの病原性に影響していることを示
している。そこで、我々は現在の分子生物学的手法で該
植物から優性の耐性遺伝子を同定および単離する可能性
を予測した。モノゼニック条件での感染の成功数は簡単
に評価しうる（染色または破壊的根分析無しに）。この
事はスクリーニングにおける土壌の使用を排除し、さら
に、モノゼニック培養システムに組み込まれる。ネマト
ーダ耐性を検定して高く評価された植物は、直ちに種子
収穫に向けて開花条件に誘導しうる。根の中で形成する
フィーディング構造は低倍率で観察でき、混入細胞の少
ない単離物を簡単に得ることができる。これらのフィー
ディング構造は、特異的にこれらの構造内で発現される
RNAの優れた原料となる。この事は、望ましくは分子濃
縮操作（デッキンソン（Dickinson）等、1991）を用い
たこれらのRNAに対応する遺伝子の単離を可能にする。
（アンチ）センス遺伝子がフィーディング構造の発達ま
たは維持に必要な遺伝子を指向する（アンチ）センス法
を用いて、これらを特異的に阻害しうる。別に、そのよ
うな必須遺伝子に関連するプロモーターをネマトーダの
正常なフィーディング構造の発達または正常なフィーデ
ィング行動を阻害する遺伝子の発現を促進するのに使用
しうる。
アラビドプシス サリアナのエコタイプに関する真正
ネマトーダの培養条件の発達は植物寄生ネマトーダに対
する耐性が高い植物を開発する未知の可能性を提供す
る。
ネマトーダの培養条件の発達は植物寄生ネマトーダに対
する耐性が高い植物を開発する未知の可能性を提供す
る。
以下に示す特徴は説明のためにある程度詳しく述べら
れているが、本発明の範囲を制限する物ではない。
れているが、本発明の範囲を制限する物ではない。
Ｉ 植物寄生ネマトーダに対する耐性を増加するために
商業的に重要な穀物植物に導入しうるネマトーダ耐性遺
伝子を得るための最初の一般的な方法であって、一般に
以下のステップ、 １）本発明の感染法を用いて適合性（即ち、感染性）ネ
マトーダを根に感染することによりネマトーダに対する
耐性に関してアラビドプシス（Arabidopsis）のエコタ
イプをスクリーニングし、耐性植物系列を選択し、およ
び望ましくは反復バッククロスを通して該エコタイプを
遺伝的に均一化する、 ２）子孫のネマトーダ耐性をスクリーニングするために
本発明の培地条件を再び使用してアラビドプシス サリ
アナのエコタイプ、コロンビア（Columbia）またはラン
ズバーグ エレクタ、または遺伝的背景が明確であり、
かつネマトーダに対する感受性を有するその他のエコタ
イプと（アイソジェニック）耐性系列との交配を通して
耐性を決定している遺伝子（群）をマッピングする、 ３）Ｔ−DNA挿入突然変異誘発（フェルドマン（Feldman
n）、1991）、トランスポゾン・タッギング（アルトマ
ン（Altmann）等、1991）またはRFLPマッピングおよび
染色体ウォーキング（ブレーカー（Bleecker）等、199
1）等の遺伝子タッギング法を用いることにより前記耐
性エコタイプからマッピングされたネマトーダ耐性（N
R）遺伝子を単離する；最初の方法では、Ｔ−DNAの挿入
を通して飽和突然変異誘発を起こすのにアグロバクテリ
ウムを使用し、その後トランスホームした集団から耐性
遺伝子を持つ変異体をスクリーニングする。Ｔ−DNAフ
ラグメントによる探索およびインバーティドPCR増幅が
隣接する配列の単離を可能にする。これらは順番に変異
体系列に再トランスホームしうる周囲のDNAフラグメン
トのクローニングを可能にし、NR−遺伝子を含むクロー
ンの発現型による選択を可能にする。第２の方法では、
Acトランスポゼイス等のトランスポゾンがトマト（デッ
キンソン（Dickinson）、1991）またはアラビドプシス
（アルトマン（Altmann）等、1991）等の異種植物でも
働くことが示された。NR−遺伝子のトランスポゾン突然
変異誘発に使用しうる、NR−遺伝子に近接して連結され
たAc要素を有するトランスジェニック植物を（RFLPマッ
ピングにより）選択する。第１の方法に関して上述した
ステップに続くAc配列による探索およびインバーティド
PCR増幅は隣接する配列の単離を可能にする。第３の方
法はNR−遺伝子の同定および単離を目的としたRFLPマッ
ピングとそれに続く染色体ウォーキングに関する（ブリ
ーカー（Bleecker）、1991）。
商業的に重要な穀物植物に導入しうるネマトーダ耐性遺
伝子を得るための最初の一般的な方法であって、一般に
以下のステップ、 １）本発明の感染法を用いて適合性（即ち、感染性）ネ
マトーダを根に感染することによりネマトーダに対する
耐性に関してアラビドプシス（Arabidopsis）のエコタ
イプをスクリーニングし、耐性植物系列を選択し、およ
び望ましくは反復バッククロスを通して該エコタイプを
遺伝的に均一化する、 ２）子孫のネマトーダ耐性をスクリーニングするために
本発明の培地条件を再び使用してアラビドプシス サリ
アナのエコタイプ、コロンビア（Columbia）またはラン
ズバーグ エレクタ、または遺伝的背景が明確であり、
かつネマトーダに対する感受性を有するその他のエコタ
イプと（アイソジェニック）耐性系列との交配を通して
耐性を決定している遺伝子（群）をマッピングする、 ３）Ｔ−DNA挿入突然変異誘発（フェルドマン（Feldman
n）、1991）、トランスポゾン・タッギング（アルトマ
ン（Altmann）等、1991）またはRFLPマッピングおよび
染色体ウォーキング（ブレーカー（Bleecker）等、199
1）等の遺伝子タッギング法を用いることにより前記耐
性エコタイプからマッピングされたネマトーダ耐性（N
R）遺伝子を単離する；最初の方法では、Ｔ−DNAの挿入
を通して飽和突然変異誘発を起こすのにアグロバクテリ
ウムを使用し、その後トランスホームした集団から耐性
遺伝子を持つ変異体をスクリーニングする。Ｔ−DNAフ
ラグメントによる探索およびインバーティドPCR増幅が
隣接する配列の単離を可能にする。これらは順番に変異
体系列に再トランスホームしうる周囲のDNAフラグメン
トのクローニングを可能にし、NR−遺伝子を含むクロー
ンの発現型による選択を可能にする。第２の方法では、
Acトランスポゼイス等のトランスポゾンがトマト（デッ
キンソン（Dickinson）、1991）またはアラビドプシス
（アルトマン（Altmann）等、1991）等の異種植物でも
働くことが示された。NR−遺伝子のトランスポゾン突然
変異誘発に使用しうる、NR−遺伝子に近接して連結され
たAc要素を有するトランスジェニック植物を（RFLPマッ
ピングにより）選択する。第１の方法に関して上述した
ステップに続くAc配列による探索およびインバーティド
PCR増幅は隣接する配列の単離を可能にする。第３の方
法はNR−遺伝子の同定および単離を目的としたRFLPマッ
ピングとそれに続く染色体ウォーキングに関する（ブリ
ーカー（Bleecker）、1991）。
４）例えば、グルクロニダーゼ等のマーカー遺伝子を用
いたプロモーター分析を通じて、感染部位で防御するよ
うに植物中で機能するプロモーターを同定および単離す
る、 ５）発現カセット中にプロモーターの後ろの前記NR−遺
伝子をクローニングする；多くの場合、発現カセットへ
のクローニング後、直接自分自身のプロモーターを伴う
全耐性遺伝子を使用しうる。
いたプロモーター分析を通じて、感染部位で防御するよ
うに植物中で機能するプロモーターを同定および単離す
る、 ５）発現カセット中にプロモーターの後ろの前記NR−遺
伝子をクローニングする；多くの場合、発現カセットへ
のクローニング後、直接自分自身のプロモーターを伴う
全耐性遺伝子を使用しうる。
６）新しい植物を生成しうる植物体に前記発現カセット
を導入する、 ７）該トランスホーム植物から新しい植物体を生成す
る、 を含む方法。
を導入する、 ７）該トランスホーム植物から新しい植物体を生成す
る、 を含む方法。
その後、本発明の感染方法を用い、ネマトーダで感染
した土壌中またはモノゼニック条件下での植物の成育を
介して、ネマトードをその上で培養できるトランスホー
ム植物をネマトード耐性に関してアッセイできる。
した土壌中またはモノゼニック条件下での植物の成育を
介して、ネマトードをその上で培養できるトランスホー
ム植物をネマトード耐性に関してアッセイできる。
II 植物寄生ネマトーダに対する耐性を増加するために
商業的に重要な植物に導入しうるネマトーダ耐性遺伝子
を得るための第２の典型的方法は、一般に以下に示すス
テップ、 １）本発明に従う感染方法を用いて非適合性（即ち、非
感染性）ネマトーダ（例えば、グロボデラ ロストチエ
ンシス（Globodera rostochiensis）またはH.ゲッチン
ギアナ（goettingiana））を根に感染させることにより
ネマトーダに対する感受性でアラビドプシスのエコタイ
プまたは耐性エコタイプの変異体をスクリーニングし、
感受性植物系列を選択し、かつ望ましくは反復するバッ
ククロスにより該エコタイプをアイソジェニックにす
る、 ２）再度本発明に従う培地条件を用いた（アイソジェニ
ックな）感受性エコタイプまたは変異体との交配を通じ
て、例えばアラビドプシス サリアナのエコタイプ、コ
ロンビアまたはランズバーグ エレクタからの耐性遺伝
子をマッピングする、 ３）乃至７）はＩの方法と同様である、 を含んでいる。
商業的に重要な植物に導入しうるネマトーダ耐性遺伝子
を得るための第２の典型的方法は、一般に以下に示すス
テップ、 １）本発明に従う感染方法を用いて非適合性（即ち、非
感染性）ネマトーダ（例えば、グロボデラ ロストチエ
ンシス（Globodera rostochiensis）またはH.ゲッチン
ギアナ（goettingiana））を根に感染させることにより
ネマトーダに対する感受性でアラビドプシスのエコタイ
プまたは耐性エコタイプの変異体をスクリーニングし、
感受性植物系列を選択し、かつ望ましくは反復するバッ
ククロスにより該エコタイプをアイソジェニックにす
る、 ２）再度本発明に従う培地条件を用いた（アイソジェニ
ックな）感受性エコタイプまたは変異体との交配を通じ
て、例えばアラビドプシス サリアナのエコタイプ、コ
ロンビアまたはランズバーグ エレクタからの耐性遺伝
子をマッピングする、 ３）乃至７）はＩの方法と同様である、 を含んでいる。
この説明に使用される語句「耐性遺伝子」は、ジーン
・フォ・ジーンモデルで説明されるような認識反応に関
する遺伝子に限定されないことを理解すべきである。最
初の方法で述べた適合性ネマトーダを用いた変異体のス
クリーニングにおいて、フィーデング構造の誘導または
維持等、初期認識相後のステップに必須の変異遺伝子に
遭遇することがある。このような必須の遺伝子（以後必
須遺伝子と呼ぶ）中の変異は本発明で示されている培養
条件で耐性の発現型を供与し、このような変異を有する
遺伝子が同定されうる。
・フォ・ジーンモデルで説明されるような認識反応に関
する遺伝子に限定されないことを理解すべきである。最
初の方法で述べた適合性ネマトーダを用いた変異体のス
クリーニングにおいて、フィーデング構造の誘導または
維持等、初期認識相後のステップに必須の変異遺伝子に
遭遇することがある。このような必須の遺伝子（以後必
須遺伝子と呼ぶ）中の変異は本発明で示されている培養
条件で耐性の発現型を供与し、このような変異を有する
遺伝子が同定されうる。
III 以下のステップは、後者のカテゴリーに属するネ
マトーダ耐性遺伝子であって、植物寄生ネマトーダに対
する耐性を増加する目的で商業的に重要な穀物植物に導
入しうる遺伝子を得るIIIの方法を示している。
マトーダ耐性遺伝子であって、植物寄生ネマトーダに対
する耐性を増加する目的で商業的に重要な穀物植物に導
入しうる遺伝子を得るIIIの方法を示している。
１）本発明の方法に従い適合性ネマトーダを根に感染さ
せてアラビドプシスの感受性エコタイプの変異体を耐性
によりスクリーニングすることにより寄生性ネマトーダ
の病原性における何処かのステップで必須の必須遺伝子
における変異を同定する、 ２）例えば、アラビドプシス サリアナのエコタイプ、
コロンビアまたはランズバーグ エレクタとの交配を通
じて耐性遺伝子をマッピングする、 ３）方法Ｉのステップ３）で示したような相補実験によ
り該遺伝子のプロモーターを含む変異遺伝子の野生型相
当物（もし変異が劣性なら）または該変異体由来の変異
遺伝子（もし変異が優性なら）を単離する、 ４）適当なプロモーターの後側のアンチセンス方向に該
野生型遺伝子をクローニングする、および ５）乃至７）は、NR−遺伝子がプロモーターに関してア
ンチセンス方向に存在するという条件でＩの方法で述べ
たステップと同様である。
せてアラビドプシスの感受性エコタイプの変異体を耐性
によりスクリーニングすることにより寄生性ネマトーダ
の病原性における何処かのステップで必須の必須遺伝子
における変異を同定する、 ２）例えば、アラビドプシス サリアナのエコタイプ、
コロンビアまたはランズバーグ エレクタとの交配を通
じて耐性遺伝子をマッピングする、 ３）方法Ｉのステップ３）で示したような相補実験によ
り該遺伝子のプロモーターを含む変異遺伝子の野生型相
当物（もし変異が劣性なら）または該変異体由来の変異
遺伝子（もし変異が優性なら）を単離する、 ４）適当なプロモーターの後側のアンチセンス方向に該
野生型遺伝子をクローニングする、および ５）乃至７）は、NR−遺伝子がプロモーターに関してア
ンチセンス方向に存在するという条件でＩの方法で述べ
たステップと同様である。
別に、特定の場合には内在性遺伝子を取り込んだ相同
的遺伝子の発現で抑制する「センス」法（ナポリ（Napo
li）等、1990、バンデルクロール（Van der Krol）等、
1990）も利用しうる。
的遺伝子の発現で抑制する「センス」法（ナポリ（Napo
li）等、1990、バンデルクロール（Van der Krol）等、
1990）も利用しうる。
この方法（III）では、NR−遺伝子が事実上（そのま
まの）「必須遺伝子」であるが、過剰発現され、過剰発
現の阻害効果により「必須遺伝子」が本発明に従うネマ
トーダ耐性遺伝子となる。
まの）「必須遺伝子」であるが、過剰発現され、過剰発
現の阻害効果により「必須遺伝子」が本発明に従うネマ
トーダ耐性遺伝子となる。
IV また、上述のIIIの方法においてアラビドプシスか
ら単離される耐性遺伝子は、農業的に重要な他の植物種
から相同的遺伝子およびそれらの特定のプロモーターを
単離するためのプローブとして使用しうる。
ら単離される耐性遺伝子は、農業的に重要な他の植物種
から相同的遺伝子およびそれらの特定のプロモーターを
単離するためのプローブとして使用しうる。
Ｖ また、培養方法は、同調感染または根からのフィー
ディング構造の切り出しの必要もなく該構造組織を容易
に豊富にする（enrichment）方法を提供する。アラビド
プシスの根の内部に発達するフィーディング構造は、周
囲の上皮および柔組織の大きさの数倍になり、従って、
低倍率の顕微鏡下でさえ混入細胞を最小限に抑えて容易
に単離しうる。このような組織サンプルから単離したメ
ッセンジャーRNAは、この感染段階で特異的に発現され
る遺伝子の同定を目的とした基礎cDNAライブラリーの開
発およびスクリーニングに使用しうる（ディッキンソン
（Dickinson）等、1991）。この操作を通じて、フィー
ディング構造組織に特異的であり、かつ、恐らくフィー
ディング構造の誘導または維持に必要な遺伝子が単離さ
れ、かつ、IIIの方法で述べた（アンチ）センス法で使
用しうる。
ディング構造の切り出しの必要もなく該構造組織を容易
に豊富にする（enrichment）方法を提供する。アラビド
プシスの根の内部に発達するフィーディング構造は、周
囲の上皮および柔組織の大きさの数倍になり、従って、
低倍率の顕微鏡下でさえ混入細胞を最小限に抑えて容易
に単離しうる。このような組織サンプルから単離したメ
ッセンジャーRNAは、この感染段階で特異的に発現され
る遺伝子の同定を目的とした基礎cDNAライブラリーの開
発およびスクリーニングに使用しうる（ディッキンソン
（Dickinson）等、1991）。この操作を通じて、フィー
ディング構造組織に特異的であり、かつ、恐らくフィー
ディング構造の誘導または維持に必要な遺伝子が単離さ
れ、かつ、IIIの方法で述べた（アンチ）センス法で使
用しうる。
VI 本発明の根システムはフィーディング構造中の遺伝
子、望ましくは耐性遺伝子を発現しうるプロモーターの
簡便な単離に使用しうる。このようなプロモーターは、
例えばインターポゾン・タッギング（トッピング（Topp
ing）等、1991,Developm.112,1009−1019;コンク（Konc
z）,C.等、（1989）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,8467−8
471）により単離される。Ｔ−DNAのランダム組み込みが
フィーディング構造中で活性なプロモーター配列の同定
を可能にする。このタイプのプロモーター配列のインタ
ーポゾン・タッギングは特にアラビドプシス（カートバ
ンディット（Kertbundit）等、1991,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA 88,5212−5216）およびタバコ（トッピング（Top
ping）等、1991,Developm.112,1009−1019）でよく確立
されている。GUS構造遺伝子コード配列の上流にタッグ
されたプロモーター配列は、例えばインバーティド・ポ
リメレース・チェーン・リアクション（ドス（Does）
等、1991,Plant Mol.Biol.17,151−153）で単離しう
る。一度適当な調節配列が同定されるか、またはフィー
ディング構造内で転写された遺伝子が同定されれば、そ
れらを他の植物種の相同配列の単離を目的としたプロー
ブとして使用しうる。
子、望ましくは耐性遺伝子を発現しうるプロモーターの
簡便な単離に使用しうる。このようなプロモーターは、
例えばインターポゾン・タッギング（トッピング（Topp
ing）等、1991,Developm.112,1009−1019;コンク（Konc
z）,C.等、（1989）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,8467−8
471）により単離される。Ｔ−DNAのランダム組み込みが
フィーディング構造中で活性なプロモーター配列の同定
を可能にする。このタイプのプロモーター配列のインタ
ーポゾン・タッギングは特にアラビドプシス（カートバ
ンディット（Kertbundit）等、1991,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA 88,5212−5216）およびタバコ（トッピング（Top
ping）等、1991,Developm.112,1009−1019）でよく確立
されている。GUS構造遺伝子コード配列の上流にタッグ
されたプロモーター配列は、例えばインバーティド・ポ
リメレース・チェーン・リアクション（ドス（Does）
等、1991,Plant Mol.Biol.17,151−153）で単離しう
る。一度適当な調節配列が同定されるか、またはフィー
ディング構造内で転写された遺伝子が同定されれば、そ
れらを他の植物種の相同配列の単離を目的としたプロー
ブとして使用しうる。
以下の実施例はさらに本発明を説明するものである。
実験 ネマトーダ種の維持および滅菌に関して本セクション
で述べられている方法は、ネマトロジーの分野でのルー
チン操作であり本発明の一部ではない。
で述べられている方法は、ネマトロジーの分野でのルー
チン操作であり本発明の一部ではない。
植物の培養 アラビドプシスの種子を70％エタノールに２分間浸漬
し、次いで該種子の汚染の程度によっても0.8％Ca（OCl
2）、0.05％Tween 20中５分間、または５％Ca（OC
l2）、0.05％Tween 20中８分間浸漬して表面を滅菌し
た。滅菌した種子を滅菌水で少なくとも３回洗浄し、寒
天を含む生育培地に移した。
し、次いで該種子の汚染の程度によっても0.8％Ca（OCl
2）、0.05％Tween 20中５分間、または５％Ca（OC
l2）、0.05％Tween 20中８分間浸漬して表面を滅菌し
た。滅菌した種子を滅菌水で少なくとも３回洗浄し、寒
天を含む生育培地に移した。
ネマトーダのモノゼニックな発育のための至適培地に
は、2.5mM K+、1.27mM Ca2+、0.2mM Mg2+、2.54mM NO3 -
0.5mM H2 PO4 -、0.2mM SO4 2-2μM Na2+、1.8μM Mn2+、
0.14μM Zn2+、60nM Cu2+、24nM Co2+、24nM Cl-、９μ
M BO3 3-、60nM MoO4 2-が含まれる。鉄は20μM Fe3+NaET
DAとして添加された。pHは1N KOHでpH6.4に調整した。
滅菌（110℃、20分間）の直前に、１％（W/V）スクロー
スおよび0.8％（W/V）ダイチン寒天（ブランシュウィグ
・ケミーBV,POB 70213,アムステルダム、オランダ）を
添加した。15個の種子を入れた9cmシャーレまたはウェ
ル当たり２個の種子を入れた24穴組織培養プレート（グ
レイナー製、ドイツ）を培地条件の研究に使用した。エ
コタイプのスクリーニングには24穴プレートを使用し
た。種々のネマトーダをテストする時には種子をシャー
レの上半分に１列に整列させた。３日の発芽期間の後、
根が下方に成育するようにプレートを僅かに傾けた。こ
のプレートをパラフィルムでシールし、23−25℃に16時
間L/8時間Ｄ維持した。
は、2.5mM K+、1.27mM Ca2+、0.2mM Mg2+、2.54mM NO3 -
0.5mM H2 PO4 -、0.2mM SO4 2-2μM Na2+、1.8μM Mn2+、
0.14μM Zn2+、60nM Cu2+、24nM Co2+、24nM Cl-、９μ
M BO3 3-、60nM MoO4 2-が含まれる。鉄は20μM Fe3+NaET
DAとして添加された。pHは1N KOHでpH6.4に調整した。
滅菌（110℃、20分間）の直前に、１％（W/V）スクロー
スおよび0.8％（W/V）ダイチン寒天（ブランシュウィグ
・ケミーBV,POB 70213,アムステルダム、オランダ）を
添加した。15個の種子を入れた9cmシャーレまたはウェ
ル当たり２個の種子を入れた24穴組織培養プレート（グ
レイナー製、ドイツ）を培地条件の研究に使用した。エ
コタイプのスクリーニングには24穴プレートを使用し
た。種々のネマトーダをテストする時には種子をシャー
レの上半分に１列に整列させた。３日の発芽期間の後、
根が下方に成育するようにプレートを僅かに傾けた。こ
のプレートをパラフィルムでシールし、23−25℃に16時
間L/8時間Ｄ維持した。
ネマトーダの維持 これらの研究に使用した種々のネマトーダは、ポット
培養物として維持するか、または表１に示されているよ
うに各宿主の野外集団からサンプリングした。H.シャク
チのモノゼニック・ストック培養物は、試験管内で６週
間シナピス・アルバcv.アルバトロス（Sinapis alva c
v.Albatros）を用いて維持し、使用まで４℃で保存した
（グランドラー（Grundler）,1989）。
培養物として維持するか、または表１に示されているよ
うに各宿主の野外集団からサンプリングした。H.シャク
チのモノゼニック・ストック培養物は、試験管内で６週
間シナピス・アルバcv.アルバトロス（Sinapis alva c
v.Albatros）を用いて維持し、使用まで４℃で保存した
（グランドラー（Grundler）,1989）。
ネマトーダの滅菌 破壊した新鮮な包嚢またはメロイドギン（Meloidogyn
e）の場合はハンドピックしたタマゴからタマゴ・サス
ペンジョンを調製した。このサスペンジョンをニトロセ
ルロース・メンブレン（シュレイチャー・アンド・シュ
エル製、ポアサイズ５μｍ）を装着した無菌的スウィネ
ックス・ディスク・フィルター・ホルダーまたはプラス
チック・リングに固定した20μｍナイロンガーゼに載せ
た。フィルター上のタマゴを0.1％HgCl2で４分間処理
し、5mlの滅菌水で４回洗浄した（グランドラー（Grund
ler）,1989）。滅菌したタマゴをメンブレンから寒天表
面にすくい落とした。
e）の場合はハンドピックしたタマゴからタマゴ・サス
ペンジョンを調製した。このサスペンジョンをニトロセ
ルロース・メンブレン（シュレイチャー・アンド・シュ
エル製、ポアサイズ５μｍ）を装着した無菌的スウィネ
ックス・ディスク・フィルター・ホルダーまたはプラス
チック・リングに固定した20μｍナイロンガーゼに載せ
た。フィルター上のタマゴを0.1％HgCl2で４分間処理
し、5mlの滅菌水で４回洗浄した（グランドラー（Grund
ler）,1989）。滅菌したタマゴをメンブレンから寒天表
面にすくい落とした。
微生物の寄託 大腸菌Ｋ−12 DH5α株中のバイナリーベクターpMOG23
は、受理番号CBS102.90で1990年１月29日、オランダ、
バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャ
ーズに寄託されている。
は、受理番号CBS102.90で1990年１月29日、オランダ、
バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャ
ーズに寄託されている。
実施例１ アラビドプシスの感染に関する培養条件 J2を含むH.シャクチの無菌的包嚢を成育する根の周辺
から直接切り出すか、または200μｍメッシュのプラス
チック製フルイに移し、3mM ZnCl2の孵化刺激溶液を入
れたシールされたガラスロートに入れる。暗所３日後
（25℃）孵化したJ2を収穫し、滅菌水で３度洗浄した
後、再生産可能な接種用に0.5％のゲルライトに懸濁し
た。接種は実験のタイプに応じて破壊した包嚢または植
物当たり25−70の幼若体の種蒔き後７−10日目に行っ
た。全ての操作は最低45個の植物について無菌条件で行
った。
から直接切り出すか、または200μｍメッシュのプラス
チック製フルイに移し、3mM ZnCl2の孵化刺激溶液を入
れたシールされたガラスロートに入れる。暗所３日後
（25℃）孵化したJ2を収穫し、滅菌水で３度洗浄した
後、再生産可能な接種用に0.5％のゲルライトに懸濁し
た。接種は実験のタイプに応じて破壊した包嚢または植
物当たり25−70の幼若体の種蒔き後７−10日目に行っ
た。全ての操作は最低45個の植物について無菌条件で行
った。
モノゼニック培養における感染の成功数に関する種々
の寒天の影響を第１図に示した。植物当たりの感染成功
数に関する植物当たりの雌株生育数の数に関する種々の
培地、スクロース濃度およびダイチン寒天濃度の効果は
第２図に示した。以下に示すエコタイプのアラビドプシ
スについてテストした。An−1,Ba−1,Bch−1,Bl−1,Bla
−1,Bn−0,Bor−0,Cal−0,Chi−0,Ci−0,Co−4,Col−0,
Ct−1,Cvi−0,Edi−0,En−2,Esc−0,Est−0,For−1,Gd
−1,G−0,Gre−0,Ha−0,Hl−0,Hm−0,Hs−0,Ita−0,K
−0,Kil−0,Kin−0,Kl−0,Kr−0,La−0,La−er,Lan−
0,Lc−0,Ll−0,Map−0,Mc−0,Mh−0,Mr−0,Ms−0,Old−
2,Ove−0,Pa−3,Per−1,Pi−0,Pla−0,Po−0,Pt−0,Rou
−0,Rsch−0,Sac−0,Sah−0,Se−0,Sei−0,Set−0,Sf−
0,Sr−0,Stw−0,Su−0,Sue−0,Sy−0,Ts−1,Tu−0,Tul
−0,Ty−0,Wa−1,Wc−1,Wil−3,Ws−0,Wt−1,Yo−0,Ze
−０。コードはAISシードバンク・リスト（クランツ（K
ranz）およびカルクヘイム（Kirchheim）,1987）のコー
ドに従った。最も耐性の高いエコタイプ（即ち、植物当
たりの雌株発育平均数が最も低い）は、Sah−０、La−
０およびKil−０であった。最も感受性の高いエコタイ
プはGre−０およびLan−０であった。今のところSan−
０およびLan−０が耐性遺伝子のマッピングに最も適し
た候補である。我々はさらにエコタイプをスクリーニン
グすることによりNR−遺伝子のマッピングに最も適し
た、完全な耐性を示すものも含む、より耐性の高いエコ
タイプが見つかると考えている。
の寒天の影響を第１図に示した。植物当たりの感染成功
数に関する植物当たりの雌株生育数の数に関する種々の
培地、スクロース濃度およびダイチン寒天濃度の効果は
第２図に示した。以下に示すエコタイプのアラビドプシ
スについてテストした。An−1,Ba−1,Bch−1,Bl−1,Bla
−1,Bn−0,Bor−0,Cal−0,Chi−0,Ci−0,Co−4,Col−0,
Ct−1,Cvi−0,Edi−0,En−2,Esc−0,Est−0,For−1,Gd
−1,G−0,Gre−0,Ha−0,Hl−0,Hm−0,Hs−0,Ita−0,K
−0,Kil−0,Kin−0,Kl−0,Kr−0,La−0,La−er,Lan−
0,Lc−0,Ll−0,Map−0,Mc−0,Mh−0,Mr−0,Ms−0,Old−
2,Ove−0,Pa−3,Per−1,Pi−0,Pla−0,Po−0,Pt−0,Rou
−0,Rsch−0,Sac−0,Sah−0,Se−0,Sei−0,Set−0,Sf−
0,Sr−0,Stw−0,Su−0,Sue−0,Sy−0,Ts−1,Tu−0,Tul
−0,Ty−0,Wa−1,Wc−1,Wil−3,Ws−0,Wt−1,Yo−0,Ze
−０。コードはAISシードバンク・リスト（クランツ（K
ranz）およびカルクヘイム（Kirchheim）,1987）のコー
ドに従った。最も耐性の高いエコタイプ（即ち、植物当
たりの雌株発育平均数が最も低い）は、Sah−０、La−
０およびKil−０であった。最も感受性の高いエコタイ
プはGre−０およびLan−０であった。今のところSan−
０およびLan−０が耐性遺伝子のマッピングに最も適し
た候補である。我々はさらにエコタイプをスクリーニン
グすることによりNR−遺伝子のマッピングに最も適し
た、完全な耐性を示すものも含む、より耐性の高いエコ
タイプが見つかると考えている。
アラビドプシスに関してテストしたネマトーダ種 感染性および生活環の完結に関してテストした種々の
ネマトーダを表１に示した。G.ロストシエンシス（rost
ochiensis）およびH.ゲッチンキアナを除く表１に示し
た全てのネマトーダは本発明の培地を用いたアラビドプ
シスの根において生活環を完結する。この培地はH.シャ
クチに対して至適化したものであるが、テストした他の
種に対して最至適なものである必要はない。さらに、植
物寄生ネマトーダの特定の必要条件に従って、特定のイ
オン濃度およびスクロース濃度、バッファのタイプおよ
びゲルマトリクスを至適化することができる。表１に示
したネマトーダ種は説明のために示したもので本発明を
制限するものではない。
ネマトーダを表１に示した。G.ロストシエンシス（rost
ochiensis）およびH.ゲッチンキアナを除く表１に示し
た全てのネマトーダは本発明の培地を用いたアラビドプ
シスの根において生活環を完結する。この培地はH.シャ
クチに対して至適化したものであるが、テストした他の
種に対して最至適なものである必要はない。さらに、植
物寄生ネマトーダの特定の必要条件に従って、特定のイ
オン濃度およびスクロース濃度、バッファのタイプおよ
びゲルマトリクスを至適化することができる。表１に示
したネマトーダ種は説明のために示したもので本発明を
制限するものではない。
実施例２ プロモータレス・GUS遺伝子構築物の構築 3'nosターミネータ配列に融合されているが、いかな
る5'調節プロモーター配列も含まないGUSをコードする
遺伝子をプラスミドpBI101（ジェファーソン（Jefferso
n）、1987,Plant Mol.Biol.Reporter 5,387−405）から
のEcoR I−BamH Iフラグメントとしてバイナリーベクタ
ーpMOG23のマルチクローニング部位にクローニングし、
バイナリベクターpMOG452を作製した（第５図）。pMOG4
52はヘルパーとしてHB101 pRK2013を用いた大腸菌から
のトリペアレンタル・メイラィングによりアグロバクテ
リウム ツメファシエンスMOG101株に導入した。トラン
スコンジュガントはリファンピシン（20mg/l）およびカ
ナマイシン（100mg/l）に対する耐性で選択した。
る5'調節プロモーター配列も含まないGUSをコードする
遺伝子をプラスミドpBI101（ジェファーソン（Jefferso
n）、1987,Plant Mol.Biol.Reporter 5,387−405）から
のEcoR I−BamH Iフラグメントとしてバイナリーベクタ
ーpMOG23のマルチクローニング部位にクローニングし、
バイナリベクターpMOG452を作製した（第５図）。pMOG4
52はヘルパーとしてHB101 pRK2013を用いた大腸菌から
のトリペアレンタル・メイラィングによりアグロバクテ
リウム ツメファシエンスMOG101株に導入した。トラン
スコンジュガントはリファンピシン（20mg/l）およびカ
ナマイシン（100mg/l）に対する耐性で選択した。
実施例３ アグロバクテリウムMOG101株の構築 バイナリーベクターシステムを用い、アラビドプシス
植物に遺伝子構築物を導入した。アグロバクテリウム
ツメファシエンスに毒性機能を供与するヘルパープラス
ミドは、オクトピンTi−プラスミドpTiB6に由来する。M
OG101は、全Ｔ−領域が欠失し、トランスポゾンTn 1831
由来の細菌性スペクチノマイシン耐性マーカー（ホイカ
ース（Hooyaas）等、1980 Plasmid 4,64−75）で置換さ
れているノンオンコジェニックTi−プラスミドを有する
アグロバクテリウム ツメファシエンスである（コーク
マン（Koekman）等、1982,Plasmid 7,119−132）。
植物に遺伝子構築物を導入した。アグロバクテリウム
ツメファシエンスに毒性機能を供与するヘルパープラス
ミドは、オクトピンTi−プラスミドpTiB6に由来する。M
OG101は、全Ｔ−領域が欠失し、トランスポゾンTn 1831
由来の細菌性スペクチノマイシン耐性マーカー（ホイカ
ース（Hooyaas）等、1980 Plasmid 4,64−75）で置換さ
れているノンオンコジェニックTi−プラスミドを有する
アグロバクテリウム ツメファシエンスである（コーク
マン（Koekman）等、1982,Plasmid 7,119−132）。
Ti−プラスミドpTiB6は、二つの隣接するＴ−領域、T
L（Ｔ−レフト）およびTR（Ｔ−ライト）を含んでい
る。TL−およびTR−領域を欠く誘導体を得るために、中
間ベクターpMOG579を構築した。プラスミドpMOG579はpB
R322の誘導体であり、Ｔ−領域の外側の左右に存在する
２つのTi−プラスミドフラグメントを含む（第６図）。
２個のフラグメント（黒で示されている）はpMOG579に
おいて、スペクチノマイシン耐性マーカーを有するトラ
ンスポゾンTn1831（ホイカース（Hooykaas）等、1980 P
lasmid 4,64−75）由来の2.5kbのBamH I−Hind IIIフラ
グメントで分断されている（第７図）。このプラスミド
をヘルパーとしてアグロバクテリウム ツメファシエン
スLBA1010株（HB101 pRK2013を用いた大腸菌からのトリ
ペアレンタル・メイティングによりpTiB6を導入した
（コークマン（Koekman）等、1982上述）救済された株
であるC58−C9（pTiB6））に導入した。トランスコンジ
ュガントは、リファンピシン（20mg/l）およびスペクチ
ノマイシン（250mg/l）に対する耐性で選択した。pMOG5
79とpTiB6間の二重組み換えではカルベニシリン耐性（p
BR322マーカー）が失われ、全Ｔ−領域が欠失した。カ
ルベニシリン（100mg/l）にプレーティングした5000個
のスペクチノマイシン耐性トランスコンジュガントの
内、２個の感受性であった。サザン分析は２回の交配で
さえ全Ｔ−領域が欠失することを示した（データ示さ
ず）。生成した株をMOG101と命名する。
L（Ｔ−レフト）およびTR（Ｔ−ライト）を含んでい
る。TL−およびTR−領域を欠く誘導体を得るために、中
間ベクターpMOG579を構築した。プラスミドpMOG579はpB
R322の誘導体であり、Ｔ−領域の外側の左右に存在する
２つのTi−プラスミドフラグメントを含む（第６図）。
２個のフラグメント（黒で示されている）はpMOG579に
おいて、スペクチノマイシン耐性マーカーを有するトラ
ンスポゾンTn1831（ホイカース（Hooykaas）等、1980 P
lasmid 4,64−75）由来の2.5kbのBamH I−Hind IIIフラ
グメントで分断されている（第７図）。このプラスミド
をヘルパーとしてアグロバクテリウム ツメファシエン
スLBA1010株（HB101 pRK2013を用いた大腸菌からのトリ
ペアレンタル・メイティングによりpTiB6を導入した
（コークマン（Koekman）等、1982上述）救済された株
であるC58−C9（pTiB6））に導入した。トランスコンジ
ュガントは、リファンピシン（20mg/l）およびスペクチ
ノマイシン（250mg/l）に対する耐性で選択した。pMOG5
79とpTiB6間の二重組み換えではカルベニシリン耐性（p
BR322マーカー）が失われ、全Ｔ−領域が欠失した。カ
ルベニシリン（100mg/l）にプレーティングした5000個
のスペクチノマイシン耐性トランスコンジュガントの
内、２個の感受性であった。サザン分析は２回の交配で
さえ全Ｔ−領域が欠失することを示した（データ示さ
ず）。生成した株をMOG101と命名する。
実施例４ pMOG452によるアラビドプシスのトランスホーメーショ
ン アラビドプシスをバイナリーベクターpMOG452を含む
アグロバクテリウムMOG101株でトランスホームした。ト
ランスホーメーションはバルベケンス（Valvekens）等
（1988,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,5536−5540）の方法
によりアラビドプシス サリアナ（エコタイプC24）の
根断片の共培養で行った。トランスジェニック植物は選
択培地（50mg/lカナマイシン）で成育し、根づかせ、発
芽培地または土壌に移した若木から再生した。
ン アラビドプシスをバイナリーベクターpMOG452を含む
アグロバクテリウムMOG101株でトランスホームした。ト
ランスホーメーションはバルベケンス（Valvekens）等
（1988,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85,5536−5540）の方法
によりアラビドプシス サリアナ（エコタイプC24）の
根断片の共培養で行った。トランスジェニック植物は選
択培地（50mg/lカナマイシン）で成育し、根づかせ、発
芽培地または土壌に移した若木から再生した。
トランスジェニック植物系列（T2またはそれ以後の世
代）を植物寄生ネマトーダによる感染に使用し、続いて
フィーディング構造のGUS分析に使用した。フィーディ
ング構造のGUS検定は実質的に植物の葉に対して述べら
れた方法で行いうる（ジェファーソン（Jefferson）198
7,Plant Mol.Biol.Reporter 5,387−405）。フィーディ
ング構造を含む切断した根を未だ寒天の中にある状態で
検定した。寒天は染色前に除去することもできる。
代）を植物寄生ネマトーダによる感染に使用し、続いて
フィーディング構造のGUS分析に使用した。フィーディ
ング構造のGUS検定は実質的に植物の葉に対して述べら
れた方法で行いうる（ジェファーソン（Jefferson）198
7,Plant Mol.Biol.Reporter 5,387−405）。フィーディ
ング構造を含む切断した根を未だ寒天の中にある状態で
検定した。寒天は染色前に除去することもできる。
H.シャクチの接種後のこのようなスクリーニング実験
の結果は意外にもフィーディング構造の内部にGUS活性
を有する植物が非常に多く、また、その他の植物部位に
はGUS活性が全くまたは殆ど無いことを示しており、こ
の事はフィーディング構造の内部で遺伝子発現を遂行し
ている調節配列がプロモータレス・GUS遺伝子構築物で
標識されていることを示している。13個の独立するトラ
ンスジェニック植物系列中の１つがフィーディング構造
細胞中で活性のある標識されたプロモーターを示してい
る。この高い頻度は植物細胞中でのネマトーダ耐性遺伝
子の発現にうまく使用しうるプロモーターの標識、およ
び単離が容易なことを示している。
の結果は意外にもフィーディング構造の内部にGUS活性
を有する植物が非常に多く、また、その他の植物部位に
はGUS活性が全くまたは殆ど無いことを示しており、こ
の事はフィーディング構造の内部で遺伝子発現を遂行し
ている調節配列がプロモータレス・GUS遺伝子構築物で
標識されていることを示している。13個の独立するトラ
ンスジェニック植物系列中の１つがフィーディング構造
細胞中で活性のある標識されたプロモーターを示してい
る。この高い頻度は植物細胞中でのネマトーダ耐性遺伝
子の発現にうまく使用しうるプロモーターの標識、およ
び単離が容易なことを示している。
実施例５ フィーディング構造内でGUSを発現するトランスジェニ
ック植物からのプロモーターの単離 フィーディング構造内でGUS活性を発現するトランス
ジェニック植物系列を選択し、ゲノムDNAの単離に使用
した。組み込まれたGUS遺伝子の上流（5'）の調節配列
をプライマー5'−CCAGACTGAATGCCCACAGGC−3'および5'
−GGTGACGCATGTCGCGCAAG−3'を用いたインバーティドPC
R（ドース（Does）等、1991,Plant Mol.Biol.17,151−1
53）で単離した。増幅したフラグメントを用いてフィー
ディング構造内で遺伝子を発現するのに適したプロモー
ターを含むゲノムクローンを単離するためにアラビドプ
シスのゲノムライブラリーをスクリーニングした。
ック植物からのプロモーターの単離 フィーディング構造内でGUS活性を発現するトランス
ジェニック植物系列を選択し、ゲノムDNAの単離に使用
した。組み込まれたGUS遺伝子の上流（5'）の調節配列
をプライマー5'−CCAGACTGAATGCCCACAGGC−3'および5'
−GGTGACGCATGTCGCGCAAG−3'を用いたインバーティドPC
R（ドース（Does）等、1991,Plant Mol.Biol.17,151−1
53）で単離した。増幅したフラグメントを用いてフィー
ディング構造内で遺伝子を発現するのに適したプロモー
ターを含むゲノムクローンを単離するためにアラビドプ
シスのゲノムライブラリーをスクリーニングした。
また、GUS遺伝子の最初の200bpを選択された植物から
作製したゲノムバンクを探るのに使用した。
作製したゲノムバンクを探るのに使用した。
参考文献 アルトマン（Altmann）,T.、ジェソプ（Jessop）,A.,、
モリス（Morris）,P.C.、シュミット（Schmidt）,R.、
ウィルミッツァー（Willmitzer）,L.（1991）J.Cell.Bi
ochem.Suppl 15A,p.110。
モリス（Morris）,P.C.、シュミット（Schmidt）,R.、
ウィルミッツァー（Willmitzer）,L.（1991）J.Cell.Bi
ochem.Suppl 15A,p.110。
バロン（Barone）,A.、リッター（Ritter）,E.、シャク
シャベル（Schachtschabel）,U.、デベナー（Debene
r）,T.、サラミニ（Salamini）,F.およびゲブハルト（G
ebhardt）,C.（1990）Mol.Gen.Genet.224,117−182。
シャベル（Schachtschabel）,U.、デベナー（Debene
r）,T.、サラミニ（Salamini）,F.およびゲブハルト（G
ebhardt）,C.（1990）Mol.Gen.Genet.224,117−182。
ブレーカー（Bleecker）,A.B.（1991）J.Cell.Biochm.,
suppl 15A,p.23。
suppl 15A,p.23。
デラート（Dellaert）,L.M.W.、メイヤー（Meijer）,K.
（1986）Zaadbelangen 7,167−170。
（1986）Zaadbelangen 7,167−170。
ディッキンソン（Deckinson）,M.、ジョーンズ（Jone
s）,D.、ハリソン（Harrison）,T.K.、イングリッシュ
（English）,J.、ビショップ（Bishop）,G.、スコフィ
ールド（Scofield）,S.、ハモンド・コサック（Hammond
−Kosack）,K.、ジョーンズ（Jones）,J.D.G.（1991）A
dv.Mol.Gen.Plant−Microbe Interactions,1,276−27
9。
s）,D.、ハリソン（Harrison）,T.K.、イングリッシュ
（English）,J.、ビショップ（Bishop）,G.、スコフィ
ールド（Scofield）,S.、ハモンド・コサック（Hammond
−Kosack）,K.、ジョーンズ（Jones）,J.D.G.（1991）A
dv.Mol.Gen.Plant−Microbe Interactions,1,276−27
9。
ドロプキン（Dropkin）,V.H.（1988）Ann.Rev.Phytopat
h.26,145−161。
h.26,145−161。
ドロプキン（Dropkin）,V.H.およびボーン（Boone）,W.
R.（1966）Nematologica 12,225−236。
R.（1966）Nematologica 12,225−236。
フェルドマン（Feldmann）,K.A.（1991）J.Cell.Bioche
m.suppl 15A,p.26。
m.suppl 15A,p.26。
ガブリエル（Gabriel）,D.W.およびロルフェ（Rolfe）,
B.G.（1990）Ann.Rev.Phytopathol.28,365−391。
B.G.（1990）Ann.Rev.Phytopathol.28,365−391。
グランドラー（Grundler）,F.（1989）Thesis,キール大
学、ドイツ。
学、ドイツ。
ジョーンズ（Jones）,F.G.W.、パロット（parrott）,D.
M.、ペリー（Perry）,J.N.（1981）「植物寄生ネマトー
ダ」第三巻（B.M.ズッカーマン（Zuckerman）およびR.
A.ローデ（Rohde））pp 23−36アカデミープレス、ニュ
ーヨーク。
M.、ペリー（Perry）,J.N.（1981）「植物寄生ネマトー
ダ」第三巻（B.M.ズッカーマン（Zuckerman）およびR.
A.ローデ（Rohde））pp 23−36アカデミープレス、ニュ
ーヨーク。
コッホ（Koch）,E.およびスルサレンコ（Slusarenko）,
A.（1990）Plant Cell 2,437−445。
A.（1990）Plant Cell 2,437−445。
クランツ（Kranz）,A.R.およびカークヘイム（Kirchhei
m）,B.（1987）Arabidopsis Inf.Serv.24,1−368。
m）,B.（1987）Arabidopsis Inf.Serv.24,1−368。
ミューラー（Ｍller）,J.（1978）Revue Nmatol.1,
47−52。
47−52。
ムラシゲ（Murashige）,M.およびスコーグ（Skoog）,F.
（1962）Physiol.Plant.15,473−497。
（1962）Physiol.Plant.15,473−497。
ナポリ（Napoli）,C.レミュー（Lemieux）,G.、ジョー
ゲンセン（Jorgensen）,R.（1990）Plant Cell 2,279−
289。
ゲンセン（Jorgensen）,R.（1990）Plant Cell 2,279−
289。
オムウェガ（Omwega）,C.O.、トマソン（Thomason）,I.
J.、ロバーツ（Roberts）,P.A.（1990）Phytopath.80,7
45−748。
J.、ロバーツ（Roberts）,P.A.（1990）Phytopath.80,7
45−748。
ポール（Paul）,H.、ヴァンデーレン（Van Deelen）,J.
E.M.、ヘンケン（Henken）,B.、デボック（De Bock）,
T.S.M.、レンジ（Lange）,W.およびクレンス（Krens）,
F.A.（1990）Euphytica 48,153−157。
E.M.、ヘンケン（Henken）,B.、デボック（De Bock）,
T.S.M.、レンジ（Lange）,W.およびクレンス（Krens）,
F.A.（1990）Euphytica 48,153−157。
レデイ（Ｒdei）,G.P.（1965）Amer.J.Bot.52,834−8
41。
41。
リック（Rick）,C.M.、フォブス（Fobes）,J.F.（197
4）Tomato Genet Coop Rep 24,25。
4）Tomato Genet Coop Rep 24,25。
サンフト（Sanft）,U.およびウィス（Wyss）,U.（199
0）Potato Res.33,55−66。
0）Potato Res.33,55−66。
セイサー（Sasser）,J.N.およびフレックマン（Freckma
n）,D.W.（1987）World prospective on nematology:th
e role of the society.「ネマトロジーの展望」J.A.ビ
ーチ（Veech）およびD.W.ディッキンソン（Dickinson）
編、ハイヤッツ・ウィル、メリーランド、pp.7−14。
n）,D.W.（1987）World prospective on nematology:th
e role of the society.「ネマトロジーの展望」J.A.ビ
ーチ（Veech）およびD.W.ディッキンソン（Dickinson）
編、ハイヤッツ・ウィル、メリーランド、pp.7−14。
シンプソン（Simpson）,R.B.およびジョンソン（Johnso
n）,L.J.（1990）Mol.Plant−Microbe Interact.3,233
−237。
n）,L.J.（1990）Mol.Plant−Microbe Interact.3,233
−237。
ターナー（Turner）,S.J.、ストーン（Stone）,A.R.、
ペリー（Perry）,J.N.（1983）Euphytica 32,911−91
7。
ペリー（Perry）,J.N.（1983）Euphytica 32,911−91
7。
ヴァンデルクロール（Van der Krol）,A.R.、マー（Mu
r）,L.A.、ベルド（Beld）,M.、モル（Mol）,J.N.M.、
スチュージェ（Stuitje）,A.R.（1990）Plant Cell 2,2
91−299。
r）,L.A.、ベルド（Beld）,M.、モル（Mol）,J.N.M.、
スチュージェ（Stuitje）,A.R.（1990）Plant Cell 2,2
91−299。
ウォーレン（Whalen）,M.C.、イネス（Innes）,R.W.、
ベント（Bent）,A.F.およびスタスカウッツ（Staskawic
z）,B.J.（1991）Plant Call 3,49−59。
ベント（Bent）,A.F.およびスタスカウッツ（Staskawic
z）,B.J.（1991）Plant Call 3,49−59。
ウィリアムソン（Williamson）,V.M.、コルウェル（Col
well）,G.、メイ（Mei）,H.、ホ（Ho）,J.Y.（1990）Pr
oc.2nd Int.Nematol.Congress,ベルドホーベン、オラン
ダ。
well）,G.、メイ（Mei）,H.、ホ（Ho）,J.Y.（1990）Pr
oc.2nd Int.Nematol.Congress,ベルドホーベン、オラン
ダ。
フロントページの続き (72)発明者 グルントレル フロリアン ドイツ連邦共和国 24118 キール ヘ ルマン ローデヴァルト シュトラーセ ９ ユニフェルツテート キール イ ンシュト．フュール フィトパトロジイ (72)発明者 バローズ ポール イギリス ハートフォードシャー エイ エル５ ２ジェイキュー ハーペンデン ローサムステッド エクスペリメント ステイション デパートメント ネマ トロジイ (56)参考文献 Ｒ．Ｂ．Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａ ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ −Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉ ｏｎｓ，ｖｏｌ．３（４），ｐｐ．233 −237（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 1/00 - 5/00 ＢＩＯＳＩＳ ＷＰＩＤＳ ＣＲＯＰＵ ＥＭＢＡＳＥ ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ
Claims (5)
- 【請求項１】植物寄生ネマトーダの１種に感染したアラ
ビドプシス属植物の根であって、 該根は、少なくとも１種のネマトーダのフィーディング
構造を含み、 該根は、組織培養用品質のゲルマトリクス及び適切な栄
養培地を含む物質により支持されている、 ことを特徴とする根。 - 【請求項２】トランスジェニック植物の根である、請求
項１に記載の植物の根。 - 【請求項３】前記植物の導入遺伝子が、前記植物のゲノ
ムに常在する調節配列の制御下、前記ネマトーダのフィ
ーディング構造中で発現する選択可能又はスクリーニン
グ可能なマーカーをコードする読み取り枠を含んでい
る、請求項２に記載の植物の根。 - 【請求項４】アラビドプシス属植物のネマトーダのフィ
ーディング構造中における遺伝子発現を遂行することが
できるプロモーターを単離する方法であって、 ａ）請求項３に記載の根がらゲノムDNAを単離する工
程、 ｂ）選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコー
ドする読み取り枠の上流のDNAを増幅する工程、及び、 ｃ）増幅したDNA中のプロモーターを同定し、単離する
工程、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項５】植物寄生ネマトーダに対する相対的耐性を
有するアラビドプシスのエコタイプ又は変異体を得る方
法であって、 ａ）請求項１に記載の根を含む１種以上の異なるアラビ
ドプシスのエコタイプ又は変異体を提供する工程、 ｂ）該エコタイプ又は変異体の根に形成したネマトーダ
のフィーディング構造の数を比較する工程、及び、 ｃ）最少数のネマトーダのフィーディング構造を有する
エコタイプ又は変異体を選択する工程、 を含むことを特徴とする方法。
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |