CN101605895A

CN101605895A - 用cad-样基因的rna干扰控制线虫的组合物和方法

Info

Publication number: CN101605895A
Application number: CNA2008800043372A
Authority: CN
Inventors: A·威格
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2009-12-16
Also published as: MX2009007918A; WO2008095911A2; US20100017912A1; WO2008095911A3; AR065282A1; EP2118282A2; CA2674564A1; BRPI0807018A2

Abstract

本发明涉及能够在植物中抑制对于建立或维持线虫感染必需的基因表达的双链RNA组合物和转基因植物，和其相关方法。具体而言，本发明涉及RNA干扰抑制目的CAD样植物基因表达的用途，还涉及产生具有提高的寄生线虫抗性的植物。

Description

用CAD-样基因的RNA干扰控制线虫的组合物和方法

对相关申请的交叉引用

[第1段]本申请要求于2007年2月8日提交的序列号为60/900,145的美国临时申请的优先权权益。

发明领域

[第2段]本发明涉及线虫的控制。特别涉及大豆胞囊线虫的控制。本发明还涉及将遗传材料引入线虫易感植物中，以提高其对线虫的抗性。

发明背景

[第3段]线虫是以超过2,000种行间作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小蠕虫样的动物。一种常见的线虫类型是根结线虫(RKN)，其采食引起根部特征性虫瘿的形成。其它采食根部的线虫是胞囊型及损伤型线虫，这些线虫具有更高的宿主特异性。

[第4段]线虫存在于美国各地，但在南部和西部的温暖湿润地区及在沙土中问题最大。大豆胞囊线虫(SCN)(Heterodera glycines)在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。其是大豆植物的最严重病虫。某些地区严重遭受大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产将不再可能是经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草的总计约50种宿主。

[第5段]线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而，线虫(包括SCN)可以引起严重产量损失，而无明显的地上部分症状。另外受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原体侵袭。

[第6段]线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出来。这些幼体是线虫能够感染大豆根的唯一发育阶段。

[第7段]SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。线虫注射调节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨大细胞)，这种合胞体被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取必要的营养物，导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至于它们突破根组织并暴露在根的表面。

[第8段]在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土壤内并使柠檬形状的的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍附着于根系统并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。最终雌性成体的整个体腔充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫体才称作胞囊。最后胞囊释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在第一年中孵化，然而很多卵也会在胞囊内存活几年。

[第9段]线虫依赖其自身力量在土壤中每年只能穿行几英寸。然而，线虫侵染可以以多种方式传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，都能够传播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。甚至还存在某些线虫种类可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些起因中的某些起因。

[第10段]防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理完线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。

[第11段]已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予植物对寄生线虫增加的抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在采食植物的部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子然后能够用于指导有害蛋白质或酶的特异性表达，或指导靶基因或一般细胞基因的反义RNA的表达。这些植物启动子也可以用于通过用含有与其产物被摄取后诱导线虫致死的基因连接的植物靶基因的启动子的构建体转化植物来在采食部位特异性赋予线虫抗性。

[第12段]最近，已提出用RNA干扰(RNAi)(也称作基因沉默)作为控制线虫的方法。当与靶基因或mRNA的序列基本上相关的双链RNA(dsRNA)引入细胞中时，靶基因的表达会被抑制(参见例如美国专利号6,506,559)。美国专利号6,506,559证明了RNAi抗秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中已知基因的有效性，但没有披露RNAi用于控制植物寄生的线虫的用途。

[第13段]已有提议采用靶向线虫主要基因的RNAi，例如WO01/96584、WO 01/17654、US 2004/0098761、US 2005/0091713、US2005/0188438、US 2006/0037101、US 2006/0080749、US 2007/0199100和US 2007/0250947。

[第14段]对于RNAi的作用已提出了许多模型。在哺乳动物系统中，大于30个核苷酸的双链RNA以一种非序列特异性方式引发诱导合成干扰素以及蛋白质合成的总体停止。但是，美国专利号6,506,559揭示，在线虫中，对应于靶基因序列的双链RNA的长度可为至少25、50、100、200、300或400碱基，甚至更长的双链RNA也能有效诱导秀丽隐杆线虫中的RNAi。已知当用包含98～854个核苷酸的双链区的发夹RNA构建体转化许多植物品种时，能有效沉默靶植物基因。一般认为在包括线虫和植物的许多有机体中，大片的双链RNA在细胞内被裂解成大约19-24个核苷酸的片段(siRNA)，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。

[第15段]虽然已经进行了大量的努力来使用RNAi控制植物寄生线虫，但是至今还没有任何国家对转基因的线虫抗性植物解除管制。所以，仍然需要鉴定安全有效的组合物和方法以用RNAi控制植物寄生线虫，并生产对植物寄生的线虫具有增加的抗性的植物。

发明内容

[第16段]发明人发现新的植物靶基因——肉桂醇脱氢酶样(CAD-样)基因(也以登记号49676534表示)，在SCN对大豆根感染诱导的合胞体中过表达。发明人进一步证明，当49676534基因在大豆根部模型系统中的表达得到抑制时，线虫感染这些大豆根的能力会降低。

[第17段]所以，在第一实施方案中，本发明提供了双链RNA(dsRNA)分子，该分子包含：a)第一链，包含与CAD-样基因的一部分基本上相同的序列；和b)第二链，包含与第一链基本上互补的序列。

[第18段]本发明进一步涉及双链RNA分子库，包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自与CAD样基因的一部分基本上相同的多核苷酸。

[第19段]在另一个实施方案中，本发明提供能够表达与CAD样基因的一部分基本上相同的双链RNA的转基因线虫抗性植物。

[第20段]在另一个实施方案中，本发明提供能够表达dsRNA分子库的转基因植物，其中每种dsRNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自与CAD样基因的一部分基本上相同的多核苷酸。

[第21段]在另一个实施方案中，本发明提供一种制备能够表达双链RNA分子库的转基因植物的方法，其中每个双链RNA分子与植物中的CAD样基因的一部分基本上相同，所述方法包括步骤：a)制备具有与CAD样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成CAD样基因一部分的双链转录物；b)用所述核酸转化受体植物；c)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和d)选择表达所述转录物的子代。

[第22段]本发明进一步提供一种赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包括步骤：a)制备具有与CAD样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成CAD样基因一部分的双链转录物；b)用所述核酸转化受体植物；c)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和d)选择线虫抗性的子代。

[第23段]本发明进一步提供包含与CAD样基因的一部分基本上相同的核酸的表达盒和表达载体。

[第24段]在另一个实施方案中，本发明提供一种控制寄生线虫感染植物的方法，包括用双链RNA分子转化植物的步骤，该双链RNA分子有效地连接到根优选的、线虫可诱导的或采食部位优选的启动子上，由此该双链RNA包含一条与CAD样靶核酸的一部分基本上相同的链，该CAD样靶核酸对于采食部位的形成、发展或支持，特别是合胞体或巨大细胞的形成、发展或支持是必需的，从而通过去除或功能性失活所述采食部位、合胞体或巨大细胞来控制线虫对植物的感染。

附图说明

[第25段]图1列出了指定给CAD样基因、RCB584所用启动子和5’RACE片段的对应序列号(SEQ ID NO)的表格。

[第26段]图2列出了基因49676534的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。

[第27段]图3a-3b展示了基因49676534(SEQ ID NO：1)与SEQ IDNO：5所述的5’RACE片段的DNA比对。

[第28段]图4a-4b展示了来自多种植物物种的示例性CAD样蛋白质的氨基酸比对，包括：对应于基因49676354的SEQ ID NO：7所述的CAD样基因的全长蛋白质序列。该比对在Vector NTI软件组中进行(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分隔罚分＝8)。

[第29段]图5展示了SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23和25所述的示例性CAD样基因的整体氨基酸百分比同一性矩阵表。

[第30段]图6展示了SEQ ID NO：2、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24所述的示例性CAD样基因的整体核苷酸百分比同一性矩阵表。

[第31段]图7a-7j示出SEQ ID NO：2、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的示例性CAD样基因中多个可能的21mer的核苷酸位置。

本发明优选实施方式的详述

[第32段]本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及本文所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域普通技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991Glossary ofgenetics：classical和molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Current protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编著，CurrentProtocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资企业(1998增刊)中找到。应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)”可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，例如对“单数细胞”的称谓可以意指可以使用至少一个细胞。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案而并非意味对其限制性。

[第33段]在本申请通篇范围内，参考了多种专利和文献出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容完整地并入本申请作为参考，旨在更充分地描述本发明所涉及领域的现状。

[第34段]此处植物的“CAD样基因”定义为与包含SEQ ID NO：1限定的基因49676534的序列的多核苷酸有至少50％序列同一性的基因。根据本发明，CAD样基因包括具有诸如SEQ ID NOs：2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26中限定的那些序列的基因，其与SEQ ID NO：1的CAD样基因同源。此处限定的CAD样基因编码与具有SEQ ID NO：7中所限定序列的49676534多肽有至少45％序列同一性的多肽。这样的多肽包括具有SEQ ID NOs：4、9、11、13、15、17、19、21、23和25中限定的序列的CAD样多肽。适宜的CAD样靶基因与包含SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸的序列同一性为至少约50-60％、至少约60-70％或至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，也可以是至少约96％、97％、98％、99％或更高。或者，适宜的CAD样靶基因包含在严紧条件下与包含SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸杂交的多核苷酸。

[第35段]另外CAD样基因(CAD样基因同源物)可以用此处提供的信息和生物技术领域技术人员已知的技术从大豆之外的植物中分离。例如，在严紧条件下与SEQ ID NO：1的核酸杂交的植物核酸分子可以从植物组织cDNA文库中分离。或者，可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry 18：5294-5299的胍盐-硫氰酸盐抽提方法)，cDNA可以用反转录酶制备(例如Moloney MLV反转录酶，可购自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或AMV反转录酶，可购自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)。可以基于SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列设计用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸引物。可以基于具有SEQ IDNOs：2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26中限定的序列的CAD样基因序列设计其它寡核苷酸引物。对应于此处限定的CAD样靶基因的核酸分子可以根据标准PCR扩增技术用cDNA或备选的基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物扩增。这样扩增的核酸分子可以克隆至合适的载体中，并通过DNA序列分析来表征。

[第36段]此处使用的“RNAi”或“RNA干扰”指的是双链RNA(dsRNA)介导的植物中序列特异性转录后基因沉默方法。此处使用的“dsRNA”指部分或完全双链的RNA。双链RNA还指小或短的干扰RNA(siRNA)、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA、微小-RNA(miRNA)等等。在RNAi方法中，将包含与靶基因(例如CAD样基因)的一部分基本上相同的第一链和与第一链互补的第二链的双链RNA引入植物中。在引入植物以后，该靶基因特异性双链RNA被加工成相对小的片段(siRNA)，接着能够分布整个植物，导致具有表型的功能缺失突变，这种表型在一代的时间内可能会与靶基因的部分或完全缺失产生的表型非常接近。或者，靶基因特异性双链RNA与调节元件或启动子有效地结合，导致该双链RNA在组织中以空间性的、空间性的或可诱导的方式表达，可被含有RNAi加工结构的植物细胞进一步加工为相对小的片段，从而得到功能缺失表型。另外，该调节元件或启动子可指导对根或合胞体或巨大细胞优先的表达，其中所述双链RNA可以或者在这些组织中组成型表达或者被线虫或幼体线虫(例如J2线虫)的采食而诱导表达。

[第37段]如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶，用于dsRNA的术语“基本上相同”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约80％-90％相同，更优选地、与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95％相同并且最优选与靶基因或者CAD样基因的20个或更多个连续核苷酸至少约95％、96％、97％、98％或99％相同或完全相同。20个或更多个核苷酸是指靶基因至少约20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续碱基的部分或至多靶基因的全长。

[第38段]如此处所用，“互补的”多核苷酸是那些能够根据标准沃森-克里克互补规则碱基配对的多核苷酸。具体而言，嘌呤会与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)、对于DNA是腺嘌呤与胸腺嘧啶(A:T)、或对于RNA是腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。可以理解即使不完全互补两种多核苷酸也可以互相杂交，只要各自具有与对方基本上互补的至少一个区域。如此处所用，“基本上互补”指两个核酸序列的核苷酸至少超过80％互补。优选这两个核酸序列至少超过85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或全部核苷酸互补。或者，“基本上互补”指两个核酸序列能够在高度严紧的条件下杂交。如此处所用，术语“基本上相同”或“对应于”指两个核酸序列具有至少80％的序列同一性。优选这两个核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

[第39段]如此处所用，术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA或其杂合体。该术语还包括RNA/DNA杂合体。当合成制备双链RNA时，不常见的碱基(例如肌酐、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其他)也可用于反义RNA、双链RNA和核酶配对。例如含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已表明能以高亲和力结合RNA并作为基因表达的有效的反义抑制剂。也可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯骨架的修饰或对RNA的核糖基团中的2’-羟基修饰。

[第40段]如此处所用的术语“控制”当用于感染的上下文中时指感染的降低或预防。减低或预防线虫的感染会使植物具有对线虫增加的抗性；但是，这种增加的抗性并不意味着植物必须100％地抗线虫感染。在优选实施方案中，在抗性植物中对线虫感染的抗性比对线虫无抗性的野生型植物高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。优选所述野生型植物是具有与线虫抗性增加的植物相似或更优选相同的基因型，但是不包含针对靶基因的双链RNA的植物。植物对线虫感染的抗性可以是由于当线虫暴露于含有双链RNA的植物时，线虫的死亡、不育、停止发育或移动性受损造成的，所述双链RNA特异性针对对于功能性采食部位、合胞体或巨大细胞的发育或维持必须的基因。此处使用的术语“对线虫感染的抗性”或“具有线虫抗性的植物”指与野生型植物相比，植物避免线虫感染、杀死线虫或阻止、减少或停止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可以通过主动过程达到，例如通过产生对线虫有害的物质，或通过被动过程达到，例如含有降低的线虫所需的营养价值或不形成由线虫采食部位诱导的结构例如合胞体或巨大细胞。植物的线虫抗性水平可以以多种方法检测，例如，计数能够在植物上建立寄生的线虫数量，或测量线虫发育时间、雌雄线虫的比例，或对于胞囊线虫计数在感染的植物的根部或植物分析系统中产生的胞囊数量或线虫卵的数量。

[第41段]若非上下文中另外说明。术语“植物”涵盖植物发育或成熟的任何阶段，以及取自或衍生自任何这样的植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括，但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、微孢子、原生质体、毛根培养物等等。本发明还包括用本发明的植物制备的种子。在一个实施方案中，与植物种子的野生型变体相比，种子确实被育种为有提高的抗线虫感染的抗性。如此处所用，“植物细胞”包括但不限于，原生质体、生产配子的细胞和再生为完整植株的细胞。植物多种组织的组织培养物和来自这些组织培养物的植物再生为本领域所公知且已经充分公开。.

[第42段]如此处使用的术语“转基因”指含有至少一个重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸的所有或部分被稳定整合入染色体中，或是稳定的染色体外元件，从而能够传递至下一代。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指的是已经由遗传工程改变、重排或修饰的多核苷酸。其实例包括连接到或加入到异源序列的任何克隆多核苷酸。术语“重组”并非指天然发生事件所导致的多核苷酸的改变，例如自发突变，或通过选择性育种导致的非自发突变。

[第43段]如此处所用的术语“有效抑制表达的量”指的是足以降低植物中靶基因产生的mRNA或蛋白质的水平或稳定性的双链RNA的浓度或量。如此处所用的“抑制表达”指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物的水平的缺乏或可观察到的降低。靶基因表达的抑制可能对于寄生线虫是致死的，其可以直接或间接通过对采食部位、合胞体或巨大细胞的修饰或根除达成，或者，如果对全功能采食部位、合胞体或巨大细胞的进入与寄生线虫的生命周期的特定阶段相关的话，这样的抑制可以拖延或防止进入特殊的发育步骤(例如变态)。可以通过检测植物根部胞囊的减少或消除，或线虫或线虫侵染的其他性质来确认抑制的结果(见下文实施例3所述)。

[第44段]根据本发明，用编码双链RNA的核酸转化植物，该双链RNA特异性抑制CAD样基因在植物中的表达，该基因对于采食部位、合胞体或巨大细胞的发育和维持是必需的，最后影响线虫的存活、变态或繁殖。在一个实施方案中，所述双链RNA由已经转化入所感染的植物的祖株中的载体编码。优选表达所述靶向CAD样基因的双链RNA的核酸在根部特异性启动子或寄生线虫采食细胞特异性启动子或线虫可诱导的启动子的转录控制下。

[第45段]所以，本发明的双链RNA包含与植物基因组的诸如大豆基因49676534靶基因的CAD样基因的一部分基本上相同的第一链和与第一链基本上互补的第二链。在优选的实施方式中，靶基因选自：a)含有SEQID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；b)与SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26有至少80％序列同一性的多核苷酸；和c)在严紧条件下与含有SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸杂交的来自植物的多核苷酸。该基本相同的双链核苷酸序列的长度可以是CAD样基因至少大约19、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续的碱基或至多CAD样基因的全长。在一个优选实施方式中，双链核苷酸序列的长度为从大约19至大约200-500个连续核苷酸的长度。在另一个优选的实施方式中，本发明的双链RNA与SEQ ID NO：5的碱基1～170基本相同或相同。

[第46段]如上所述，长度大于约19-24个核苷酸的双链RNA片段被线虫和植物细胞内剪切成大约19-24个核苷酸长的siRNA，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。图7a-7j中的表格列出了此处限定的CAD样基因的示例性21-mer。该表格也可用于通过从各21mer加上或减去适宜数量的核苷酸计算19、20、22、23或24-mer。所以，本发明的双链RNA长度范围在CAD样基因大约19个核苷酸至大约500个连续核苷酸或至多CAD样基因的全长。优选本发明的双链RNA具有大约21个核苷酸至大约600个连续核苷酸。更优选本发明的双链RNA具有大约21个核苷酸至大约500个连续核苷酸的长度，或约21个核苷酸至大约200个连续核苷酸的长度。

[第47段]如此处所公开的，不需要RNA与靶基因100％序列同一性来实现本发明。当优选含有与CAD样基因的一部分序列相同的核苷酸序列的双链RNA用于抑制时，本发明可以容忍因为基因操作或合成、基因突变、品系多态性或进化趋异导致的可预期的序列变化。所以本发明的双链RNA还涵盖与靶基因具有至少1、2或更多个核苷酸错配的双链RNA。例如，本发明中可以预见图7a-7j中示例性示出的21mer双链RNA序列可包含1、2或更多核苷酸的添加、删除或取代，只要得到的序列仍然干扰CAD样基因的功能。

[第48段]可以用本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，和其中引用的参考文献)来优化本发明的双链RNA和CAD样靶基因之间的序列同一性，并通过例如BESTFIT软件程序(例如威斯康辛大学遗传计算组)中实施的Smith-Waterman算法以默认参数计算核苷酸序列间的差异百分比。优选在抑制性RNA和靶基因的部分之间的序列同一性大于80％、90％，甚至100％。或者，RNA的双链体区域可以功能性地限定为能够在严紧条件下与靶基因转录物的部分杂交的核苷酸序列(严紧条件例如为400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，60℃杂交12-16小时，然后65℃下用0.1％SDS和0.1％SSC洗涤大约15-60分钟)。

[第49段]当本发明的双链RNA长度大于约21个核苷酸时，例如约50个至约1130个核苷酸，其会在植物或寄生线虫细胞内被随机剪切成大约21个核苷酸的双链RNA，即siRNA。本发明的较长双链RNA的裂解会产生来自该较长双链RNA的大约21mer(大约19mer至大约24mer范围内)的双链RNA库。该约21mer双链RNA库也包含在本发明的范围内，不管是在植物或线虫细胞内产生的还是用已知的寡核苷酸合成技术合成的。

[第50段]本发明的siRNA具有对应于在整个CAD样靶基因完整序列中跨越大约19-24个连续核苷酸片段的序列。例如，衍生自SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的CAD样基因的本发明siRNA库可以包括多种RNA分子，其选自含有与图7a-7i中所示SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的21mer核苷酸基本相同的一条链的寡核苷酸。衍生自SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26所述CAD样基因的本发明siRNA库也可以包括含有衍生自图7a-7j中所述SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的任何21个连续核苷酸序列的特定RNA分子的任何组合。并且，如上所述，植物中多个专门切酶产生通常在19-24个核苷酸大小的siRNA(见Henderson等人，2006.Nature Genetics 38：721-725.)。本发明的siRNA范围可以在约19个连续核苷酸序列至约24个连续核苷酸序列。同样，本发明的siRNA库可包括多个RNA分子，其具有衍生自SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的约19、20、21、22、23或24个连续核苷酸序列的任意一种。或者，本发明的siRNA库可包括多个RNA分子，其具有衍生自SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的约19、20、21、22、23和/或24个连续核苷酸序列的任意组合。

[第51段]本发明的双链RNA可任选地包括在一端或两端的单链突出。该双链结构可以通过单链自身互补RNA链形成(即形成发夹环)或两个互补的RNA链形成。RNA双链体的形成可以在细胞内或细胞外起始。当本发明的双链RNA形成发夹环时，可任选地包括内含子(如US2003/0180945A1中所述)或核苷酸间割区，该间割区是在互补的RNA链间的序列片段以稳定细胞中的发夹转基因。制备各种双链RNA分子的方法记载于例如WO 99/53050和美国专利No.6,506,559中。RNA可以允许每个细胞输送至少一个拷贝的量引入。更高剂量的双链材料会得到更有效的抑制。

[第52段]在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组表达载体，其包含编码如上所述双链RNA的核酸，其中与宿主植物细胞的野生型品种相比，该载体在宿主植物细胞中的表达导致对寄生线虫的抗性增加。如此处所用的术语“载体”指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环状双链DNA环，附加的DNA片段可以连接其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主植物细胞中自主复制。其他载体在导入宿主细胞时整合入宿主植物细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样的载体在此称为“表达载体”，用于重组DNA技术的表达载体一般是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意欲包括具有相同功能的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如马铃薯病毒X，烟草rattle病毒和双粒病毒组)。

[第53段]本发明的重组表达载体包括以适宜在宿主植物细胞中表达核酸的形式的本发明核酸，意思是该重组表达载体包括一个或多个调节序列，例如启动子，该调节序列基于待用于表达的宿主植物细胞进行选择，被有效连接至待表达的核酸序列。至于重组表达载体，术语“有效连接”和“有效结合”可以互换，意为以允许核苷酸序列表达的方式(即，当载体被引入宿主植物细胞中时在宿主植物细胞中表达)将目的核苷酸序列连接到调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸信号)。例如这类调节序列记载于Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)已及Gruber和Crosby的：Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick和Thompson编著，第7章，89-108，CRC Press：BocaRaton，Florida中，包括其参考文献。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些和仅仅在某些宿主细胞中或在某些情况下指导核苷酸序列表达的那些。本领域技术人员了解表达载体的设计可取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、所需双链RNA的表达水平等因素。本发明的表达载体可引入植物宿主细胞中进而产生此处所述的核酸编码的本发明的双链RNA分子。

[第54段]根据本发明，重组表达载体包括有效连接到核苷酸序列的调节序列，该核苷酸序列是本发明双链RNA的一条或两条链的模板。在一个实施方案中，所述核酸分子进一步包括在所述核酸分子任何一端侧翼的启动子，其中该启动子驱动各个DNA链的表达，从而产生杂交形成双链RNA的两个互补的RNA。在另一个实施方案中，核酸分子包含转录成在一个转录单元中有双链RNA的两条链的核苷酸序列，其中正义链从转录单元的5’端开始转录，反义链从3’端开始转录，其中这两条链被大约3～500个碱基对或更多碱基对隔开，转录后，该RNA转录产物自身折叠形成发夹。根据本发明，发夹转录物中的间隔区可以是任何DNA片段。

[第55段]根据本发明，所引入的多核苷酸如果合并入非染色体自主复制子中或整合入植物染色体中，会在植物细胞中稳定保持。或者，所引入的多核苷酸可以存在于染色体外非复制载体上，并瞬时表达或瞬时有活性。不管存在于染色体外非复制载体中还是整合入染色体的载体中，该多核苷酸优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够驱动在植物细胞中基因表达的调节序列，该调节序列得到有效地连接，从而使得每个序列都能够发挥其功能，例如通过多聚腺苷酸信号终止转录。优选的多聚腺苷酸信号是那些来自于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)t-DNA的信号，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合成酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBO J.3：835)或其功能等同物，还有植物中的所有其他有功能活性的终止子都适用。因为植物基因的表达通常不在转录水平限制，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，例如像翻译增强子的序列，例如来自烟草花叶病毒的含有5’-不翻译前导序列的增速驱动序列，可增加每个RNA产生的多肽比例(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括详细描述于下列文献中的载体：Becker，D.等人，1992.New plant binary vectors with selectable markers located proximalto the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和Transgenic Plants第1卷，Engineering and Utilization中的Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，S.15-38。

[第56段]植物基因的表达应该有效地连接至适当启动子，该启动子以时间优先、空间优先、细胞类型优先和/或组织优先方式使该基因表达。用于本发明表达盒的启动子包括能够在存在于植物根部的植物细胞中起始转录的任何启动子。这类启动子包括但不限于，那些能够从植物、植物病毒和含有在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌)中得到的启动子。优选本发明的表达盒包括根特异性启动子、病原体可诱导的启动子或线虫可诱导的启动子。更优选该线虫可诱导的启动子是寄生线虫采食部位特异性启动子。寄生线虫采食部位特异性启动子可以对合胞体细胞或巨大细胞具有特异性或对这两种细胞都具有特异性。如果一个启动子在其诱导状态下的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)比未诱导状态下的活性高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，那么这个启动子是可诱导的启动子。如果一个启动子的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)在特定的细胞类型、组织或器官中比在同一个植物的其他细胞类型、组织中要高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，那么这种启动子是细胞、组织或器官特异性启动子，优选所述其他的细胞类型或组织是相同植物器官(例如根)的细胞类型或组织。在器官特异性启动子的情况中，启动子活性应该与其他植物器官中的启动子活性比较，例如叶、茎、花或种子。

[第57段]启动子可以是组成型的、可诱导的、发育阶段优先的、细胞类型优先的、组织优先的或器官优先的。组成型启动子在大多数情况下都有活性。组成型启动子的非限制实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science 236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)、玄参花斑病病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)、来自农杆菌属T-DNA的启动子，例如甘露碱合成酶、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶、核酮糖磷酸氢盐羧化酶(ssuRUBISCO)启动子的小亚基等。优选在接触寄生线虫的细胞中表达双链RNA的启动子。或者，所述启动子可以驱动双链RNA在远离接触线虫的部位的植物组织中表达，然后该双链RNA可以由植物转运至接触寄生线虫的细胞中，在线虫采食部位的特定细胞中或接近线虫采食部位的细胞中，例如合胞体细胞或巨大细胞。

[第58段]可诱导的启动子在特定环境条件下是有活性的，例如存在或缺乏营养素或代谢产物、热或冷、光照、病原体攻击、缺氧条件等。例如，已经表明启动子TobRB7、AtRPE、AtPyk10、Gemini19和AtHMG1可以由线虫诱导(对于线虫可诱导的启动子的综述，请参见Ann.Rev.Phytopathol.(2002)40：191-219；还参见U.S.Pat.No.6,593,513)。分离可以由线虫诱导的其他启动子的方法在美国专利5,589,622和5,824,876中列出。其他可以诱导的启动子包括：芸苔属的hsp80启动子，其可由热休克诱导；PPDK启动子，其由光诱导；烟草、拟南芥和玉蜀黍的PR-1启动子，其可以由病原体感染诱导；和Adh1启动子，其由缺氧和冷胁迫诱导。植物基因表达也可由可诱导的启动子促进(关于综述参见Gatz，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果需要时间特异性基因表达，可化学诱导的启动子特别适用。这种启动子的非限制性实例是可水杨酸诱导的启动子(PCT申请No.WO 95/19443)、可四环素诱导的启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和可乙醇诱导的启动子(PCT申请No.WO93/21334).

[第59段]发育阶段优先的启动子在发育的特定阶段优先表达。组织和器官优先的启动子包括那些在特定组织和器官优先表达的启动子，例如叶、根、种子或木质部。组织优先或器官优先启动子的实例包括但不限于果实优先、胚珠优先、雄性组织优先、种子优先、珠被优先、块茎优先、柄优先、果皮优先和叶子优先、柱头优先、花粉优先、花药优先、花瓣优先、萼片优先、花梗优先、长角果优先、根优先、茎优先等等。种子优先的启动子在种子发育和/或萌发时优先表达。例如，种子优先启动子可以是胚优先、胚乳优先和种皮优先的。见Thompson等人，1989，BioEssays10：108。种子优先的启动子包括但不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

[第60段]其他适宜的组织优先或器官优先启动子包括但不限于，油菜的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP-启动子(Baeumlein等人，1991，Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(PCT申请No.WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆素启动子(美国专利号5,504,200)、芸苔属Bce4-启动子(PCT申请No.WO91/13980)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，PlantJournal，2(2)：233-9)，以及在像玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植物中赋予种子特异性表达的启动子。要关注的适宜启动子是大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(PCT申请No.WO 95/15389和PCT申请No.WO95/23230)，或在PCT申请No.WO 99/16890中描述的那些启动子(大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、小麦的麦胶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因)。

[第61段]用于本发明的表达盒的其他启动子包括但不限于，主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质基因(waxy)启动子、超甜基因(shrunken)1启动子、超甜基因2启动子和bronze基因启动子、Zm13启动子、(美国专利号5,086,169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)，以及合成的或其他天然启动子。

[第62段]根据本发明，所述表达盒包括与核苷酸序列有效连接的表达控制序列，该核苷酸序列是所述双链RNA的一条或两条链的模板。该双链RNA模板包括：(a)第一链，具有与SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的大约19～500个或至多全长的连续核苷酸基本上相同的序列；和(b)第二链，具有与第一链基本上互补的序列。在进一步的实施方案中，启动子位于所述模板核苷酸序列任一端的侧翼，其中所述启动子驱动各个单独的DNA链的表达，进而产生两条互补的RNA，这两条互补的RNA杂交并形成所述双链RNA。在备选的实施方案中，核苷酸序列被转录成在一个转录单元上的双链RNA的两条链，其中，正义链从转录单元的5’端转录，而反义链从3’端转录，其中这两条链隔开大约3～500个碱基对，并且转录之后，该RNA转录物自身折叠形成发夹。

[第63段]在另一个实施方案中，所述载体含有双向启动子，驱动两个核酸分子的表达，由此一个核酸分子编码与CAD样基因的一部分基本上相同的序列，而另一个核酸分子编码与第一链基本上互补的第二序列，并且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。双向启动子是能够在两个方向介导表达的启动子。

[第64段]在另一个实施方案中，所述载体含有两种启动子，一个介导与CAD样基因的一部分基本上相同的序列的转录，另一个启动子介导与第一链基本上互补的第二序列的转录，并且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。第二启动子可以是不同的启动子。

[第65段]不同启动子指就细胞或组织特异性来说具有不同活性，或对诸如病原体、非生物胁迫或化学品等不同的诱导物呈现表达的启动子。例如，一个启动子可以是组成型的或组织特异性的，而另一个则可能是组织特异性或可被病原体诱导的。在一个实施方案中，一个启动子介导与过表达CAD样基因相适应的核酸分子的转录，而另一个启动子介导互补核酸的组织或细胞特异性转录或病原体诱导的表达。

[第66段]本发明还涉及能表达本发明的双链RNA、进而抑制例如根部、采食部位、合胞体和/或巨大细胞中的CAD样基因的转基因植物。所述植物或转基因植物可以是诸如但不限于树、切花(cut flowers)、观赏植物、蔬菜或农作物植物的任何植物。上述植物可来自选自由苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组中的属。所述植物可以来自选自下列属的属：拟南芥属、苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、Brachipodium、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、黑小麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属组成的组中的属。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

[第67段]优选所述植物是农作物植物。农作物植物是用于农业的所有植物。根据一个实施方案，所述植物是单子叶植物，优选禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、黍属、穇属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属植物。当植物是玉蜀黍属时，优选物种是玉米(Zea mays)。当该植物是小麦属时，优选物种是普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(Triticumspeltae)或圆柱小麦(Triticum durum)。当所述植物是稻属时，优选物种是稻(O.sativa)。当所述植物是大麦属植物时，优选物种是大麦(Hordeumvulgare)。当所述植物是黑麦属植物时，优选物种是黑麦(Secale cereale)。当所述植物是燕麦属植物时，优选物种是燕麦(Avena sativa)。当所述植物是甘蔗属植物时，优选物种是甘蔗(Saccharum officinarum)。当所述植物是高粱属植物时，优选物种是高粱(Sorghum vulgare)、高粱(Sorghum bicolor)或苏丹草(Sorghum sudanense)。当所述植物是狼尾草属植物时，优选物种是御谷(Pennisetum glaucum)。当所述植物是狗尾草属植物时，优选物种是粱(Setaria italica)。当所述植物是黍属植物时，优选物种是野生稷(Panieum miliaceum)或柳枝稷(Panieum virgatum)。当所述植物是穇属(Eleusine)植物时，优选物种是穇子(Eleusine coracana)。当所述植物是芒属植物时，优选物种是芒(Miscanthus sinensis)。当所述植物是羊茅属(Festuca)植物时，优选物种是Festuca arundinaria、紫羊茅(Festuca rubra)或草甸草(Festuca pratensis)。当所述植物是黑麦草属植物时，优选物种是黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum)。或者，所述植物是黑小麦(Triticosecale)。

[第68段]作为备选方案，在一个实施方案中，植物为双子叶植物，优选豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑桔科(Citrus)植物。在一个实施方案中，所述植物是豆科、茄科或十字花科植物。所以，在一个实施方案中，所述植物是豆科植物，优选的属是大豆属、豌豆属、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)。豆科的优选物种是蒺藜苜蓿(M.truncatula)、紫花苜蓿(M.sativa)、大豆、豌豆、落花生(A.hypogaea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)、苜蓿(M.sativa)或兵豆(Lens culinaris)。更优选是大豆、落花生和紫花苜蓿。最优选的物种是大豆。当所述植物是茄科时，优选的属是茄属、番茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，所述植物是十字花科，优选属是芸苔属或萝卜属。十字花科的优选物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥(B.juncea)或芜青(B.rapa)。更优选的物种是欧洲油菜。当所述植物是藜科植物时，优选属是甜菜属植物。且优选物种是甜菜(B.vulgaris)。当所述植物是菊科植物时，优选属是向日葵属，优选物种是向日葵(H.annuus)。当所述植物是锦葵科植物时，优选属是棉属或秋葵属。当所述属是棉属时，优选物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)。最优选的是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当所述植物是亚麻科时，优选属是亚麻属，优选物种是亚麻(L.usitatissimum)。当所述植物是大戟科植物时，优选的属木薯属、麻风树属(Jatropa)、或蓖麻属(Rhizinus)植物。优选物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.communis)。当所述植物是旋花科植物时，优选属是番薯属，优选物种是甘薯(L.batatas)。当所述植物是蔷薇科时，优选属是蔷薇属、苹果属、梨属、李属、悬钩子属(Rubus)、茶蔗子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属植物。优选物种是杂交草莓(Fragaria×ananassa)。当所述植物是葫芦科植物时，优选是香瓜属、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)植物。优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbitapepo)。当所述植物是山茶科时，优选属是山茶属，优选物种是山茶(C.sinensis)。当所述植物是茜草科植物时，优选属是咖啡属，优选物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当所述植物是梧桐科时，优选属是可可属(Theobroma)，优选物种是可可树(T.cacao)。当所述植物是柑桔属时，优选物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)，和柑桔属物种的杂交品种，等等。在本发明的优选实施方案中，所述植物是大豆、马铃薯或谷物植物。

[第69段]转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的适当方法在植物生物生物技术领域内已知。任何方法都可以用于将重组表达载体转化入植物细胞中以获得本发明的转基因植物。转化双子叶植物的一般方法公开于：例如美国专利号4,940,838和5,464,763等中。转化具体双子叶植物(例如棉花)的方法在美国专利号5,004,863、5,159,135和5,846,797中列出。大豆转化方法于美国专利号4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301中列出，也可以使用EP 0301749B1中的方法。转化方法可包括直接或间接转化法。适当的直接法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、用基因枪的生物发射技术(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人Plant Cell 2：603，1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干胚的方法和微注入法。在直接转化法的情况下，所用质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，例如pUC系列的质粒、pBR322、M13mp系列和pACYC184等等。如果要从转化的细胞再生完整的植物，优选在质粒中有一个附加的选择性标记基因。直接转化技术对双子叶和单子叶植物都同等适用。

[第70段]还可以通过利用农杆菌(例如EP 0 116 718)的细菌感染、利用病毒载体(EP 0 067 553、US 4,407,956、WO 95/34668、WO 93/03161)的病毒感染来进行转化或借助花粉转化(EP 0 270 356；WO 85/01856；US4,684,611)。农杆菌类转化技术(尤其是对于双子叶植物)为本领域公知的技术。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包括质粒(Ti或Ri质粒)和用农杆菌感染之后转移入植物的T-DNA元件。该T-DNA(转移DNA)被整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-质粒上，或者分开包括在所谓的双元载体中。农杆菌介导的转化方法记载于例如Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，也已经适用于单子叶植物。用农杆菌的转化记载于下列文献中，例如：White FF，Vectors for Gene Transfer in HigherPlants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页、Jenes B等人Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第128-143页和Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225中。多种组织适用于作为农杆菌介导的转换过程的起始材料(外植体)，这些组织包括但不限于愈伤组织(US 5,591，616；EP-A1 604 662)、不成熟胚(EP-A1 672 752)、花粉(US 54,929,300)、苗端(US 5,164,310)或适用于植物转化(US 5,994,624)。实际上此处所描述的方法和材料可以与所有本领域已知的农杆菌介导的转化方法结合使用。利用植物育种中的已知方法，本发明的转基因植物可以与相似的转基因植物杂交，或与缺少本发明核酸的转基因植物杂交，或与非转基因植物杂交，来产生种子。此外，本发明的转基因植物可包括、和/或与另一种含有一种或多种核酸的转基因植物杂交，从而在该植物和/或其后代中形成转基因的“垛叠”。然后种植种子来得到杂交的能育的含有本发明核酸的转基因植物。该杂交能育的转基因植物可以具有特定的通过母本或通过父本遗传的表达盒。第二代植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明还包括任何这些杂交能育转基因植物的种子。本发明种子可从能育转基因植物收获，并用于生长包括含有所述DNA构建体的杂交植物系的本发明转化植物的后代。

[第71段]“基因垛叠”也可以用植物转化通过将两个或多个基因转移入细胞核中来实现。在转化过程中多个基因可以引入细胞核中，无论是依次引入还是一次引入。利用针对多个连锁的部分目的序列的单次转基因，可以通过基因沉默机制特别是RNAi下调植物中或目的病原体物种中的多个基因。在单独启动子控制下的垛叠的多个基因也可以过表达，来得到所需的单个或多个表型。含有既包括过表达基因又包括沉默靶基因的基因垛叠的构建体也可以引入植物中，获得单个或多个农艺学重要表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与任何目的多核苷酸序列的组合垛叠，以形成所需的表型。这些组合可以产生具有多种性状组合的植物，这些性状包括但不限于，疾病抗性、除草剂耐受、产量升高、耐冷和抗旱。这些垛叠组合可以通过包括但不限于常规方法或遗传转化方法杂交育种植物的任何方法形成。如果通过遗传转化法垛叠所述性状，目的多核苷酸可以以任何顺序依次组合或同时组合。例如，如果要引入两个基因，这两个序列可以包含在分别的转化盒中，或在同一个转化盒中。这些序列的表达可以被同一个启动子或不同启动子驱动。

[第72段]根据本实施方案，本发明的转基因植物用包括如下步骤的方法生产：制备具有与选择的CAD样基因的一部分基本上相同的第一区和与第一区互补的第二区的表达盒；将该表达盒转化入植物中；选择表达本发明双链RNA构建体的经转化植物的子代。

[第73段]对线虫感染的增加的抗性是希望能够遗传至广泛的植物中的一般性状。本发明可用于减少任何植物寄生线虫造成的农作物破坏。优选所述寄生线虫属于诱导巨大细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨大细胞或合胞体细胞的线虫发现于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)中。优选地，发现于异皮线虫科或根结线虫科中。

[第74段]所以，本发明所针对的寄生线虫属于选自下列组的一个或多个属：Naccobus、棘皮线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)。在优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组的一个或多个属：Naccobus、棘皮线虫属、长形胞囊线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属。在更加优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组中的一个或多个属：球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属。在进一步更优选的实施方案中，寄生线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属中的一个或两个属。在另一个实施方案中，寄生线虫属于根结线虫属。

[第75段]当寄生线虫属于球胞囊线虫属时，其物种优选选自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(Globodera virginiae)。在另一个优选的实施方案中，寄生的球胞囊线虫属线虫包括物种马铃薯白线虫、烟草球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个。当所述寄生线虫属于胞囊线虫属时，所述物种优选选自由燕麦胞囊线虫(H.avenae)、胡萝卜胞囊线虫(H.carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(H.ciceri)、十字花科胞囊线虫(H.cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(H.delvii)、褐藻胞囊线虫(H.elachista)、菲氏胞囊线虫(H.filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(H.gambiensis)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、豌豆胞囊线虫(H.goettingiana)、荞麦胞囊线虫(H.graduni)、啤酒花胞囊(H.humuli)、大麦胞囊线虫(H.hordecalis)、麦类胞囊线虫(H.latipons)、燕麦胞囊线虫(H.major)、苜蓿胞囊线虫(H.medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(H.rosii)、甘蔗胞囊线虫(H.sacchari)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、蜀黍胞囊线虫(H.sorghi)、三叶草胞囊线虫(H.trifolii)、荨麻胞囊线虫(H.urticae)、木豆胞囊线虫(H.vigni)和玉米胞囊线虫(H.zeae)组成的组中。在另一个实施方案中，寄生胞囊线虫属线虫包括物种大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫(H.cajani)、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个。在更优选的实施方案中，寄生线虫包括大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫的至少一个物种。在最优选的实施方案中，所述寄生线虫是大豆胞囊线虫。

[第76段]当所述寄生线虫是根结线虫属线虫时，所述寄生线虫可选自由高粱根结线虫(M.acronea)、小果咖啡线虫(M.arabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.lini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)组成的组中。在优选的实施方案中，所述寄生线虫包括以下物种至少之一：爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫。

[第77段]下列实施例并不意味着限制本发明要求保护的范围，而意在作为某些实施方案的示例性描述。本领域技术人员所想到的对这些示例性方法的任何改变都应落入本发明的范围内。

实施例1：从大豆克隆基因49676534

[第78段]大豆栽培种威廉姆斯82(Glycine max cv.Williams 82)在琼脂板上萌发生长3天，然后转移至萌发袋中。一天后，将每个幼苗与大豆胞囊线虫第3小种第二阶段幼体(J2)一起孵育。孵育后6天，将新生的根组织切成1cm长的段，固定，在cryomold中包埋，并用已知的方法切片。在PALM显微镜(P.A.L.M.Microlaser Technologies GmbH，Bernried，德国)下通过其特有形态鉴定合胞体细胞：增大的细胞大小、增厚的细胞壁和稠密的细胞质，并将其分离出来放入RNA抽提缓冲液中。用已知方法抽提总细胞RNA、扩增并荧光标记。从“非合胞体”和未处理的对照根分离总RNA作为对照，进行同样的RNA扩增过程。扩增后的RNA与专利大豆cDNA阵列杂交。

[第79段]如表1所示，在SCN感染的大豆根部合胞体中，大豆cDNA克隆49676534被鉴定为上调。大豆cDNA克隆49676534(SEQ ID NO：1)的氢基酸序列记载于SEQ ID NO：4中。根据SEQ ID NO：4与同源的全长蛋白质序列的比对，测得49676534cDNA序列(SEQ ID NO：1)不是全长。

表1

基因名	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根
基因名	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根	49676534^§	52±16(4)	133±94(5)	未检测	未检测

实施例2.用于大豆转化的双元载体构建

[第80段]此示例性方法使用了含有49676534靶基因(SEQ ID NO：26)的双元载体。该载体由49676534靶基因的反义片段(SEQ ID NO：2)、间隔区、该靶基因的正义片段和载体骨架组成。对应于SEQ ID NO：1的核苷酸677～876的靶基因片段(SEQ ID NO：2)用来构建双元载体RCB584。在这些载体中，用于49676534靶基因的双链RNA在RCB584中的合胞体或根优先的MtN3-样启动子(SEQ ID NO：3)控制下表达。这些启动子优先在根和/或合胞体或巨大细胞中驱动转基因的表达。这些转化的选择性标记是来自拟南芥的突变乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，其赋予了对除草剂ARSENAL的抗性(咪唑烟酸，BASF Corporation，Mount Olive，NJ)。突变AHAS的表达由荷兰芹的泛素启动子驱动(WO 03/102198)。

实施例3.生根外植体(rooted explant)的检测

[第81段]用生根外植体检测来说明双链RNA表达和得到的线虫抗性。该检测方法可见共同未决的申请USSN 12/001,234，其内容通过引用合并于此。

[第82段]将来自大豆栽培种的干净大豆种子表面灭菌并使其萌发。

[第83段]接种前三天，开始卸甲的(disarmed)农杆菌培养物的过夜液体培养，例如，含有双元载体RCB584的卸甲的发根农杆菌株K599。第二天，将培养物涂敷到含有卡那霉素作为选择剂的LB琼脂板上。将这些琼脂板在28℃培养两天。每50个要接种的外植体一个板。含有与苗连接的近端的子叶用作转化的外植体。去除子叶之后，用解剖刀围绕切除部位刮擦表面。切下并刮过的子夜是农杆菌接种的目标物。将制得的外植体浸入如上制备的卸甲的浓发根农杆菌菌落中，以使该菌落能在该切过并刮过的表面上可见。然后将外植体放到培养皿的1％琼脂上，光下共培养6-8天。在转化和共培养后，将大豆外植体转入含有选择剂的生根诱导培养基中，例如用于突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的S-B5-708(Sathasivan等人，Plant Phys.97：1044-50，1991)。在与共培养步骤中同样的条件下保持培养物。S-B5-708培养基包含：0.5×B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1×维生素B5、400μg/ml特美汀、0.8％诺布尔琼脂和1μM咪唑烟酸(用于AHAS基因的选择剂)(BASF Corporation，Florham Park，NJ)，pH为5.8。选择和根部诱导后2到3周，在外植体的切开的末端上形成转化的根。将外植体转移至相同的选择培养基(S-B5-708培养基)中进一步选择。在该培养基中，一周内转基因根良好增殖并适合进行继代培养。将强壮的白色大豆根从生根的外植体切离，并培养于六孔板中的补充有200mg/l特美汀的根生长培养基(S-MS-606培养基)中。暗处室温保持培养物。S-MS-606培养基包括：0.2×MS盐和维生素B5，2％的蔗糖和200mg/l特美汀，pH为5.8。

[第84段]继代培养一至五天后，在多孔板中用表面消毒的线虫幼体接种上述根，用于目的基因或启动子构建体检测。使用大豆栽培种威廉姆斯82对照载体和Jack对照载体根作为对照。占据至少半个孔的每株根培养物用表面净化的大豆胞囊线虫(SCN)第三小种的第二阶段幼体(J2)以500J2/孔的水平接种。然后密封这些板，并放回到25℃下黑暗中的培养箱中。从每个双元载体转化产生几个独立的根株，这些根株用来进行生物检定。接种线虫后四周，计数每个孔中的胞囊。构建体RCB584在多个株中呈现减少的胞囊数量的生物检定数据表明了在检测的许多株中都有胞囊数量减少的普遍趋势。

[第85段]实施例4.RACE以测定49676534(SEQ ID NO：1)的全部转录序列

[第86段]按照说明书的指导，用Invitrogen的GeneRacer试剂盒(L1502-01)扩增对应于49676534(SEQ ID NO：1)的cDNA序列的全长转录序列。根据Invitrogen的GeneRacer试剂盒说明书制备SCN感染后6天收获的大豆根部的总RNA，以根据说明书指导产生连接到GeneRacerRNA Oligo的去磷酸化和脱帽的RNA。制备的RNA根据GeneRacer试剂盒说明书反转录，并用作用于PCR的RACE文库模板，以根据GeneRacer试剂盒说明书用首次和第二(巢氏)PCR反应分离5’cDNA末端。

[第87段]在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分离第二次PCR反应的产物。可观察到为清楚条带的特定产物，将其从凝胶上切下。根据说明书从琼脂糖凝胶中纯化片段并克隆到pCR4-TOPO载体(Invitrogen)中，然后根据说明书指导转化至TOP10 One Shot细胞(Invitrogen)中。小量制备得到的克隆并测序。记为SEQ ID NO：5的一个测序片段与SEQ ID NO：1的49676534cDNA序列比对。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：1的比对示于图3中。基于该比对结果，分离出推定的全长毗连群序列，记为SEQ ID NO：6。在SEQ ID NO：6毗连群序列的碱基34～1107部分有一个开放阅读框。该开放阅读框序列记为SEQ ID NO：26。SEQ IDNO：6的碱基34～1107部分的开放阅读框的氨基酸序列记为SEQ ID NO：7。

实施例5.同源物的描述

[第88段]如实施例3中所述，构建体RCB584导致双链RNA分子的表达，该双链RNA分子靶向SEQ ID NO：1并在与线虫可诱导的启动子有效地连接且在大豆根部表达时会导致胞囊数量减少。如实施例4中所述，对应于SEQ ID NO：1的基因的推定全长转录序列含有具有SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列的开放阅读框。对SEQ ID NO：7中所述氨基酸序列的基因同源物的鉴定可鉴别其它序列，其可以能够调节SEQ ID NO：1转录物导致降低的线虫数量。为了研究该可能性，用SEQ ID NO：7所述的氨基酸序列鉴定同源基因。有可能表达特异性针对同源基因DNA的双链RNA也会导致如下结果：当在根中表达时，通过靶向SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：6所述的转录物而使得胞囊数量减少。鉴定出具有与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：26分别同源的氨基酸和DNA序列的基因样本，记为SEQ IDNO：8-25，并示于图1中。所述同源物代表SEQ ID NO：7所述基因的一定范围内的同源性。鉴定出的SEQ ID NO：7的截短了的同源物的氨基酸比对示于图4中。表示鉴定出的同源物与SEQ ID NO：7相互之间的氨基酸同一性百分比的矩阵表示于图5中。表示鉴定出的同源物和SEQ ID NO：26相互之间的DNA序列同一性百分比的矩阵表示于图6中。

[第89段]本领域技术人员会知晓，或仅仅通过常规的实验就能够确定此处描述的本发明具体实施方式的许多等同物。所附权利要求书意在涵盖这些等同物。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

A·威格

<120>用CAD-样基因的RNA干扰控制线虫的组合物和方法

<130>PF 58860

<160>26

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1130

<212>DNA

<213>大豆

<400>1

tgcttcgctg atgtagtttg gacaaggaat aaacatggtg actcaaagta tcctgtcgtg 60

cctggtcatg agattgctgg gattgtgaca aaggttggcg ccaatgtcca ccattttaag 120

gttggcgacc atgttggagt ggggacttat ataaactcat gtagggattg tgagtattgt 180

aatgatggac aagaagttca ttgtaccaag ggatctgtat acacttttaa tggtgttgat 240

tttgatggta caattacaaa aggaggatac tccagttaca tagtagtcca tgagaggtac 300

tgcttcatga taccaaaaag ctatccattg gcttccgcag ctcctttgct ttgtgctgga 360

attactgttt attcaccgat ggtccgccac aagatgaatc aacctggtaa atctctagga 420

gtgattggtc ttggtggcct cggtcatatg gcggtgaaat ttggaaaggc atttggtttg 480

agtgtaacgg tttttagcac tagtatatcc aagaaagagg aggcactgag cctgcttggc 540

gcagacaaat ttgttgtttc atctaatcaa gaggaaatga cggcgttggc taaatcgttg 600

gactttataa tcgacacagc atctggtgat cactcgtttg atccttacat gtcactgctg 660

aagacatatg gtgtttttgt cctagttggt ttccctagtc aagtcaaatt tatccctgca 720

agccttaata taggatcaaa gactgttgcc ggaagtgtta caggtggtac aaaagatata 780

caggagatga ttggcttctg tgctgcaaac gagattcacc caaatataga ggtgattcca 840

atcgagtatg ccaatgaagc tcttgagagg ctcataaata gggacgtcaa gtaccggttt 900

gtaatagatg ttgagaattc cctgaaagaa aaatgagttg ttgcctccca aattggacat 960

tattggactt caccttgttc gataaataat gatggtcgga gttcgtaatt tacttacata 1020

gagttgattt gaattttctt taattatttt gtgaactaat attatgtgat tataagaata 1080

ttttggattt ttaaataata ataattatgg aaatcaaaaa aaaaaaaaaa 1130

<210>2

<211>200

<212>DNA

<213>大豆

<400>2

ttgtcctagt tggtttccct agtcaagtca aatttatccc tgcaagcctt aatataggat 60

caaagactgt tgccggaagt gttacaggtg gtacaaaaga tatacaggag atgattggct 120

tctgtgctgc aaacgagatt cacccaaata tagaggtgat tccaatcgag tatgccaatg 180

aagctcttga gaggctcata 200

<210>3

<211>609

<212>DNA

<213>大豆

<400>3

gaagccacgt catgaagagt atatcatttc agtaatgttt tgagacgcct ctataatgct 60

ttaccaacaa aacaaaacaa aaaaaagaac atttgaaacc atttgtatta aaaaaaaaaa 120

ggtatattag gccataatat tataggtaac atgaaatatc aaatgacacg caagagtttt 180

gtcaaaaatg aaaccatcac acatcagaga ttatggcaaa taatgttttg tgtgtctctt 240

gcttcaccca taacataagc ctctataact ggagagaaga aaaaaaaaag tggaggggct 300

agggtgggaa tttggaagaa tacagttata ttgagcattg agcaagttga tagaaagctt 360

ctcaatttgt acaaaatttg catccacatg attattaaag acgtagacag cacttcttcc 420

ttcttttttt ctataagttt cttatatatt gttcttcatg ttttaatatt attactttat 480

gtacgcgtct aacagtagtc ctcccaaact gctataaata gagcctcttc aacgcacctc 540

ttggcagtac aaaaattatt catctcttct aagttctaat tttctaagca ttcagtaaaa 600

gaactaacc 609

<210>4

<211>311

<212>PRT

<213>大豆

<400>4

Cys Phe Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys His Gly Asp Ser Lys

1 5 10 15

Tyr Pro Val Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Thr Lys Val

20 25 30

Gly Ala Asn Val His His Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly

35 40 45

Thr Tyr Ile Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Gln

50 55 60

Glu Val His Cys Thr Lys Gly Ser Val Tyr Thr Phe Asn Gly Val Asp

65 70 75 80

Phe Asp Gly Thr Ile Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser Tyr Ile Val Val

85 90 95

His Glu Arg Tyr Cys Phe Met Ile Pro Lys Ser Tyr Pro Leu Ala Ser

100 105 110

Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Val

115 120 125

Arg His Lys Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu

130 135 140

Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu

145 150 155 160

Ser Val Thr Val Phe Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu

165 170 175

Ser Leu Leu Gly Ala Asp Lys Phe Val Val Ser Ser Asn Gln Glu Glu

180 185 190

Met Thr Ala Leu Ala Lys Ser Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser

195 200 205

Gly Asp His Ser Phe Asp Pro Tyr Met Ser Leu Leu Lys Thr Tyr Gly

210 215 220

Val Phe Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Gln Val Lys Phe Ile Pro Ala

225 230 235 240

Ser Leu Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Asp Ile Gln Glu Met Ile Gly Phe Cys Ala Ala Asn Glu Ile

260 265 270

His Pro Asn Ile Glu Val Ile Pro Ile Glu Tyr Ala Asn Glu Ala Leu

275 280 285

Glu Arg Leu Ile Asn Arg Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Val

290 295 300

Glu Asn Ser Leu Lys Glu Lys

305 310

<210>5

<211>519

<212>DNA

<213>大豆

<400>5

ggatccttac tcatcacaag tgtgagaaaa attatgagtt ccaaaggtgt tggtgaagat 60

tgcctgggat gggcagcaag agatgcatcc ggagttctat caccttacaa attcagtcgc 120

aggactcttg ggaacgaaga tgttcatatt aaaattacgc actgtggtgt ttgcttcgct 180

gatgtagttt ggacaaggaa taaacatggt gactcaaagt atcctgtcgt gcctggtcat 240

gagattgctg ggattgtgac aaaggttggc gccaatgtcc accattttaa ggttggcgac 300

catgttggag tggggactta tataaactca tgtagggatt gtgagtattg taatgatgga 360

caagaagttc attgtaccaa gggatctgta tacactttta atggtgttga ttttgatggt 420

acaattacaa aaggaggata ctccagttac atagtagtcc atgagaggta ctgcttcatg 480

ataccaaaaa gctatccatt ggcttccgca gctcctttg 519

<210>6

<211>1301

<212>DNA

<213>大豆

<400>6

ggatccttac tcatcacaag tgtgagaaaa attatgagtt ccaaaggtgt tggtgaagat 60

tgcctgggat gggcagcaag agatgcatcc ggagttctat caccttacaa attcagtcgc 120

aggactcttg ggaacgaaga tgttcatatt aaaattacgc actgtggtgt ttgcttcgct 180

gatgtagttt ggacaaggaa taaacatggt gactcaaagt atcctgtcgt gcctggtcat 240

gagattgctg ggattgtgac aaaggttggc gccaatgtcc accattttaa ggttggcgac 300

catgttggag tggggactta tataaactca tgtagggatt gtgagtattg taatgatgga 360

caagaagttc attgtaccaa gggatctgta tacactttta atggtgttga ttttgatggt 420

acaattacaa aaggaggata ctccagttac atagtagtcc atgagaggta ctgcttcatg 480

ataccaaaaa gctatccatt ggcttccgca gctcctttgc tttgtgctgg aattactgtt 540

tattcaccga tggtccgcca caagatgaat caacctggta aatctctagg agtgattggt 600

cttggtggcc tcggtcatat ggcggtgaaa tttggaaagg catttggttt gagtgtaacg 660

gtttttagca ctagtatatc caagaaagag gaggcactga gcctgcttgg cgcagacaaa 720

tttgttgttt catctaatca agaggaaatg acggcgttgg ctaaatcgtt ggactttata 780

atcgacacag catctggtga tcactcgttt gatccttaca tgtcactgct gaagacatat 840

ggtgtttttg tcctagttgg tttccctagt caagtcaaat ttatccctgc aagccttaat 900

ataggatcaa agactgttgc cggaagtgtt acaggtggta caaaagatat acaggagatg 960

attggcttct gtgctgcaaa cgagattcac ccaaatatag aggtgattcc aatcgagtat 1020

gccaatgaag ctcttgagag gctcataaat agggacgtca agtaccggtt tgtaatagat 1080

gttgagaatt ccctgaaaga aaaatgagtt gttgcctccc aaattggaca ttattggact 1140

tcaccttgtt cgataaataa tgatggtcgg agttcgtaat ttacttacat agagttgatt 1200

tgaattttct ttaattattt tgtgaactaa tattatgtga ttataagaat attttggatt 1260

tttaaataat aataattatg gaaatcaaaa aaaaaaaaaa a 1301

<210>7

<211>357

<212>PRT

<213>大豆

<400>7

Met Ser Ser Lys Gly Val Gly Glu Asp Cys Leu Gly Trp Ala Ala Arg

1 5 10 15

Asp Ala Ser Gly Val Leu Ser Pro Tyr Lys Phe Ser Arg Arg Thr Leu

20 25 30

Gly Asn Glu Asp Val His Ile Lys Ile Thr His Cys Gly Val Cys Phe

35 40 45

Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys His Gly Asp Ser Lys Tyr Pro

50 55 60

Val Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Thr Lys Val Gly Ala

65 70 75 80

Asn Val His His Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr Tyr

85 90 95

Ile Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Gln Glu Val

100 105 110

His Cys Thr Lys Gly Ser Val Tyr Thr Phe Asn Gly Val Asp Phe Asp

115 120 125

Gly Thr Ile Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser Tyr Ile Val Val His Glu

130 135 140

Arg Tyr Cys Phe Met Ile Pro Lys Ser Tyr Pro Leu Ala Ser Ala Ala

145 150 155 160

Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Val Arg His

165 170 175

Lys Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly

180 185 190

Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Ser Val

195 200 205

Thr Val Phe Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu Ser Leu

210 215 220

Leu Gly Ala Asp Lys Phe Val Val Ser Ser Asn Gln Glu Glu Met Thr

225 230 235 240

Ala Leu Ala Lys Ser Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser Gly Asp

245 250 255

His Ser Phe Asp Pro Tyr Met Ser Leu Leu Lys Thr Tyr Gly Val Phe

260 265 270

Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Gln Val Lys Phe Ile Pro Ala Ser Leu

275 280 285

Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly Thr Lys

290 295 300

Asp Ile Gln Glu Met Ile Gly Phe Cys Ala Ala Asn Glu Ile His Pro

305 310 315 320

Asn Ile Glu Val Ile Pro Ile Glu Tyr Ala Asn Glu Ala Leu Glu Arg

325 330 335

Leu Ile Asn Arg Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Val Glu Asn

340 345 350

Ser Leu Lys Glu Lys

355

<210>8

<211>1068

<212>DNA

<213>葡萄

<400>8

atgacttctg aaagtgcaga tgacaactgc ttagcatggg cggcaagaga tccatctggc 60

cttctatcac cttacaaatt cagccgcagg gctcttggaa gtgatgatgt ttcattgaat 120

atcacacact gtggggtttg ttatgctgat gtagtctgga ctaggaataa atttggagac 180

tctaagtatc ctgtggtacc tggacatgag attgctggaa ttgtaaaaga ggttggctca 240

aatgttcgtc gcttcaaagt tggtgaccat gttggagtgg gaacctatgt caactcatgc 300

agggattgtg agtactgcaa tgatggactt gaagttcatt gtgcgagggg gtcggtgttc 360

acttttaatg gtgttgatgt tgatggtacg gtcaccaaag gaggttattc cagtcacatt 420

gttgttcatg aaaggtactg cttcaagata cctgacaact acccattagc ttcagcagca 480

cctttgctat gtgctggaat tactgtttac actcccatga tgcgccacaa gatgaaccaa 540

cctggtaaat ccctcggggt gattgggcta ggtggtcttg gtcacttggc tgtgaagttt 600

ggcaaggctt ttggattgcg tgtcacagtt ctcagcacaa gcatatccaa gaaagaagaa 660

gctctgaatc tgcttggagc agacaaattt gtggtctcat cagacgaaca gcagatgatg 720

gctctttcta gatcactcga ctttataatt gatactgcat caggtgatca cccattcgat 780

ccatacttgt ctctgttgaa gactgccgga gtcctagttc tggtggggtt cccaagtgaa 840

gtgaaattca gtcctggaag cattgtcatg ggtatgagaa ctgtttctgg tagcgctaca 900

ggtggtacaa aagatacaca agaaatgctt gacttttgtg ctgcacatgg aattcaccca 960

gagatcgaag taattccaat tcagtatgca aatgaagccc ttgagaggct aataaagaag 1020

gacgtgaagt accgttttgt gattgatatt gaaaactctc tgaagtga 1068

<210>9

<211>355

<212>PRT

<213>葡萄

<400>9

Met Thr Ser Glu Ser Ala Asp Asp Asn Cys Leu Ala Trp Ala Ala Arg

1 5 10 15

Asp Pro Ser Gly Leu Leu Ser Pro Tyr Lys Phe Ser Arg Arg Ala Leu

20 25 30

Gly Ser Asp Asp Val Ser Leu Asn Ile Thr His Cys Gly Val Cys Tyr

35 40 45

Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys Phe Gly Asp Ser Lys Tyr Pro

50 55 60

Val Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Lys Glu Val Gly Ser

65 70 75 80

Asn Val Arg Arg Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr Tyr

85 90 95

Val Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Leu Glu Val

100 105 110

His Cys Ala Arg Gly Ser Val Phe Thr Phe Asn Gly Val Asp Val Asp

115 120 125

Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser His Ile Val Val His Glu

130 135 140

Arg Tyr Cys Phe Lys Ile Pro Asp Asn Tyr Pro Leu Ala Ser Ala Ala

145 150 155 160

Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Thr Pro Met Met Arg His

165 170 175

Lys Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly

180 185 190

Leu Gly His Leu Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Arg Val

195 200 205

Thr Val Leu Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu Asn Leu

210 215 220

Leu Gly Ala Asp Lys Phe Val Val Ser Ser Asp Glu Gln Gln Met Met

225 230 235 240

Ala Leu Ser Arg Ser Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser Gly Asp

245 250 255

His Pro Phe Asp Pro Tyr Leu Ser Leu Leu Lys Thr Ala Gly Val Leu

260 265 270

Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Glu Val Lys Phe Ser Pro Gly Ser Ile

275 280 285

Val Met Gly Met Arg Thr Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Thr Lys

290 295 300

Asp Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Ala His Gly Ile His Pro

305 310 315 320

Glu Ile Glu Val Ile Pro Ile Gln Tyr Ala Asn Glu Ala Leu Glu Arg

325 330 335

Leu Ile Lys Lys Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Ile Glu Asn

340 345 350

Ser Leu Lys

355

<210>10

<211>1068

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>10

atgagttctt cagagagtgt ggaaaacgag tgcatgtgtt gggctgcaag agatccatct 60

ggtcttcttt ctcctcatac tatcactcgc aggtctgtta caactgacga tgtttcactc 120

acaatcactc attgtggagt gtgttacgct gatgttatct ggagtagaaa ccaacatgga 180

gactccaagt accctttggt tcctgggcat gagattgctg gaatagtgac taaggttggg 240

cctaatgttc aacgattcaa agttggagac catgttggtg ttggaacgta tgttaactcc 300

tgcagggagt gtgaatattg taatgaagga caagaagtta attgtgcgaa aggagttttt 360

actttcaatg gcattgatca tgatggctct gttactaaag gaggctactc tagtcacatt 420

gttgttcatg aaaggtactg ctacaagata cctgtggact atcccttgga atcagctgca 480

ccattactct gtgctggaat cacggtttat gctcctatga tgcgtcacaa tatgaatcaa 540

cctggtaaat ctcttggggt gatcgggcta ggtggtcttg gacacatggc ggttaagttt 600

ggcaaggctt ttggacttag tgttacggtt tttagcacca gcatttccaa gaaagaagaa 660

gctttgaatc tgctaggagc tgagaatttc gttatctcat ctgaccatga ccagatgaag 720

gcactagaga aatctctaga ctttctagtt gacacagcat ctggtgatca cgcgtttgat 780

ccttacatgt ctctcttgaa gattgctgga acttatgtat tggttggttt cccaagtgaa 840

attaaaatca gtcctgccaa tctcaatctt ggtatgagaa tgctcgctgg aagtgtaacc 900

ggggggacca aaataacaca gcaaatgtta gatttctgtg cagctcataa gatttatcca 960

aacatagagg tgattcccat tcaaaagata aacgaagctc tcgaaagagt ggtgaagaag 1020

gacatcaagt accgtttcgt gattgacatc aagaactccc tcaaatag 1068

<210>11

<211>355

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>11

Met Ser Ser Ser Glu Ser Val Glu Asn Glu Cys Met Cys Trp Ala Ala

1 5 10 15

Arg Asp Pro Ser Gly Leu Leu Ser Pro His Thr Ile Thr Arg Arg Ser

20 25 30

Val Thr Thr Asp Asp Val Ser Leu Thr Ile Thr His Cys Gly Val Cys

35 40 45

Tyr Ala Asp Val Ile Trp Ser Arg Asn Gln His Gly Asp Ser Lys Tyr

50 55 60

Pro Leu Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Thr Lys Val Gly

65 70 75 80

Pro Asn Val Gln Arg Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr

85 90 95

Tyr Val Asn Ser Cys Arg Glu Cys Glu Tyr Cys Asn Glu Gly Gln Glu

100 105 110

Val Asn Cys Ala Lys Gly Val Phe Thr Phe Asn Gly Ile Asp His Asp

115 120 125

Gly Ser Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser His Ile Val Val His Glu

130 135 140

Arg Tyr Cys Tyr Lys Ile Pro Val Asp Tyr Pro Leu Glu Ser Ala Ala

145 150 155 160

Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ala Pro Met Met Arg His

165 170 175

Asn Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly

180 185 190

Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Ser Val

195 200 205

Thr Val Phe Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu Asn Leu

210 215 220

Leu Gly Ala Glu Asn Phe Val Ile Ser Ser Asp His Asp Gln Met Lys

225 230 235 240

Ala Leu Glu Lys Ser Leu Asp Phe Leu Val Asp Thr Ala Ser Gly Asp

245 250 255

His Ala Phe Asp Pro Tyr Met Ser Leu Leu Lys Ile Ala Gly Thr Tyr

260 265 270

Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Glu Ile Lys Ile Ser Pro Ala Asn Leu

275 280 285

Asn Leu Gly Met Arg Met Leu Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly Thr Lys

290 295 300

Ile Thr Gln Gln Met Leu Asp Phe Cys Ala Ala His Lys Ile Tyr Pro

305 310 315 320

Asn Ile Glu Val Ile Pro Ile Gln Lys Ile Asn Glu Ala Leu Glu Arg

325 330 335

Val Val Lys Lys Asp Ile Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Ile Lys Asn

340 345 350

Ser Leu Lys

355

<210>12

<211>1071

<212>DNA

<213>北美云杉

<400>12

atgaatacta aagaagactg caaggagaac tgtaaaggat gggcagctcg agatccatca 60

ggtgttttgt caccttacca atttaaccga agagtcccag gccttgatga tatctcatta 120

aagataactc attgtggagt ttgttatgcc gatgttgtct ggacccggaa taaacatggt 180

gattcaaagt atccattggt gccagggcat gaaattgttg gaattgtgaa agaagttggc 240

atcaatgtgg tctcttttaa ggctggcgat catgttggag tgggtacata tgtcagttcc 300

tgtcagcaat gtgaatattg taacgaaagg atggaagtca attgtgaaaa agggtctgtt 360

ttcaccttta atggtatcga tgtagatggc acagtaacta aaggaggata ttctagtcac 420

attgttgttc accaaaggta ctgctttaag ataccagaca atctaccact ggcttcagct 480

gcacctttgc tctgtgcagg aattactgtt tacagcccta tgattcgtca tcacatgaat 540

catgcaggaa agtctcttgg agtaattggg ctaggaggtc ttggtcatat ggcagtaaaa 600

tttggaaagg cttttggact gaatgtaaca atttttagca catctgcatc aaagaaggat 660

gaagcattaa acattcttgg agcagataaa tttatagtgt catctgataa agatcagata 720

gaggcttcat caaagactct agatttcatc attgacaccg cttcagggga ccacccaatt 780

gatctttata tgccactttt gaagactgca ggagtgtttg tcatcgtagg tttccccagt 840

gaaatcaaga tccaccctgc caatcttatt ataggcatga aatcaattgc aggaagtgta 900

acaggtggca ccaaagacac tcaagaaatg cttgattttt gtgcaaagga aagagtatat 960

ccagacattg aagtcattcc aatccagtat gtgaatgagg ctttagaacg aatgattaac 1020

aaagatgtga aatatcgctt tgtgattgac attgagaatt ctctagtctg a 1071

<210>13

<211>356

<212>PRT

<213>北美云杉

<400>13

Met Asn Thr Lys Glu Asp Cys Lys Glu Asn Cys Lys Gly Trp Ala Ala

1 5 10 15

Arg Asp Pro Ser Gly Val Leu Ser Pro Tyr Gln Phe Asn Arg Arg Val

20 25 30

Pro Gly Leu Asp Asp Ile Ser Leu Lys Ile Thr His Cys Gly Val Cys

35 40 45

Tyr Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys His Gly Asp Ser Lys Tyr

50 55 60

Pro Leu Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Ile Val Lys Glu Val Gly

65 70 75 80

Ile Asn Val Val Ser Phe Lys Ala Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr

85 90 95

Tyr Val Ser Ser Cys Gln Gln Cys Glu Tyr Cys Asn Glu Arg Met Glu

100 105 110

Val Asn Cys Glu Lys Gly Ser Val Phe Thr Phe Asn Gly Ile Asp Val

115 120 125

Asp Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser His Ile Val Val His

130 135 140

Gln Arg Tyr Cys Phe Lys Ile Pro Asp Asn Leu Pro Leu Ala Ser Ala

145 150 155 160

Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Ile Arg

165 170 175

His His Met Asn His Ala Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu Gly

180 185 190

Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Asn

195 200 205

Val Thr Ile Phe Ser Thr Ser Ala Ser Lys Lys Asp Glu Ala Leu Asn

210 215 220

Ile Leu Gly Ala Asp Lys Phe Ile Val Ser Ser Asp Lys Asp Gln Ile

225 230 235 240

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser Gly

245 250 255

Asp His Pro Ile Asp Leu Tyr Met Pro Leu Leu Lys Thr Ala Gly Val

260 265 270

Phe Val Ile Val Gly Phe Pro Ser Glu Ile Lys Ile His Pro Ala Asn

275 280 285

Leu Ile Ile Gly Met Lys Ser Ile Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly Thr

290 295 300

Lys Asp Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Lys Glu Arg Val Tyr

305 310 315 320

Pro Asp Ile Glu Val Ile Pro Ile Gln Tyr Val Asn Glu Ala Leu Glu

325 330 335

Arg Met Ile Asn Lys Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Ile Glu

340 345 350

Asn Ser Leu Val

355

<210>14

<211>1032

<212>DNA

<213>稻

<400>14

atggctgctg aatgtgggag tggcaactgt gatgcttggg cagcgagaga tccttccgga 60

atcctctccc cgtacaaatt caaccgcagg gaagtacaga gtgaagatgt ttctttgagg 120

atcacacact gtggagtatg ttatgctgat gtcatttgga cacggaatat gttcaacgat 180

tcgatatacc ctttggttcc tgggcacgag atagctggag ttgtaactga ggttggtgca 240

gacgtcaagg ggttcaaagt gggcgaccat gactgcgaga actgcaatag ctctctggag 300

aaccactgct cgaaatgtgt cgtcacttac aacagtgttg attcagacgg gaccgtaaca 360

aagggtggat attccagtca tatactagtg catcaaaggt actgctttaa aatacctgct 420

gactaccctt tgtcaaaggc agcaccactg ctttgtgcgg gaattaccgt atatactcca 480

atgatacgac ataacatgaa ccaaccaggg aagtcacttg gcgtcattgg actaggtggg 540

ttgggtcaca tggcagtaaa atttgggaaa gcctttggac tcaaagtgac agtttttagt 600

acaagtgaat caaagagaga agaagctatc aaccttcttg gtgcagataa ttttgtgata 660

tcatcagatg aaaatcagat ggagtcactg aaaagttccc ttcacttcat tattgatact 720

gcatctggtg atcaccagtt cgatccttat ctctcgcttc tgaaagttgg tggtgtaatg 780

gtgctactta gcttcccaag tgaaatcaaa gttcatcctg aaaaccttaa tctcgctgcg 840

cggagcttag ctggtagtgt aacagggggt acaaaggata tccaggagat gataaacttc 900

tgtgctgcaa acaatgttta cccagatata gagatgatca agatagacta cgtcaacgag 960

gctcttcaga ggctcatcaa ccgggatgtg agattccgct ttgtaatcga catcgagaac 1020

tctttcaagt ag 1032

<210>15

<211>343

<212>PRT

<213>稻

<400>15

Met Ala Ala Glu Cys Gly Ser Gly Asn Cys Asp Ala Trp Ala Ala Arg

1 5 10 15

Asp Pro Ser Gly Ile Leu Ser Pro Tyr Lys Phe Asn Arg Arg Glu Val

20 25 30

Gln Ser Glu Asp Val Ser Leu Arg Ile Thr His Cys Gly Val Cys Tyr

35 40 45

Ala Asp Val Ile Trp Thr Arg Asn Met Phe Asn Asp Ser Ile Tyr Pro

50 55 60

Leu Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Val Val Thr Glu Val Gly Ala

65 70 75 80

Asp Val Lys Gly Phe Lys Val Gly Asp His Asp Cys Glu Asn Cys Asn

85 90 95

Ser Ser Leu Glu Asn His Cys Ser Lys Cys Val Val Thr Tyr Asn Ser

100 105 110

Val Asp Ser Asp Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser His Ile

115 120 125

Leu Val His Gln Arg Tyr Cys Phe Lys Ile Pro Ala Asp Tyr Pro Leu

130 135 140

Ser Lys Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Thr Pro

145 150 155 160

Met Ile Arg His Asn Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile

165 170 175

Gly Leu Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe

180 185 190

Gly Leu Lys Val Thr Val Phe Ser Thr Ser Glu Ser Lys Arg Glu Glu

195 200 205

Ala Ile Asn Leu Leu Gly Ala Asp Asn Phe Val Ile Ser Ser Asp Glu

210 215 220

Asn Gln Met Glu Ser Leu Lys Ser Ser Leu His Phe Ile Ile Asp Thr

225 230 235 240

Ala Ser Gly Asp His Gln Phe Asp Pro Tyr Leu Ser Leu Leu Lys Val

245 250 255

Gly Gly Val Met Val Leu Leu Ser Phe Pro Ser Glu Ile Lys Val His

260 265 270

Pro Glu Asn Leu Asn Leu Ala Ala Arg Ser Leu Ala Gly Ser Val Thr

275 280 285

Gly Gly Thr Lys Asp Ile Gln Glu Met Ile Asn Phe Cys Ala Ala Asn

290 295 300

Asn Val Tyr Pro Asp Ile Glu Met Ile Lys Ile Asp Tyr Val Asn Glu

305 310 315 320

Ala Leu Gln Arg Leu Ile Asn Arg Asp Val Arg Phe Arg Phe Val Ile

325 330 335

Asp Ile Glu Asn Ser Phe Lys

340

<210>16

<211>894

<212>DNA

<213>稻

<400>16

atgaaattgt gtctaaattt caatatgagt aggcatgaga tagcaggagt tgtaactgag 60

gttggtgcag acgtcaagag cttcaaagtg ggtgaccatg taggtgttgg cacatacgtg 120

aattcatgcc gggactgtga gaactgcaat agctctctag agaactactg ctcacaacat 180

gtcttcactt tcaatggtgt tgacactgat gggactgtca caaagggagg atattctact 240

cacatagtag tacatgagag gtattgcttt aaaatacctg atggctaccc tttggaaaag 300

gcagcacctt tactttgtgc tggcatcact gtatatagtc cgatgatgcg gcataatatg 360

aaccagccag ggaagtcact cggcgtcatt ggacttggtg gcttgggtca catggcagta 420

aaatttggga aagcctttgg actgaaagtc acagttatta gtactagtga atcaaagaga 480

aaagaagcta ttgaccttct tggtgcagat aatttcgtgg tgtcatcgga tgaaaatcag 540

atggagacct tgaaaagctc tctgaacttc attattgaca cagcctccgg cgatcaccca 600

ttcgatcctt atctcacgct tctgaaagtt ggtggtgtaa tggcactact tagcttccca 660

agtgaaatca aagtgcatcc tgcaaacctt aatctcggtg ggcggagttt atctggtagt 720

gtaactggag gtacgaagga catccaggag atgataaact tctgtgcggc aaacaaaatc 780

tacccagata tcgagatgat caagatagat tacatcaacg aggctcttca gaggcttgtt 840

gaccgggatg tcagatttcg ctttgtaatc gacattgaga actcgttcaa gtag 894

<210>17

<211>297

<212>PRT

<213>稻

<400>17

Met Lys Leu Cys Leu Asn Phe Asn Met Ser Arg His Glu Ile Ala Gly

1 5 10 15

Val Val Thr Glu Val Gly Ala Asp Val Lys Ser Phe Lys Val Gly Asp

20 25 30

His Val Gly Val Gly Thr Tyr Val Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Asn

35 40 45

Cys Asn Ser Ser Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Gln His Val Phe Thr Phe

50 55 60

Asn Gly Val Asp Thr Asp Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Thr

65 70 75 80

His Ile Val Val His Glu Arg Tyr Cys Phe Lys Ile Pro Asp Gly Tyr

85 90 95

Pro Leu Glu Lys Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr

100 105 110

Ser Pro Met Met Arg His Asn Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly

115 120 125

Val Ile Gly Leu Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys

130 135 140

Ala Phe Gly Leu Lys Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Glu Ser Lys Arg

145 150 155 160

Lys Glu Ala Ile Asp Leu Leu Gly Ala Asp Asn Phe Val Val Ser Ser

165 170 175

Asp Glu Asn Gln Met Glu Thr Leu Lys Ser Ser Leu Asn Phe Ile Ile

180 185 190

Asp Thr Ala Ser Gly Asp His Pro Phe Asp Pro Tyr Leu Thr Leu Leu

195 200 205

Lys Val Gly Gly Val Met Ala Leu Leu Ser Phe Pro Ser Glu Ile Lys

210 215 220

Val His Pro Ala Asn Leu Asn Leu Gly Gly Arg Ser Leu Ser Gly Ser

225 230 235 240

Val Thr Gly Gly Thr Lys Asp Ile Gln Glu Met Ile Asn Phe Cys Ala

245 250 255

Ala Asn Lys Ile Tyr Pro Asp Ile Glu Met Ile Lys Ile Asp Tyr Ile

260 265 270

Asn Glu Ala Leu Gln Arg Leu Val Asp Arg Asp Val Arg Phe Arg Phe

275 280 285

Val Ile Asp Ile Glu Asn Ser Phe Lys

290 295

<210>18

<211>1089

<212>DNA

<213>毛果杨(Populus trichocarpa)

<400>18

atggcaaaat caccagaagt agaacatcca cataaggctt ttggctgggc tgccaaagat 60

agttctgggg tcctttctcc ctttcatttc tcaagaaggg acaatggagt tgaagatgtg 120

accataaaaa tcctgtactg tggagtttgc cattcggact tgcacgctgc caagaatgaa 180

tgggggtttt ccagatatcc tttgattcct gggcatgaaa ttgttggtat tgtgacaaaa 240

attggaagca atgtgaagaa gttcaaagtg gacgatcagg ttggtgttgg agtactggtg 300

aactcctgta agtcatgcga gtattgcgac caggacttgg agaattactg ccctaaaatg 360

atatttacat acaatgccca aaaccatgat gggacaaaaa cttatggtgg ttattctgat 420

acaattgtgg ttgaccagca ctttgtactc cgtattcctg atagcatgcc tgctgatggg 480

gctgcaccac tattatgtgc tgggatcaca gtgtacagcc caatgaaata ttatggaatg 540

acagaaccag ggaagcattt gggaatcgta ggattggggg ggcttggaca tgttgctgtg 600

aagattggta aggcctttgg tttgaaagtt acagtcatca gttcatcatc aagaaaggag 660

agcgaagcac ttgatagact tggtgctgat tcattccttg tgagcagtga ccctgagaaa 720

atgaaggcag catttggcac tatggattac atcattgaca ctgtgtctgc agttcatgcc 780

ttggctccac ttcttagtct gctgaagaca aatggaaaac ttgttacttt gggcttgcct 840

gagaagcccc ttgagctgcc tatcttccct ttggtcttgg ggcgaaagct agttggtgga 900

agtgatattg gaggggtgaa agagactcaa gagatgttgg acttctgtgc gaagcacaat 960

attacctcag atgttgaggt gatccgaatg gatcaaatca acacagccat ggataggctt 1020

gccaaatcgg atgtcaggta ccggtttgtg attgatgtgg ccaactccct gtcacaatct 1080

cagttatga 1089

<210>19

<211>362

<212>PRT

<213>毛果杨

<400>19

Met Ala Lys Ser Pro Glu Val Glu His Pro His Lys Ala Phe Gly Trp

1 5 10 15

Ala Ala Lys Asp Ser Ser Gly Val Leu Ser Pro Phe His Phe Ser Arg

20 25 30

Arg Asp Asn Gly Val Glu Asp Val Thr Ile Lys Ile Leu Tyr Cys Gly

35 40 45

Val Cys His Ser Asp Leu His Ala Ala Lys Asn Glu Trp Gly Phe Ser

50 55 60

Arg Tyr Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Ile Val Gly Ile Val Thr Lys

65 70 75 80

Ile Gly Ser Asn Val Lys Lys Phe Lys Val Asp Asp Gln Val Gly Val

85 90 95

Gly Val Leu Val Asn Ser Cys Lys Ser Cys Glu Tyr Cys Asp Gln Asp

100 105 110

Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Lys Met Ile Phe Thr Tyr Asn Ala Gln Asn

115 120 125

His Asp Gly Thr Lys Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp Thr Ile Val Val

130 135 140

Asp Gln His Phe Val Leu Arg Ile Pro Asp Ser Met Pro Ala Asp Gly

145 150 155 160

Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Lys

165 170 175

Tyr Tyr Gly Met Thr Glu Pro Gly Lys His Leu Gly Ile Val Gly Leu

180 185 190

Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Ile Gly Lys Ala Phe Gly Leu

195 200 205

Lys Val Thr Val Ile Ser Ser Ser Ser Arg Lys Glu Ser Glu Ala Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Lys

225 230 235 240

Met Lys Ala Ala Phe Gly Thr Met Asp Tyr Ile Ile Asp Thr Val Ser

245 250 255

Ala Val His Ala Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Lys Thr Asn Gly

260 265 270

Lys Leu Val Thr Leu Gly Leu Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Ile

275 280 285

Phe Pro Leu Val Leu Gly Arg Lys Leu Val Gly Gly Ser Asp Ile Gly

290 295 300

Gly Val Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Lys His Asn

305 310 315 320

Ile Thr Ser Asp Val Glu Val Ile Arg Met Asp Gln Ile Asn Thr Ala

325 330 335

Met Asp Arg Leu Ala Lys Ser Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp

340 345 350

Val Ala Asn Ser Leu Ser Gln Ser Gln Leu

355 360

<210>20

<211>1080

<212>DNA

<213>烟草

<400>20

atggcaaaat tatatgagaa tgaacaccca gtaaaggcct ttggatgggc agctagagat 60

acttctggtg ttctttctcc ttttaacttt tcaagaagag ccacgggtga aaaggatgtg 120

cagtttaaag ttatgtattg tggaatttgt cattctgatc ttcatcagct caagaatgaa 180

tggagcacta gcatatatcc aatggtacct gggcatgagg ttgctggtgt ggtaactgat 240

gttggtagca aggttgagaa atttaaggtt ggtgacaaag taggagttgg atgtttggta 300

ggatcatgtc gcaaatgtga aaactgtgac aataatctcg agaattactg tcccggtcag 360

ataatgacat acaacggtat ttacatcgat ggaaccacca cgtatggagg atactccaat 420

attatggtaa cggacgagca ctacgtggtt cactggcctg agaacttgcc aatggaagcg 480

gctccattgt tatgtgctgg aattacaaca tatagtcctt tgaaatattt tggactcgat 540

aaacctggaa tgcacattgg tgttgttggt cttggtggtc ttggtcatat ggctgtgaaa 600

tttgctaagg cattcggaac aaaagtgact gttattagta catctgctag taagaaacaa 660

gaagcaattg ggcgtttggg tgcggactca tttttggtta gtcgtgaccc tgaccaaatg 720

caggctgcag caggctcgct tgatggcatc attgacactg tctctgcaat tcaccctctt 780

cttccattga ttaatttgtt gaaaactcat gggaagcttg taatggttgg cgcaccagaa 840

aaaccattag agttgcccgt atttcccttg cttttaggaa ggaagctagt agcagggagt 900

gccataggag ggataaagga gacacaagag atggtagatt tcgcggcaaa gcataacatt 960

acaccagatg ttgaagtcgt gccaatggac tatgtgaata cagctttaga ccgtcttttg 1020

aaatcggatg ttaagtaccg ttttgtactt gacgttggca atacattaaa caagaattag 1080

<210>21

<211>359

<212>PRT

<213>烟草

<400>21

Met Ala Lys Leu Tyr Glu Asn Glu His Pro Val Lys Ala Phe Gly Trp

1 5 10 15

Ala Ala Arg Asp Thr Ser Gly Val Leu Ser Pro Phe Asn Phe Ser Arg

20 25 30

Arg Ala Thr Gly Glu Lys Asp Val Gln Phe Lys Val Met Tyr Cys Gly

35 40 45

Ile Cys His Ser Asp Leu His Gln Leu Lys Asn Glu Trp Ser Thr Ser

50 55 60

Ile Tyr Pro Met Val Pro Gly His Glu Val Ala Gly Val Val Thr Asp

65 70 75 80

Val Gly Ser Lys Val Glu Lys Phe Lys Val Gly Asp Lys Val Gly Val

85 90 95

Gly Cys Leu Val Gly Ser Cys Arg Lys Cys Glu Asn Cys Asp Asn Asn

100 105 110

Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Gly Gln Ile Met Thr Tyr Asn Gly Ile Tyr

115 120 125

Ile Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Met Val Thr

130 135 140

Asp Glu His Tyr Val Val His Trp Pro Glu Asn Leu Pro Met Glu Ala

145 150 155 160

Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Lys Tyr

165 170 175

Phe Gly Leu Asp Lys Pro Gly Met His Ile Gly Val Val Gly Leu Gly

180 185 190

Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Ala Lys Ala Phe Gly Thr Lys

195 200 205

Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Ala Ser Lys Lys Gln Glu Ala Ile Gly

210 215 220

Arg Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Arg Asp Pro Asp Gln Met

225 230 235 240

Gln Ala Ala Ala Gly Ser Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Ser Ala

245 250 255

Ile His Pro Leu Leu Pro Leu Ile Asn Leu Leu Lys Thr His Gly Lys

260 265 270

Leu Val Met Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Val Phe

275 280 285

Pro Leu Leu Leu Gly Arg Lys Leu Val Ala Gly Ser Ala Ile Gly Gly

290 295 300

Ile Lys Glu Thr Gln Glu Met Val Asp Phe Ala Ala Lys His Asn Ile

305 310 315 320

Thr Pro Asp Val Glu Val Val Pro Met Asp Tyr Val Asn Thr Ala Leu

325 330 335

Asp Arg Leu Leu Lys Ser Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Leu Asp Val

340 345 350

Gly Asn Thr Leu Asn Lys Asn

355

<210>22

<211>1083

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>22

atggcgaaat ctccagaaac agagcatccg aacaaagtct ttggttgggg tgctagagac 60

aaatccggtg ttctctctcc ttttcacttc tctagaagag acaatggtga aaatgatgtg 120

acagtgaaga tcttgttctg tggagtttgc cacactgatt tacacaccat caaaaacgac 180

tggggatact cgtattaccc agtagttcca gggcatgaaa tcgttgggat cgctacaaaa 240

gttggtaaga acgtgactaa attcaaagaa ggagatcgtg tcggagtagg agtgatcagt 300

ggctcgtgcc aatcttgcga atcttgtgac caagatcttg aaaactactg tcctcaaatg 360

tctttcacat acaatgcgat tggatccgat ggaaccaaga attacggtgg ctattcggag 420

aacattgtgg ttgatcaacg gtttgttttg cggtttccgg agaatttacc gagcgattcg 480

ggtgcgccgt tgctgtgtgc tggaatcact gtgtatagtc caatgaagta ttatggtatg 540

actgaggcag ggaagcattt aggggttgct ggacttggtg ggcttggtca tgttgctgtt 600

aagattggta aagcttttgg tttgaaagtt actgtcatta gttcttcttc tacgaaagca 660

gaggaagcca ttaatcatct tggtgctgat tcgtttcttg tcacaactga tcctcagaaa 720

atgaaggctg caattggaac aatggactac attatcgata cgatatcagc agtacatgct 780

ctgtatccgt tgctcggttt actcaaagtc aacggaaagc tcattgcttt aggcttacct 840

gagaagcctc tcgagctacc aatgttccct cttgttctcg gaaggaaaat ggttggagga 900

agtgacgtgg gagggatgaa ggagacacaa gagatgcttg atttctgcgc taagcacaac 960

attacagctg atattgaatt gattaagatg gatgagatta acactgcgat ggagaggctt 1020

gctaagtctg atgttaggta caggttcgtg atcaacgtgg ctaactcctt gagccctcca 1080

tga 1083

<210>23

<211>360

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>23

Met Ala Lys Ser Pro Glu Thr Glu His Pro Asn Lys Val Phe Gly Trp

1 5 10 15

Gly Ala Arg Asp Lys Ser Gly Val Leu Ser Pro Phe His Phe Ser Arg

20 25 30

Arg Asp Asn Gly Glu Asn Asp Val Thr Val Lys Ile Leu Phe Cys Gly

35 40 45

Val Cys His Thr Asp Leu His Thr Ile Lys Asn Asp Trp Gly Tyr Ser

50 55 60

Tyr Tyr Pro Val Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Ile Ala Thr Lys

65 70 75 80

Val Gly Lys Asn Val Thr Lys Phe Lys Glu Gly Asp Arg Val Gly Val

85 90 95

Gly Val Ile Ser Gly Ser Cys Gln Ser Cys Glu Ser Cys Asp Gln Asp

100 105 110

Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Gln Met Ser Phe Thr Tyr Asn Ala Ile Gly

115 120 125

Ser Asp Gly Thr Lys Asn Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Asn Ile Val Val

130 135 140

Asp Gln Arg Phe Val Leu Arg Phe Pro Glu Asn Leu Pro Ser Asp Ser

145 150 155 160

Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Lys

165 170 175

Tyr Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Lys His Leu Gly Val Ala Gly Leu

180 185 190

Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Ile Gly Lys Ala Phe Gly Leu

195 200 205

Lys Val Thr Val Ile Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Glu Glu Ala Ile

210 215 220

Asn His Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Thr Thr Asp Pro Gln Lys

225 230 235 240

Met Lys Ala Ala Ile Gly Thr Met Asp Tyr Ile Ile Asp Thr Ile Ser

245 250 255

Ala Val His Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gly Leu Leu Lys Val Asn Gly

260 265 270

Lys Leu Ile Ala Leu Gly Leu Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Met

275 280 285

Phe Pro Leu Val Leu Gly Arg Lys Met Val Gly Gly Ser Asp Val Gly

290 295 300

Gly Met Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Lys His Asn

305 310 315 320

Ile Thr Ala Asp Ile Glu Leu Ile Lys Met Asp Glu Ile Asn Thr Ala

325 330 335

Met Glu Arg Leu Ala Lys Ser Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asn

340 345 350

Val Ala Asn Ser Leu Ser Pro Pro

355 360

<210>24

<211>1074

<212>DNA

<213>火炬松

<400>24

atgggaagct tggaatctga aaaaactgtt acaggatatg cagctcggga ctccagtggc 60

cacttgtccc cttacactta caatctcaga aagaaaggac ctgaggatgt aattgtaaag 120

gtcatttact gcggaatctg ccactctgat ttagttcaaa tgcgtaatga aatgggcatg 180

tctcattacc caatggtccc tgggcatgaa gtggtgggga ttgtaacaga gattggtagc 240

gaggtgaaga aattcaaagt gggagagcat gtaggggttg gttgcattgt tgggtcctgt 300

cgcagttgcg gtaactgcaa tcagagcatg gaacaatact gcagcaagag gatttggacc 360

tacaatgatg tgaaccatga cggcacccct actcagggag gatttgcaag cagtatggtg 420

gttgatcaga tgtttgtggt tcgaatcccg gagaatcttc ctctggaaca agcagcccct 480

ctgttatgtg caggggttac agttttcagc ccaatgaagc atttcgccat gacagagccc 540

gggaagaaat gtgggatttt gggtttagga ggcgtggggc acatgggtgt caagattgcc 600

aaagcctttg gacttcacgt gacggttatc agttcgtctg ataaaaagaa agaagaagcc 660

atggaagtcc tcggcgccga tgcttatctt gttagcaagg atactgaaaa gatgatggaa 720

gcagcagaga gcctagatta cataatggac accattccag ttgctcatcc tctggaacca 780

tatcttgccc ttctgaagac aaatggaaag ctagtgatgc tgggcgttgt tccagagccg 840

ttgcacttcg tgactcctct cttaatactt gggagaagga gcatagctgg aagtttcatt 900

ggcagcatgg aggaaacaca ggaaactcta gatttctgtg cagagaagaa ggtatcatcg 960

atgattgagg ttgtgggcct ggactacatc aacacggcca tgaaaaggtt ggagaagaac 1020

gatgtccgtt acagatttgt ggtggatgtt gctgcaagca agctggataa ctag 1074

<210>25

<211>357

<212>PRT

<213>火炬松

<400>25

Met Gly Ser Leu Glu Ser Glu Lys Thr Val Thr Gly Tyr Ala Ala Arg

1 5 10 15

Asp Ser Ser Gly His Leu Ser Pro Tyr Thr Tyr Asn Leu Arg Lys Lys

20 25 30

Gly Pro Glu Asp Val Ile Val Lys Val Ile Tyr Cys Gly Ile Cys His

35 40 45

Ser Asp Leu Val Gln Met Arg Asn Glu Met Gly Met Ser His Tyr Pro

50 55 60

Met Val Pro Gly His Glu Val Val Gly Ile Val Thr Glu Ile Gly Ser

65 70 75 80

Glu Val Lys Lys Phe Lys Val Gly Glu His Val Gly Val Gly Cys Ile

85 90 95

Val Gly Ser Cys Arg Ser Cys Gly Asn Cys Asn Gln Ser Met Glu Gln

100 105 110

Tyr Cys Ser Lys Arg Ile Trp Thr Tyr Asn Asp Val Asn His Asp Gly

115 120 125

Thr Pro Thr Gln Gly Gly Phe Ala Ser Ser Met Val Val Asp Gln Met

130 135 140

Phe Val Val Arg Ile Pro Glu Asn Leu Pro Leu Glu Gln Ala Ala Pro

145 150 155 160

Leu Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Phe Ser Pro Met Lys His Phe Ala

165 170 175

Met Thr Glu Pro Gly Lys Lys Cys Gly Ile Leu Gly Leu Gly Gly Val

180 185 190

Gly His Met Gly Val Lys Ile Ala Lys Ala Phe Gly Leu His Val Thr

195 200 205

Val Ile Ser Ser Ser Asp Lys Lys Lys Glu Glu Ala Met Glu Val Leu

210 215 220

Gly Ala Asp Ala Tyr Leu Val Ser Lys Asp Thr Glu Lys Met Met Glu

225 230 235 240

Ala Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Ile Met Asp Thr Ile Pro Val Ala His

245 250 255

Pro Leu Glu Pro Tyr Leu Ala Leu Leu Lys Thr Asn Gly Lys Leu Val

260 265 270

Met Leu Gly Val Val Pro Glu Pro Leu His Phe Val Thr Pro Leu Leu

275 280 285

Ile Leu Gly Arg Arg Ser Ile Ala Gly Ser Phe Ile Gly Ser Met Glu

290 295 300

Glu Thr Gln Glu Thr Leu Asp Phe Cys Ala Glu Lys Lys Val Ser Ser

305 310 315 320

Met Ile Glu Val Val Gly Leu Asp Tyr Ile Asn Thr Ala Met Lys Arg

325 330 335

Leu Glu Lys Asn Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Val Asp Val Ala Ala

340 345 350

Ser Lys Leu Asp Asn

355

<210>26

<211>1074

<212>DNA

<213>大豆

<400>26

atgagttcca aaggtgttgg tgaagattgc ctgggatggg cagcaagaga tgcatccgga 60

gttctatcac cttacaaatt cagtcgcagg actcttggga acgaagatgt tcatattaaa 120

attacgcact gtggtgtttg cttcgctgat gtagtttgga caaggaataa acatggtgac 180

tcaaagtatc ctgtcgtgcc tggtcatgag attgctggga ttgtgacaaa ggttggcgcc 240

aatgtccacc attttaaggt tggcgaccat gttggagtgg ggacttatat aaactcatgt 300

agggattgtg agtattgtaa tgatggacaa gaagttcatt gtaccaaggg atctgtatac 360

acttttaatg gtgttgattt tgatggtaca attacaaaag gaggatactc cagttacata 420

gtagtccatg agaggtactg cttcatgata ccaaaaagct atccattggc ttccgcagct 480

cctttgcttt gtgctggaat tactgtttat tcaccgatgg tccgccacaa gatgaatcaa 540

cctggtaaat ctctaggagt gattggtctt ggtggcctcg gtcatatggc ggtgaaattt 600

ggaaaggcat ttggtttgag tgtaacggtt tttagcacta gtatatccaa gaaagaggag 660

gcactgagcc tgcttggcgc agacaaattt gttgtttcat ctaatcaaga ggaaatgacg 720

gcgttggcta aatcgttgga ctttataatc gacacagcat ctggtgatca ctcgtttgat 780

ccttacatgt cactgctgaa gacatatggt gtttttgtcc tagttggttt ccctagtcaa 840

gtcaaattta tccctgcaag ccttaatata ggatcaaaga ctgttgccgg aagtgttaca 900

ggtggtacaa aagatataca ggagatgatt ggcttctgtg ctgcaaacga gattcaccca 960

aatatagagg tgattccaat cgagtatgcc aatgaagctc ttgagaggct cataaatagg 1020

gacgtcaagt accggtttgt aatagatgtt gagaattccc tgaaagaaaa atga 1074

Claims

1、一种双链RNA分子，包含：i)第一链，包含与CAD-样基因的一部分基本上相同的序列；和ii)第二链，包含与第一链基本上互补的序列，其中所述CAD-样基因的一部分是选自下组的多核苷酸的一部分：

a)包含SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中所限定序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

e)包括具有SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸片段的多核苷酸；

f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽的生物活性部分；

g)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括具有SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和

h)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中所限定序列的多肽的多核苷酸至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸。

2、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26限定的序列。

3、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸与具有SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性。

4、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽。

5、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸编码与具有SEQID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽。

6、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸在严紧条件下与包含SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸杂交。

7、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中所限定序列的多肽的生物活性部分的片段。

8、一种双链RNA分子库，包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸的一部分：

c)与具有SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有至少90％序列同一性的多核苷酸；和

d)编码与具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中所限定序列的多肽有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。

9、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列。

10、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸与具有SEQID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有至少90％序列同一性。

11、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽。

12、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽有至少90％序列同一性的多肽。

13、一种转基因植物，能够表达与CAD样基因的一部分基本上相同的双链RNA，其中所述CAD样基因的一部分来自选自下组的多核苷酸：

14、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述双链RNA包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸的一部分：

15、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自玉蜀黍、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿、prerennial grass、黑麦草和拟南芥。

16、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是大豆。

17、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列。

18、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸与具有SEQID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性。

19、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中限定的序列的多肽。

20、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中限定的序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽。

21、一种制备能够表达在植物中抑制CAD样靶基因表达的双链RNA的转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤：i)制备具有与CAD样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成双链转录物；ii)用所述核酸转化受体植物；iii)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和iv)选择表达所述转录物的子代，

其中所述靶基因的一部分是选自下组中的多核苷酸的19～500个核苷酸：

g)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括具有SEQ ID NO：1、2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和

h)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸。

22、如权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸：

23、如权利要求21所述的方法，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、香蕉、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、嫩荚菜豆、利马豆、豌豆和烟草。

24、如权利要求21所述的方法，其中所述植物是大豆。

25、如权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA在植物根部或线虫采食位点表达。