CN101631867A - 用cdpk-样基因的rna干扰控制线虫的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够抑制对于在植物中建立或维持线虫感染所必需基因的表达的双链RNA组合物和转基因植物，和其相关方法。具体而言，本发明涉及RNA干扰抑制目的植物基因——CDPK样基因表达的用途，还涉及产生具有对寄生线虫增加的抗性的植物。

Description

用CDPK-样基因的RNA干扰控制线虫的组合物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2007年2月9日提交的序列号为60/900,466的美国临时申请的优先权权益。
发明领域
本发明的领域是线虫控制，特别是大豆胞囊线虫的控制。本发明还涉及将遗传材料引入易感线虫的植物，从而增加对线虫的抗性。
发明背景
线虫是以超过2,000种行间作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小线虫。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根结线虫(RKN)、形成胞囊及形成损伤的线虫。以造成采食部位处根瘿形成为特征的根结线虫具有相对广泛的宿主范围并且因此对种类繁多的作物物种是致病性的。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有更有限的宿主范围，不过依旧在易感作物中造成巨大损失。
致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草的总计约50种宿主。
线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原体侵袭。
线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。
SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨细胞)，这种合胞体被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取必要的营养物，导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。
在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍附着于根系统并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞囊。最后胞囊释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在第一年中孵化，然而很多卵也会在保护性胞囊内存活几年。
线虫依赖其自身力量在土壤中每年只能穿行几英寸。然而，线虫侵染可以以多种方式传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，都能够传播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。甚至还存在某些线虫种类可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些起因中的某些起因。
防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理完线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。
已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予植物对寄生线虫增加的抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在采食植物的部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子然后能够用于指导有害蛋白质或酶的特异性表达，或指导对靶基因或对一般细胞基因反义的RNA的表达。这些植物启动子也可以用于通过用含有与其产物被摄取后诱导线虫致死的基因连接的植物靶基因的启动子的构建体转化植物来在采食部位特异性赋予线虫抗性。
最近，已提出用RNA干扰(RNAi)(也称作基因沉默)作为控制线虫的方法。当与靶基因或mRNA的序列基本上相关的双链RNA(dsRNA)引入细胞中时，靶基因的表达会被抑制(参见例如美国专利号6,506,559)。美国专利号6,506,559证明了RNAi抗秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中已知基因的有效性，但没有披露RNAi用于控制植物寄生的线虫的用途。
已有提议采用靶向线虫必需基因的RNAi，例如PCT公开文本WO01/96584、WO 01/17654、US 2004/0098761、US 2005/0091713、US2005/0188438、US 2006/0037101、US 2006/0080749、US 2007/0199100和US 2007/0250947中提出的。
对于RNAi的作用已提出了许多的模型。在哺乳动物系统中，大于30个核苷酸的双链RNA以一种非序列特异性方式引发诱导合成干扰素以及蛋白质合成的总体停止。但是，美国专利号6,506,559揭示，在线虫中，对应于靶基因序列的双链RNA的长度可为至少25、50、100、200、300或400碱基，甚至更长的双链RNA也能有效诱导秀丽隐杆线虫中的RNAi。已知当用包含98～854个核苷酸的双链区的发夹RNA构建体转化许多植物品种时，能有效沉默靶植物基因。一般认为在包括线虫和植物的许多有机体中，大片的双链RNA在细胞内被裂解成大约19-24个核苷酸的片段(siRNA)，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。
多种钙依赖型蛋白质激酶(CDPK)在植物中介导多种对环境的应答。在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的特定CDPK(CDPK1)被证明对于形成植物和根瘤菌(Rhizobia)和菌根真菌之间的共生相互作用是必需的(见Ivashuta等人，(2005)Plant Cell 17：2911-2921)。Ivashuta等人提出CDPK1参与细胞壁扩展和/或合成。
虽然已经进行了大量的努力来使用RNAi控制植物寄生线虫，但是至今还没有任何国家对转基因的线虫抗性植物解除管制。所以，仍然需要鉴定安全有效的组合物和方法以用RNAi控制植物寄生线虫，并生产对植物寄生的线虫具有增加的抗性的植物。
发明概述
本发明人已经发现了下调钙依赖型蛋白质激酶(CDPK或CDPL-样基因)(由标注为49806575的大豆cDNA所示例)，赋予了对植物寄生线虫的抗性。这一下调可以使用靶向此类CDPK-样基因的RNAi来实现。
在一个实施方案中，本发明提供了dsRNA分子，该分子包含：a)第一链，包含与CDPK-样基因的一部分基本上相同的序列；和b)第二链，包含与第一链基本上互补的序列。
本发明进一步涉及双链RNA分子库，包括多种RNA分子，每个RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自与CDPK样基因的一部分基本上相同的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供能够表达与CDPK样基因的一部分基本上相同的双链RNA的转基因线虫抗性植物。
在另一个实施方案中，本发明提供能够表达dsRNA分子库的转基因植物，其中每个dsRNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自与CDPK样基因的一部分基本上相同的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种制备能够表达双链RNA分子库的转基因植物的方法，其中每个双链RNA分子与植物中的CDPK样基因的一部分基本上相同，所述方法包括步骤：a)制备具有与CDPK样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成CDPK样基因一部分的双链转录物；b)用所述核酸转化受体植物；c)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和d)选择表达所述转录物的子代。
本发明进一步提供一种赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包括步骤：a)制备具有与CDPK样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成CDPK样基因一部分的双链转录物；b)用所述核酸转化受体植物；c)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和d)选择线虫抗性的子代。
本发明进一步提供包含与CDPK样基因的一部分基本上相同的序列的表达盒和表达载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种控制寄生线虫感染植物的方法，包括用双链RNA分子转化植物的步骤，该双链RNA分子有效地连接到根优选的、线虫可诱导的或采食部位优选的启动子上，该双链RNA包含一条与靶核酸的一部分基本上相同的链，该靶核酸对于采食部位的形成、发展或支持，特别是合胞体或巨细胞的形成、发展或支持是必需的，从而通过去除或功能性失活所述采食部位、合胞体或巨细胞来控制线虫对植物的感染，其中所述靶核酸是CDPK样基因。
附图说明
图1显示了分配给所对应序列的SEQ ID NO表。SEQ ID NO：1是来自大豆Hygen克隆49806575的部分cDNA序列，包括终止密码子和3’非翻译区域。SEQ IDN NO：2是用于实施例2的生根外植体测定法中的49806575(SEQ IDNO：1)的片段的有义序列。SEQ IDN NO：3是由49806575(SEQ IDNO：1)所编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：4是苜蓿属(Medicago)Genbank登录号AY821 654的cDNA序列，包括非编码和编码序列。编码区的第一个碱基对应于核苷酸147，终止密码子的最后一个碱基对应于核苷酸1829。SEQ ID NO：5是实施例1中描述的合成的序列，SEQ ID NO：6是TPP-样启动子的序列(SEQ ID NO：6)(如在共同待决USSN 60/874,375中所描述的并且因此引入本文作为参考)。
图2a-2c显示了CDPK-样蛋白质的氨基酸比对：部分大豆属cDNA克隆49806575(SEQ ID NO：3)，由来自苜蓿属的AY821654编码的蛋白质(SEQ ID NO：7)，由来自苜蓿属的AY823957编码的蛋白质(SEQ ID NO：9)，由来自烟草属(Nicotiana)的AF435451编码的蛋白质(SEQ ID NO：11)，由来自烟草属的AY971376编码的蛋白质(SEQ ID NO：13)，由来自茄属(Solanum)的AF030879编码的蛋白质(SEQ ID NO：15)，由来自拟南芥属的At2g17890编码的蛋白质(SEQ ID NO：17)，由来自拟南芥属的At4g36070编码的蛋白质(SEQ ID NO：19)，由来自拟南芥属的At5g66210编码的蛋白质(SEQ ID NO：21)，由来自稻属(Oryza)的NM 001052286编码的蛋白质(SEQ ID NO：23)，由来自稻属的NM 001065979编码的蛋白质(SEQ ID NO：25)，以及来自大豆属的自CDPK 5’RACE PCR扩增的产物RKF195-3(SEQ ID NO：27)。比对在Vector NTI软件套装中进行(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。
图3显示了示例性CDPK-样基因的全局氨基酸同一性百分比：由部分大豆属克隆49806575编码的蛋白质(SEQ ID NO：3)，由RKF195-3编码的蛋白质，来自大豆属(SEQ ID NO：27)，来自苜蓿属的由AY821654编码的蛋白质(SEQ ID NO：7)，来自苜蓿属的由AY823957编码的蛋白质(SEQ IDNO：9)，来自烟草属的由AF435451编码的蛋白质(SEQ ID NO：11)，来自烟草属的由AY971376编码的蛋白质(SEQ ID NO：13)，来自茄属的由AF030879编码的蛋白质(SEQ ID NO：15)，来自拟南芥属的由At2g17890编码的蛋白质(SEQ ID NO：17)，来自拟南芥属的由At4g36070编码的蛋白质(SEQ ID NO：19)，来自拟南芥属的由At5g66210编码的蛋白质(SEQ IDNO：21)，来自稻属的由NM 001052286编码的蛋白质(SEQ ID NO：23)以及来自稻属的由NM 001065979编码的蛋白质(SEQ ID NO：25)。仅仅是与部分cDNA克隆49806575重叠的区域被包括在分析中。使用Needle ofEMBOSS-4.0.0(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1 970)J.Mol.Biol.48，443-453)来计算配对比对和同一性百分比。
图4显示了示例性CDPK-样基因的全局核苷酸同一性百分比：部分大豆属克隆49806575(SEQ ID NO：1)，来自大豆属的RKF195-3(SEQ IDNO：26)，来自苜蓿属的AY821654(SEQ ID NO：4)，来自苜蓿属的AY823957(SEQ ID NO：8)，来自烟草属的AF435451(SEQ ID NO：10)，来自烟草属的AY971376(SEQ ID NO：12)，来自茄属的AF030879(SEQID NO：14)，来自拟南芥属的At2g17890(SEQ ID NO：16)，来拟南芥属的At4g36070(SEQ ID NO：18)，来自拟南芥属的At5g66210(SEQ ID NO：20)，来自稻属的NM_001052286(SEQ ID NO：22)，来自稻属的NM_001065979(SEQ ID NO：24)。仅仅与部分cDNA克隆49806575重叠的区域被包括在分析中。使用Needle of EMBOSS-4.0.0(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)来计算配对比对和同一性百分比。
图5a-5g通过核苷酸位置显示了SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的示例性CDPK-样基因或编码CDPK-样同源物的多核苷酸序列的可能的多个21mers。
优选实施方案详述
本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及本文所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域普通技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991 Glossary ofgenetics：classical和molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Currentprotocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编著，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley&Sons，Inc.的合资企业(1998增刊)中找到。应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)”可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，对“单数细胞”的称谓可以意指可以使用至少一个细胞。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案而并非意味对其限制性。
在本申请通篇范围内，参考了多种专利和文献出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容完整地并入本申请作为参考，旨在更充分地描述本发明所涉及领域的现状。
此处植物的“CDPK样基因”定义为与具有SEQ ID NO：1(大豆CDPK样基因)所示序列的49806575多核苷酸有至少70％序列同一性的基因。根据本发明，CDPK样基因包括具有诸如SEQ ID NOs：4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26中限定的那些序列的基因，其是大豆CDPK样基因的同源物。此处限定的CDPK样基因编码与具有SEQ ID NO：3中限定的序列的大豆CDPK样部分多肽有至少70％序列同一性的多肽。这样的多肽包括具有SEQ ID NOs：7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27中限定的序列的CDPK样多肽。
另外CDPK样基因(CDPK样基因同源物)可以用此处提供的信息和生物技术领域技术人员已知的技术从大豆之外的植物中分离。例如，在严格条件下与SEQ ID NO：1的核酸杂交的植物核酸分子可以从植物组织cDNA文库中分离。或者，可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry 18：5294-5299的胍盐-硫氰酸盐抽提方法)，cDNA可以用反转录酶制备(例如Moloney MLV反转录酶，可购自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或AMV反转录酶，可购自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)。可以基于SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列设计用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸引物。可以基于具有SEQ ID NOs：2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26中限定的序列的CDPK样基因序列设计其它寡核苷酸引物。对应于此处限定的CDPK样靶基因的核酸分子可以根据标准PCR扩增技术用cDNA或备选的基因组DNA作为模板和适宜的引物扩增。这样扩增的核酸分子可以克隆至载体中，并通过DNA序列分析来表征。
此处使用的“RNAi”或“RNA干扰”指的是双链RNA(dsRNA)介导的植物中序列特异性转录后基因沉默方法。此处使用的“dsRNA”指部分或完全双链的RNA。双链RNA还指小或短的干扰RNA(siRNA)、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA、微小-RNA(miRNA)等等。在RNAi方法中，将包含与靶基因(例如CDPK样基因)的一部分基本上相同的第一链和与第一链互补的第二链的双链RNA引入植物中。在引入植物以后，该靶基因特异性双链RNA被加工成较小的片段(siRNA)，接着能够分布整个植物，导致具有表型的功能缺失突变，这种表型在一代的时间内可能会与靶基因的部分或完全缺失产生的表型非常接近。或者，靶基因特异性双链RNA与调节元件或启动子有效地结合，导致该双链RNA在组织中以暂时、空间性的或可诱导的方式表达，可被含有RNAi加工结构的植物细胞进一步加工为较小的片段，从而得到功能缺失表型。另外，该调节元件或启动子可指导对根或合胞体或巨细胞优先的表达，其中所述双链RNA可以或者在这些组织中组成型表达或者被线虫或幼体线虫(例如J2线虫)的采食而诱导表达。
如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶，用于dsRNA的术语“基本上相同”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约80％-90％相同，更优选地、与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95％相同并且最优选与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约95％、96％、97％、98％、99％相同或完全相同。20个或更多个核苷酸是指靶基因至少约20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续碱基的部分或至多靶基因的全长。
如此处所用，“互补的”多核苷酸是那些能够根据标准沃森-克里克互补规则碱基配对的多核苷酸。具体而言，嘌呤会与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)、对于DNA是腺嘌呤与胸腺嘧啶(A:T)、或对于RNA是腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。可以理解即使不完全互补两种多核苷酸也可以互相杂交，只要各自具有与对方基本上互补的至少一个区域。如此处所用，“基本上互补”指两个核酸序列的核苷酸至少超过80％互补。优选这两个核酸序列至少超过85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或全部核苷酸互补。或者，“基本上互补”指两个核酸序列能够在高度严格的条件下杂交。如此处所用，术语“基本上相同”或“对应于”指两个核酸序列具有至少80％的序列同一性。优选这两个核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
如此处所用，术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA或其杂合体。该术语还包括RNA/DNA杂合体。当合成制备双链RNA时，不常见的碱基(例如肌酐、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其他)也可用于反义RNA、双链RNA和核酶配对。例如含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已表明能以高亲和力结合RNA并作为基因表达的有效的反义抑制剂。也可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯骨架的修饰或对RNA的核糖基团中的2’-羟基修饰。
如此处所用的术语“控制”当用于感染的上下文中时指感染的降低或预防。减低或预防线虫的感染会使植物具有对线虫增加的抗性；但是，这种增加的抗性并不意味着植物必须100％地抗线虫感染。在优选实施方案中，在抗性植物中对线虫感染的抗性比对线虫无抗性的野生型植物高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。优选所述野生型植物是具有与线虫抗性增加的植物相似或更优选相同的基因型，但是不包含针对靶基因的双链RNA的植物。植物对线虫感染的抗性可以是由于当线虫暴露于含有双链RNA的植物时，线虫的死亡、不育、停止发育或移动性受损造成的，所述双链RNA特异性针对对于功能性采食部位、合胞体或巨细胞的发育或维持必须的基因。此处使用的术语“对线虫感染的抗性”或“具有线虫抗性的植物”指与野生型植物相比，植物避免线虫感染、杀死线虫或阻止、减少或停止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可以通过主动过程达到，例如通过产出对线虫有害的物质，或通过被动过程达到，例如含有降低的线虫所需的营养价值或不形成由线虫采食部位诱导的结构例如合胞体或巨细胞。植物的线虫抗性水平可以以多种方法检测，例如，计数能够在植物上建立寄生的线虫数量，或测量线虫发育时间、雌雄线虫的比例，或对于胞囊线虫计数在感染的植物的根部或植物分析系统中产生的胞囊数量或线虫卵的数量。
若非上下文中另外说明，术语“植物”涵盖植物发育或成熟的任何阶段，以及取自任何这样的植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括，但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、微孢子、原生质体、毛根培养物、生根的外植体等等。本发明还包括用本发明的植物制备的种子。在一个实施方案中，与植物种子的野生型变体相比，种子确实被育种为有提高的抗线虫感染的抗性。如此处所用，“植物细胞”包括但不限于，原生质体、生产配子的细胞和再生为完整植株的细胞。植物多种组织的组织培养物和从这些组织培养物的植物再生为本领域所公知且已经充分公开。
如此处使用的术语“转基因”指含有至少一个重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸的所有或部分被稳定整合入染色体中，或是稳定的染色体外元件，从而能够传递至下一代。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指的是已经由遗传工程改变、重排或修饰的多核苷酸。其实例包括连接到或加入到异源序列的任何克隆多核苷酸。术语“重组”并非指天然发生事件所导致的多核苷酸的改变，例如自发突变或通过选择性育种导致的非自发突变。
如此处所用的术语“有效抑制表达的量”指的是足以降低植物中靶基因产生的mRNA或蛋白质的水平或稳定性的双链RNA的浓度或量。如此处所用的“抑制表达”指靶基因所产生的蛋白质和/或mRNA的水平的缺乏或可观察到的降低。靶基因表达的抑制可能对于寄生线虫是致死的，其可以直接或间接通过对采食部位、合胞体或巨细胞的修饰或根除达成，或者，如果对全功能采食部位、合胞体或巨细胞的进入与寄生线虫的生命周期的特定阶段相关的话，这样的抑制可以拖延或防止进入特殊的发育步骤(例如变态)。可以通过检测植物根部胞囊的减少或消除，或线虫或线虫侵染的其他性质来确认抑制的结果(见实施例2所述)。
根据本发明，用核酸或双链RNA转化植物，该核酸或双链RNA特异性抑制靶基因(CDPK样基因)在植物中表达，该基因对于采食部位、合胞体或巨细胞的发育和维持是必需的，最后影响线虫的存活、变态或繁殖。在一个实施方案中，所述双链RNA由已经转化入所感染的植物的祖株中的载体编码。优选表达该双链RNA的核酸序列在根部特异性启动子或寄生线虫采食细胞特异性启动子或线虫诱导的启动子的转录控制下。
所以，本发明的双链RNA包含与CDPK样基因例如大豆49806575cDNA的一部分基本上相同的第一链和与第一链基本上互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自由下列多核苷酸组成的组中：(a)具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；b)与SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26有至少70％序列同一性的多核苷酸；和c)来自植物的在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26所示的序列的多核苷杂交的多核苷酸。该基本上相同的双链核苷酸序列的长度可以是CDPK样基因的至少大约19、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续碱基或长达CDPK样基因的全长。在一个优选实施方案中，双链核苷酸序列的长度为从大约19至大约200-500个连续核苷酸的长度。在另一个优选的实施方案中，本发明的双链RNA与SEQ ID NO：2的碱基1～320基本上相同或相同。
如上所述，长度大于约19-24个核苷酸的双链RNA片段被线虫和植物在细胞内断裂成大约19-24个核苷酸长的siRNA，这些siRNA是RNAi现象的实际介体。图51-5g中的表格列出了此处限定的CDPK样基因的示例性21-mers。该表格也可用于通过从各21mer加上或减去适宜数量的核苷酸计算19、20、22、23或24-mer。所以，本发明的双链RNA长度范围在大约19个核苷酸至大约320个核苷酸。优选本发明的双链RNA具有大约21个核苷酸至大约600个核苷酸的长度。更优选本发明的双链RNA具有大约21个核苷酸至大约500个核苷酸的长度，或约21个核苷酸至大约400个核苷酸的长度。
如此处所公开的，不需要双链RNA与靶基因100％序列同一性来实现本发明。当优选含有与CDPK样基因的部分序列相同的核苷酸序列的双链RNA用于抑制时，本发明可以容忍因为基因操作或合成、基因突变、品系多态性或进化趋异导致的可预期的序列变化。所以本发明的双链RNA还涵盖与靶基因具有至少1、2或更多核苷酸错配的双链RNA。例如，本发明中可以预见图5a-5g中示例性示出的21mer双链RNA序列可包含1、2或更多核苷酸的添加、删除或取代，只要得到的序列仍然干扰CDPK样基因的功能。
可以用本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，和其中引用的参考文献)来优化本发明的双链RNA和CDPK样靶基因之间的序列同一性，并通过例如BESTFIT软件程序(例如威斯康辛大学遗传计算组)中实施的Smith-Waterman算法以默认参数计算核苷酸序列间的差异百分比。优选在抑制性RNA和靶基因的部分之间的序列同一性大于80％、90％，甚至100％。或者，RNA的双链体区域可以功能性地限定为能够在严格条件下与靶基因转录物的部分杂交的核苷酸序列(严格条件例如为400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1 mM EDTA，60℃杂交12-16小时，然后65℃下用0.1％SDS和0.1％SSC洗涤大约15-60分钟)。
当本发明的双链RNA长度大于约21个核苷酸时，例如约50～约1000个核苷酸，其会在植物或寄生线虫细胞内被随机裂解成大约21个核苷酸的双链RNA，即siRNA。本发明的较长双链RNA的裂解会产生来自该较长双链RNA的大约21mer(约19mer～约24mer范围内)的双链RNA的库。该约21mer双链RNA库也包含在本发明的范围内，不管是在植物或线虫细胞内产生的还是用已知的寡核苷酸合成技术合成的。
本发明的siRNA具有对应于在CDPK样靶基因完整序列中19-24个连续核苷酸片段的序列。例如，衍生自如SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的CDPK样基因的本发明的siRNA库包括多种RNA分子，其选自与图5a-5g中所示SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的21mer核苷酸基本上相同的寡核苷酸。衍生自SEQ ID NO：1的CDPK样靶基因的本发明的siRNA库也可以包括含有衍生自图5a-5g中所述SEQ ID NO：1的任意21个连续核苷酸序列的特定RNA分子的任意组合。并且，如上所述，植物中多个专化切酶产生通常在19-24个核苷酸大小的siRNA(见Henderson等人，2006.Nature Genetics 38：721-725)。本发明的siRNA范围可以在约19个连续核苷酸序列至约24个连续核苷酸序列之间。同样，本发明的siRNA库可包括多个RNA分子，其具有衍生自SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、1 8、20、22、24或26的约19、20、21、22、23或24个连续核苷酸序列的任意一种。或者，本发明的siRNA库可包括多个RNA分子，其具有衍生自SEQ ID NO：1的约19、20、21、22、23和/或24个连续核苷酸序列的组合。
本发明的双链RNA可任选地包括在一端或两端的单链突出。该双链结构可以通过单链自身互补RNA链形成(即形成发夹环)或两个互补的RNA链形成。RNA双链体的形成可以在细胞内或细胞外起始。当本发明的双链RNA形成发夹环时，可任选地包括内含子(如US 2003/0180945A1中所述)或核苷酸间割区，该间割区是在互补的RNA链间的序列片段以稳定细胞中的发夹转基因。制备各种双链RNA分子的方法记载于例如WO99/53050和美国专利No.6,506,559中。RNA可以允许每个细胞输送至少一个拷贝的量引入。更高剂量的双链材料会得到更有效的抑制。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组表达载体，其包含编码如上所述双链RNA的核酸，其中与宿主植物细胞的野生型品种相比，该载体在宿主植物细胞中的表达导致对寄生线虫的抗性增加。如此处所用的术语“载体”指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环状双链DNA环，附加的DNA片段可以连接其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主植物细胞中自主复制。其他载体在导入宿主细胞时整合入宿主植物细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样的载体在此称为“表达载体”，用于重组DNA技术的表达载体一般是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意欲包括具有相同功能的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如马铃薯病毒X，烟草rattle病毒和双粒病毒组)。
本发明的重组表达载体包括以适宜在宿主植物细胞中表达的核酸形式的本发明的核酸，意思是该重组表达载体包括一个或多个调节序列，例如启动子，该调节序列基于待用于表达的宿主植物细胞进行选择，被有效连接至待表达的核酸序列。至于重组表达载体，术语“有效连接”和“有效结合”可以互换，意为以允许核苷酸序列表达的方式(即，当载体被引入宿主植物细胞中时在宿主植物细胞中表达)将目的核酸序列连接到调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸信号)。例如这类调节序列记载于Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)已及Gruber and Crosby的：Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick和Thompson编著，第7章，89-108，CRC Press：BocaRaton，Florida中，包括其参考文献。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些和仅仅在某些宿主细胞中或在某些情况下指导核苷酸序列表达的那些。本领域技术人员了解表达载体的设计可取决于诸如要转化的宿主细胞、所需双链RNA的表达水平等因素。本发明的表达载体可引入植物宿主细胞中进而产生此处所述的核酸编码的本发明的双链RNA分子。
根据本发明，重组表达载体包括有效连接到核苷酸序列的调节序列，该核苷酸序列是本发明双链RNA的一条或两条链的模板。在一个实施方案中，所述核酸分子进一步包括在所述核酸分子任何一端侧翼的启动子，其中该启动子驱动各个DNA链的表达，从而产生杂交形成双链RNA的两个互补的RNA。在另一个实施方案中，核酸分子包含在一个转录单元中转录成双链RNA的两个链的核苷酸序列，其中正义链从转录单元的5’端开始转录，反义链从3’端开始转录，其中这两个链被大约3～500个碱基对或更多碱基对隔开，转录后，该RNA转录产物自身折叠形成发夹。根据本发明，发夹转录物中的间隔区可以是任何DNA片段。
根据本发明，所引入的多核苷酸如果合并入非染色体自主复制子中或整合入植物染色体中，会在植物细胞中稳定保持。或者，所引入的多核苷酸可以存在于染色体外非复制载体上，并瞬时表达或瞬时有活性。不管存在于染色体外非复制载体中还是整合入染色体的载体中，该多核苷酸优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够驱动在植物细胞中基因表达的调节序列，该调节序列得到有效地连接，从而使得每个序列都能够发挥其功能，例如通过多聚腺苷酸信号终止转录。优选的多聚腺苷酸信号是那些来自于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)t-DNA的信号，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合成酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBO J.3：835)或其功能等同物，还有植物中的所有其他有功能活性的终止子都适用。因为植物基因的表达通常不在转录水平限制，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，例如像翻译增强子的序列，例如来自烟草花叶病毒的含有5’-不翻译前导序列的增速驱动序列，可增加每个RNA产生的多肽比例(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括详细描述于下列文献中的载体：Becker，D.等人，1992，New plant binary vectors with selectable markers located proximal to theleft border，Plant Mol.Biol.20：1195-1 197；Bevan，M.W.，1984，BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和Transgenic Plants第1卷，Engineering and Utilization中的Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，S.15-38。
植物基因的表达应该有效地连接至适当启动子，该启动子以时间优先、空间优先、细胞类型优先和/或组织优先方式使该基因表达。用于本发明表达盒的启动子包括能够起始存在于植物根部的植物细胞中转录的任何启动子。这类启动子包括但不限于，那些能够从植物、植物病毒和含有在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌)中得到的启动子。优选本发明的表达盒包括根特异性启动子、病原体可诱导的启动子或线虫可诱导的启动子。更优选该线虫可诱导的启动子是寄生线虫采食细胞特异性启动子。寄生线虫采食部位特异性启动子可以对合胞体细胞或巨细胞具有特异性或对这两种细胞都具有特异性。如果一个启动子在其诱导状态下的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)比未诱导状态下的活性高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，那么这个启动子是可诱导的启动子。如果一个启动子的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)在特定的细胞类型、组织或器官中比在同一个植物的其他细胞类型、组织中要高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，那么这种启动子是细胞、组织或器官特异性启动子，优选所述其他的细胞类型或组织是相同植物器官(例如根)的细胞类型或组织。在器官特异性启动子的情况中，启动子活性应该与其他植物器官中的启动子活性比较，例如叶、茎、花或种子。
启动子可以是组成型的、可诱导的、发育阶段优先的、细胞类型优先的、组织优先的或器官优先的。组成型启动子在大多数情况下都有活性。组成型启动子的非限制实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)、玄参花斑病病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)、来自农杆菌属T-DNA的启动子，例如甘露碱合成酶、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶、核酮糖磷酸氢盐羧化酶(ssuRUBISCO)启动子的小亚基等。优选在接触寄生线虫的细胞中表达双链RNA的启动子。或者，所述启动子可以驱动双链RNA在远离接触线虫的部位的植物组织中表达，然后该双链RNA可以由植物转运至接触在特定细胞中的寄生线虫的细胞中，或接近线虫采食部位，例如合胞体细胞或巨细胞。
可诱导的启动子在特定环境条件下是有活性的，例如存在或缺乏营养素或代谢产物、热或冷、光照、病原体攻击、缺氧条件等。例如，已经表明启动子TobRB7、AtRPE、AtPyk10、Gemini19和AtHMG1可以由线虫诱导(对于线虫可诱导的启动子的综述，请参见Ann.Rev.Phytopathol.(2002)40：191-219；还参见U.S.Pat.No.6,593,513)。分离可以由线虫诱导的其他启动子的方法在美国专利5,589,622和5,824,876中列出。其他可以诱导的启动子包括：芸苔属的hsp80启动子，其可由热休克诱导；PPDK启动子，其由光诱导；烟草、拟南芥和玉蜀黍的PR-1启动子，其可以由病原体感染诱导；和Adh1启动子，其由缺氧和冷胁迫诱导。植物基因表达也可由可诱导的启动子促进(关于综述参见Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果需要时间特异性基因表达，可化学诱导的启动子特别适用。这种启动子的非限制性实例是可水杨酸诱导的启动子(PCT申请No.WO 95/19443)、可四环素诱导的启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和可乙醇诱导的启动子(PCT申请No.WO93/21334)。
发育阶段优先的启动子在发育的特定阶段优先表达。组织个器官优先的启动子包括但不限于那些在特定组织和器官优先表达的启动子，例如叶、根、种子或木质部。组织优先或器官优先启动子的实例包括但不限于果实优先、胚珠优先、雄性组织优先、种子优先、珠被优先、块茎优先、柄优先、果皮优先和叶子优先、柱头优先、花粉优先、花药优先、花瓣优先、萼片优先、花梗优先、长角果优先、根优先、茎优先等等。种子优先的启动子在种子发育和/或萌发时优先表达。例如，种子优先启动子可以是胚优先、胚乳优先和种皮优先的。见Thompson等人，1989，BioEssays10：108。种子优先的启动子包括但不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
其他适宜的组织优先或器官优先启动子包括油菜籽napin-基因启动子(美国专利号5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP-启动子(Baeumlein等人，1991，Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(PCT申请No.WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆素启动子(美国专利号5,504,200)、芸苔属Bce4-启动子(PCT申请No.WO 91/13980)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，以及在像玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植物中赋予种子特异性表达的启动子。要关注的适宜启动子是大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(PCT申请No.WO 95/15389和PCT申请No.WO 95/23230)，或在PCT申请No.WO 99/16890中描述的那些启动子(大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、小麦的麦胶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因)。
用于本发明的表达盒的其他启动子包括但不限于，主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质基因(waxy)启动子、超甜基因(shrunken)1启动子、超甜基因2启动子和bronze基因启动子、Zm13启动子、(美国专利号5,086,169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)，以及合成的或其他天然启动子。
根据本发明，所述表达盒包括与核苷酸序列有效连接的表达控制序列，该核苷酸序列是所述双链RNA的一条或两条链的模板。该双链RNA模板包括：(a)第一链，具有与SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的大约19～大约500个或至多全长的连续核苷酸基本上相同的序列；和(b)第二链，具有与第一链基本上互补的序列。在进一步的实施方案中，启动子位于所述模板核苷酸序列任一端的侧翼，其中所述启动子驱动各个单独的DNA链的表达，进而产生两条互补的RNA，这两条互补的RNA能够杂交并形成所述双链RNA。在备选的实施方案中，核苷酸序列在一个转录单元上被转录成双链RNA的两条链，其中，正义链从转录单元的5’端转录，而反义链从3’端转录，其中这两条链隔开大约3～大约500个碱基对，并且转录之后，该RNA转录物自身折叠形成发夹结构。
在另一个实施方案中，所述载体含有双向启动子，驱动两个核酸分子的表达，由此一个核酸分子编码与CDPK样基因的一部分基本上相同的序列，而另一个核酸分子编码与第一链基本上互补的第二序列，并且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。双向启动子是能够在两个方向介导表达的启动子。
在另一个实施方案中，所述载体含有两种启动子，一个介导与CDPK样基因的一部分基本上相同的序列的转录，另一个启动子介导与第一链基本上互补的第二序列的转录，并且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。第二启动子可以是不同的启动子。
不同启动子指就细胞或组织特异性来说具有不同活性，或对诸如病原体、非生物胁迫或化学品等不同的诱导呈现表达的启动子。例如，一个启动子可以是组成型的或组织特异性的，而另一个则可能是组织特异性或可被病原体诱导的。在一个实施方案中，一个启动子介导与过表达CDPK样基因相适应的核酸的转录，而另一个启动子介导互补核酸的组织或细胞特异性转录或病原体诱导的表达。
本发明还涉及能表达本发明的双链RNA、进而抑制根部、采食部位、合胞体和/或巨细胞中的CDPK样基因的转基因植物。所述植物或转基因植物可以是诸如但不限于树、切花(cut flowers)、观赏植物、蔬菜或农作物植物的任何植物。上述植物可来自选自由苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组中的属。所述植物可以来自选自下列属的属：拟南芥属、苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、Brachipodium、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、黑小麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、墨角纶属、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属组成的组中的属。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
优选地，所述植物是农作物植物。农作物植物是用于农业的所有植物。根据一个实施方案，所述植物是单子叶植物，优选禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高梁属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、黍属、穇属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属植物。当植物是玉蜀黍属时，优选物种是玉米(Zea mays)。当该植物是小麦属时，优选物种是普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(Triticumspeltae)或圆柱小麦(Triticum durum)。当所述植物是稻属时，优选物种是稻(O. sativa)。当所述植物是大麦属植物时，优选物种是大麦(Hordeumvulgare)。当所述植物是黑麦属植物时，优选物种是黑麦(Secale cereale)。当所述植物是燕麦属植物时，优选物种是燕麦(Avena sativa)。当所述植物是甘蔗属植物时，优选物种是甘蔗(Saccharum officinarum)。当所述植物是高梁属植物时，优选物种是高粱(Sorghum vulgare)、高粱(Sorghumbicolor)或苏丹草(Sorghum sudanense)。当所述植物是狼尾草属植物时，优选物种是御谷(Pennisetum glaucum)。当所述植物是狗尾草属植物时，优选物种是粱(Setaria italica)。当所述植物是黍属植物时，优选物种是野生稷(Panieum miliaceum)或柳枝稷(Panieum virgatum)。当所述植物是穇属(Eleusine)植物时，优选物种是穇子(Eleusine coracana)。当所述植物是芒属植物时，优选物种是芒(Miscanthus sinensis)。当所述植物是羊茅属(Festuca)植物时，优选物种是Festuca arundinaria、紫羊茅(Festuca rubra)或草甸草(Festuca pratensis)。当所述植物是黑麦草属植物时，优选物种是黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum)。或者，所述植物是黑小麦(Triticosecale)。
作为备选方案，在一个实施方案中，植物为双子叶植物，优选豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑桔科(Citrus)植物。在一个实施方案中，所述植物是豆科、茄科或十字花科植物。所以，在一个实施方案中，所述植物是豆科植物，优选的属是大豆属、豌豆属、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)。豆科的优选物种是蒺藜苜蓿(M.truncatula)、紫花苜蓿(M.sativa)、大豆、豌豆、落花生(A.hypogaea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)、苜蓿(M.sativa)或兵豆(Lens culinaris)。更优选是大豆、落花生和紫花苜蓿。最优选的物种是大豆。当所述植物是茄科时，优选的属是茄属、番茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，所述植物是十字花科，优选属是芸苔属或萝卜属。十字花科的优选物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥(B.juncea)或芜青(B.rapa)。更优选的物种是欧洲油菜。当所述植物是藜科植物时，优选属是甜菜属植物。且优选物种是甜菜(B.vulgaris)。当所述植物是菊科植物时，优选属是向日葵属，优选物种是向日葵(H.annuus)。当所述植物是锦葵科植物时，优选属是棉属或秋葵属。当所述属是棉属时，优选物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)。最优选的是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当所述植物是亚麻科时，优选属是亚麻属，优选物种是亚麻(L.usitatissimum)。当所述植物是大戟科植物时，优选的属木薯属、麻风树属(Jatropa)、或蓖麻属(Rhizinus)植物。优选物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.communis)。当所述植物是旋花科植物时，优选属是番薯属，优选物种是甘薯(L.batatas)。当所述植物是蔷薇科时，优选属是蔷薇属、苹果属、梨属、李属、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属植物。优选物种是杂交草莓(Fragaria×ananassa)。当所述植物是葫芦科植物时，优选是香瓜属、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)植物。优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbita pepo)。当所述植物是山茶科时，优选属是山茶属，优选物种是山茶(C.sinensis)。当所述植物是茜草科植物时，优选属是咖啡属，优选物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当所述植物是梧桐科时，优选属是可可属(Theobroma)，优选物种是可可树(T.cacao)。当所述植物是柑桔属时，优选物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)，和柑桔属物种的杂交品种，等等。在本发明的优选实施方案中，所述植物是大豆、马铃薯或谷物植物。
在一个实施方案中，所述植物是豆科植物，靶基因与SEQ ID NO：1、2、4、5、8或26基本上相似。在进一步的实施方案中，所述植物是十字花科植物，靶基因与SEQ ID NO：16、18或20基本上相同。在一个备选的实施方案中，所述植物是茄科植物，靶基因与SEQ ID NO：10、12或14基本上相同。在进一步的实施方案中，所述植物是禾本科植物，靶基因与SEQ ID NO：22或24基本上相同。
转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的适当方法在植物生物生物技术领域内已知。任何方法都可以用于将重组表达载体转化入植物细胞中以获得本发明的转基因植物。转化双子叶植物的一般方法公开于：例如美国专利号4,940,838和5,464,763等中。转化具体双子叶植物(例如棉花)的方法在美国专利号5,004,863、5,159,135和5,846,797中列出。大豆转化方法于美国专利号4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301中列出，也可以使用EP 0301749B1中的方法。
转化方法可包括直接或间接转化法。适当的直接法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、用基因枪的生物发射技术(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人Plant Cell 2：603，1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干胚的方法和微注入法。在直接转化法的情况下，所用质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，例如pUC系列的质粒、pBR322、M13mp系列和pACYC184等等。如果要从转化的细胞再生完整的植物，优选在质粒中有一个附加的选择性标记基因。直接转化技术对双子叶和单子叶植物都同等适用。
还可以通过利用农杆菌(例如EP 0 116 718)的细菌感染、利用病毒载体(EP 0 067 553、US 4,407,956、WO 95/34668、WO 93/03161)的病毒感染来进行转化或借助花粉转化(EP 0 270 356；WO 85/01856；US 4,684,611)。农杆菌类转化技术(尤其是对于双子叶植物)为本领域公知的技术。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包括质粒(Ti或Ri质粒)和用农杆菌感染之后转移入植物的T-DNA元件。该T-DNA(转移DNA)被整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-质粒上，或者分开包括在所谓的双元载体中。农杆菌介导的转化方法记载于例如Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，也已经适用于单子叶植物。用农杆菌的转化记载于下列文献中，例如：White FF，Vectors for Gene Transfer in HigherPlants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页、Jenes B等人Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第128-143页和Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225中。
转化可能会导致瞬时或稳定的转化和表达。虽然本发明的核苷酸序列可以插入到属于这些广泛类别的任何植物和植物细胞中，但是它特别适用于农作物植物细胞。
利用植物育种中的已知方法，本发明的转基因植物可以与相似的转基因植物杂交，或与缺少本发明核酸的转基因植物杂交，或与非转基因植物杂交，来产生种子。此外，本发明的转基因植物可包括、和/或与另一种含有一种或多种核酸的转基因植物杂交，从而在该植物和/或其后代中形成转基因的“垛叠”。然后种植种子来得到杂交的能育的含有本发明核酸的转基因植物。该杂交能育的转基因植物可以具有特定的通过母本或通过父本遗传的表达盒。第二代植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明还包括任何这些杂交能育转基因植物的种子。本发明种子可从能育转基因植物收获，并用于生长包括含有所述DNA构建体的杂交植物系的本发明转化植物的后代。
“基因垛叠”也可以用植物转化通过将两个或多个基因转移入细胞核中来实现。在转化过程中多个基因可以引入细胞核中，无论是依次引入还是一次引入。利用针对多个连锁的部分目的序列的单次转基因，可以通过基因沉默机制特别是RNAi下调植物中或目的病原体物种中的多个基因。在单独启动子控制下的垛叠的多个基因也可以过表达，来得到所需的单个或多个表型。含有既包括过表达基因又包括沉默靶基因的基因垛叠的构建体也可以引入植物中，获得单个或多个农艺学重要表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与任何目的多核苷酸序列的组合垛叠，以形成所需的表型。这些组合可以产生具有多种性状组合的植物，这些性状包括但不限于，疾病抗性、除草剂耐受、产量升高、耐冷和抗旱。这些垛叠组合可以通过包括但不限于常规方法或遗传转化方法杂交育种植物的任何方法形成。如果通过遗传转化法垛叠所述性状，目的多核苷酸可以以任何顺序依次组合或同时组合。例如，如果要引入两个基因，这两个序列可以包含在分别的转化盒中，或在同一个转化盒中。这些序列的表达可以被同一个启动子或不同启动子驱动。
根据本实施方案，本发明的转基因植物用包括如下步骤的方法生产：提供CDPK样靶基因；制备具有与选择的CDPK样基因的一部分基本上相同的第一区和与第一区基本上互补的第二区的表达盒；将该表达盒转化入植物中；选择表达本发明双链RNA构建体的经转化植物的子代。
对线虫感染的增加的抗性是希望能够遗传至广泛的植物中的一般性状。本发明可用于减少任何植物寄生线虫造成的农作物破坏。优选所述寄生线虫属于诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫发现于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)中。优选地，发现于异皮线虫科或根结线虫科中。
所以，本发明所针对的寄生线虫属于选自下列组的一个或多个属：Naccobus、棘皮线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)。在优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组的一个或多个属：Naccobus、棘皮线虫属、长形胞囊线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属。在更加优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组中的一个或多个属：球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属。在进一步更优选的实施方案中，寄生线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属中的一个或两个属。在另一个实施方案中，寄生线虫属于根结线虫属。
当寄生线虫属于球胞囊线虫属时，其物种优选选自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G. mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(Globodera virginiae)。在另一个优选的实施方案中，寄生的球胞囊线虫属线虫包括物种马铃薯白线虫、烟草球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个。当所述寄生线虫属于胞囊线虫属时，所述物种优选选自由燕麦胞囊线虫(H.avenae)、胡萝卜胞囊线虫(H.carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(H.ciceri)、十字花科胞囊线虫(H.cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(H.delvii)、褐藻胞囊线虫(H.elachista)、菲氏胞囊线虫(H.filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(H.gambiensis)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、豌豆胞囊线虫(H.goettingiana)、荞麦胞囊线虫(H.graduni)、啤酒花胞囊(H.humuli)、大麦胞囊线虫(H.hordecalis)、麦类胞囊线虫(H.latipons)、燕麦胞囊线虫(H.major)、苜蓿胞囊线虫(H.medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(H.rosii)、甘蔗胞囊线虫(H.sacchari)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、蜀黍胞囊线虫(H.sorghi)、三叶草胞囊线虫(H.trifolii)、荨麻胞囊线虫(H.urticae)、木豆胞囊线虫(H.vigni)和玉米胞囊线虫(H.zeae)组成的组中。在另一个实施方案中，寄生胞囊线虫属线虫包括物种大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫(H.cajani)、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个。在更优选的实施方案中，寄生线虫包括大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫的至少一个物种。在最优选的实施方案中，所述寄生线虫是大豆胞囊线虫。
当所述寄生线虫是根结线虫属线虫时，所述寄生线虫可选自由高粱根结线虫(M.acronea)、小果咖啡线虫(M.arabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.lini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)组成的组中。在优选的实施方案中，所述寄生线虫包括以下物种至少之一：爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫。
下列实施例并不意味着限制本发明要求保护的范围，而意在作为某些实施方案的示例性描述。本领域技术人员所想到的对这些示例性方法的任何改变都应落入本发明的范围内。
实施例1：用于大豆转化的双元载体构建
这一示例性的方法使用了包含对应于大豆cDNA克隆49806575的靶基因的双元载体。克隆49806575通过使用公共的蒺藜苜蓿序列AY821654搜索cDNA序列的私有数据库来鉴定。表达载体由以下组成：合成的片段(SEQ ID NO：5)，其又包含49806575基因的320bp反义部分、间隔区、靶基因的有义片段(SEQ ID NO：2，其对应于SEQ ID NO：1的核苷酸50-372)，以及载体骨架。在这一载体RCB562中，4980657靶基因的dsRNA在合胞体或根优选的启动子TPP-样启动子(SEQ ID NO：6，见共同待决专利申请美国专利申请60/874,375，其在本文引用作为参考)下表达。TPP-样启动子优先在根和/或合胞体或巨细胞中驱动转基因表达。在该载体中用于转化的选择标记是突变的AHAS基因，其来自拟南芥，赋予对杀虫剂Arsenal(灭草烟，BASF Corporation，Mount Olive，NJ)的抗性。突变的AHAS的表达由欧芹泛蛋白启动子驱动(见Plesch，G.和Ebneth，M.，“Method for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants，controlled by a parsley ubiquitin promoter”，WO 03/102198，在本文引用作为参考。)
实施例2：使用大豆植物测定系统来检测对SCN感染的抗性
用生根外植体检测来说明双链RNA表达和得到的线虫抗性。该检测方法可见共同待决的申请USSN 12/001,234，其内容合并于此作为参考。
将来自大豆栽培种的干净大豆种子表面灭菌并使其萌发。接种前三天，开始卸甲的(disarmed)农杆菌培养物的过夜液体培养，例如，含有双元载体RCB562的卸甲的发根农杆菌株K599。第二天，将培养物涂敷到含有卡那霉素作为选择剂的LB琼脂板上。将这些琼脂板在28℃培养两天。每50个要接种的外植体一个板。含有与苗连接的近端的子叶用作转化的外植体。去除子叶之后，用解剖刀围绕切除部位刮擦表面。切下并刮过的子夜是农杆菌接种的目标物。将制得的外植体浸入如上制备的卸甲的浓发根农杆菌菌落中，以使该菌落能在该切过并刮过的表面上可见。然后将外植体放到培养皿的1％琼脂上，光下共培养6-8天。
在转化和共培养后，将大豆外植体转入含有选择剂的生根诱导培养基中，例如用于突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的S-B5-708(Sathasivan等人，Plant Phys.97：1044-50，1991)。在与共培养步骤中同样的条件下保持培养物。S-B5-708培养基包含：0.5×B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1×维生素B5、400μg/ml特美汀、0.8％诺布尔琼脂和1μM Imazapyr(用于AHAS基因的选择剂)(BASF Corporation，Florham Park，NJ)，pH为5.8。
选择和根诱导后2到3周，在外植体的切开末端上形成转化的根。将外植体转移至相同的选择培养基(S-B5-708培养基)中进一步选择。在该培养基中，一周内转基因根良好增殖并适合进行传代培养。
将强壮的白色大豆根从生根的外植体切离，并培养于六孔板中的补充有200 mg/l特美汀的根生长培养基(S-MS-606培养基)中。暗处室温保持培养物。S-MS-606培养基包括：0.2×MS盐和维生素B5，2％的蔗糖和200mg/l特美汀，pH为5.8。
传代培养一至五天后，在多孔板中用表面消毒的线虫幼体接种上述根，用于目的基因或启动子构建体的检测。使用大豆栽培种威廉姆斯82对照载体和Jack对照载体根作为对照。占据至少半个孔的每株根培养物用表面净化的大豆胞囊线虫(SCN)第三小种的第二阶段幼体(J2)以500 J2/孔的水平接种。然后密封这些板，并放回到25℃下黑暗中的培养箱中。从每个双元载体转化产生几个独立的根株，这些根株用来进行生物检定。接种线虫后四周，计数每个孔中的胞囊。
对于每个转化的株，从几个重复的孔中测定每株胞囊平均数、雌性指数百分数和标准误值(雌性指数＝在转基因根上发育的SCN胞囊平均数占W82野生型易感对照根上发育的胞囊平均数量的百分比)。进行多个独立的生物学重复实验以比较RCB562转化体和易感的Williams 82株系之间的胞囊数。结果显示RCB562转化的根在多个转基因株系中具有显著地胞囊数减少(p-值≤0.05)以及在大多数测定的转基因株系中减少的胞囊计数的一般倾向。
实施例3：RACE以确定完全转录的序列
按照说明书的指导，用Invitrogen的GeneRacer试剂盒(L1502-01)分离与部分cDNA克隆49806575(SEQ ID NO：1)高度同源的全长转录物序列。根据Invitrogen的GeneRacer试剂盒说明书从SCN感染后6天收获的大豆根制备总RNA以产生去磷酸以及脱帽的连接至GeneRacer RNA寡聚物(如SEQ ID NO：28所述)上的RNA。制备的RNA根据GeneRacer试剂盒说明书反转录，并用作RACE库模板进行PCR，以根据GeneRacer试剂盒说明书用初次和二次(嵌套)PCR反应分离5’cDNA末端。用于初次PCR反应的引物由SEQ ID NO：29和31所述。二次嵌套PCR反应引物由SEQ ID NO：30和32所述。
用凝胶电泳分离二次PCR反应的产物。根据生产商说明书从琼脂糖凝胶中纯化特定产物并克隆到PCR4-TOPO载体(Invitrogen)中。小量制备得到的菌落并测序。记为SEQ ID NO：26(RKF 195-3 2)的一个全长片段与SEQ ID NO：1(49806575 cDNA序列)有高同一性百分比。部分大豆49806575序列、全长大豆RKF195-3 2和来自其他植物物种的CDPK样基因编码的蛋白质之间的比对示于图2a-2d。
本领域技术人员将认识到，或仅仅通过常规的实验就能够确定此处描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。所附权利要求书意在涵盖这些等同方案。
<110>巴斯福植物科学有限公司
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<221>3’UTR
<222>(663)..(1045)
<223>预测的多聚A尾核苷酸残基1031到1045
<400>1
aagatcctcg tgcgagatat actgctgctc aggctctttc acatccatgg gttagagaag    60
gaggagaggc attagagatt cctattgata tatctgtcct gaacaacatg cgacagtttg    120
tgaaatatag tcggttgaaa caatttgcac taagggcatt ggctagcaca cttaatgaag    180
gagagttgtc tgatctaaaa gatcagtttg atgcaataga tgtggacaaa aatggttcta    240
ttagtcttga ggagatgaga caggctcttg ctaaagatca accttggaag ttgaaagaat    300
cacgtgtgct agagatattg caagcgatag acagcaacac agatgggcta gtggatttca    360
ccgagtttgt ggcagctact ttacatgtac atcaattgga ggaacatgat tctgacaagt    420
ggcagcaacg gtcacaggct gcttttgaga aatttgactt ggataaggat ggctatatta    480
ctccagatga acttagaatg catacgggtt tgagaggctc cattgatcca ttgcttgagg    540
aagccgatat tgataaagat gggaaaatca gcttaccaga atttcgtaga cttctaagaa    600
ctgcaagcat gggttctcga acagtaatga gcccaagtca ccgtcatcat cgaaagattt    660
agattagata tgtttcggag acagggataa ttcaggagat gagagtgatg gatttccttt    720
taagatgatg atctcttatg cagattgtgc tgaagccctc cttgtgatat ctattctgct    780
gcacattttg cactctgacc atcattatat ggaactctga aactagagtt aatattgact    840
atggcatacc acacaggatt gtgtgttaag cttagtctag acgaccatgt caagaggaat    900
ttaaatagtg tgtggattga cttgaggtat cagagtttca tcggtgtaca tcattggctt    960
gtttgtgcca tacatgtaat gtgtaatact gtaactataa ataaaaaact tcttactccc    1020
cttcccctgc aaaaaaaaaa aaaaa                                          1045
<210>2
<211>320
<212>DNA
<213>大豆
<400>2
gttagagaag gaggagaggc attagagatt cctattgata tatctgtcct gaacaacatg    60
cgacagtttg tgaaatatag tcggttgaaa caatttgcac taagggcatt ggctagcaca    120
cttaatgaag gagagttgtc tgatctaaaa gatcagtttg atgcaataga tgtggacaaa    180
aatggttcta ttagtcttga ggagatgaga caggctcttg ctaaagatca accttggaag    240
ttgaaagaat cacgtgtgct agagatattg caagcgatag acagcaacac agatgggcta    300
gtggatttca ccgagtttgt                                                320
<210>3
<211>219
<212>PRT
<213>大豆
<400>3
Asp Pro Arg Ala Arg Tyr Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ser His Pro Trp
1               5                   10                   15
Val Arg Glu Gly Gly Glu Ala Leu Glu Ile Pro Ile Asp Ile Ser Val
    20                          25                  30
Leu Asn Asn Met Arg Gln Phe Val Lys Tyr Ser Arg Leu Lys Gln Phe
    35                      40                  45
Ala Leu Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu Asn Glu Gly Glu Leu Ser Asp
    50                  55                  60
Leu Lys Asp Gln Phe Asp Ala Ile Asp Val Asp Lys Asn Gly Ser Ile
65                  70          75                          80
Ser Leu Glu Glu Met Arg Gln Ala Leu Ala Lys Asp Gln Pro Trp Lys
                85                  90                  95
Leu Lys Glu Ser Arg Val Leu Glu Ile Leu Gln Ala Ile Asp Ser Asn
            100                 105                 110
Thr Asp Gly Leu Val Asp Phe Thr Glu Phe Val Ala Ala Thr Leu His
        115                 120                 125
Val His Gln Leu Glu Glu His Asp Ser Asp Lys Trp Gln Gln Arg Ser
    130                 135                 140
Gln Ala Ala Phe Glu Lys Phe Asp Leu Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Pro Asp Glu Leu Arg Met His Thr Gly Leu Arg Gly Ser Ile Asp Pro
                165                 170                 175
Leu Leu Glu Glu Ala Asp Ile Asp Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Pro
            180                 185                 190
Glu Phe Arg Arg Leu Leu Arg Thr Ala Ser Met Gly Ser Arg Thr Val
        195                 200                 205
Met Ser Pro Ser His Arg His His Arg Lys Ile
    210         215
<210>4
<211>2211
<212>DNA
<213>蒺藜苜蓿
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(146)
<220>
<221>3’UTR
<222>(1830)..(2211)
<400>4
ttctccttct tcccttcttc gtcgttcctg ccacattcct tccttcttct caatctcaat    60
catctcacac gctttccaat ttctaaatca atgatcattt ttttcaaatt ttcttaatta    120
tcatttttca aacaaaacaa aacatcatgg gtttatgttt ttcttctaca aaggttgtta    180
gtggttctaa cagcaacacc acaaacaatg ataaccgtaa acggaatcag tcaacaacca    240
cggataccac cgtcacggta acaacagcaa caacggcggc gcagaaacaa acggcacaga    300
gacgtaaagg agggtcaaat gaaacagccc agaagaagaa tcatcatcaa catcataggt    360
taaaagagaa aacaggttct aaacatgttc cttgtggaaa aagaacggat tttgggtatg    420
agaaagattt tgataaaaga ttttctcttg ggaaattgtt gggtcatgga caatttggtt    480
atacttatgt tggtgttgat aaatccaatg gagatcgtgt cgccgttaag cgactcgaga   540
aagctaagat ggttctccct atagcagttg aggatgtaaa aagagaggtc aagatattga   600
aagaacttac aggccatgaa aatgtggttc agttttataa tgcttttgac gatgattcat   660
atgtgtacat agttatggag ttatgcgaag gtggagaact actagaccgg atactaaaca   720
aaaaggacag ccgttatact gaaaaagatg ccgccgttgt tgtaaggcag atgctgaagg   780
ttgcagctca gtgtcattta catggtttgg tacatcgcga catgaagcca gagaattttc   840
ttttcaaatc aaacaaagaa gattcagctt tgaaggccac tgattttggt ttgtctgatt   900
tcataaaacc tggaaagagg tttcaagata ttgttggaag tgcttactat gtcgcaccag   960
aagtgttgaa acggaagtca ggccctgaat cagatgtatg gagtattggt gtgattacat   1020
acatattgct ttgtgggaga cgtccatttt gggacaagac tgaagatggt atcttcaagg   1080
aggtcttacg aaacaagcct gatttccggc ggaaaccatg gccaaccata agtaatgctg   1140
caaaagattt tgtgaagaaa ttgttggtaa aagatcctcg ggcaagatta acggctgctc   1200
aggctctatc acatccatgg gttagagaag gaggagaggc atccgagatt ccaattgata   1260
tatctgtcct aaacaacatg cggcagtttg tgaagtatag tcgattgaaa caatttgcat   1320
tgagggcatt ggctagcaca cttaacgaag gtgagttgtc tgatctaaaa gatcagtttg   1380
atgcaataga tgtggacaaa aatggtgcta ttagtcttga agagatgaga caggctcttg   1440
ctaaagatct cccgtggaag ttgaaagaat cccgtgtatt ggagatattg caagcgattg   1500
acagcaacac ggatggatta gtagatttca ccgagtttgt tgcagctact ttacatgtgc   1560
atcaattgga ggaacatgac tccgacaagt ggcagcaacg gtcacaggct gcttttgaga   1620
aatttgacat agacaaggat ggctatatta ctccagagga actcagaatg cacactggta   1680
tgagaggttc catcgatcct ctgctcgagg aagccgatat tgacaaagat ggaaagatca   1740
gcttaccaga attcaggaga cttttaagaa ctgcaagcat tggttctcga aacgtaacaa   1800
gcccaactct acgtcatcga aggatctagc ttagatgtgt ttcagaggcg gagatgattc   1860
aaatgagagt gttggagttc ccttttaaga tgatctcctg tgcaggttgt gttgaagcca   1920
ttgtgatata tgctctgcag attttgcaat ctcttgccat tccatggaac tctgaaactt   1980
aaattatatt gaatatggcg tcgtcttgca aaggattgtg ttaaaagctt agtctagagg   2040
actgtatcaa gaagtgtttc atagagtgta tagaccctgc ttggattggc ttcaggtatc   2100
aaagttgaga gtttccatca gtgtacatca tttttaagtg tcagggtttt ctggatttac   2160
ttgtgccata acttgtaatg tgtaactata aataaaaatc ttctattcta c            2211
<210>5
<211>740
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>从49806575合成的发夹寻靶序列
<400>5
acaaactcgg tgaaatccac tagcccatct gtgttgctgt ctatcgcttg caatatctct    60
agcacacgtg attctttcaa cttccaaggt tgatctttag caagagcctg tctcatctcc    120
tcaagactaa tagaaccatt tttgtccaca tctattgcat caaactgatc ttttagatca    180
gacaactctc cttcattaag tgtgctagcc aatgccctta gtgcaaattg tttcaaccga    240
ctatatttca caaactgtcg catgttgttc aggacagata tatcaatagg aatctctaat    300
gcctctcctc cttctctaac cgtcgtgaaa gctctctgga agaagaagat tctcatcagg    360
atccccgaga aactcggata agagactcac agagtagcca tgctcggtca caacgctaca    420
gttagagaag gaggagaggc attagagatt cctattgata tatctgtcct gaacaacatg    480
cgacagtttg tgaaatatag tcggttgaaa caatttgcac taagggcatt ggctagcaca    540
cttaatgaag gagagttgtc tgatctaaaa gatcagtttg atgcaataga tgtggacaaa    600
aatggttcta ttagtcttga ggagatgaga caggctcttg ctaaagatca accttggaag    660
ttgaaagaat cacgtgtgct agagatattg caagcgatag acagcaacac agatgggcta    720
gtggatttca ccgagtttgt                                                740
<210>6
<211>1999
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>6
gtagtgccct tcatggatac caaaagagaa aatttgattt agtgcataca tataacaata    60
taacgccgca taataatact gtataaaaca gtcatgtaac gatatgacag cagtaataca    120
gttccaagag acgttataat cgtatgcaat catatgcttg cgtagatttt ccaacagttt    180
tgtttcgttg ataggaggaa ctcaacactc tagggtagtg attggtagac actattagca    240
caaaaaatat taattttact ctgatgttta ccaaaaaagt taccaatcaa atatttaaga    300
gatcgtactc ttccacggcg actctaaaaa ccaaagatat aggttagact cataactact    360
ttataaagaa aatgtttaac gataactacc gagatctaat aaataaacct tcattttcaa    420
gtatattata tttgcttctt ttgtttatat atcaaaccaa gttctggttt ataaaaatat    480
tagataaaac tcgtctaaat aggtaggtgt aaaataaaat tttaaatttt tatcgataat    540
atttaaaatt tgaaaagtta ataatgatcc acacattttt tctaatattt aatttagtaa    600
tttttgtatt aaataaaatt tcaatcatat acattcgatt tttctataca ttttaactat    660
ctatttctgc ataataaact gtattttcat tttatacgct tcatcttatg gatgatattt    720
aaattttaaa tagtaattca tacacttttt aatatttaat ttagtatttt cttaaatcca    780
aattttaatc ttacaattta aatatctact ttaacataat acaaatacaa tttaatttca    840
ttgtattaaa ttcaaatata atttgattat aataaaatac aatttaattc taaaaagtcc    900
atcttagatt ttaattttcc tttttagttt tgaaaattaa aaatttaaat ttattagata   960
tatatgttac tttttcagtt ttcctattta tttaagaaaa aaatattttt taacacatgt   1020
caacttgtaa acaatagact gaacacgtca ttttatatta tgtttagttt tgaaaattaa   1080
agttaattaa atatttatat ttcttttttt tagcttttct aattattttt aaaatagtaa   1140
atatttttaa tacaaatcaa tatctgaaca atagatttga tacataacat aatcctataa   1200
attattaact tggaaaacga tagtttatat aataaaatta ttttcttaag ttctctaacc   1260
ataacaatta aactatattt tagcgaagaa aagaagagaa taccgagaga acgcaacttg   1320
cactaaaagc taccactttg gcaaatcact catttatatt attatatact atcacctcaa   1380
ttcaatcgaa acctcaaaat aacactaata tatacacaaa gaaacaacag aataacaccg   1440
aagaatatag gtttaggaaa atccagaatt tgttgagact aaagagatca aattttcgat   1500
acaaggtttt gctcaatttg tattttcata ataaaattct ttatttcacc atagacttac   1560
atgattagtt tttcttttaa taaaaaaaaa cacgcgacat gaaaattata ttatctcagt   1620
gttgtcgaat ttgaatttga attttgagtt aaatactaca catttgttga caacttatta   1680
aactttacaa gtctgctaca aatattgtca aatatttact aattaatgga ccaaaatcct   1740
ctaacttgca aatttgtatc tacatcaact taaaaattag gaatatgcga cccaaaaaaa   1800
aaaaaactag gaataataat aaaaaaatgg aatgatgtgg aggaagctct ttactctttg   1860
agaggaagtt tataaattga ccacacattt agtctattat catcacatgt attaagactt   1920
gacaacttgt ctttctcaca ccaaacccct ctcctctgtt tcataacatc tgctctttct   1980
tttttttcct aagccccta                                                1999
<210>7
<211>560
<212>PRT
<213>蒺藜苜蓿
<400>7
Met Gly Leu Cys Phe Ser Ser Thr Lys Val Val Ser Gly Ser Asn Ser
1               5                   10                  15
Asn Thr Thr Asn Asn Asp Asn Arg Lys Arg Asn Gln Ser Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Asp Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Gln Lys Gln
        35                  40                  45
Thr Ala Gln Arg Arg Lys Gly Gly Ser Asn Glu Thr Ala Gln Lys Lys
    50                  55                  60
Asn His His Gln His His Arg Leu Lys Glu Lys Thr Gly Ser Lys His
65                  70                  75                  80
Val Pro Cys Gly Lys Arg Thr Asp Phe Gly Tyr Glu Lys Asp Phe Asp
                85                  90                  95
Lys Arg Phe Ser Leu Gly Lys Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly Tyr
            100                 105                 110
Thr Tyr Val Gly Val Asp Lys Ser Asn Gly Asp Arg Val Ala Val Lys
        115                 120                 125
Arg Leu Glu Lys Ala Lys Met Val Leu Pro Ile Ala Val Glu Asp Val
    130                 135                 140
Lys Arg Glu Val Lys Ile Leu Lys Glu Leu Thr Gly His Glu Asn Val
145                 150                 155                 160
Val Gln Phe Tyr Asn Ala Phe Asp Asp Asp Ser Tyr Val Tyr Ile Val
                165                 170                 175
Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Asn Lys
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Arg Tyr Thr Glu Lys Asp Ala Ala Val Val Val Arg Gln
        195                 200                 205
Met Leu Lys Val Ala Ala Gln Cys His Leu His Gly Leu Val His Arg
    210                 215                 220
Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Lys Ser Asn Lys Glu Asp Ser
225                 230                 235                 240
Ala Leu Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Asp Phe Ile Lys Pro Gly
                245                 250                 255
Lys Arg Phe Gln Asp Ile Val Gly Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro Glu
            260                 265                 270
Val Leu Lys Arg Lys Ser Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile Gly
        275                 280                 285
Val Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Arg Arg Pro Phe Trp Asp Lys
    290                 295                 300
Thr Glu Asp Gly Ile Phe Lys Glu Val Leu Arg Asn Lys Pro Asp Phe
305                 310                 315                 320
Arg Arg Lys Pro Trp Pro Thr Ile Ser Asn Ala Ala Lys Asp Phe Val
                325                 330                 335
Lys Lys Leu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala Gln
            340                 345                 350
Ala Leu Ser His Pro Trp Val Arg Glu Gly Gly Glu Ala Ser Glu Ile
        355                 360                 365
Pro Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Asn Met Arg Gln Phe Val Lys Tyr
    370                 375                 380
Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ala Leu Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu Asn
385                 390                 395                 400
Glu Gly Glu Leu Ser Asp Leu Lys Asp Gln Phe Asp Ala Ile Asp Val
                405                 410                 415
Asp Lys Asn Gly Ala Ile Ser Leu Glu Glu Met Arg Gln Ala Leu Ala
            420                 425                 430
Lys Asp Leu Pro Trp Lys Leu Lys Glu Ser Arg Val Leu Glu Ile Leu
        435                 440                 445
Gln Ala Ile Asp Ser Asn Thr Asp Gly Leu Val Asp Phe Thr Glu Phe
    450                 455                 460
Val Ala Ala Thr Leu His Val His Gln Leu Glu Glu His Asp Ser Asp
465                 470                 475                 480
Lys Trp Gln Gln Arg Ser Gln Ala Ala Phe Glu Lys Phe Asp Ile Asp
                485                 490                 495
Lys Asp Gly Tyr Ile Thr Pro Glu Glu Leu Arg Met His Thr Gly Met
            500                 505                 510
Arg Gly Ser Ile Asp Pro Leu Leu Glu Glu Ala Asp Ile Asp Lys Asp
        515                 520                 525
Gly Lys IleSer Leu Pro Glu Phe Arg Arg Leu Leu Arg Thr AlaSer
    530                 535                 540
Ile Gly Ser ArgAsn Val Thr Ser Pro Thr Leu Arg Hi s Arg Arg Ile
545                 550                 555                 560
<210>8
<211>1683
<212>DNA
<213>蒺藜苜蓿
<400>8
atgggtttat gtttttcttc tacaaaggtt gttagtggtt ctaacagcaa caccacaaac    60
aatgataacc gtaaacggaa tcagtcaaca accacggata ccaccgtcac ggtaacaaca    120
gcaacaacgg cggcgcagaa acaaacggca cagagacgta aaggagggtc aaatgaaaca    180
gcccagaaga agaatcatca tcaacatcat aggttaaaag agaaaacagg ttctaaacat    240
gttccttgtg gaaaaagaac ggattttggg tatgagaaag attttgataa aagattttct    300
cttgggaaat tgttgggtca tggacaattt ggttatactt atgttggtgt tgataaatcc    360
aatggagatc gtgtcgccgt taagcgactc gagaaagcta agatggttct ccctatagca    420
gttgaggatg taaaaagaga ggtcaagata ttgaaagaac ttacaggcca tgaaaatgtg    480
gttcagtttt ataatgcttt tgacgatgat tcatatgtgt acatagttat ggagttatgc    540
gaaggtggag aactactaga ccggatacta aacaaaaagg acagccgtta tactgaaaaa    600
gatgccgccg ttgttgtaag gcagatgctg aaggttgcag ctcagtgtca tttacatggt    660
ttggtacatc gcgacatgaa gccagagaat tttcttttca aatcaaacaa agaagattca    720
gctttgaagg ccactgattt tggtttgtct gatttcataa aacctggaaa gaggtttcaa    780
gatattgttg gaagtgctta ctatgtcgca ccagaagtgt tgaaacggaa gtcaggccct    840
gaatcagatg tatggagtat tggtgtgatt acatacatat tgctttgtgg gagacgtcca   900
ttttgggaca agactgaaga tggtatcttc aaggaggtct tacgaaacaa gcctgatttc   960
cggcggaaac catggccaac cataagtaat gctgcaaaag attttgtgaa gaaattgttg   1020
gtaaaagatc ctcgggcaag attaacggct gctcaggctc tatcacatcc atgggttaga   1080
gaaggaggag aggcatccga gattccaatt gatatatctg tcctaaacaa catgcggcag   1140
tttgtgaagt atagtcgatt gaaacaattt gcattgaggg cattggctag cacacttaac   1200
gaaggtgagt tgtctgatct aaaagatcag tttgatgcaa tagatgtgga caaaaatggt   1260
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<213>蒺藜苜蓿
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Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Asn Lys
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Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ser His Pro Trp Val Arg
        355                 360                 365
Glu Gly Gly Ile Ala Ser Glu Ile Pro Leu Asp Ile Ser Val Leu Ser
    370                 375                 380
Asn Met Arg Gln Phe Val Arg Tyr Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ala Leu
385                 390                 395                 400
Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu Asp Glu Glu Glu Leu Ser Asp Leu Lys
                405                 410                 415
Asp Gln Phe Ser Ala Ile Asp Val Asp Lys Asn Gly Val Ile Ser Leu
            420                 425                 430
Glu Glu Met Arg Gln Ala Leu Ala Lys Asp Leu Pro Trp Lys Met Lys
        435                 440                 445
Glu Ser Arg Val Leu Glu Ile Leu Gln Ala Ile Asp Ser Asn Thr Asp
    450                 455                 460
Gly Leu Val Asp Phe Pro Glu Phe Val Ala Ala Thr Leu His Val His
465                 470                 475                 480
Gln Leu Glu Glu His Asn Ser Thr Lys Trp Gln Gln Arg Ser Gln Ala
                485                 490                 495
Ala Phe Glu Lys Phe Asp Val Asp Arg Asp Gly Phe Ile Thr Pro Glu
            500                 505                 510
Glu Leu Lys Met His Thr Gly Leu Lys Gly Ser Ile Asp Pro Leu Leu
        515                 520                 525
Glu Glu Ala Asp Ile Asp Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Ser Glu Phe
    530                 535                 540
Arg Arg Leu Leu Arg Thr Ala Ser Met Ser Ser Pro Thr Val Arg Asp
545                 550                 555                 560
Ser Arg Arg Asn Val Ala Leu
                565
<210>14
<211>1695
<212>DNA
<213>马铃薯
<400>14
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aatgttaagc caagttcaag aagacaaggt ggggttattc cttgtgggaa aagaacagat   300
tttgggtatg ataaagattt tgaaaagaga tatacaattg ggaaattgtt gggtcatggt   360
caatttggtt atacatatgt tgctacagat aaatcttcag gagatcgtgt ggctgtcaaa   420
agaattgaga aaaacaagat ggttcttccc attgcggttg aggatgtgaa acgagaagtc   480
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tgtcaaaaga cagtcggtat acgagaagat gcagcaatag tcgtacccca gatgctaaaa   660
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<210>15
<211>564
<212>PRT
<213>马铃薯
<400>15
Met Gly Ser Cys Phe Ser Ser Ser Lys Val Ser Gly Ser Asn Ser Asn
1               5                   10                  15
Thr Pro Ser Thr Asn Asn Thr Ala Thr Asn Thr Asn Thr Thr Val Asn
            20                  25                  30
Val His Pro Asn Arg Arg Glu Thr Ser Lys Ala Pro Ser Thr Thr Val
        35                  40                  45
Val Asn Ser Arg Asn Gln Glu Gly Ser Asn Tyr Asn Arg Gly Lys Gly
    50                  55                  60
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Asn Val Lys Pro Ser Ser Arg Arg Gln Gly Gly Val Ile Pro Cys Gly
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Lys Arg Thr Asp Phe Gly Tyr Asp Lys Asp Phe Glu Lys Arg Tyr Thr
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Ile Gly Lys Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly Tyr Thr Tyr Val Ala
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Asn Lys Met Val Leu Pro Ile Ala Val Glu Asp Val Lys Arg Glu Val
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Lys Ile Leu Lys Ala Leu Gly Arg His Glu Asn Val Val Gln Phe Tyr
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Asn Ser Phe Glu Asp His Asn Tyr Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Cys
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Glu Gly Gly Glu Leu Leu Asp Asp Cys Gln Lys Thr Val Gly Ile Arg
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Glu Asp Ala Ala Ile Val Val Pro Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Glu
    210                 215                 220
Cys His Leu His Gly Leu Val His Arg Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe
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Leu Phe Lys Ser Thr Lys Glu Asp Ser Pro Leu Lys Ala Thr Asp Phe
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Val Leu Arg Asn Lys Pro Asp Phe Arg Arg Lys Pro Trp Ser Asn Ile
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Asn Met Arg Gln Phe Val Arg Tyr Ser His Leu Lys Gln Phe Ala Leu
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Arg Ala Leu Arg Ser Thr Leu Asp Glu Glu Glu Ile Ala Asp Leu Arg
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Gln Leu Glu Glu His Asn Ser Ala Lys Trp Gln Gln Arg Ser Gln Ala
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Ala Phe Glu Lys Phe Asp Val Asp Arg Asp Gly Phe Ile Thr Pro Glu
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Glu Glu Ala Asp Ile Asp Lys Asp Gly Lys Ile Ser Ile Ser Glu Phe
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Arg Arg Leu Leu Arg Thr Ala Ser Met Thr Ser Pro Thr Val Arg Asp
545                 550                 555                 560
Ser Arg Gly Met
<210>16
<211>1716
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>16
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<210>17
<211>571
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>17
Met Gly Leu Cys Phe Ser Ser Ala Ala Lys Ser Ser Gly His Asn Arg
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Ser Ser Arg Asn Pro His Pro His Pro Pro Leu Thr Val Val Lys Ser
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Arg Pro Pro Arg Ser Pro Cys Ser Phe Met Ala Val Thr Ile Gln Lys
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Asp Phe Gly Tyr Ala Lys Asp Phe Asp His Arg Tyr Thr Ile Gly Lys
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Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly Tyr Thr Tyr Val Ala Thr Asp Lys
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Glu Asp Lys Asn Ser Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly
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Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Ala Arg Lys Asp Ser Arg Tyr Ser Glu
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Arg Asp Ala Ala Val Val Val Arg Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Glu
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Leu Phe Lys Ser Thr Glu Glu Asp Ser Pro Leu Lys Ala Thr Asp Phe
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Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile Gly Val Ile Ser Tyr Ile Leu Leu
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<210>18
<211>1605
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>18
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acagcagctc aagcgctatc acattcatgg gtgaaagaag gaggtgaggc ctcagaggtt   1020
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cagattgcac ttagggctct ggcgaaaaca attaatgagg atgagctgga tgatctcaga   1140
gaccagtttg atgcgattga cattgacaag aacggttcta taagccttga ggaaatgagg   1200
caggctcttg cgaaagatgt tccttggaaa ctcaaagatg caagagttgc agagattctc   1260
caagcgaatg atagcaacac tgatggtttg gtggatttca ctgagtttgt ggtggctgct   1320
ttgcacgtga accaattgga ggagcatgac tctgagaagt ggcaacagag gtcaagagca   1380
gcatttgaca agtttgacat agacggagat gggtttataa ctcccgaaga acttagattg   1440
caaacgggtt taaaaggctc catcgaacca cttcttgaag aggccgacgt agatgaagat   1500
gggagaatca gcatcaatga gtttcgcaga cttttgagaa gtgcaagcct caagtcaaaa   1560
aatgttaaaa gccctcctgg ttaccagctt tcacaaaaga tgtaa                    1605
<210>19
<211>534
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>19
Met Gly Leu Cys Phe Ser Ser Pro Lys Ala Thr Arg Arg Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Asn Pro Asn Pro Asp Ser Pro Thr Gln Gly Lys Ala Ser Glu
            20                  25                  30
Lys Val Ser Asn Lys Asn Lys Lys Asn Thr Lys Lys Ile Gln Leu Arg
        35                  40                  45
His Gln Gly Gly Ile Pro Tyr Gly Lys Arg Ile Asp Phe Gly Tyr Ala
    50                  55                  60
Lys Asp Phe Asp Asn Arg Tyr Thr Ile Gly Lys Leu Leu Gly His Gly
65                  70                  75                  80
Gln Phe Gly Phe Thr Tyr Val Ala Thr Asp Asn Asn Asn Gly Asn Arg
                85                  90                  95
Val Ala Val Lys Arg Ile Asp Lys Ala Lys Met Thr Gln Pro Ile Glu
            100                 105                 110
Val Glu Asp Val Lys Arg Glu Val Lys Ile Leu Gln Ala Leu Gly Gly
        115                 120                 125
His Glu Asn Val Val Gly Phe His Asn Ala Phe Glu Asp Lys Thr Tyr
    130                 135                 140
Ile Tyr Ile Val Met Glu Leu Cys Asp Gly Gly Glu Leu Leu Asp Arg
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ala Lys Lys Asp Ser Arg Tyr Thr Glu Lys Asp Ala Ala Val
                165                 170                 175
Val Val Arg Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Glu Cys His Leu Arg Gly
            180                 185                 190
Leu Val His Arg Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Lys Ser Thr
        195                 200                 205
Glu Glu Gly Ser Ser Leu Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Asp Phe
    210                 215                 220
Ile Lys Pro Gly Val Lys Phe Gln Asp Ile Val Gly Ser Ala Tyr Tyr
225                 230                 235                 240
Val Ala Pro Glu Val Leu Lys Arg Arg Ser Gly Pro Glu Ser Asp Val
                245                 250                 255
Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Arg Arg Pro
            260                 265                 270
Phe Trp Asp Lys Thr Gln Asp Gly Ile Phe Asn Glu Val Met Arg Lys
        275                 280                 285
Lys Pro Asp Phe Arg Glu Val Pro Trp Pro Thr Ile Ser Asn Gly Ala
    290                 295                 300
Lys Asp Phe Val Lys Lys Leu Leu Val Lys Glu Pro Arg Ala Arg Leu
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ser His Ser Trp Val Lys Glu Gly Gly Glu
                325                 330                 335
Ala Ser Glu Val Pro Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Asn Met Arg Gln
            340                 345                 350
Phe Val Lys Phe Ser Arg Leu Lys Gln Ile Ala Leu Arg Ala Leu Ala
        355                 360                 365
Lys Thr Ile Asn Glu Asp Glu Leu Asp Asp Leu Arg Asp Gln Phe Asp
    370                 375                 380
Ala Ile Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Glu Glu Met Arg
385                 390                 395                 400
Gln Ala Leu Ala Lys Asp Val Pro Trp Lys Leu Lys Asp Ala Arg Val
                405                 410                 415
Ala Glu Ile Leu Gln Ala Asn Asp Ser Asn Thr Asp Gly Leu Val Asp
            420                 425                 430
Phe Thr Glu Phe Val Val Ala Ala Leu His Val Asn Gln Leu Glu Glu
        435                 440                 445
His Asp Ser Glu Lys Trp Gln Gln Arg Ser Arg Ala Ala Phe Asp Lys
    450                 455                 460
Phe Asp Ile Asp Gly Asp Gly Phe Ile Thr Pro Glu Glu Leu Arg Leu
465                 470                 475                 480
Gln Thr Gly Leu Lys Gly Ser Ile Glu Pro Leu Leu Glu Glu Ala Asp
                485                 490                 495
Val Asp Glu Asp Gly Arg Ile Ser Ile Asn Glu Phe Arg Arg Leu Leu
            500                 505                 510
Arg Ser Ala Ser Leu Lys Ser Lys Asn Val Lys Ser Pro Pro Gly Tyr
        515                 520                 525
Gln Leu Ser Gln Lys Met
    530
<210>20
<211>1572
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>20
atgggtgtct gtttctccgc cattagagtc actggtgcta gcagcagtag acgaagcagt    60
cagaccaaat ccaaggctgc tcctactccc atcgatacca aggcctctac caaacgccga    120
accggctcca tcccctgcgg caagcgtacc gattttggct actccaaaga cttccacgat    180
cactacacca tcggcaagtt gctcggccat ggtcaattcg gctacaccta cgtcgccatc    240
cacagaccca atggagatcg cgtcgccgtc aaaagactcg ataagtctaa gatggttctt    300
cctattgctg ttgaggatgt caagcgtgag gttcagattc ttattgctct ctctggccac    360
gagaatgttg ttcagtttca caatgccttt gaggatgacg attacgtcta tattgttatg    420
gagttgtgcg aaggaggcga attgctggat aggatattat ccaagaaagg taatcggtac    480
tccgagaaag atgcagccgt tgtcgttagg cagatgctca aagttgcagg agaatgtcat    540
ctacacggtc ttgtacatag agatatgaaa ccagagaact ttttgttcaa atcagctcaa    600
ctagattcgc ctctaaaggc tacggatttt ggtttatcgg attttatcaa accagggaaa    660
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tcagggcctg aatcagatgt atggagcatt ggtgtgatta cgtatatatt actttgtggg   780
aggcggcctt tttgggatag aactgaagat ggtatattta aagaggtttt aagaaataaa   840
cctgacttca gccgtaaacc ttgggcaact ataagtgaca gcgccaaaga ttttgtgaaa   900
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aaaaatggcg tcattagtct tgaagagatg agacaggcac ttgccaaaga tcttccttgg   1200
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gattcagaga aatggcagct aaggtcaaga gcagcttttg agaaattcga cctagacaaa   1380
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aatcttcgat ag                                                       1572
<210>21
<211>523
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>21
Met Gly Val Cys Phe Ser Ala Ile Arg Val Thr Gly Ala Ser Ser Ser
1               5                   10                  15
Arg Arg Ser Ser Gln Thr Lys Ser Lys Ala Ala Pro Thr Pro Ile Asp
            20                  25                  30
 Thr Lys Ala Ser Thr Lys Arg Arg Thr Gly Ser Ile Pro Cys Gly Lys
         35                  40                  45
Arg Thr Asp Phe Gly Tyr Ser Lys Asp Phe His Asp His Tyr Thr Ile
    50                  55                  60
Gly Lys Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly Tyr Thr Tyr Val Ala Ile
65                  70                  75                  80
His Arg Pro Asn Gly Asp Arg Val Ala Val Lys Arg Leu Asp Lys Ser
                85                  90                  95
Lys Met Val Leu Pro Ile Ala Val Glu Asp Val Lys Arg Glu Val Gln
            100                 105                 110
Ile Leu Ile Ala Leu Ser Gly His Glu Asn Val Val Gln Phe His Asn
        115                 120                 125
Ala Phe Glu Asp Asp Asp Tyr Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Cys Glu
    130                 135                 140
Gly Gly Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Ser Lys Lys Gly Asn Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Glu Lys Asp Ala Ala Val Val Val Arg Gln Met Leu Lys Val Ala
                165                 170                 175
Gly Glu Cys His Leu His Gly Leu Val His Arg Asp Met Lys Pro Glu
            180                 185                 190
Asn Phe Leu Phe Lys Ser Ala Gln Leu Asp Ser Pro Leu Lys Ala Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Gly Leu Ser Asp Phe Ile Lys Pro Gly Lys Arg Phe His Asp
    210                 215                 220
Ile Val Gly Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Lys Arg Arg
225                 230                 235                 240
Ser Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Tyr Ile
                245                 250                 255
Leu Leu Cys Gly Arg Arg Pro Phe Trp Asp Arg Thr Glu Asp Gly Ile
            260                 265                 270
Phe Lys Glu Val Leu Arg Asn Lys Pro Asp Phe Ser Arg Lys Pro Trp
        275                 280                 285
Ala Thr Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Phe Val Lys Lys Leu Leu Val
    290                 295                 300
Lys Asp Pro Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ser His Ala
305                 310                 315                 320
Trp Val Arg Glu Gly Gly Asn Ala Thr Asp Ile Pro Val Asp Ile Ser
                325                 330                 335
Val Leu Asn Asn Leu Arg Gln Phe Val Arg Tyr Ser Arg Leu Lys Gln
            340                 345                 350
Phe Ala Leu Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu Asp Glu Ala Glu Ile Ser
        355                 360                 365
Asp Leu Arg Asp Gln Phe Asp Ala Ile Asp Val Asp Lys Asn Gly Val
    370                 375                 380
Ile Ser Leu Glu Glu Met Arg Gln Ala Leu Ala Lys Asp Leu Pro Trp
385                 390                 395                 400
Lys Leu Lys Asp Ser Arg Val Ala Glu Ile Leu Glu Ala Ile Asp Ser
                405                 410                 415
Asn Thr Asp Gly Leu Val Asp Phe Thr Glu Phe Val Ala Ala Ala Leu
            420                 425                 430
His Val His Gln Leu Glu Glu His Asp Ser Glu Lys Trp Gln Leu Arg
        435                 440                 445
Ser Arg Ala Ala Phe Glu Lys Phe Asp Leu Asp Lys Asp Gly Tyr Ile
    450                 455                 460
Thr Pro Glu Glu Leu Arg Met His Thr Gly Leu Arg Gly Ser Ile Asp
465                 470                 475                 480
Pro Leu Leu Asp Glu Ala Asp Ile Asp Arg Asp Gly Lys Ile Ser Leu
                485                 490                 495
His Glu Phe Arg Arg Leu Leu Arg Thr Ala Ser Ile Ser Ser Gln Arg
            500                 505                 510
Ala Pro Ser Pro Ala Gly His Arg Asn Leu Arg
        515                 520
<210>22
<211>1569
<212>DNA
<213>稻
<400>22
atgggcgcgt gcttctcatc ccacactgcg accgccgccg ccgatggcgg gagcgggaag   60
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gtcgggaggc tgctcggcca cggccagttc ggctacacct tcgccgccac cgaccgggcc   240
tccggtgacc gcgtcgccgt caagcgcatc gacaaggcca agatggttcg ccctgttgct   300
gtggaggatg taaagagaga agtgaagatt cttaaagaac ttaaaggcca tgagaatatt   360
gttcacttct acaatgcgtt tgaagatgac tcatatgtat atattgtgat ggaactatgt   420
gagggtggtg aactattgga ccggattttg gcaaaaaaga acagccgtta tagtgagaaa   480
gatgctgcag tggtggtgcg gcagatgctc aaagtggcag ctgagtgcca tctgcatggg   540
ctagttcacc gagatatgaa gcccgagaac ttccttttca aatcaaccaa ggaggactca   600
cctttaaagg caacagattt tggtctgtca gacttcataa aaccagggaa aaagtttcac   660
gatatagttg gcagtgccta ttatgtagca ccagaagttt taaaacgacg gtctggccct   720
gagtcagatg tttggagcat aggagtcata acttatattt tgctctgtgg gagacgccct   780
ttttggaata agacagagga tggcatattc agagaggtac taagaaacaa gcctgatttt   840
cgtaagaagc cttggccagg catcagttca ggtgctaaag atttcgttaa aaagttactt   900
gtaaagaacc caagggcaag attaaccgct gctcaagctc tctcgcatcc atgggtaaga   960
gaaggaggag aagcatctga gatccctgtt gatatatctg tattgtccaa catgcgtcag   1020
tttgtcaagt acagccgttt taagcaattt gctctgaggg ctttagcaag tacactaaaa   1080
gaggaagaac tagcagatct gaaggaccag ttcgatgcaa ttgatgttga taaaagtgga   1140
tcaattagta ttgaggaaat gcggcatgcc cttgcaaagg atcttccttg gagattgaag   1200
ggcccccgtg ttctcgagat tatccaagca atcgacagca acactgatgg tcttgtggac   1260
tttgaagagt ttgtagcagc aaccctccat atacatcaaa tggctgagct tgactctgaa   1320
aggtggggcc tacgctgcca ggctgctttc agcaaatttg atctggatgg tgacggatac   1380
atcactccag atgaactcag aatggtgcag cacactggct tgaagggttc catcgagcca   1440
ttgctggagg aggccgacat cgacaaagac gggagaataa gcttgtcgga gttccgcaag   1500
ctcctgcgga cagcgagcat gagcaacctt cccagtccaa gaggacctcc aaatccacaa   1560
cccctgtga                                                           1569
<210>23
<211>522
<212>PRT
<213>稻
<400>23
Met Gly Ala Cys Phe Ser Ser His Thr Ala Thr Ala Ala Ala Asp Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Lys Arg Gln Gln Arg Lys Gly Asp His Lys Gly Lys Leu
            20                  25                  30
Pro Asp Gly Gly Gly Gly Glu Lys Glu Lys Glu Ala Ala Arg Val Glu
        35                  40                  45
Phe Gly Tyr Glu Arg Asp Phe Glu Gly Arg Tyr Gln Val Gly Arg Leu
    50                  55                  60
Leu Gly His Gly Gln Phe Gly Tyr Thr Phe Ala Ala Thr Asp Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Asp Arg Val Ala Val Lys Arg Ile Asp Lys Ala Lys Met Val
                85                  90                  95
Arg Pro Val Ala Val Glu Asp Val Lys Arg Glu Val Lys Ile Leu Lys
            100                 105                 110
Glu Leu Lys Gly His Glu Asn Ile Val His Phe Tyr Asn Ala Phe Glu
        115                 120                     125
Asp Asp Ser Tyr Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu
    130             135                 140
Leu Leu Asp Arg Ile Leu Ala Lys Lys Asn Ser Arg Tyr Ser Glu Lys
145             150                 155                 160
Asp Ala Ala Val Val Val Arg Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Glu Cys
            165                 170                 175
His Leu His Gly Leu Val His Arg Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe Leu
        180                 185                 190
Phe Lys Ser Thr Lys Glu Asp Ser Pro Leu Lys Ala Thr Asp Phe Gly
    195                 200                 205
Leu Ser Asp Phe Ile Lys Pro Gly Lys Lys Phe His Asp Ile Val Gly
                    210                 215                 220
Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Lys Arg Arg Ser Gly Pro
225             230                 235                 240
Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Cys
            245                 250                 255
Gly Arg Arg Pro Phe Trp Asn Lys Thr Glu Asp Gly Ile Phe Arg Glu
        260                 265                 270
Val Leu Arg Asn Lys Pro Asp Phe Arg Lys Lys Pro Trp Pro Gly Ile
    275                 280                 285
Ser Ser Gly Ala Lys Asp Phe Val Lys Lys Leu Leu Val Lys Asn Pro
    290                 295                 300
Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ser His Pro Trp Val Arg
305                 310                 315                 320
Glu Gly Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Asp Ile Ser Val Leu Ser
                325                 330                 335
Asn Met Arg Gln Phe Val Lys Tyr Ser Arg Phe Lys Gln Phe Ala Leu
            340                 345                 350
Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu Lys Glu Glu Glu Leu Ala Asp Leu Lys
        355                 360                 365
Asp Gln Phe Asp Ala Ile Asp Val Asp Lys Ser Gly Ser Ile Ser Ile
    370                 375                 380
Glu Glu Met Arg His Ala Leu Ala Lys Asp Leu Pro Trp Arg Leu Lys
385                 390                 395                 400
Gly Pro Arg Val Leu Glu Ile Ile Gln Ala Ile Asp Ser Asn Thr Asp
                405                 410                 415
Gly Leu Val Asp Phe Glu Glu Phe Val Ala Ala Thr Leu His Ile His
            420                 425                 430
Gln Met Ala Glu Leu Asp Ser Glu Arg Trp Gly Leu Arg Cys Gln Ala
        435                 440                 445
Ala Phe Ser Lys Phe Asp Leu Asp Gly Asp Gly Tyr Ile Thr Pro Asp
    450                 455                 460
Glu Leu Arg Met Val Gln His Thr Gly Leu Lys Gly Ser Ile Glu Pro
465                 470                 475                 480
Leu Leu Glu Glu Ala Asp Ile Asp Lys Asp Gly Arg Ile Ser Leu Ser
                485                 490                 495
Glu Phe Arg Lys Leu Leu Arg Thr Ala Ser Met Ser Asn Leu Pro Ser
            500                 505                 510
Pro Arg Gly Pro Pro Asn Pro Gln Pro Leu
        515                 520
<210>24
<211>1539
<212>DNA
<213>稻
<400>24
atgggactct gctcctcctc cagcgcccgc cgggacgccg gcacacccgg cggcggtaac    60
ggcgcgggga acaaggataa cgcggggagg aaggggatcg tggcgtgcgg gaagcggacg    120
gacttcgggt acgacaagga cttcgaggcg cggtacgcgc tcgggaagct gctgggccac    180
ggccagttcg gctacacctt cgccgccgtc gaccgccgct ccagcgagcg cgtcgccgtc    240
aagcgcatcg acaagaacaa gatggttctt cctgttgccg ttgaagacgt aaagcgagaa    300
gttaaaatac tgaaggcctt acaaggccat gaaaatgttg tacattttta caatgcattt    360
gaagatgata attatgtgta tattgttatg gaattatgtg aaggcgggga gttacttgac    420
cggatactag ccaagaaaga tagccgttat agcgagaaag atgctgcagt agttgtgcgg    480
caaatgctca aggttgctgc tgagtgccat ttgcatggtt tggttcatcg ggacatgaag    540
cctgagaact tcctcttcaa atcaaccaaa gaggactcat ccctcaaggc tacagatttt    600
ggtctttcag attttataag accagggaaa cactttcgtg acattgttgg aagtgcctac   660
tatgtagcac cagaagtgct taagcgtaag tcaggcccag aatctgacgt ttggagtatt   720
ggcgtaataa cctatattct actgtgtgga agacgacctt tctgggacaa aactgaagat   780
ggaatattta aagaggtgtt gaaaaacaag ccagattttc gtcgcaagcc ctggccaaat   840
atcactcctt gtgctaaaga ctttgtacaa aagttgcttg ttaaggatcc ccgtgcaaga   900
ttaactgctg ctcaggcatt atcacatgaa tgggtgagag aaggaggaca ggcatctgat   960
atacctctag atatatctgt attacataat atgcgtcagt ttgtaaaata cagtcggttt   1020
aagcaatttg ctttacgggc gttagcttct acactaaatg cagaagagtt gtctgatctt   1080
cgtgaccagt tcaatgccat tgatgttgac aagaatggaa caattagtct ggaagaactg   1140
aagcaggctc ttgcaaagga tgttccatgg agattaaagg gtccacgtgt tttagagatt   1200
gttgaggcaa ttgacagtaa cacagatgga ttagttgatt tcgaagagtt tgttgctgca   1260
acattacatg tgcatcagct agtggaacat gatactgaga agtggaaatc attgtctcaa   1320
gctgcatttg ataaatttga tgttgacgga gatggctata tcacatctga tgaactgaga   1380
atgcaaacag gactgaaagg ttctattgat cccctcctgg aggaggctga cattgacaga   1440
gatggaaaaa taagcctaga tgaatttcgc aggctcctga aaactgcaag catgagttca   1500
cgcaatgtac aaactccgag gagtgttcac agatcgtag                          1539
<210>25
<211>512
<212>PRT
<213>稻
<400>25
Met Gly Leu Cys Ser Ser Ser Ser Ala Arg Arg Asp Ala Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Asn Gly Ala Gly Asn Lys Asp Asn Ala Gly Arg Lys Gly
            20                  25                  30
Ile Val Ala Cys Gly Lys Arg Thr Asp Phe Gly Tyr Asp Lys Asp Phe
        35                  40                  45
Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gly Lys Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly
    50                  55                  60
Tyr Thr Phe Ala Ala Val Asp Arg Arg Ser Ser Glu Arg Val Ala Val
65                  70                  75                  80
Lys Arg Ile Asp Lys Asn Lys Met Val Leu Pro Val Ala Val Glu Asp
                85                  90                  95
Val Lys Arg Glu Val Lys Ile Leu Lys Ala Leu Gln Gly His Glu Asn
            100                 105                 110
Val Val His Phe Tyr Asn Ala Phe Glu Asp Asp Asn Tyr Val Tyr Ile
        115                 120                 125
Val Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Leu Asp ArgIle Leu Ala
    130                 135                 140
Lys Lys Asp Ser Arg Tyr Ser Glu Lys Asp Ala Ala Val Val Val Arg
145                 150                 155                 160
Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Glu Cys His Leu His Gly Leu Val His
                165                 170                 175
Arg Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Lys Ser Thr Lys Glu Asp
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Asp Phe Ile Arg Pro
        195                 200                 205
Gly Lys His Phe Arg Asp Ile Val Gly Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro
    210                 215                 220
Glu Val Leu Lys Arg Lys Ser Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile
225                 230                 235                 240
Gly Val Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Arg Arg Pro Phe Trp Asp
                245                 250                 255
Lys Thr Glu Asp Gly Ile Phe Lys Glu Val Leu Lys Asn Lys Pro Asp
            260                 265                 270
Phe Arg Arg Lys Pro Trp Pro Asn Ile Thr Pro Cys Ala Lys Asp Phe
        275                 280                 285
Val Gln Lys Leu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala
    290                 295                 300
Gln Ala Leu Ser His Glu Trp Val Arg Glu Gly Gly Gln Ala Ser Asp
305                 310                 315                 320
Ile Pro Leu Asp Ile Ser Val Leu His Asn Met Arg Gln Phe Val Lys
                325                 330                 335
Tyr Ser Arg Phe Lys Gln Phe Ala Leu Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu
            340                 345                 350
Asn Ala Glu Glu Leu Ser Asp Leu Arg Asp Gln Phe Asn Ala Ile Asp
        355                 360                 365
Val Asp Lys Asn Gly Thr Ile Ser Leu Glu Glu Leu Lys Gln Ala Leu
    370                 375                 380
Ala Lys Asp Val Pro Trp Arg Leu Lys Gly Pro Arg Val Leu Glu Ile
385                 390                 395                 400
Val Glu Ala Ile Asp Ser Asn Thr Asp Gly Leu Val Asp Phe Glu Glu
                405                 410                 415
Phe Val Ala Ala Thr Leu His Val His Gln Leu Val Glu His Asp Thr
            420                 425                 430
Glu Lys Trp Lys Ser Leu Ser Gln Ala Ala Phe Asp Lys Phe Asp Val
        435                 440                 445
Asp Gly Asp Gly Tyr Ile Thr Ser Asp Glu Leu Arg Met Gln Thr Gly
    450                 455                 460
Leu Lys Gly Ser Ile Asp Pro Leu Leu Glu Glu Ala Asp Ile Asp Arg
465                 470                 475                 480
Asp Gly Lys Ile Ser Leu Asp Glu Phe Arg Arg Leu Leu Lys Thr Ala
                485                 490                 495
Ser Met Ser Ser Arg Asn Val Gln Thr Pro Arg Ser Val His Arg Ser
            500                 505                 510
<210>26
<211>1689
<212>DNA
<213>大豆
<400>26
atgggcctct gtttctcctc caccaaggtc agcggctcca gcagcaacaa caacaacaac     60
aacaacgcct catccaaccg taaccgcaaa tgttcggccg cgccggcggc tgcagcgccg   120
ccggagccgg tgacgccgca gaagaaacaa ccgtcgcagg ctcaacggcg gcgagtgcca   180
gaggagtcgc ggaagaaccc acgcgccaaa gacaaagcgg gtgcgcgtcg gcaagggaca   240
cgtgttccgt gcggaaagcg aacggatttc gggtacgaga aagacttcga gaatagattc   300
tcgctcggga aattgttggg acatggacaa ttcggttaca cctacgttgg aattgacaaa   360
aaaaatgggg accgtgtcgc ggttaagaga ctagagaaga gcaagatggt tctccccatt   420
gcggttgagg atgttaagcg agaagtcaag atattgaaag aacttacagg ccatgaaaat   480
gtggttcagt tctttaatgc ttttgaggat gattcatatg tgtacatagt tatggagtta   540
tgtgagggtg gagaactgct agatcggata ttggccaaga aggacagtcg ttatactgaa   600
aaagatgcag ctgtggttgt aaggcagatg ctaaaggttg cggctgagtg tcatttacat   660
gggttggtac accgggacat gaaaccagag aattttcttt tcaagtcaac caaagaagat   720
tcacctttaa aggctaccga ttttggtttg tctgatttca taaaacctgg aaagaggttt   780
caagatattg ttggcagtgc ttactatgtt gcaccagaag tgttaaaacg taagtcaggt   840
cccgagtcgg atgtatggag tattggtgtg attacataca tattgctttg tgggagacgc   900
ccattttggg ataagacaga ggatggtatc ttcaaggagg tcttacggaa caagccggat   960
ttccggcgga aaccatggcc tactataagc aatgctgcaa aagattttat gaagaaattg   1020
ttggtaaaag atcctcgtgc gagatatgct gctgctcagg ctctttcaca tccatgggtt   1080
agagaaggag gagaggcatt agagattcct attgatatat ctgtcctgaa caacatgcga   1140
cagtttgtga aatatagtcg gttgaaacaa tttgcactaa gggcattggc tagcacactt   1200
aatgaaggag agttgtctga tctaaaagat cagtttgatg caatagatgt ggacaaaaat   1260
ggttctatta gtcttgagga gatgagacag gctcttgcta aagatcaacc ttggaagttg   1320
aaagaatcac gtgtgctaga gatattgcaa gcgatagaca gcaacacaga tgggctagtg   1380
gatttcaccg agtttgtggc agctacttta catgtacatc aattggagga acatgattct   1440
gacaagtggc agcaacggtc acaggctgct tttgagaaat ttgacttgga taaggatggc   1500
tatattactc cagatgaact tagaatgcat acgggtttga gaggctccat tgatccattg   1560
cttgaggaag ccgatactga taaagatggg aaaatcagct taccagaatt tcgtagactt   1620
ctaagaactg caagcatggg ttctcgaaca gtaatgagcc caagtcaccg tcatcatcga   1680
aagatttag                                                           1689
<210>27
<211>562
<212>PRT
<213>大豆
<400>27
Met Gly Leu Cys Phe Ser Ser Thr Lys Val Ser Gly Ser Ser Ser Asn
1               5                   10                  15
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ala Ser Ser Asn Arg Asn Arg Lys Cys Ser
            20                  25                 30
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Pro Glu Pro Val Thr Pro Gln Lys
        35                  40                  45
Lys Gln Pro Ser Gln Ala Gln Arg Arg Arg Val Pro Glu Glu Ser Arg
    50                  55                  60
Lys Asn Pro Arg Ala Lys Asp Lys Ala Gly Ala Arg Arg Gln Gly Thr
65                  70                  75                  80
Arg Val Pro Cys Gly Lys Arg Thr Asp Phe Gly Tyr Glu Lys Asp Phe
                85                  90                  95
Glu Asn Arg Phe Ser Leu Gly Lys Leu Leu Gly His Gly Gln Phe Gly
            100                 105                 110
Tyr Thr Tyr Val Gly Ile Asp Lys Lys Asn Gly Asp Arg Val Ala Val
        115                 120                 125
Lys Arg Leu Glu Lys Ser Lys Met Val Leu Pro Ile Ala Val Glu Asp
    130                 135                 140
Val Lys Arg Glu Val Lys Ile Leu Lys Glu Leu Thr Gly His Glu Asn
145                 150                 155                 160
Val Val Gln Phe Phe Asn Ala Phe Glu Asp Asp Ser Tyr Val Tyr Ile
                165                 170                 175
Val Met Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Ala
            180                 185                 190
Lys Lys Asp Ser Arg Tyr Thr Glu Lys Asp Ala Ala Val Val Val Arg
        195                 200                 205
Gln Met Leu Lys Val Ala Ala Glu Cys His Leu His Gly Leu Val His
    210                 215                 220
Arg Asp Met Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Lys Ser Thr Lys Glu Asp
225                 230                 235                 240
Ser Pro Leu Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Asp Phe Ile Lys Pro
                245                 250                 255
Gly Lys Arg Phe Gln Asp Ile Val Gly Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro
            260                 265                 270
Glu Val Leu Lys Arg Lys Ser Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ile
        275                 280                 285
Gly Val Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Arg Arg Pro Phe Trp Asp
    290                 295                 300
Lys Thr Glu Asp Gly Ile Phe Lys Glu Val Leu Arg Asn Lys Pro Asp
305                 310                 315                 320
Phe Arg Arg Lys Pro Trp Pro Thr Ile Ser Asn Ala Ala Lys Asp Phe
                325                 330                 335
Met Lys Lys Leu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ala Arg Tyr Ala Ala Ala
            340                 345                 350
Gln Ala Leu Ser His Pro Trp Val Arg Glu Gly Gly Glu Ala Leu Glu
        355                 360                 365
Ile Pro Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Asn Met Arg Gln Phe Val Lys
    370                 375                 380
Tyr Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ala Leu Arg Ala Leu Ala Ser Thr Leu
385                 390                 395                 400
Asn Glu Gly Glu Leu Ser Asp Leu Lys Asp Gln Phe Asp Ala Ile Asp
                405                 410                 415
Val Asp Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Glu Glu Met Arg Gln Ala Leu
            420                 425                 430
Ala Lys Asp Gln Pro Trp Lys Leu Lys Glu Ser Arg Val Leu Glu Ile
    435    440    445
Leu Gln Ala Ile Asp Ser Asn Thr Asp Gly Leu Val Asp Phe Thr Glu
    450                 455                 460
Phe Val Ala Ala Thr Leu His Val His Gln Leu Glu Glu His Asp Ser
465                 470                 475                 480
Asp Lys Trp Gln Gln Arg Ser Gln Ala Ala Phe Glu Lys Phe Asp Leu
                485                 490                 495
Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Thr Pro Asp Glu Leu Arg Met His Thr Gly
            500                 505                 510
Leu Arg Gly Ser Ile Asp Pro Leu Leu Glu Glu Ala Asp Thr Asp Lys
        515                 520                 525
Asp Gly Lys Ile Ser Leu Pro Glu Phe Arg Arg Leu Leu Arg Thr Ala
    530                 535                 540
Ser Met Gly Ser Arg Thr Val Met Ser Pro Ser His Arg His His Arg
545                 550                 555                 560
Lys Ile
<210>28
<211>44
<212>RNA
<213>未知
<220>
<223>引物
<400>28
cgacuggagc acgaggacac ugacauggac ugaaggagua gaaa                       44
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物
<400>29
cgactggagc acgaggacac tga                                               23
<210>30
<211>26
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物
<400>30
ggacactgac atggactgaa ggagta    26
<210>31
<211>28
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物
<400>31
tagcaagagc ctgtctcatc tcctcaag                                          28
<210>32
<211>28
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物
<400>32
tgctagccaa tgcccttagt gcaaattg                                          28

Claims (25)

1、一种双链RNA分子，包含：i)第一链，包含与CDPK-样基因的一部分基本上相同的序列；和ii)第二链，包含与第一链基本上互补的序列，其中所述CDPK-样基因的一部分来自选自下组的多核苷酸：
a)包含SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)包含具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；
f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的生物活性部分；
g)在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，该多核苷酸包含具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和
h)在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，该多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少连续100个核苷酸、或至少200个连续核苷酸。
2、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26限定的序列。
3、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸与具有SEQ IDNO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有70％序列同一性。
4、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽。
5、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸编码与具有SEQID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有70％序列同一性的多肽。
6、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸杂交。
7、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽的生物活性部分的片段。
8、双链RNA分子库，其包含多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸：
a)包含SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、或27中限定的序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有90％序列同一性的多核苷酸；和
d)编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有90％序列同一性的多肽的多核苷酸。
9、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列。
10、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸与具有SEQID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有90％序列同一性。
11、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽。
12、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽有90％序列同一性的多肽。
13、一种转基因植物，其能够表达与CDPK样基因的一部分基本上相同的双链RNA，其中所述CDPK样基因的一部分来自选自下组的多核苷酸：
a)包含SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)包含具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；
f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的生物活性部分；
g)在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，该多核苷酸包含具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和
h)在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，该多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少连续100个核苷酸、或至少200个连续核苷酸。
14、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述双链RNA包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸的一部分：
a)包含SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有90％序列同一性的多核苷酸；和
d)编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有90％序列同一性的多肽的多核苷酸。
15、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、香蕉、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、四季豆、利马豆、豌豆和烟草。
16、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是大豆。
17、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列。
18、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸与具有SEQID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有70％的序列同一性。
19、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽。
20、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽有70％序列同一性的多肽。
21、一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物能够表达抑制该植物中CDPK样基因表达的双链RNA，所述方法包括下列步骤：i)制备具有与CDPK样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成双链转录物；ii)用所述核酸转化受体植物；iii)产生所述受体植物的一个或多个转基因后代；和iv)选择表达所述转录物的后代，
其中所述CDPK样基因的一部分是选自下组中的多核苷酸：
a)包含SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)包含具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；
f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的生物活性部分；
g)在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，该多核苷酸包含具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和
h)在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，该多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少连续100个核苷酸、或至少200个连续核苷酸。
22、如权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA包含多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24核苷酸的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸：
a)包含SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中限定的序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中限定的序列的多核苷酸有90％序列同一性的多核苷酸；和
d)编码与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中所限定序列的多肽有90％序列同一性的多肽的多核苷酸。
23、如权利要求21所述的方法，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、香蕉、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、四季豆、利马豆、豌豆和烟草。
24、如权利要求21所述的方法，其中所述植物是大豆。
25、如权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA在植物根或合胞体中表达。
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