CN113046375B

CN113046375B - SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中的应用

Info

Publication number: CN113046375B
Application number: CN202110546583.8A
Authority: CN
Inventors: 王娟; 李宁; 郭斌; 王柏柯; 胡佳蕙; 杨涛; 王强; 余庆辉
Original assignee: HORTICULTURE INSTITUTE OF XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: HORTICULTURE INSTITUTE OF XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-05-19
Also published as: ZA202202342B; CN113046375A

Abstract

本发明公开一种潘那利番茄SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中及创制耐旱番茄材料的应用。以潘那利番茄叶片cDNA为模板扩增SpCPK33基因的开放阅读框序列，获得的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，它包含1578碱基对，SpCPK33基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码525个氨基酸，如序列表SEQ ID NO:3所示。同时对该SpCPK33基因的耐旱表型及其在干旱条件下的生理指标进行了观察与分析，进一步证实了该基因的耐旱能力，揭示了SpCPK33在耐旱过程中的分子机制。

Description

SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及潘那利番茄SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中及创制耐旱番茄材料的应用。

背景技术

植物的每一个发育阶段都可能面临环境胁迫，如盐、旱、高低温、营养缺乏等。干旱是导致作物产量下降并严重影响世界农业发展的重要因素之一。据统计，世界主要作物的产量因干旱胁迫造成的损失可能达到甚至超过50％。全球气候变暖预示着未来平均地表温度上升和干旱的加剧，加之土壤退化和人类活动造成的可耕地面积减少，将给未来的农业生产带来巨大的压力。如何应对干旱胁迫已成为作物增产过程中亟待解决的问题。

植物不能通过移动来避免逆境，因此在长期进化过程中形成了一系列调控机制应对不利生长环境。越来越多的证据表明，在非生物胁迫下，钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK/CPK)途径信号通路发挥着积极的作用。CDPKs是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有4个(或5个)具明显特征的结构域组成，包括N端可变区、催化域、结合域及类钙调蛋白结构域(包括钙离子结合EF手型区，也称C端可变区)。

越来越多的证据表明，CPK能够响应干旱胁迫。研究发现，在聚乙二醇(PEG-6000)模拟的干旱胁迫下，过表达水稻OsCPK9的转基因水稻通过渗透调节诱导气孔关闭，提高干旱耐受性及花粉活力和穗育性。过表达野生葡萄VaCPK20的转基因拟南芥，对干旱胁迫具有高度的耐受性；干旱胁迫下，蚕豆VfCPK1在叶表皮中转录本数量显著增加。此外，CPK还可以参与调节抗氧化剂的产生和渗透调节物质的动态平衡，以应对干旱胁迫。如AtCPK8通过调节保卫细胞的气孔运动和H₂O₂的内稳态，以响应细胞内的Ca²⁺浓度变化。Ca²⁺作为植物信号转导途径中的第二信使，其游离态几乎参与植物所有的生长发育过程。而作为Ca²⁺信号响应组分的CDPK通过对下游组分的磷酸化传递信号，在植物生长发育以及多种胁迫响应过程中发挥积极作用。干旱胁迫下，气孔关闭是阻止水分流失的重要机制，有很多CDPKs参与了气孔运动的调节。如在拟南芥中，CPK13与KAT1和KAT2以及其他K⁺转运蛋白相互作用，通过内向K⁺通道驱动K⁺摄入，使得气孔开启；K⁺的摄入以及阴离子(如Cl^-和NO₃ ^-)的积累，能增加保卫细胞的渗透压，使保卫细胞吸水膨胀，促使气孔开放。而AtCPK8则通过与AtCAT3作用参与ABA调控的气孔关闭，通过抑制保卫细胞的内向K⁺通道活动从而响应干旱胁迫。此外，大量实验证明CPK10与HSP1之间存在相互作用，并参与调控保卫细胞的内向K⁺通道。而AtCPK21、AtCPK23通过磷酸化激活下游阴离子通道蛋白SLAC1，进而响应干旱胁迫。外源添加ABA后，能抑制拟南芥过表达CPK10的转基因株系叶片的气孔开度。在水稻中，Almadanim等利用磷酸化蛋白质组学方法确定了OsCPK17在水稻内存在6个潜在互作组分，其中，OsCPK17以钙依赖的方式磷酸化OsSPS4(蔗糖磷酸合成酶)和OsPIP2；1/OsPIP2；6(水通道蛋白)，从而参与干旱胁迫的响应。

目前，现有的一些番茄种质经过长期高压选择，其遗传基础已经变得十分狭窄。在极端的气候条件下，这将使番茄的损失变得更为严重。因此，发掘和利用野生种质资源的有益基因对阐明基因功能、创新番茄育种材料，解析番茄抗旱分子机理、提高番茄耐旱性具有重要的意义。潘那利番茄(Solanum pennellii Correll)多分布于干旱的河床与岩石斜坡，经过自然界长期逆境筛选，对干旱环境产生了较强的耐受力，且积累了丰富的耐旱基因资源。随着S.pennellii基因组测序结果的发表，使研究者们能够快速识别、鉴定与耐旱性相关的候选基因，为解析番茄耐旱的分子机制提供了理想的实验模型。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供一种潘那利番茄SpCPK33基因及其编码蛋白在调控耐旱性中的应用。本发明以300mmol/L甘露醇处理的潘那利番茄和栽培番茄品种‘M82’为材料，通过转录组测序技术筛选到一个表达量发生显著变化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，随后在https://solgenomics.net/比对发现其定位于12号染色体上(Sopen12g001040)，与拟南芥AtCPK33高度同源，故命名为SpCPK33。构建pGEX-4T-1-SpCPK33原核表达载体，检测其重组蛋白表达情况，分析其重组菌株在细菌E.coli中的功能，初步验证了SpCPK33的耐旱功能；随后构建pSUP1300-SpCPK33-GFP植物双元表达载体，利用转基因的方法，将该基因转至栽培番茄品种‘M82’中，获得转基因材料，并对该基因的耐旱表型及其在干旱条件下的生理指标进行了观察与分析，进一步证实了该基因的耐旱能力，揭示了SpCPK33在耐旱过程中的分子机制。

本发明的技术方案：一、一种调控番茄耐旱性的蛋白激酶基因SpCPK33，其cDNA序列核如SEQ ID NO:1所示。

二、一种调控番茄耐旱性的蛋白激酶基因SpCPK33，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

三、一种调控番茄耐旱性的蛋白激酶基因SpCPK33的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO:3所示。

四、一种调控番茄耐旱性的蛋白激酶基因SpCPK33的克隆方法，该克隆方法如下：检索Sol Genomics Network数据库，根据序列库中提供的序列，Sopen12g001040，以此为基础设计特异引物，以潘那利番茄叶片cDNA为模板进行扩增，扩增体系和扩增条件如下表；PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收目的片段后连接pMD-19-T载体，并转化E.coli DH5α感受态，菌落PCR验证后送测，测序结果如SEQ ID NO:1所示；生物信息学分析显示，该基因编码525个氨基酸，如SEQ ID NO:3所示；

其中，所述特异性引物为：SpCPK33-F：5’-ATGGGTGTTTGTTTGAGCAAA-3’，如SEQ IDNO:9所示，SpCPK33-R：5’-CCAGGCAAGCTCTTCTAA-3’，如SEQ ID NO:10所示。

五、一种调控番茄耐旱性的蛋白激酶基因SpCPK33原核表达载体构建方法及重组蛋白的获得，以潘那利番茄叶片cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR扩增获得目的片段，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收目的片段，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pGEX-4T-1空载，并与目的片段进行连接构建原核表达载体；利用热激法转化T5-Zero感受态细胞，对单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆；pGEX-4T-1载体选择性标记基因为氨苄霉素，提取PCR阳性克隆质粒进行测序验证，获得SpCPK33基因的原核表达载体为pGEX-4T-1-SpCPK33；以重组质粒转化E.coli Transetta感受态，利用0.5mmol/L的IPTG诱导表达融合蛋白，SDS-PAGE电泳和western-blot分析后，获得与预期大小一致的蛋白条带，表明重组蛋白pGEX-4T-1-SpCPK33能够正确表达，其中，所述特异性引物为：SpCPK33-4T-1-F：5’-CGGGATCCGGTGTTTGTTTGAGCAA-3’(SEQ ID NO:4)和SpCPK33-4T-1-R：5’-CCCTCGAGTTAGAAGAGCTTGCCTG-3’(SEQ ID NO:5)。

六、为探究SpCPK33在响应干旱胁迫中的功能，本发明利用细菌生长曲线的方法分析了在E.coli中异源表达SpCPK33对其耐旱性的影响；比较了在不同浓度甘露醇(模拟干旱)胁迫下，重组蛋白Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33与对照菌株蛋白Transetta::pGEX-4T-1的生长情况；随着甘露醇浓度增加，干旱胁迫逐渐严重，菌株生长速度逐渐降低，但重组菌在胁迫下比对照菌株生长状况更好，说明SpCPK33蛋白的表达增强了E.coli对干旱胁迫的耐受性。

七、本发明同时利用滴板法对SpCPK33的功能进行进一步验证，将对照菌株Transetta::pGEX-4T-1和重组菌株Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33经IPTG诱导后，在含有400mmol/L甘露醇的LB固体平板培养基上滴5μL菌液，待菌液吸收后，37℃倒置过夜培养；观察比较菌斑的大小及生长情况，对SpCPK33的原核重组蛋白的耐旱能力进行验证。

八、一种调控番茄耐旱性的蛋白激酶基因SpCPK33植物过表达载体构建方法及转基因番茄植株的获得；以潘那利番茄叶片cDNA为模板，利用特异性扩增引物，通过Phanta酶进行PCR扩增获得目的片段，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收目的片段，用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切pSUP1300-GFP空载，并与目的片段进行连接构建过表达载体；利用热激法转化T5-Zero感受态细胞，对单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆；pSUP1300-GFP载体选择性标记基因为卡那霉素，提取PCR阳性克隆质粒进行测序验证，获得SpCPK33基因的重组过表达载体为pSUP1300-SpCPK33-GFP；将pSUP1300-SpCPK33-GFP重组质粒导入农杆菌GV3101中，得到含有目的片段的过表达载体农杆菌；利用农杆菌侵染叶片；诱导愈伤组织，经卡那霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；获得阳性转基因株系T0代，提取基因组DNA，对过表达植株进行检测；设计特异性检测引物，对目的片段进行PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果筛选过表达株系，并利用T2代植株进行干旱表型观察和检测；其中，上述方法中特异性扩增引物为：SpCPK33-1300-F：5’-GCTCTAGAATGGGTGTTTGTTTGAGCAAA-3’(SEQ ID NO:6)和SpCPK33-1300-R：5’-GGGGTACCGAAGAGCTTGCCTGGTTGTTTA-3’(SEQ ID NO:7)；其中，上述方法中所述特异性检测引物对，该引物对分别为：SpCPK33-1300-F：5’-GCTCTAGAATGGGTGTTTGTTTGAGCAAA-3’(SEQ ID NO:6)和GFP-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(SEQ ID NO:8)。

上述方法中，所述转基因番茄的耐旱性高于对照野生型番茄品种‘M82’，体现在如下①～④中任一种：①转基因番茄株系的存活叶片数高于野生型番茄；②转基因番茄株系的渗透调节物质(脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱)高于野生型番茄；③转基因番茄株系的ROS系统(MDA、H₂O₂、O^2-)的含量低于野生型番茄；④转基因番茄株系的抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)高于野生型番茄。

有益效果：本发明利用转录组测序分析从潘那利番茄中克隆获得了SpCPK33(Sopen12g001040)基因，并研究了其功能。该基因cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，它包含1578个碱基对；其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，它包含3599个碱基对；其氨基酸编码区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，它包含525个氨基酸，具有典型的保守结构域，与拟南芥、马铃薯、辣椒、烟草等植物中CPKs同源性较高，暗示其可能在番茄耐旱过程中发挥功能。

本发明根据SpCPK33基因编码区序列，分别设计了原核重组蛋白生长曲线、滴板实验及转基因实验。研究发现，SpCPK33基因能够在蛋白水平上表达，初步证实在E.coli中异源表达SpCPK33能够提高细菌对干旱的耐受性；同时，利用转基因技术获得的过表达SpCPK33的转基因番茄株系的耐旱能力高于野生型番茄植株，且能积累大量有机渗调物质，提高了抗氧化酶活性，有效缓解了胁迫下活性氧的积累，表明SpCPK33是调节番茄耐旱的正响应因子，进一步了解了番茄耐旱的调控机制，对番茄的耐旱改良具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的调控番茄耐旱性的SpCPK33基因的PCR扩增图、酶切鉴定图及菌落PCR图；图2是本发明实施例提供的pGEX-4T-1-SpCPK33重组蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析；其中A是：SDS-PAGE电泳；B是：Western blot分析；图3是本发明实施例提供的重组蛋白Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照蛋白Transetta::pGEX-4T-1在含有不同浓度的甘露醇溶液(0、200、400、600、800mmol/L的液体LB培养基)中的生长情况；图4是本发明实施例提供的重组蛋白Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照蛋白Transetta::pGEX-4T-1在含有400mmol/L甘露醇的LB固体培养基上的生长情况；图5是本发明实施例提供的过表达株系中SpCPK33基因的检测示意图；图6是本发明实施例提供的转SpCPK33基因株系在番茄耐旱过程中的表型图，其中A是：野生型及过表达株系番茄幼苗干旱胁迫处理前；B是：自然干旱15天后；C是：复水恢复7天后；D是：存活叶片数分析；图7是本发明实施例提供的干旱胁迫条件下，各转基因株系的渗透调节物质差异显著性分析，其中，A是指脯氨酸含量(μg/g鲜重)：B是指甜菜碱含量(mg/g鲜重)：C是指：可溶性糖含量(mg/g鲜重)；图8是本发明实施例提供的干旱胁迫条件下，各转基因株系的氧化酶系统及ROS积累差异显著性分析，其中A是指：O₂ ^-含量(mg/g鲜重)；B是指H₂O₂含量(μmol/g鲜重)：C是指：MDA含量(nmol/g鲜重)；D是指：SOD活性(U/g鲜重)；E是指：POD活性(U/g鲜重)；F是指：CAT活性(U/g鲜重)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为常规市售商品。

实施例1：潘那利番茄SpCPK33基因的克隆

检索Sol Genomics Network数据库，根据序列库中提供的序列(Sopen12g001040)，以此为基础设计特异引物，以潘那利番茄叶片cDNA为模板进行扩增，扩增体系和扩增条件如下表。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收目的片段后连接pMD-19-T载体，并转化E.coli DH5α感受态，菌落PCR验证后送测，测序结果如SEQ ID NO:1所示。生物信息学分析显示，该基因编码525个氨基酸，如SEQ ID NO:3所示。

所述特异性引物为：SpCPK33-F：5’-ATGGGTGTTTGTTTGAGCAAA-3’(SEQ ID NO:9)；SpCPK33-R：5’-CCAGGCAAGCTCTTCTAA-3’(SEQ ID NO:10)。

实施例2：潘那利番茄SpCPK33原核表达载体的构建及鉴定原核表达载体的构建：根据SpCPK33基因的cDNA序列设计上下游特异引物并加入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ；将测序正确的pMD-19-T-SpCPK33基因与原核表达载体pET-30a进行双酶切后进行连接转化；鉴定正确的菌株提取质粒转化BL21感受态，挑取单菌落PCR鉴定；

所述上下游特异性引物为：SpCPK33-4T-1-F：5’-CGGGATCCGGTGTTTGTTTGAGCAA-3’(SEQ ID NO:4)和SpCPK33-4T-1-R：5’-CCCTCGAGTTAGAAGAGCTTGCCTG-3’(SEQ ID NO:5)，下划线部分为酶切位点。

原核重组蛋白的表达步骤：挑取鉴定正确的转Transtta感受态的pGEX-4T-1-SpCPK33单菌落，按2％比例分别接种到1mL含氨苄霉素(50mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；次日按1％比例分别接种于50mL含氨苄霉素(50mg/L)的LB培养基中，于37℃摇床振荡培养至OD₆₀₀约0.4～0.6，取出1mL菌液作为诱导前样品；加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，至37℃培养4h，取出1mL菌液作为诱导后样品；将1mL诱导前、诱导后菌液在4℃，12000rpm离心10min；去上清，沉淀用40μL PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，加5×SDS上样缓冲液10μL，SDS-PAGE电泳和Westernblot分析融合蛋白的表达情况。

实施例3：E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33重组菌的生长曲线正常条件：菌体按1％接菌量在正常状态下培养4h后，加终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达4h，调节重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1的初始OD值一致；按1％的接菌量二次转接至含50mg/L氨苄霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min振荡培养；每隔2h取样，利用酶标仪测定菌液OD₆₀₀值。

甘露醇模拟干旱胁迫：重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1的菌体按1％接菌量在正常状态下培养4h后，加终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达4h，调节重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1的初始OD值一致；按1％的接菌量二次转接至含200、400、600、800mmol/L甘露醇的LB液体培养基中，于37℃、220r/min振荡培养；培养12h后，取菌液在测定OD₆₀₀值；为进一步说明，将重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1调初始OD值一致后，按1％的接菌量二次转接至含200、400、600、800mmol/L甘露醇的LB液体培养基中，于37℃、220r/min振荡培养；每隔2h取样，测定OD₆₀₀值，整理记录结果，绘制细菌生长曲线。

实施例4：利用滴板法初步验证SpCPK33的耐旱功能

重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1的菌体按1％接菌量在正常状态下培养4h后，加终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达4h，调节重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1的初始OD₆₀₀值一致；用LB液体培养液对菌液进行梯度稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍；各取5μL菌液依次滴加到LB固体培养基(对照)、含有400mmol/L甘露醇的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h后，拍照观察重组菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1-SpCPK33和对照菌E.coli Transetta::pGEX-4T-1的生长差异，如图4。

实施例5：潘那利番茄SpCPK33植物双元表达载体的构建及鉴定植物双元表达载体的构建：根据SpCPK33基因的cDNA序列设计上下游特异引物并加入酶切位点KpnⅠ和XbaⅠ；将测序正确的pMD-19-T-SpCPK33基因与植物双元表达载体pSUP1300-GFP进行双酶切后进行连接转化；pSUP1300载体选择性标记基因为卡那霉素，提取PCR阳性克隆质粒进行测序验证，获得SpCPK33基因的重组表达载体为pSUP1300-SpCPK33-GFP；将鉴定正确pSUP-SpbHLH89-GFP菌株提取质粒导入农杆菌中GV3101中，得到含有目的片段的过表达载体农杆菌；利用农杆菌侵染叶片；诱导愈伤组织，经卡那霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；提取获得的阳性转基因T0代株系基因组DNA，在插入位点的两侧设计检测引物对，对过表达植株进行检测；根据电泳结果筛选过表达株系，并利用T2代植株进行干旱表型观察和检测；其中，上述方法中特异性扩增引物为：SpCPK33-1300-F：5’-GCTCTAGAATGGGTGTTTGTTTGAGCAAA-3’(SEQ ID NO:6)和SpCPK33-1300-R：5’-GGGGTACCGAAGAGCTTGCCTGGTTGTTTA-3’(SEQ IDNO:7)，下划线部分为酶切位点；其中，上述方法中所述特异检测引物对，该引物对分别为：SpCPK33-1300-F：5’-GCTCTAGAATGGGTGTTTGTTTGAGCAAA-3’(SEQ ID NO:6所示)和GFP-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(SEQ ID NO:8所示)。

实施例6：过表达SpCPK33转基因番茄植株的耐旱功能鉴定表型及存活叶片数统计：将T2代转基因番茄株系(OE3、OE6、OE9)及野生型番茄‘M82’种子于4℃同步春化3d，16h光照/8h黑暗，25℃培养3-4周，选择长势一致的转基因植株与野生型植株，进行自然干旱处理；每天观察记录植株表型；待植株严重缺水导致萎蔫后，恢复浇水处理24h后观察植株恢复情况，7d后记录植株存活叶片数(同支的羽状复叶算一片真叶)；耐旱生理指标测定：待植株长至4w时，选取长势一致的植株进行干旱胁迫处理；将300mmol/L甘露醇溶液(用1/2Hoagland营养液配制)从基质表层往下将育苗盆浇透(避免溅到叶片上)，确保将育苗盆中原有的水分全部置换并沥干后，将育苗盆置于盛有相应甘露醇溶液的托盘中，处理24h后采样于-80℃保存备用；以未做任何处理的植株作对照。

结合附图对本发明的应用原理做详细描述

如图1所示，SpCPK33基因(Sol Genomics登录号Sopen12g001040)，基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，它包含3599个碱基长度。本发明以潘那利番茄叶片cDNA为模板扩增SpCPK33基因的开放阅读框序列，获得的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，它包含1578碱基对，编码525个氨基酸，如SEQ ID NO:3所示。将其插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点，进而构建重组载体pGEX-4T-1-SpCPK33，并对重组质粒进行双酶切验证。如图1A及测序，通过序列比对确认SpCPK33开放阅读框克隆正确；对重组菌pGEX-4T-1-SpCPK33进行菌液PCR鉴定，特异性条带大小与目标片段一致，如图1B。

SDS-PAGE电泳结果显示，pGEX-4T-1-SpCPK33重组表达蛋白约在84kDa处有差异表达条带，如图2A；Western-blot分析显示，在约84kDa处产生单一免疫条带，与预测蛋白大小一致，表明重组蛋白pGEX-4T-1-SpCPK33能够正确表达，如图2B。

为进一步探究SpCPK33在响应非生物胁迫中的功能，本发明分析了在E.coli中异源表达SpCPK33对E.coli耐旱性的影响。比较不同浓度甘露醇胁迫下重组菌Transetta::pGEX-SpCPK33与对照菌株Transetta::pGEX-4T-1的生长情况；随着甘露醇浓度增加，干旱胁迫逐渐严重，菌株生长速度逐渐降低，但重组菌在胁迫下比对照菌株生长状况更好，如图3；说明pGEX-4T-1-SpCPK33重组蛋白的表达增强了E.coli对干旱胁迫的耐受性。

为检测干旱胁迫条件下过表达SpCPK33对E.coli的作用，将重组菌Transetta::pGEX-SpCPK33和对照菌株Transetta::pGEX-4T-1分别滴加到含有400mmol/L甘露醇的LB固体培养基上，通过细菌滴板实验观察干旱胁迫条件下菌株之间的生长表型差异；结果显示：在LB固体培养基中，重组菌和对照菌在菌落形成数方面没有明显的差别，如图4A；在400mmol/L甘露醇胁迫条件下，重组菌Transetta::pGEX-SpCPK33菌落数明显高于对照菌Transetta::pGEX-4T-1，如图4B。

通过外植体分化、卡那霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性单株3个，分别为OE3、OE6、OE9。利用PCR鉴定3个番茄转基因株系，获得约2100bp的特异性条带(SpCPK33+GFP)，如图5A，表明pSUP1300-SpCPK33-GFP重组质粒已整合到番茄基因组中；利用qRT-PCR分析发现，与野生型番茄‘M82’相比，转基因番茄植株中SpCPK33的表达量显著提高，如图5B。

利用过表达SpCPK33转基因番茄3个株系(OE3、OE6和OE9)的T2代苗期植株进行了自然干旱处理。本发明结果显示，非胁迫条件下，转基因株系与野生型生长情况相一致，如图6A，但自然干旱处理15d后，所有植株叶片均萎蔫变黄，其中野生型番茄植株整体萎蔫较严重，三个转基因株系较轻，如图6B；复水7d后，转基因株系OE3和OE6植株叶片均能恢复生长，转基因株系OE9部分植株也能恢复生长，而野生型植株对照未能恢复生长，如图6C；通过统计学分析，三个转基因株系复水处理后叶片存活数均显著高于野生型植株，如图6D；结果显示，在番茄中过表达SpCPK33基因能增强了番茄的抗旱性。

干旱胁迫下，SpCPK33基因与渗透调节物质、ROS积累及氧化酶系统相关性验证以甘露醇模拟干旱逆境，浇灌番茄幼苗，检测植株对甘露醇的响应。根据试剂盒的方法分别检测渗透调节物质(脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖)，如附图7所示、ROS积累(MDA、H₂O₂、O^2-)如附图7所示，及氧化酶系统(SOD、CAT、POD)的含量及活性，发现过表达SpCPK33的转基因株系能够显著增高渗透调节能力、氧化酶活性增加及清除ROS能力增强，表明SpCPK33能够提高番茄植株的耐旱能力，如附图8所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业科学院园艺作物研究所

<120> SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中的应用

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 蛋白激酶基因SpCPK33的cDNA基因

<400> 1

atgggtgttt gtttgagcaa aagtaaacca acagagtgta agtctagtgg gcatcataga 60

tcaggtggga gtgatggggg aagggggcat catcacggaa cccatcaaac tcaaattcag 120

tatactaaat cagcaggccc agaaactcaa ttacccatga gaactcaagc aagtcctaaa 180

ccagtagaaa ccattttggg caaggcattt gaagatgtta aggcacacta tacactaggt 240

aaagaattgg gtagaggtca atttggggtt acatttcttt gtactgaaat atcaagtggt 300

catcaatatg cttgtaagtc aatatcaaag aagaaacttg ttactaaatc tgataaagct 360

gatatgagaa gagagattca gattatgcag catttgagtg gacaaccaaa tatagttgca 420

tttaaaggtg cttatgagga taagaattca gtgcgtcttg ttatggagtt gtgtgctggt 480

ggagagttat ttgataggat catagctaag ggtcattaca ctgaaagagc tgctgcatca 540

atgtgtagag ctattgttaa tgttgtacat gtttgccatt ttatgggtgt tatgcatcgt 600

gatcttaagc ctgagaactt tctcttgtca gacaagagtg aaaatgctgc tttgaaggca 660

acagattttg ggctgtctat gttcattgaa gaaggtaagg tgtacaagga tattgttggg 720

agtgcttact atgttgcccc agaagtgttg cgtaagagtt atggcaagga aatagatgtt 780

tggagtgcag gtgttatgtt gtatatacta cttagtggtg tgcctccgtt ttgggcagaa 840

accgagagag gtatatttga tgccatatta aaagaagaca ttgactttga aagtcaacct 900

tggccctcta tcacaactag tgccaaggac ctggtccgaa agatgctcaa taaagaccca 960

aagcaacgta tttctgctgc tcaagttctt gatcatcctt ggctcaaggt aggtggagta 1020

gcatcagata aaccattaga taatgctgtc ctctcaagaa tgaagcaatt cagagctatg 1080

aacaaactca agagacttgc tttaaaggtc attgctgaga atctctcagc agatgaaatt 1140

caggggctca aatcaatgtt ccataacatt gacactgata atagtggaac aatcacttat 1200

gaagaattga acagcggatt ggccagactt ggatcaaagc tcaccgaggc ggaagtaaag 1260

caattgatgg aagctgctga tgtggatgga aatggctcga tcgactatat tgagttcatc 1320

actgccacca tgcataaaca tagactagaa agatatgaaa atctatacaa agcatttcag 1380

tatttcgata aagatggtag cgggttcatt acaagagatg aactcgaaac atctatggaa 1440

gagcatggaa taggtgatcc agctagtata agggaaataa tatctgaagt ggacgctgat 1500

aatgatggaa gaatcaacta tgaggaattt tgtacaatgg tgacaagtgg agctaaacaa 1560

ccaggcaagc tcttctaa 1578

<210> 2

<211> 3599

<212> DNA

<213> 蛋白激酶基因SpCPK33核苷酸

<400> 2

ataattataa ttatgaataa tttagtacgc gaatcaaaat gaagttttat aattatgggt 60

tgtaacaacc aacctcaaaa aaaatttatc ctttccaaag aaatctcttc ttttctcctc 120

ttttttagta cctttgtcag tggttataca ctgtttatgc tgaccaatgt ttcagtgttg 180

ttaactttcc ccataagatt caatccaact cattaaggac aattttagat atattaacaa 240

ttccaatcta gaatcttgaa taattcctta aaaagtgttt cttttttttt gaataaaaat 300

ccaatctttt tgtgtatcac ttatatggtg tctttaactt ttagattctt gaatctccat 360

ctggggttgt tgttttcttg atttctggat ctgctgagat aaatgggtgt ttgtttgagc 420

aaaagtaaac caacagagtg taagtctagt gggcatcata gatcaggtgg gagtgatggg 480

ggaagggggc atcatcacgg aacccatcaa actcaaattc agtatactaa atcagcaggc 540

ccagaaactc aattacccat gagaactcaa gcaagtccta aaccagtaga aaccattttg 600

ggcaaggcat ttgaagatgt taaggcacac tatacactag gtaaagaatt gggtagaggt 660

caatttgggg ttacatttct ttgtactgaa atatcaagtg gtcatcaata tgcttgtaag 720

tcaatatcaa agaagaaact tgttactaaa tctgataaag ctgatatgag aagagagatt 780

cagattatgc agcatttgag tggacaacca aatatagttg catttaaagg tgcttatgag 840

gataagaatt cagtgcgtct tgttatggag ttgtgtgctg gtggagagtt atttgatagg 900

atcatagcta agggtcatta cactgaaaga gctgctgcat caatgtgtag agctattgtt 960

aatgttgtac atgtttgcca ttttatgggt gttatgcatc gtgatcttaa gcctgagaac 1020

tttctcttgt cagacaagag tgaaaatgct gctttgaagg caacagattt tgggctgtct 1080

atgttcattg aagaaggtta actaactctt cattaataat tatattttac tatcctgttg 1140

ttgttactgc tatgtctttg ccaagggttt gtttgtataa actctacccc cacttatgga 1200

actataatgg atatgttgtt gtatatagca tctttgggat gagttctaat gaaatcattc 1260

catatttttg tctgctatct acatatcaga agtaattaat tgtatctatg atttctaagt 1320

ttagaagtag aggactttat ctgtttggac atatgccagc ctgctaatcc aatctaaaga 1380

tttctttact ttgtttgggt tttgtgcagg taaggtgtac aaggatattg ttgggagtgc 1440

ttactatgtt gccccagaag tgttgcgtaa gagttatggc aaggaaatag atgtttggag 1500

tgcaggtgtt atgttgtata tactacttag tggtgtgcct ccgttttggg caggtaaagt 1560

ctaagtgcat cataattatc caggactagt tgtgtttatt gttatatata aatgcagaaa 1620

ccgagagagg tatatttgat gccatattaa aagaagacat tgactttgaa agtcaacctt 1680

ggccctctat cacaactagt gccaaggacc tggtccgaaa gatgctcaat aaagacccaa 1740

agcaacgtat ttctgctgct caagttcttg gtacgctgag ttagtagcta ctatggcttt 1800

tcaaacaatt tactcctttc tacttcttac ttcatctttt gatttgcctg atgatgatag 1860

atcatccttg gctcaaggta ggtggagtag catcagataa accattagat aatgctgtcc 1920

tctcaagaat gaagcaattc agagctatga acaaactcaa gagacttgct ttaaaggtga 1980

ctctgatttc tttgctctaa ctcaatacaa ctaacgatat gtatatcaat cttccatttt 2040

attcattcac actggaacta ccattgacct atggttttgg tatcaggtca ttgctgagaa 2100

tctctcagca gatgaaattc aggggctcaa atcaatgttc cataacattg acactgataa 2160

tagtggaaca atcacttatg aagaattgaa cagcggattg gccagacttg gatcaaagct 2220

caccgaggcg gaagtaaagc aattgatgga agctgtaagg ccgagacaca tcaactgttc 2280

actttgttgt tcaaatggtg tacaccatga aataactaaa tatatcttgt caacttcagg 2340

ctgatgtgga tggaaatggc tcgatcgact atattgagtt catcactgcc accatgcata 2400

aacatagact agaaagatat gaaaatctat acaaagcatt tcagtatttc gataaagatg 2460

gtagcgggta agtccattgt gcaaatgcag cagtgtggaa ttgttaaatc agtggagttt 2520

tcttttgtat aatgcaggtt cattacaaga gatgaactcg aaacatctat ggaagagcat 2580

ggaataggtg atccagctag tataagggaa ataatatctg aagtggacgc tgataatgtg 2640

agtttggtca ctcttaaaac attccaaaaa cggtcaaacc tatcttaaca cgtattgatt 2700

ctgtaaaatt tacaggatgg aagaatcaac tatgaggaat tttgtacaat ggtgacaagt 2760

ggagctaaac aaccaggcaa gctcttctaa taacacgaat ctcctagtcg ttggaagtag 2820

tgattcttca acgtttgcat catggactgc ccatatgata tgacagacat caagtacatg 2880

aacaacctga actagttgga gcttttaact tctccctgta aattggtgat tcctgtttct 2940

gttctttttc tcactatgtt gaattgtcta ctcattagtt tttttctatt ccacaaagag 3000

cacagaggaa atgagtgaag aacataaact ctttactatt tgaatagaga aacaaatgac 3060

cttgtaaata tatcttgtgt tatgttcaag tgtttttata tgtaaaataa acatctcttg 3120

taaaaagaaa ctgaggaaca tctttcaccc acattttgtt tattgtgcct ctcctcataa 3180

tcaaatcacg ccatttgata tctagtctta ttcattgtgt tgagtgtttg tttttactct 3240

ttcttgggtg tgacttgtga attcagagta ataagacctt agtttagtta tggtgtatct 3300

ctggaggtat ttgtgactta tcccctaaaa aacctatcaa acgatgctta agtaactata 3360

cataaagatg gttctcctct tgaagctaag atcaaaccag ttgtcacagt ttacaagctg 3420

tcccacgaca actcattgga ccatggcaaa atgtgtcttg cgctacatat gtttgtgctg 3480

atccctgtgt tccactttcg catgaagcac attgaactcg gttatcattt ttgcttgatt 3540

ttcactatga atggtgtgtg tttttatatt ctgtcatata agaaaaggtg ttatgattc 3599

<210> 3

<211> 525

<212> PRT

<213> 蛋白激酶基因SpCPK33的蛋白质

<400> 3

Met Gly Val Cys Leu Ser Lys Ser Lys Pro Thr Glu Cys Lys Ser Ser

1 5 10 15

Gly His His Arg Ser Gly Gly Ser Asp Gly Gly Arg Gly His His His

20 25 30

Gly Thr His Gln Thr Gln Ile Gln Tyr Thr Lys Ser Ala Gly Pro Glu

35 40 45

Thr Gln Leu Pro Met Arg Thr Gln Ala Ser Pro Lys Pro Val Glu Thr

50 55 60

Ile Leu Gly Lys Ala Phe Glu Asp Val Lys Ala His Tyr Thr Leu Gly

65 70 75 80

Lys Glu Leu Gly Arg Gly Gln Phe Gly Val Thr Phe Leu Cys Thr Glu

85 90 95

Ile Ser Ser Gly His Gln Tyr Ala Cys Lys Ser Ile Ser Lys Lys Lys

100 105 110

Leu Val Thr Lys Ser Asp Lys Ala Asp Met Arg Arg Glu Ile Gln Ile

115 120 125

Met Gln His Leu Ser Gly Gln Pro Asn Ile Val Ala Phe Lys Gly Ala

130 135 140

Tyr Glu Asp Lys Asn Ser Val Arg Leu Val Met Glu Leu Cys Ala Gly

145 150 155 160

Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Ile Ala Lys Gly His Tyr Thr Glu Arg

165 170 175

Ala Ala Ala Ser Met Cys Arg Ala Ile Val Asn Val Val His Val Cys

180 185 190

His Phe Met Gly Val Met His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu

195 200 205

Leu Ser Asp Lys Ser Glu Asn Ala Ala Leu Lys Ala Thr Asp Phe Gly

210 215 220

Leu Ser Met Phe Ile Glu Glu Gly Lys Val Tyr Lys Asp Ile Val Gly

225 230 235 240

Ser Ala Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Arg Lys Ser Tyr Gly Lys

245 250 255

Glu Ile Asp Val Trp Ser Ala Gly Val Met Leu Tyr Ile Leu Leu Ser

260 265 270

Gly Val Pro Pro Phe Trp Ala Glu Thr Glu Arg Gly Ile Phe Asp Ala

275 280 285

Ile Leu Lys Glu Asp Ile Asp Phe Glu Ser Gln Pro Trp Pro Ser Ile

290 295 300

Thr Thr Ser Ala Lys Asp Leu Val Arg Lys Met Leu Asn Lys Asp Pro

305 310 315 320

Lys Gln Arg Ile Ser Ala Ala Gln Val Leu Asp His Pro Trp Leu Lys

325 330 335

Val Gly Gly Val Ala Ser Asp Lys Pro Leu Asp Asn Ala Val Leu Ser

340 345 350

Arg Met Lys Gln Phe Arg Ala Met Asn Lys Leu Lys Arg Leu Ala Leu

355 360 365

Lys Val Ile Ala Glu Asn Leu Ser Ala Asp Glu Ile Gln Gly Leu Lys

370 375 380

Ser Met Phe His Asn Ile Asp Thr Asp Asn Ser Gly Thr Ile Thr Tyr

385 390 395 400

Glu Glu Leu Asn Ser Gly Leu Ala Arg Leu Gly Ser Lys Leu Thr Glu

405 410 415

Ala Glu Val Lys Gln Leu Met Glu Ala Ala Asp Val Asp Gly Asn Gly

420 425 430

Ser Ile Asp Tyr Ile Glu Phe Ile Thr Ala Thr Met His Lys His Arg

435 440 445

Leu Glu Arg Tyr Glu Asn Leu Tyr Lys Ala Phe Gln Tyr Phe Asp Lys

450 455 460

Asp Gly Ser Gly Phe Ile Thr Arg Asp Glu Leu Glu Thr Ser Met Glu

465 470 475 480

Glu His Gly Ile Gly Asp Pro Ala Ser Ile Arg Glu Ile Ile Ser Glu

485 490 495

Val Asp Ala Asp Asn Asp Gly Arg Ile Asn Tyr Glu Glu Phe Cys Thr

500 505 510

Met Val Thr Ser Gly Ala Lys Gln Pro Gly Lys Leu Phe

515 520 525

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgggatccgg tgtttgtttg agcaa 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctcgagtt agaagagctt gcctg 25

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagaat gggtgtttgt ttgagcaaa 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggtaccga agagcttgcc tggttgttta 30

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcttgtaca gctcgtccat gcc 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgggtgttt gtttgagcaa a 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccaggcaagc tcttctaa 18

Claims

1. SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中的应用，所述SpCPK33基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；SpCPK33基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。