CN1222196A - 线虫诱导的植物基因启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供从拟南芥获得的DNA片段和该DNA片段的用途,当该DNA片段重新导入植物时,能够启动相关DNA序列的根结和孢囊线虫诱导的转录。

Description

线虫诱导的植物基因启动子

本发明涉及DNA调控序列，该序列可用于在植物细胞中表达DNA序列。本发明进一步包含嵌合DNA和细胞中含此嵌合DNA的植物，该嵌合DNA包含与植物细胞中将要表达的DNA适当连接的所述DNA调控序列。本发明进一步涉及产生对植物寄生线虫或其影响具有抗性或至少更不敏感的植物的方法，以及这样的细胞，植物和其部分。本领域情况

在国际专利申请WO 92/17054中，公开了拟南芥的线虫应答DNA调控序列的鉴定和分离方法。

在WO 92/21757中，从番茄中已分离了几种DNA调控序列，这些序列对根结线虫(南方根结线虫)产生应答。这些调节序列中一些(LEMMI’S，番茄-南方根结线虫)被线虫激活，而另外一些似乎被线虫抑制。不清楚是否任何可诱导的调控序列都被范围更广的线虫激活。

在WO 93/06710中公开了可由根结线虫(南方根结线虫)诱导的另一个调控序列。该调节序列TobRb7的缺点是，它不能被一些孢囊线虫激活，其中有异皮线虫属和球头线虫属。这使得TobRBT序列不适于在目的是例如马铃薯中孢囊线虫抗性的嵌合构建体中使用。

本发明的一个目的是提供可由孢囊和根结线虫诱导的DNA调控序列，并且该序列可用于在其调控下在线虫摄食结构内，优选地但非必须地以基本上摄食位点特异的方式表达异源DNA序列。发明概述

本发明提供从拟南芥获得的DNA片段，该片段在重新导入植物时能够启动根结和孢囊线虫诱导的相关DNA序列的转录。根据本发明优选的是SEQ ID NO:4中核苷酸1至2361代表的序列。也包括根据本发明的DNA片段的部分或变体，而这些部分或变体在重新导入植物时能够启动根结和孢囊线虫诱导的相关DNA序列的转录。发明的更进一步优选的方面包括基本上是线虫摄食位点特异的DNA调控片段。

本发明的进一步实施方案包括嵌合DNA序列，该嵌合DNA序列包含转录方向上的根据本发明的DNA调控片段和在其转录控制下的将要表达的DNA序列，并且表达在天然情况下不是在所述DNA片段转录控制下。在根据本发明的嵌合DNA序列中优选的是那些其中将要表达的DNA序列引起植物细胞破裂物质比如芽孢杆菌RNA酶的合成的DNA序列。在不同的实施方案中，细胞破裂物质包含与细胞生存必需RNA互补的RNA。在另一个实施方案中，将要表达的DNA序列引起对诱导线虫有毒的物质的合成。

本发明发现了在包含根据本发明的DNA片段或嵌合DNA序列的复制子，含这样的复制子的微生物，以及根据本发明的嵌合DNA序列掺入其基因组中的植物细胞方面的应用。进一步有用的实施方案是基本上含根据本发明的细胞的植物根系统，以及基本上含根据本发明的细胞的成熟植物，优选地双子叶植物，更优选地马铃薯。本发明也包括在根据本发明的根系统上嫁接的植物，以及组成这样的植物的植物部分，选自种子，花，块茎，根，叶，果实，花粉和木材和作物。

本发明也包括根据本发明的DNA片段在鉴定能够启动植物中相关DNA序列转录的亚片段中的应用。本发明也包括根据本发明的嵌合DNA序列在转化植物中的应用。本发明还提供根据本发明的调控DNA的片段，部分或变体在构建杂交DNA调控序列中的应用。

以下附图进一步说明本发明。

附图描述

图1．双元载体pMOG23的质粒模式图。

图2．双元载体pMOG800的质粒模式图。

图3．双元载体pMOG553的质粒模式图。

图4．双元载体pMOG819的质粒模式图。

图5．双元载体pMOG849的质粒模式图。

图6．在几个pMOG849转化的拟南芥株系的NFS外的表达方式。

图7．在线虫抗性植物操作的双组份系统中，NFS破裂基因和中和基因的图示。

图8．双元载体pMOG893的质粒模式图。

下面更详细地解释实施发明的一些方法和各种词语的含义。发明详述

本发明提供从拟南芥获得的DNA调控序列，该序列是由根结和孢囊线虫诱导的，并且在植物根的特殊线虫摄食结构内显示任何相关DNA的高度优先表达。这种线虫摄食结构被入侵线虫用作食物来源，于是线虫引起植物组织的变化，形成巨大细胞(根结线虫)或合胞体(孢囊线虫)。分离DNA调控序列的方法已在现有申请WO 92/17054中公开并要求专利权，在此引用作为参考。

通过将异源DNA放置在所述DNA调控序列控制下并用已知方法将所得的嵌合DNA序列转化植物，根据本发明的DNA调控序列原则上可用来在所选的任何植物中表达任何异源DNA。当各种根结线虫比如南方根结线虫，和孢囊线虫，比如沙氏异皮线虫和Globodera pallida(比较全面，但不是限制的目录在表2中)侵染根时，表达异源DNA。有利的是，为了产生对植物寄生线虫更不敏感的植物，异源DNA可以包含编码对植物寄生线虫有毒或抑制性的物质的基因。有许多这种毒性物质的例子，如苏云金芽孢杆菌的内毒素(例如EP0 352 052)，凝集素等。

产生对植物寄生线虫更不敏感的植物的更优选方法在于植物根的特殊摄食结构的破裂，该方法通过在根据本发明的DNA调控序列控制下表达毒害植物的物质。这种方法的基本原理已在国际专利申请WO 92/21757,WO 93/10251,WO 94/10320中公开并要求专利权，在此引用作为参考。为求一致性，毒害植物的物质将在下文中称为线虫摄食位点(NFS)破裂物质。

尽管根据本发明的DNA调控序列对线虫摄食结构基本上是特异的，但是由于非靶(即非NFS)组织中的表达，在DNA调控序列控制下NFS破裂物质对植物生存力和/或产量有副作用。此外，发现根据本发明的DNA调控序列在转化步骤中组织培养期间具有活性，使得在此期间必须使用中和物质。为了减少或消除(潜在的)副作用，所以非常优选的是使用与中和基因构建体连接的根据本发明的嵌合NFS破裂构建体。在WO 93/10251中描述了用于线虫抗性植物操作的这种所谓双组份方法的细节。根据此方法，将NFS破裂化合物(编码序列A)放在启动子控制下，该启动子至少在NFS中有活性，并且优选地在NFS外不具有或几乎没有活性，而在NFS外非期望的毒害植物作用被中和化合物(编码序列B)中和，该中和化合物至少在除NFS外的其中合成破裂物质的那些组织中表达。

根据双组份方法，适当的启动子A定义为在NFS内以足以损害NFS代谢和/或功能和/或生存力的水平启动下游编码序列表达的启动子，而该启动子应该优选地，但不必须在NFS外的组织中无活性；该启动子至少在NFS外从来不会有这样的活性水平，即编码序列A编码的破裂物质的活性不能被编码序列B的产物充分中和。

根据本发明的DNA调控序列，尤其是#1164的4,2.1和1.5kBP片段的特征使它们在双组份方法中非常有用，在此通过实施例说明。明显地，在根据本发明的DNA调控序列中可能有大量突变体如核苷酸序列的缺失，增加和变化和/或这些突变的组合，这些突变不在对其预期用途关键的方面改变这些序列的特征。所以这些突变不偏离本发明。

此外，如本领域技术人员众所周知如，在基因表达方面，植物基因调控区包含具感兴趣特征的不同亚区。此处所指的亚区例子不仅是转录增强子而且也是转录沉默子。这些元件可以以普遍(组成型)方式，或以组织特异方式起作用。如实施例中所说明的，在根据本发明的DNA调控序列中可以产生几个缺失，并且亚片段可测试相关DNA的表达方式。所获得的各种亚片段，或甚至其组合可能在线虫抗性工程的方法中，或在涉及植物中异源DNA表达的其它应用中有用。本发明也包括根据本发明DNA序列鉴定功能亚区的用途，和启动或抑制植物中基因表达的随后用途。

在本发明的内容中，术语NFS破裂物质和中和物质包含一系列所选的化合物，这些化合物由DNA编码，其基因产物(蛋白质或RNA或反义-RNA)对NFS或其中细胞器的代谢和/或功能和/或生存力是有害的，并且已知中和物质在与破裂物质相同的细胞内同时表达时，能抑制破裂物质的活性。破裂物质和中和物质的优选组合是，例如来自解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)(Hartley,1988，分子生物学杂志202,913-915)，限制性内切酶/相应的甲基化酶如来自大肠杆菌的EcoRⅠ(Green等，1981，生物化学杂志256,2143-2153)和EcoRⅠ甲基化酶，或如Ⅱ型限制酶修饰系统综述中所描述的相似组合(Wilson,1991，核酸研究，19,2539-2566)，细菌素和相应免疫蛋白，例如来自大肠杆菌的大肠杆菌素E3/免疫蛋白(Lau等，1985，核酸研究12,8733-8745)或任何可以在启动子B的控制下由同时合成的反义RNA中和的破裂物质编码基因，如编码Diptheria毒素链A的DNA序列(Czako和An,1991，植物生理学，95,867-692),RNA酶例如RNA酶T1，核糖核酸酶或蛋白酶以及抵抗编码毒害植物的蛋白的mRNA的核酶。

根据本发明的另一方面，破裂物质和中和物质的组合分别包含抑制编码细胞生存必需的蛋白或多肽产物的内源基因的基因，和中和基因；中和基因编码能替代内源蛋白或多肽产物功能的蛋白或多肽产物。这样的破裂基因可以选自含以下基因的群体(a)编码抵抗内源RNA转录物的核酶基因，(b)转录时合成与细胞生存必需的内源基因的RNA转录物互补或至少部分互补的RNA转录物的基因，称为基因表达的反义抑制的方法(在EP-A 240 208中公开)，或(c)转录时合成与细胞生存必需的内源基因转录物相同或至少非常相似的RNA转录物的基因，称为共抑制的至今未知的基因表达抑制方式(由Napoli C等，1990，植物细胞2,279-289公开)。

根据本发明的优选实施方案，反义基因用于抑制细胞生存必需的内源基因表达，依靠该反义基因上游融合的根据本发明的DNA调控序列，该基因在线虫摄食结构内表达。

由抑制生命必需的内源基因的反义基因带来的破裂作用可由中和化合物B的表达中和，该表达是在如所定义的启动子B控制下，所述化合物B是与内源生命必需的基因编码的蛋白或多肽相同或相似的蛋白或多肽产物，并且能够替代宿主植物中内源基因产物的功能。优选的是，中和基因编码的RNA转录物的核苷酸序列与生命必需的内源基因RNA转录物不同，以避免可能的共抑制效应。因此，优选的是编码基本上具有与生命必需的内源基因相同功能的蛋白或多肽的中和基因，但是经过不同的RNA转录物中间物；满足此描述的中和基因可通过筛选基因数据库适当地获得，这些基因从不同植物种类，或甚至不同的非植物种类，如酵母，动物，真核生物或原核生物得到。优选地，破裂反义转化基因和中和有义转化基因编码的转录物的核苷酸序列相同性小于90％，优选地小于80％，而更优选地所述中和有义转化基因编码在氨基酸序列上与破裂基因产物不相同的蛋白或多肽基因产物，并且其中由中和转化基因编码的转录物的核苷酸序列相同性小于75％。

尽管小基因家族也适于本发明目的，但是反义破裂基因的靶基因选自那些编码对于细胞生存必需的酶，也称管家酶的基因，并且应是核编码的，优选地为单拷贝基因。此外，所述基因反义表达的效果必须不会由于由这种酶正常合成的酶产物从其它细胞或细胞器的扩散或转运而消除。优选地，选择编码参与建立跨细胞器膜的化学梯度的膜转运酶的基因。通过反义表达的这些蛋白的抑制原则上不能由跨膜底物扩散消除，只要膜内有这些蛋白。被运输的化合物不限于有机分子也可以是无机性质；例如P,H,OH或电子。

优选地，膜转运酶存在于在寄生期间会增加数量的细胞器中，由此说明了这些细胞器在包含NFS的细胞中的基本作用。这样的细胞器的具体例子是线粒体，内质网和胞间连丝(Hussey等，1992，原生质167；55-65,Magnusson和Golinowski,1991，加拿大植物学杂志69；44-52)。表1中通过举例的方式给出了靶酶的目录，但本发明不限于表中所提到的酶。可从系列著作如植物生物化学(Stumpf和Conn编辑，1988-1991,1-16卷，学院出版社)或植物生理学百科全书(新版，1976,Springer-Verlag，柏林)中得到更详细的酶目录。

尽管仅在一些例子中，编码这些酶的基因已被分离，但是基因拷贝数未知，因此必须符合本发明中描述的标准。

表1用于NFS内反义表达和NFS外有义表达的靶酶的例子

    酶                    途径/细胞器

ATP合成酶                    线粒体

腺苷酸转运蛋白               线粒体

磷酸转运蛋白                 线粒体

三羧酸转运蛋白               线粒体

二羧酸转运蛋白               线粒体

2-氧代戊二酸转运蛋白         线粒体

细胞色素C                    线粒体

丙酮酸激酶                   糖酵解

甘油醛-3-磷酸脱氢酶          糖酵解NADPH-细胞色素P450还原酶         脂代谢

脂肪酸合成复合物             脂代谢

甘油-3-磷酸酰基转移酶        脂代谢甲羟戊二酸单酰CoA还原酶       甲羟戊酸途径

氨酰转移酶                  核酸代谢

转录因子                    核酸代谢

延伸因子                    核酸代谢

合适的启动子B定义为能驱动在基本上所有细胞中表达的启动子，其中编码序列A表达，但是它不能在线虫摄食结构内驱动表达或不能有效地表达。(基本上所有细胞是指至少那些应该是活的细胞以得到商业开发这样的植物所需的植物正常生长和或发育)。作为植物的说明，是那些在雄蕊细胞中表达根据本发明的破裂基因的植物，其中破裂效应不完全在寄主植物所有细胞中中和，然而植物是活的并且适于商业开发，这可以产生雄性不育植物，这在一些作物中甚至被认为是商业上诱人的特征。适当的启动子B的例子可从植物或植物病毒中获得，或可以是化学合成的。调控序列也可以包括增强子序列，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子中发现的(Kay等，1987，科学，236,1299-1302)，和mRNA稳定序列如苜蓿花叶病毒RNA 4的先导序列(Bredemde等，1980，核酸研究，8,2213-2223)或以相似方式作用的任何其它序列。

选择性地，为了提供在所有或有效地在所有植物组织中的表达，启动子B/编码序列B与第二个启动子B’/编码序列B互补，后者具有与启动子B/编码序列B部分重叠或完全互补的表达方式，条件是启动子B和启动子B’都不能在NFS中启动表达。包含为提供此处所定义的所需表达方式而结合的不同启动子(部分)的杂交启动子在本发明的范围内。

优选地，启动子B是花椰菜花叶病毒35S启动子或其衍生物，通常被认为在植物组织中是强组成型启动子(Odell等，1985，自然313,810-812)。启动子B的另一个优选实例是毛根土壤杆菌的质粒pRiA4的强根部启动子rolD(Leach和Aoyagi,1991，植物科学79；69-76),ORF15的5’侧翼区(Slightom等，1986，生物化学杂志261，108-121)。通过将启动子与标记基因如GUS(Jefferson,1987，植物分子生物学报告5,387-405)融合，并将这些构建体转移入植物并在侵染后用PPN对这些转基因植物进行组织化学分析，可测试用作启动子B的其它组成型启动子如胭脂碱合成酶启动子(Bevan,1984，核酸研究，12,8711-8721)或玄参花叶病毒(figwort mosaic virus)启动子(EP-A 426 641)的适当性。

诸如终止子序列和聚腺苷酸化信号的其它调控序列包括在植物中起相同作用的任何这样的序列，调控序列的选择属于本领域普通技术人员的技术水平范围。该序列的1个例子是根瘤土壤杆菌的胭脂碱合成酶(nos)基因的3’侧翼区(Bevan,1984，核酸研究12,8711-8721)。

在WO 93/10251(在此引用作为参考)中可发现双组份方法的进一步细节。

植物种类的选择基本上是由在农业上估计经过PPN侵染损害的程度和植物种类转化的可行性决定。在农业生产期间由PPN损害并可以通过本发明的方法明显使之对PPN更不敏感的植物属包括但不限于表2中所提及的属。

本发明内容中所述的线虫种类包括将寄主细胞改变成特殊适应摄食结构的所有植物寄生线虫，摄食结构从迁移性外寄生物(例如Xiphinema属种类)到更进化的固定内寄生物(例如异皮线虫属，根结线虫属或肾形线虫属)变化。表2中给出了寄生线虫的目录，但发明不限于该表中所提及的种类。在Zuckerman等编，于：植物寄生线虫，Vol.I,1971，纽约，页数139-162中有更详细的目录。表2植物寄生线虫及其主要寄主植物的例子

 线虫种类              主要寄主植物

根结线虫属

北方根结线虫               广谱

南方根结线虫               广谱

微小根结线虫       咖啡，茶，蕃茄，西瓜属

印度根结线虫               柑桔

爪哇根结线虫               广谱

非洲根结线虫               咖啡

M.graminis               谷物，草

M.graminicola              水稻

花生根结线虫               广谱异皮线虫属或球头线虫属

墨西哥异皮线虫        蕃茄，茄属种类

H.punctata               谷物，草

G.rostochiensis   马铃薯，茄属种类，蕃茄

G.pallida                 马铃薯

G.tabacum              芋草，芋草属

H.cajani                木豆，豇豆

大豆异皮线虫           大豆，大豆属

H.oryzae                    稻

沙氏异皮线虫        Beta属种类，芸苔属

H.trifolii               车轴草属

H．小麦异皮线虫          谷物，草

H.carotae                 胡萝卜

H.cruciferae             十字花科

H.goettingiana         豌豆，蚕豆属

在本发明的内容中，如果与对照植物相比，可观察到植物根表面发育的成熟雌虫的数量统计上明显减少，那么称该植物对植物寄生线虫(PPN)具有降低的敏感性。根据成熟雌虫数目的易感性/抗性分类对孢囊和根结线虫都是标准方法(例如LaMondia,1991，植物疾病75,453-454；Omwega等，1990，植物病理学80,745-748)。

根据本发明的线虫摄食结构将包括一个初始摄食细胞，这是指当入侵线虫诱导注定要成为线虫摄食结构的细胞或非常有限数量的细胞。

根据本发明的NFS破裂效应不仅限于对NFS的有害影响；此外也考虑通过直接相互作用，破裂效应对线虫发育的有害影响。

可使用几种技术可将含本发明所描述的DNA序列的重组DNA导入植物寄主中。这些技术包括但不限于用钙/聚乙二醇方法，电穿孔和微注射或(包被的的)颗粒轰击转化原生质体(Potrykus,1990,Bio/Technol.8,535-542)。

除这些所谓的DNA直接转化方法外，涉及载体的转化系统也广泛得到使用，如病毒载体[例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)]和细菌载体(例如来自土壤杆菌属)(Potrykus,1990,Bio/Technol,8,535-542)，在选择和/或筛选后，用本领域已知的方法，已转化的原生质体，细胞或植物部分可再生成完整植株(Horsch等，1985，科学225,1229-1231)。转化和/或再生技术的选择对本发明不是关键。

根据本发明优选的实施方案，使用所谓双元载体系统(公开于EP-A 120 516)，其中所用土壤杆菌菌株包含具有毒性基因和相容质粒的辅助质粒，双元载体包含将要转化的基因构建体。该载体能在大肠杆菌和土壤杆菌中复制；此处所用的一个载体来自双元载体Bin19(Bevan,1984，核酸研究12,8711-8721)。如该例子中所用的双元载体在T-DNA的左右边界间包含编码卡那霉素抗性(km)的相同NPTⅡ基因(Bevan,1984，核酸研究12,8711-8721)和在所需基因构建体中用于克隆的多克隆位点。

最近的科学进展表明单子叶植物基本上可以转化并且可从转化细胞再生出可育的转基因植物。对于这些作物可重复的组织培养系统的发展与将遗传物质导入植物细胞的有效方法一起促进了转化。目前，单子叶转化的优选方法是外植体或悬浮细胞的微粒轰击，和DNA直接摄入或电穿孔(Shimamoto等，1989，自然338,274-276)。通过微粒轰击将吸水链霉菌bar基因导入玉米胚发生细胞悬浮液，已获得转基因玉米，bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(使除草剂膦丝菌素失效的酶)(Gordon-Kamm,1990，植物细胞，2,603-618)。已有报道将遗传物质导入其它单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体(Lee,1989,植物分子生物学13,21-30)。通过仅筛选老化紧密的和结节的胚发生愈伤组织来建立胚发生悬浮培养液，已从胚发生悬浮培养液中再生出小麦植株(Vasil,1990,Bio/Technol.8,429-434)。最近公开了使用土壤杆菌转化水稻的方法(WO 95/16031)。结合这些作物的转化系统使本发明能应用到单子叶植物。这些方法也适用于双子叶植物的转化和再生。

以下给出的实施例仅作说明的目的，并不用来限制本发明范围。实验部分DNA程序

依据Maniatis(分子克隆，实验指南，第2版，冷泉港实验室，1990)中所述的标准方法进行所有DNA程序。拟南芥的转化

如Valvekens等(1988，美国国家科学院院报85,5536-5540)中描述的，用拟南芥(生态型C24)根节与含合适双元载体的土壤杆菌菌株MOG101的共培养进行转化，如下：

在发芽前，在4℃将拟南芥种子春化7天，用70％EtOH将种子表面消毒2分钟，转移至5％NaOCl/0.5％NaDodSO₄中15分钟，用无菌双蒸水冲洗5次，并放在含发芽培养基(GM)(表3)的150×25mm培养皿中，便之发芽。用透气医用胶条(Urgopore,Chenove France)密封培养皿。植物在22℃16小时光照/8小时黑暗节律下生长。组织培养程序使用相同的生长室条件。所有植物培养基用2-(N-吗啉)乙磺酸以0.5g/l作为缓冲物质(pH5.7:用1M KOH调节)，用0.8％DifcoBacto琼脂固化，并在121℃高压灭菌15分钟。激素和抗生素分别溶于二甲亚枫和水，在高压灭菌冷却至65℃后加入培养基中。

将完整根在固化0.5/0.05培养基中培养3天(表3)。然后将根切成约0.5cm的小块(此处称为“根外植体”)并转移到10ml的液体0.5/0.05培养基中；加入0.5-1.0ml过夜的土壤杆菌培养物。轻轻晃动约2分钟混合根外植体和细菌。

接着，将根外植体转移在无菌滤纸上以除去大部分液体培养基，并在0.5/0.05琼脂上共培养48小时。然后用每升含1000mg万古霉素(Sigma)的液体0.5/0.05培养基冲洗外植体。转移外植体，然后在每升加了750mg万古霉素和50mg km的0.15/5琼脂(表3)上培养。用含嵌合neo基因的土壤杆菌侵染三周后，在黄色根外植体背景中形成绿色Km抗性(Km^R)愈伤。此时将根外植体移至每升仅含500mg万古霉素和50mg km的新鲜0.15/5琼脂中。三周后大多数绿色愈伤形成苗。已转化的苗转移至含GM的150×25mm培养皿中以形成根或种子或两者。在这些培养皿中，一些再生体在无根时形成种子。生根的植物也可转移到土壤中生成种子。为获得初始根物质做如下改变，6个无菌的拟南芥C24种子在50ml GM(250ml Erlenmeyer)中在低亮度条件的生长室内，在摇床上培养9天发芽。转基因植物从在选择性培养基(50mg/l万古霉素)上生长的苗中再生，生根并移至发芽培养基上或土壤中。表3植物培养基

                   CIM                           SIM

          GM    R3^*  PG1^*   0.5/0.05    0.05/7^*   0.15/5^*盐+维生素   MS    MS    B5         B5         MS         B5蔗糖，g/l   10    30    --         --         30         --葡萄糖，g/l   --    --    20         20         --         20IAA,mg/l   --     5    --         --        0.05       0.152,4-D,mg/l   --    0.5    2         0.5        --         --2ipAde,mg/l   --    --    --         --          7          5Kin,mg/l   --    0.3  0.05       0.05        --         --

L，升；IAA，吲哚-3-酸；Kin，细胞分裂表；2ipAde,N⁶-(2-异戊烯基)腺嘌呤；CIM，愈伤诱导培养基；SIM，苗诱导培养基；MS,Murashige& Skoog培养基；B5,Gamborg B5培养基马铃薯的转化

为了转化马铃薯Kardal变种，使用有几处修改的在Hoekema等，1989,Bio/Technology 7,273-278中描述的方法。

将表面无菌的削皮马铃薯块切成2mm厚的切片。这些切片用于切成围绕切片外周直径1cm的圆盘。将这些圆盘放在WM(Murashige和Skoog培养基，含1mg/l盐酸硫胺素，0.5mg/l盐酸吡哆醇，0.5mg/l烟酸，100mg/l肌醇，30g/l蔗糖，0.5g/l MES PH5.8)上。用含重新悬浮的10ml土壤杆菌培养物沉淀的100ml新鲜WM替换原WM，进行根瘤土壤杆菌菌株EHA105的接种(Hood等，1993，转基因研究2,208-218)，土壤杆菌培养物新鲜生长在LB+适当抗生素中，OD600为0.5-0.7。将块茎圆盘放在细菌悬浮液中温育20分钟后，将其转移到固化CM(补充了8g/l琼脂，3.5mg/l玉米素核苷，0.03mg/l吲哚乙酸的WM)上，密度为20外植体/培养皿。在2天以后，将圆盘移至PM(补充了200mg/l氨噻肪头孢霉素，100mg/l万古霉素的CM)上以选择抗土壤杆菌的块基圆盘。3天以后将块茎圆盘移至SIM培养皿(补充了250mg/l羧苄青霉素，100mg/l卡那霉素的CM)上以选择转化苗的再生，密度为10外植体/培养皿。2周后将组织圆盘移至新鲜的SIM上，并在另一个3周后将其移至SEM(具有10×低浓度激素的SIM)上。共培养大约8-9周后，苗大得可以从愈伤组织切去，并移至含10ml RM(含0.5×MS盐，0.5×维生素，10g/l蔗糖，100mg/l氨噻肪头孢霉素，50mg/l万古霉素和50mg/l卡那霉素的WM)的玻璃试管(Sigma,Cat.nr.C5916)中以体外生根并营养繁殖。线虫的处理，植物根的生长和侵染

将拟南芥种子表面消毒，播种含20g/l葡萄糖和20mg/l卡那霉素的B5培养基的培养皿(直径9cm)中。4℃放置3天后，将培养皿放在22℃16小时光照/8小时黑暗循环的生长箱内培养2周。然后将卡那霉素抗性植物移到装了土壤的透明塑料试管(30×15×120mm,Kelderplastibox b.v.，荷兰)中。将试管以与垂直轴成60度斜放，使根生长在试管较低的一侧。这使得可以用眼监测侵染过程并利于从土壤中取出根系统进行GUS分析。在2周后通过将含每个根系统500只沙氏异皮线虫第2阶段幼虫(3ml H₂O中)或每个根系统300只南方根结线虫第2阶段幼虫的悬浮液注射到土壤中，进行侵染。

相似地，将在含卡那霉素的RM培养基上生根的马铃薯苗移至装了土壤的透明塑料管(30×15×120mm)Kelder plastibos b.V，荷兰)中，在22℃16小时光照/8小时黑暗循环下斜置生长另2周。通过向土壤注射含每个根系统500只Globodera pallida第2阶段幼虫(在3ml H₂O中)的悬浮液进行感染。GUS检测

通过彻底清洗根系统除去大部分吸附的土壤，并且将它们在X-Gluc溶液[1mg/ml X-Gluc,50mM NaPO₄(pH7),1mM K₄Fe(CN)₆,1mM KK₃Fe(CN)₆,10mM EDTA,0.1％Triton X100)中37℃温育过夜，可以在侵染过程的不同时间的测定GUS活性。通过用70％乙醇温育几个小时从组织除去叶绿素之后，在显微镜下观察GUS染色。实施例1双元载体pMOG800的构建

双元载体pMOG800是pMOG23的衍生物(图1,1990年1月29日保存在Centraal Bureau Voor Schimmeleultures,Oosterstraatl,Baarn,The Netherlands，保藏号为CBS 102.90)，其中将附加的KpnI限制性位点导入EcoRⅠ和SmaⅠ之间的多接头中。该质粒在T-DNA左右边界之间含卡那霉素抗性基因，用于转基因植物细胞的筛选(图2)。包含PMOG800的大肠杆菌DH5α样品在1993年8月12日保存于Centraal Bureau voor Schimmelcultures,Oosterstraat 1,Baarn,TheNetherlands,保藏号为CBS414.93。实施例2无启动子的GUS构建体pMOG553的构建

在Goddijn等，1993，植物杂志4,863-873中描述了此载体的构建。在此文献中有一个错误；该构建体在β-葡糖苷酸酶基因后含CaMV 35S RNA终止子，而不是表示的nos终止子。该双元载体的T-DNA边界间的序列可从EMBL数据库录入号X84105中获得。pMOG553携带了用于植物转化的HygR标记。实施例3在拟南芥中捕获的NFS优选启动子片段的鉴定和分离

通过三亲交配将双元载体pMOG553转移到根瘤土壤杆菌菌株MOG101中。所得菌株用于拟南芥根的转化。以此方法得到多于1100个转基因拟南芥植物株系。让转基因植物生长成熟，自体受精并且收获并春化所得的种子(S1)。接着S1种子在用10mg/l潮霉素，0.6％琼脂固化的营养溶液(Goddijn等，1993，植物杂志4,863-873)上发芽，并且对于4天吸涨期于4℃保存。第5天将培养皿移至室温和适度光照(1000 lux,16小时光照/8小时黑暗)中发芽。将14天的苗移至斜置的透明塑料管(30×15×120mm)的盆栽土壤中，在5000 lux(20℃)下继续生长。以此方式使植物生长可使大部分根系统在土壤和试管间界面中试管的较低侧生长。2周后用实验部分所描述的线虫侵染根。在接种后的不同时间(从2天到14天)，如实验部分所述分析根系统的GUS活性。pMOG553#1164株系被鉴定为在分别由沙氏异皮线虫和南方根结线虫诱导的合胞体和巨大细胞内显示相当强的GUS表达。在该株系的未侵染对照植物中(以及在侵染植物中)，在幼小侧根基部和植物的一些绿色部分的一些细胞中可检测到非常弱的GUS表达。

在1164株系中，发现该表现型以1∶3比例分离，表明GUS构建体存在于每个基因组的一个基因座上。通过Southern分析证明只存在T-DNA单拷贝。通过反向PCR分离与GUS开放阅读框架毗邻的捕获的1.5kb片段启动子序列。该株系的基因组的DNA用限制性酶MscⅠ切割，该酶在GUS编码区切割一次，并重新连接。随后通过用酶SnaBⅠ消化环状DNA，可以获得两端是已知GUS序列和中间为并列植物序列的线型片段。用引物组GUSinv5(5’CTT TCC CAC CAA CGC TGA TC 3’SEQ ID NO:1)和GUS7(5’GTA ATG CTC TAC ACC ACG CCG3’SEQ ID NO:2)扩增该片段，在多拷贝载体中克隆和测序(见下面)。为在GUS前克隆这段此扩增片段，用引物组GUSinv5和1164XBM(5’TCT AGA GGA TCC TGG CCA TAC AAA TCA ACG TTT AC3’SEQ ID NO:3)从拟南芥基因组DNA中重新扩增该植物片段。携带校对活性的pfu DNA聚合酶用于减少错误几率。引物1164XBM在启动子的5端导入BamHⅠ位点，这样可以将1480bp BamHⅠ启动子片段重新克隆入构建体pMOG819中GUS前，而不改变GUS开放读框架和植物启动子之间的序列。实施例4无启动子GUS构建体pMOG819的构建

通过克隆pMOG553的GUSintron编码区(Vancanneyt等，1990,Mo1.Gen.Genet,220；245-250)构建此载体，该GUSintron编码区为pMOG800多接头中的BamHⅠ-EcoRⅠ片段。双元载体pMOG819(图4)用于介导克隆的启动子片段以用作植物转化后的进一步表达分析。实施例5重新导入拟南芥后启动子片段的分析

标签为553#1164的PCR产物克隆回双元载体pMOG819的GUS基因前，产生pMOG849(图5)。在1995年5月4日已将含pMOG849的大肠杆菌DH5α保存在Centraal Bureau Voor Schimmelcultures,Oosterstraat 1,Baarn,The Netherlands，保藏号为CBS 308.95。为确定克隆的启动子片段的组织特异性，将所得到的克隆pMOG849转移至根瘤土壤杆菌中，相应的菌株用于转化野生型拟南芥植株。每个构建体得到24-30个转化子。收获来自最初转化子的种子，使之成长以用于实验部分所述的用沙氏异皮线虫侵染检测。线虫感染后的GUS分析表明79％的用pMOG849转化的株系在合胞体中表达报告基因。在侧根分枝区，根和叶的维管组织，rozette中央和一些花组织中也发现了一些微弱表达。合胞体外GUS的表达显示出株系和株系之间的明显差异(见图6)。假设此差异是在导入的调控序列上基因组位置效应的结果。但是，在大多数株系中，发现与原始标记为553#1164的株系非常相似的表达方式。

即使各种pMOG849株系中启动子片段活性通常比合胞体内的GUS活性弱得多，也没有任何合胞体阳性株系完全对摄食位点特异。

在与其中沙氏异皮线虫诱导的合胞体中表达GUS的株系相同的株系中，用南方根结线虫侵染诱导的巨大细胞中也发现GUS表达。这表明#1164片段可在基因工程植物中用作近乎摄食位点特异的启动子，该工程植物具有对南方根结线虫和沙氏异皮线虫降低的敏感性。

在组织培养期间，观察到#1164调控序列作为启动子也是有活性的，因此，如果#1164启动子片段与在其控制下的植物细胞破裂基因例如芽孢杆菌RNA酶(见实施例8和9)一起转移到的拟南芥中，将需要使用中和基因。

以553#1164为基础的PCR片段用作分离相应基因组克隆的探针。然后以与上述(PMOG889包含与GUSintron融合的基因组553#1164)相似的方法使用2.1kb基因组片段(见SEQ ID NO:4)。另外，分别用沙氏异皮线虫和南方根结线虫侵染拟南芥根后，在合胞体和巨大细胞中可观察到线虫诱导的GUS表达。实施例6标记为pMOG553#1164的启动子的序列测定

用Pharmacia的自动测序仪ALF，通过对CsCl纯化DNA的引物步移策略测定#1164基因组克隆序列。荧光dATP与自动读序试剂盒结合使用。在Voss等(1992)分子细胞生物学3,153-155中描述了此程序。在SEQIDNO:4中描述了此序列。实施例7启动子亚片段的克隆

使用表4中所示的引物通过PCR合成5个启动子#1164的亚片段。引物序号和序列表中所用的相同。对于所有扩增反应，使用校对DNA聚合酶pfu并且使用pMOG849作为靶DNA。所有5’端引物包含1个XhoⅠ位点。因此，用这个XhoⅠ位点和BamHⅠ位点可将1164启动子的所有PCR产生的缺失片段重新导入pMOG819中，BamHⅠ位点位于pMOG553的多克隆位点中并且在标记的株系1164中保留在GUS编码区和标记植物序列之间。数字是指从在pMOG819中克隆的亚片段得到的构建体；引物6044-1至6044-6分别对应SEG ID NO的6至11。

表4

pMOG	5’端引物	3’端引物
			958959960961962	6044-16044-26044-36044-46044-1	6044-66044-66044-66044-66044-5

在将这些基因元件重新导入植物后，根据实施例3中对于1.5kb#1164片段所述的确定表达方式，时间安排等。所发现的具有有用方式和/或时间安排的片段可以接着用来启动其它异源DNA序列(有义/编码和反义)的表达和/或用来制备杂交启动子构建体。此外，进一步分析得到对几个调控元件如沉默子，增强子等的了解，并产生完全影响表达方式和/或时间安排的可能性。为了阐明根据本发明的启动子片段如何用于带来降低的对线虫的敏感性，现在说明克隆在芽孢杆菌RNA酶前的基因组2.1kb#1164片段，作为NFS破裂基因的例子。实施例8#1164在芽孢杆菌RNA酶前的克隆

在芽孢杆菌RNA酶即解淀粉芽孢杆菌衍生的RNA酶基因前克隆了一个包含株系1164的5’标记序列的2.1kb基因组DNA片段以操作抗固着植物线虫的植物。通过筛选有#1164iPCR产物的拟南芥生态型C24的基因库的400000个克隆获得该基因组片段(见实施例3)。从其中一个杂交克隆分离出4kb EcoRⅠ片段并在多拷贝质粒pKS(Stratagene)中亚克隆。序列分析表明该克隆在T-DNA插入的5’端包含株系1164的2.1kb序列和1.9kb 3’序列。

为恢复GUS编码区前完整序列内容，在基因组克隆的SnaBⅠ位点插入覆盖启动子-GUS融合的来自pMOG849的546bp SnaBⅠ片段。从所得的克隆中分离2325bp HindⅢ片段，该片段包含基因组EcoRⅠ亚克隆的完整5’标记序列。将此片段克隆入构建体pFL8中的芽孢杆菌RNA酶基因前(如下描述)，得到克隆pEL15。

用引物5’CGGACTCTGGATCCGGAAGTG 3’(SEQ ID NO:12)和5’CTGCTCGAGCCTAGGCACGGTTATCAACACGTTTG3’(SEQID NO:13)以pMT416 DNA(Hartley，同下)为模板PCR扩增包含芽孢杆菌RNA酶编码区的片段。为便于该片段的克隆，这些引物导入侧翼BamHⅠ和XhoⅠ限制性位点。该片段克隆入载体的多克隆位点，载体含在Taq启动子(在细菌中克服芽孢杆菌RNA酶毒性所必需的)控制下的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。为了消除以后克隆步骤中芽孢杆菌RNA酶表达的毒性，在芽孢杆菌RNA酶的StyⅠ位点插入ST-LS1内含子。用引物5’CGGACTCTGGATCCGGAAGTG3’(SEQ ID NO:14)和5’CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC3’(SEQ ID NO:15)通过重组PCR在芽孢杆菌RNA酶翻译起始密码子处加入一个NcoⅠ位点，得到pOG16.1。通过退火以下核苷酸序列5’GATCTAGACTCGAGAAGCTTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCC 3’(SEQ ID NO:16)和5’CATGGGGGACTGACCTACCCGGGGATCCAAGCTTCTCGAGTCTA 3’(SEQ ID NO:17)并连接得到的pOG16.1的Bg1Ⅱ位点和NcoⅠ位点间的接头，得到克隆pFL8，将芽孢杆菌RNA酶5’非翻译起始区进一步修饰成与原始pMOG553#1164株系中相应序列相似。接头向芽孢杆菌RNA酶编码区5’端导入HindⅢ位点，用来插入产生pEL15的1164启动子。此外，通过该方法将含Taq启动子和芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的片段与此接头交换。实施例9构建roID-B*

构建体pFL11在双元载体中含嵌合的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。该构建体以下列方式克隆。芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码区位于构建体pMT316中的HindⅢ/BamHⅠ片段上[Hartley(1988)分子生物学杂志202,913-915]。通过在HindⅢ位点连接自身退火的接头5’AGCTCGGATCCG 3’(SEO ID NO:18)，将HindⅢ位点变成BamHⅠ位点。接着，在WO 93/10251所述的表达盒pMOG180中的双增强CaMV35S启动子和nos终止子之间克隆所得到的BamHⅠ片段，产生pOG30。使用接头5’GGCTGCTCGAGC 3’(SEQ ID NO:19)，将nos终止子3’端的HindⅢ位点变为XhoⅠ位点，并且使用接头5’AATTGACGAAGCTTCGTC3’(SEQIDNO:20)，将启动子5’端的EcoRⅠ位点变成HindⅢ位点。然后35S启动子被来自毛根土壤杆菌的RolD基因启动子取代。该启动子从来自F.Leach的构建体pD02[Leach和Aoyagi(1991)植物科学79,69-76]切出为HindⅢ/BamHⅠ片段。通过用HindⅢ和XhoⅠ消化从所得克隆pOG38切除含启动子和终止子的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因，并插入PMOG800的多接头相应位点，产生pFL11。

最后，将嵌合的#1164启动子-芽孢杆菌RNA酶基因从pFL15中切去为EcoRⅠ片段，并在串联方向上插入在芽孢杆菌RNA酶抑制剂和NptⅡ标记基因间的pFL11的单一EcoRⅠ位点中，得到pMOG893。实施例10用pMOG893转化马铃薯并测试对Globodera Pallida的增加的抗性。

将双元载体pMOG893转移入根瘤土壤杆菌并且所得菌株用于如实验部分描述的马铃薯栽培品种Kardal的块茎圆盘转化。共获得98个转基因株系。通过将苗切成含至少一个结节的小段并在体外生根来对这些株系进行营养繁殖。如实验部分所述，测试每个株系的15株植物对Globodera Pallida增强的抗性。期望由于(发育)线虫摄食结构内芽孢杆菌RNA酶的线虫诱导表达，用含芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂构建体的pMOG893转化的马铃薯显示对Globodera pallida降低的敏感性。

上述实施例仅仅用来举例说明本发明而不是为了划定其范围。本领域技术人员容易地对本发明进行的种种变动和改进在本发明的范围内。

                     序列表(1)基本信息

(ⅰ)申请人

    (A)名称：MOGEN International N.V.

    (B)街名：Einsteinweg 97

    (C)城市：Leiden

    (D)州名：Zuid-Holand

    (E)国家：The Netherlands

    (F)邮政编码(ZIP):NL-2333 CB

    (G)电话：31-71-258282

    (H)传真：31-71-221471

(ⅱ)发明名称：DNA调控序列

(ⅲ)序列数目：20

(ⅳ)计算机可读形式

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)关于SEQ ID NO:1的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅸ)特征：

   (A)名称/关键：引物_结合

   (B)位置：1..20

   (D)其它信息：/备注=“与来自标记构建体pMOG553的uidA基因(β-葡糖苷酸酶)在224-205位上退火的引物。(x83420)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：

CTTTCCCACC AACGCTGATC(2)关于SEQ ID NO:2的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2：

GTAATGCTCT ACACCACGCC G(2)关于SEQ ID NO:3的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：35个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc-feathure

    (B)位置：1..12

    (D)其它信息：/备注=“5’XbaⅠ和BamHⅠ位点突出”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：13..35

    (D)其它信息：/备注=“与序列6044-0在646-668位上退火的引物部分。”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3：TCTAGAGGAT CCTGGCCATA CAAATCAACG TTTAC(2)关于SEQ ID NO:4的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：2163个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：否

(ⅵ)原始来源

    (A)生物：拟南芥

    (B)菌株：C24

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：CDS

    (B)位置：2161..2163

    (D)其它信息：/密码子_起始=2161

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc_feathure

    (B)位置：2128..2163

    (D)其它信息：/备注=“pMOG553上从uidA基因起始密码子上游(5’)向上至RB/植物基因组转座子的序列。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：启动子

    (B)位置：1..2127

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：784..804

    (D)其它信息：/标记=引物6044-1

        /备注=“与引物6044-1(表4)退火以扩增亚片段。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：1147..1169

    (D)其它信息：/标记=引物6044-2

        /备注=“与引物6044-2(表4)退火以扩增亚片段。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：1853..1880

    (D)其它信息：/标记=引物6044-3

        /备注=“与引物6044-3(表4)退火以扩增亚片段。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：1918..1940

    (D)其它信息：/标记=引物6044-4

        /备注=“与引物6044-4(表4)退火以扩增亚片段。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：1897..1917

    (D)其它信息：/标记=引物6044-5

    /备注=“与引物6044-1(表45退火以扩增亚片段(相反链)。”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4：GAATTCCATC AAATATTAAC TTTTAATATC ACTACATCAT CACCAGATAT GGATGAATAT        60TTATATAATA TTCACTGCCA ATTAGTTCTT TTAACATATA TATGCTGCTT GTACATATAG       120GTCATCCAAA TTTTTAGGGT TCAAAACAAA ACCAAAAGAA ACAGAAAAGA TCTGATAAAA       180AGTCTTCATT TTAGACGAGG GATCAAACTT ATCTAGTGCA TCTGAATGAA AAAAAATGAT       240CTTAACACTG CAGGTGAAGG CTGGCTCAAT CTTTGACAAT ATATTGATCT GCGATGACCC       300GGCATATGCA AGAAGCATCG TGGATGACTA TTTTGCCCAA CACAGGGAGG TAGATTTCCA       360AGTCTTTGTA TATCTTTTTG CTTCTTTTTG GATAAAATCA AAGAAGTTTT TTGATCTTGC       420AAGTGTGTAG TAATTGCAAA TGGATTTTCT GCATGCTATT ATATACGAAA ATGTCTTATT       480AGTGAATTTG ATATGCTATA TACTTGGCCA TATGCACCAG TCTGAGAAGG AGTTATTTGC       540GGAAGCAGAG AAAGAAAGAA AAGCTAGAGA AGATGAGGTT TGTAGTTCAC AAAAAAGTTC       600TTGTTCTCTT TTCAAGTCTT CTCTGTATAT CCTAGTTAAC GAGCATGGCC ATACAAATCA       660ACGTTTACAG GAAGCTCGGA TAGCACGGGA AGAAGGTGAA CGCAGGCGGA AAGAAAGGGA       720CCACCGGTAT GGAGACAGGA GGAGGCGTGA CAAACGGGTA AGTACTTATT TGAGTCCAAA       780TGAATTATAA CCTTCTCAAC TCTGTTTTAT CTGGAAACCA AGTGAGTGAA TATTGTTGGA       840AATGGTTTGG TTTGTTTTGT TTTGTTTTGC AGCCGAATCC ACGTGATTAT ATGGATGATT       900ACCATGTAAG TGTTCCTTCT ATCTCAACCA CTTTAAAAAG AATGGTTTAT GCATTTTAGT       960ACTGAATCAT CTTAACTGTT CTAAAAATGT AAGTTTGTTA TGATTCTGAA TTTCGTGTAG      1020GACGAGCTAT GAGGCGCAGA GTGGTGGGCA TTTGGCAAAG CATTGGGGGA AATTATCTAT      1080ATTTTGCCTT TGAATGTGTA CCTGTTTGTA ATTTCATAAT TTGTAACCTT TTGTATTCAT      1140ATTCTTATAA TGTATTTTGG CATGAAAACT TGACTTGTTA TTTTTCCCTT CCAATACAAA      1200AATTCTAAAA TTGGCAAGAA CGACTTACTA CCATGCAGTG ATTTGTGAAG TTTGATAGTG      1260GTGGTAATTT TAATTGTTTC ACCACAGAAA ATTTCTCTAT ATCCTGAAGA AGATAGCTGA      1320GTTGAACTGA GAGGTTGGCG TTTCTTAGTG AAAATACAAA AAATAGAAAT CTTTAGCTAG      1380AAAGTGTGGT GTGGACCCGA CTGATGGTAA CCATGTTCAT TTGGAGGAAC TAATGTGAAT      1440ATTAGCTAAA AGCATATTGT TGAGTGTTGA CAAAATGACA ACAGATAAAT CGTCAAATAC      1500TACTCCACCT AGCTAATATT TTTTTTTAAC TAATGTTAGA AAGCCACCTA TTTGCATCCG    1560TAATGATAAA AACTAAAAAA ATATTAGATT ATTAGAGTGA TACATTTTGT GTGAAAACGT    1620AAACGAAAGT CAAAAGAAAG AAAAACGAAA GAAATTTAAA TGCGGTTTAT GGTGGGCACA    1680AATGTTGTGA CCTGGTGTGT CCCTTTCCCA CTTAAATGTA CGGCTGATAA TCACATCAGT    1740GGCGACTTTA GGAAATAGAA AATTCGCACA ATTGACTCGA TACGCATTAA AGTCGTAATC    1800ACTAGACATT TTTGTTATCT GTCCTTTAGT GGTTCGTTTA ATCTGGAACG TCCTTATAAT    1860AACATAAGAT AAATATTTAC TTAATTAGCT ACGGAACTAC ATTAGTATTC AATTGATATA    1920ACTAATGGTA ATTACTAATT AATTGCGGAA AGCCGAGAGA GGTGATGGTG CACGGTGCAT    1980GTGAAGAGCT TTTGATACGT AAGTGGAGCA CTCATGATAA GCGAAGTTGT CTATTTATAA    2040AGTTTAATTT ACTGTGCTTT TTATAATGTG ACACACTATT GGAATCCAAT GACTGCATTA    2100TTTATTTATA TGTAAAAAAA AAAGTCTCAA AGCTTGGATC CCCGGGTAGG TCAGTCCCTT    2160ATG                                                                  2163Met1(2)关于SEQ ID NO:5的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：1个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5：

Met

1(2)关于SEQ ID NO:6的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：否

(ⅲ)反义：否

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc_feathure

    (B)位置：1..12

    (D)其它信息：/备注=“包含XhoⅠ和EcoRⅠ位点的5’突出。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：13..30

    (D)其它信息：/备注=“与序列6044-0(SEQ ID NO:4)在787-804位上退火的引物部分。”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6：CTCGAGAATT CTATAACCTT CTCAACTCTG(2)关于SEQ ID NO:7的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：35个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅵ)原始来源

    (A)生物：拟南芥

    (B)菌株：C24

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc_feathure

    (B)位置：1..12

    (D)其它信息：/备注=“包含XhoⅠ和EcoRⅠ位点的5’突出。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：13..35

    (D)其它信息：/备注=“与序列6044-0(SEQ ID NO:4)在1147-1169位上退火的引物部分。”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7：CTCGAGAATT CTATAATGTA TTTTGGCATG AAAAC(2)关于SEQ ID NO:8的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：37个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc_feathure

    (B)位置：1..12

    (D)其它信息：/备注=“包含XhoⅠ和EcoRⅠ位点的5’突出。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：13..37

    (D)其它信息：/备注=“与序列6044-0(SEQ ID NO:4)在1853-1880位上退火的引物部分。”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8：

CTCGAGAATT CTATAATAAC ATAAGATAAA TATTTAC(2)关于SEQ ID NO:9的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：35个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc_feathure

    (B)位置：1..12

    (D)其它信息：/备注=“包含XhoⅠ和EcoRⅠ位点的5’突出。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：13..35

    (D)其它信息：/备注=“与序列6044-0(SEQ ID N0:4)在1918-1940位上退火的引物部分。”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9：CTCGAGAATT CTATAACTAA TGGTAATTAC TAATT(2)关于SEQ ID NO:10的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：35个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：misc_feathure

    (B)位置：1..14

    (D)其它信息：/备注=“重建序列6044-0(SEQ ID NO:4)从21287至2142位序列的引物部分，同时引起1909-2127位序列的缺失。”

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：13..35

    (D)其它信息：/备注=“与序列6044-0(SEQ ID NO:4)在1897-1917位上退火的引物部分。”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10：GGATCCAAGC TTTGATCAAT TGAATACTAA TGTAG(2)关于SEQ ID NO:11的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键：引物_结合

    (B)位置：1..20

    (D)其它信息：/备注=“与来自标记构建体pMOG553的uidA基因(β-葡糖苷酸酶)在224-205位上退火的引物。(x83420)”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11：

CTTTCCCACC AACGCTGATC(2)关于SEQ ID NO:12的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：22个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12：CGGACTCTGG ATCCGGAAAG TG(2)关于SEQ ID NO:13的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：36个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13：

CTGCTCGAGC CTAGGCACAG GTTATCAACA CGTTTG(2)关于SEQ ID NO:14的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：22个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14：

CGGACTCTGG ATCCGGAAAG TG(2)关于SEQ ID NO:15的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：27个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15：

CTTACTCGAG CCATGGTAAG TTTCTGC(2)关于SEQ ID NO:16的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：44个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16：GATCTAGACT CGAGAAGCTT GGATCCCCGG GTAGGTCAGT CCCC(2)关于SEQ ID NO:17的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：44个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17：CATGGGGGAC TGACCTACCC GGGGATCCAA GCTTCTCGAG TCTA(2)关于SEQ ID NO:18的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：12个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18：

AGCTCGGATC CG(2)关于SEQ ID NO:19的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：12个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19：

GGCTGCTCGA GC(2)关于SEQ ID NO:20的信息

(ⅰ)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假拟：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20：AATTGACGAA GCYTTCGTC

Claims (24)

1．可从拟南芥中获得的DNA片段，该DNA片段在重新导入植物时能够启动相关DNA序列的根结和孢囊线虫诱导的转录。

2．根据权利要求1所述的DNA片段，包含SEQ ID NO:4中核苷酸1至2141所代表的核苷酸序列。

3．根据权利要求1所述的DNA片段，包含SEQ ID NO:4中核苷酸646至2141所代表的核苷酸序列。

4．根据权利要求2或3的任意一项所述的DNA片段的部分或变体，在重新导入植物时能够启动相关DNA序列的根结和孢囊线虫诱导的的转录。

5．根据权利要求1至4的任意一项所述的DNA片段，该DNA片段基本上是线虫摄食位点特异的。

6．在转录方向上含根据权利要求1至5的任意一项所述的DNA片段和在其转录控制下将要表达的DNA序列的嵌合DNA序列，并且将要表达的DNA序列天然地不受所述DNA片段的转录控制。

7．根据权利要求6所述的嵌合DNA序列，其中将要表达的DNA序列引起植物细胞破裂物质的合成。

8．根据权利要求7所述的嵌合DNA序列，其中所述细胞破裂物质是芽孢杆菌RNA酶。

9．根据权利要求7所述的嵌合DNA序列，其中所述细胞破裂物质包括与细胞生存必需的RNA互补的RNA。

10．根据权利要求6所述的嵌合DNA序列，其中将要表达的DNA序列引起对诱导线虫有毒的物质的合成。

11．含根据权利要求6至10的任意一项所述的嵌合DNA序列的复制子。

12．在转录方向上包含根据权利要求1至5的任意一项所述的DNA片段和至少一个用于插入将要在所述DNA片段控制下表达的DNA序列的限制性内切酶识别位点的复制子。

13．含根据权利要求11或12的任意一项所述的复制子的微生物。

14．其基因组已整合了根据权利要求6至10的任意一项所述的嵌合DNA序列的植物细胞。

15．基本上由根据权利要求14所述的细胞组成的植物根系统。

16．基本上由根据权利要求14所述细胞组成的植物。

17．根据权利要求16所述的植物是双子叶植物。

18．根据权利要求17所述的植物是马铃薯。

19．在根据权利要求15所述的根系统上嫁接的植物。

20．可从根据权利要求16至19的任意一项所述的植物中获得的植物的部分，选自种子，花，块茎，根，叶，果实，花粉和木材。

21．基本上由根据权利要求16至19的任意一项所述的植物组成的作物。

22．根据权利要求1至5的任意一项所述DNA片段，在鉴定能够启动植物中相关DNA序列转录的亚片段中的应用。

23．根据权利要求7至10的任意一项所述的嵌合DNA序列在转化植物中的应用。

24．根据权利要求4所述的部分或变体在构建杂交DNA调控序列中的应用。

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