WO2001094601A2 - Hero-resistenzgen gegen nematoden - Google Patents

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WO2001094601A2
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Karin Ernst
Martin Ganal
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Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzen Forschung
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    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the invention relates to a hero resistance gene and gene fragments thereof for the biosynthesis of proteins which bring about resistance to nematodes, in particular to globodera cyst nematodes, their isolation and their use for the genetic engineering transformation of susceptible plants, such as e.g. Potato, tomato and eggplant.
  • susceptible plants such as e.g. Potato, tomato and eggplant.
  • the field of application is in particular agriculture.
  • Nematodes are animal pests that cause great problems in agriculture because they are difficult to control and chemical control requires the use of highly toxic substances. On the other hand, permanent stages of the nematodes can survive in the soil for up to 10 years, making the cultivation of susceptible (susceptible) plants on infested fields impossible without chemical control with nematicides for a long time.
  • the cyst nematodes Globodera rostochiensis and Globodera pallida cause great damage when growing nightshade plants in the temperate climate zone (e.g. Central Europe).
  • the potato Solarium tuberosum
  • tomato Licopersicon esculentum
  • aubergine Solarium melongena
  • the invention is based on our own findings that the nematode resistance gene hero from the tomato brings about complete resistance to all pathotypes of the cyst nematode Globodera rostochiensis and probably also partial resistance to Globodera pallida. It therefore has an extremely broad spectrum of resistance to cyst nematodes.
  • a detailed description of the hero gene was first given in 1971 by Ellis and Maxon-Smith 1971 (Euphytica 20: 93-101).
  • gene A the coding region of which is sequence 2 with 3909 bp (cf. sequence listing) and which could be isolated from a large number of candidate genes from the gene family of the NBS-LRR resistance gene homologues.
  • the hero resistance gene was found to encode the protein sequence of Figure 1.
  • the invention relates to the hero resistance gene with the gene sequence A, which comprises bp 16642 to 21002 of FIG. 4 (cf. also sequence 1 in the sequence listing), the nucleotides 16666 to 16759 and 20574 to 20931 being two non-coding introns.
  • the invention also relates to a gene with sequence 2, which comprises 3909 bp and has the coding sequence of gene A.
  • the invention also relates to a protein with the amino acid sequence shown in FIG. 1, and to derivatives of the genes which code for proteins in which some of the amino acids from the amino acid sequence are missing or are substituted by others or in which amino acids have been added, but which contain the have the same properties.
  • the present invention further relates to vectors and plasmids which contain the hero gene.
  • the invention therefore also relates to cells and transgenic plants which have been transformed by means of vectors and plasmids.
  • the HR1 probe phage cDNA libraries of the tomato (made from root RNA of the Mogeor or VFN8 varieties) were sifted using standard methods at a hybridization temperature of 65 ° C.
  • the washing conditions of the hybridizations were 0.5 x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C.
  • the identified clones were examined for their size and sequenced.
  • Specific hybridization samples from the 5 'and 3' region of the longest clone (Wgt23) were used in addition to the HRl probe to examine genomic DNA.
  • Genomic Southern analyzes ( Figure 2) show that the hybridization probes (here HR1) detect a whole series of DNA fragments under standard conditions (65 ° C hybridization temperature) be (at least 8 to 10).
  • a genomic library in the binary cosmid p04541 (Jones et al. 1992; Transgenic Research 1, 285-297) was produced for the molecular isolation of the genes of resistance genomics on chromosome 4.
  • DNA from leaves of the LA1792 ( ⁇ ero) line was extracted using a modified CTAB method (Bernatzky and Tanksley, 1986; Genetics 112: 887-898).
  • the genomic DNA was partially digested with Sau3A and fractionated using a sucrose gradient centrifugation. DNA in the size range between 9 and 23 kb was ligated into the R ⁇ ⁇ I-cut vector.
  • the resulting phages were introduced into the Escherichia coli strain XLl-Blue MRF'Kan (Stratagene). 136 bacterial pools with 1000-2000 different bacterial clones each were obtained (corresponds to approximately 4.4 genome equivalents). After DNA extraction from the individual pools, these DNA pools were sighted using primers for the ⁇ R1 sequence and 5 'and 3' sequences from the cDNA clones (eg Wgt23). The cosmid clones obtained were characterized according to standard methods by digestion with restriction enzymes and via hybridization with the ⁇ R1 probe and fragments from Wgt23.
  • the ends of the cosmid were also sequenced. Starting from the end sequences of the isolated cosmids, further primers were derived in order to isolate additional cosmids. Because of the almost identical sequences of the gene family detected by ⁇ R1, it was only possible with great difficulty to assemble the gene family in a completely overlapping contig. The generation of specific probes was only possible by sequencing all cosmids and identifying regions which are specific for individual cosmids by means of sequence comparisons. Analysis of a 158 kb DNA sequence showed that 14 very similar genes are located in the Contig. Of these genes, six genes are not functional due to raster mutations, insertions or deletions. Eight genes show an intact reader and are therefore potentially functional genes. A representation of the entire contig is shown in Figure 3. 3. Identification of hero candidates from the gene family using high-resolution genetic mapping
  • the hero resistance gene with the PCR markers A10E13P1 / P2 (5'GGA TGA CTT TTA TCT CAG G3 '/ 5' GGA TAG GAT AGA AAT CCA TC3 '), F1231UP1 / UP2 (5'CGT ATA TAT TTT TTC ATC TGC3V5'GAG TAT TTC ACT ATG GTG3') and F51ES25P1 / P2 (5'AAT TCA AGT CAA GGT GGA G3 '/ 5' GGA GAA AAT GAT TTG ATA TAA C3 ') can be limited to a region of approximately 60 kb.
  • This region contains only three functional genes (genes A, B and C) from the gene family described ( Figure 3).
  • a further analysis of the recombinant plants for the range between ⁇ R1 and CT229 with all pathotypes (Rol to Ro5) showed that the resistance to all pathotypes is cosegregated and is therefore very likely controlled by a single gene.
  • FIG. 4 shows a region of 23.67 kb from the region coregulating with the hero gene, which contains the complete sequence of the three genes A, B and C.
  • the DNA Sequence was determined using standard methods from the Cosmide A3-2, F12-31 and C6-25 and subclones generated therefrom.
  • the genomic sequences of the individual genes are defined by the following sections:
  • Coding sequence gene A nucleotide 16642 to 21002 Coding sequence gene B nucleotide 7973 to 12130 Coding sequence gene C nucleotide 1690 to 5446
  • Cosmid A3-2 nucleotide 9986 to 23670
  • Cosmid F12-31 nucleotide 6640-23671
  • Cosmid C6-25 nucleotide 2379-16896
  • Gen A partially, Gen B complete, Gen C partially
  • Transformed plants were confirmed using «pt-specific primers via PCR.
  • transformed plants were self-grown and the resulting seeds were used for the resistance tests.
  • the resistance tests with the pathotypes Rol, Ro3 and Ro5 were carried out as described (Ganal et al. 1995) at the Scottish Crop Research Institute by Dr. Amar Kumar and Dr. Mark Phillips performed. The results of the resistance tests are shown in Figure 5.
  • Cosmid A3-2 and Cosmid F12-31 are able to transfer resistance to the originally susceptible lines Moneymaker and Ailsa Craig. The two cosmids overlap in a region of 7 kb which contains the complete gene A. This identifies gene A as the hero resistance gene. 6. Description of the gene structure of the hero gene:
  • the amino acid sequence (1302 amino acids) for the hero resistance gene (gene A) is shown in Figure 6.
  • the gene contains an intron in the 5 'untranslated region (nucleotide 15292 to 16622 and two introns within the coding sequence (nucleotides 16666 to 16759 and 20574 to 20931, see also Figure 4).
  • the calculated molecular weight is 150021 daltons.
  • a sequence comparison with The published nematide resistance genes Mi and Gpa2 show an identity of 35% to the Mi gene and 24% to Gpal.
  • the hero gene contains a typical P-loop (GMPGNGK), a kinase 2 (KRYLIVLDDV) and kinase 3a (G ⁇ RVILTSR) region
  • GMPGNGK typical P-loop
  • KRYLIVLDDV kinase 2
  • G ⁇ RVILTSR kinase 3a
  • LRR 13 imperfect leucine-rich repeating units
  • Atypical in comparison to other resistance genes is a so-called acid coiled coil domain within the LRRs (amino acids 1025 to 1050), which is encoded by a microsatellite-like sequence Length of this microsatellite sequence represents an important distinguishing feature between the individual members of the gene family and could be based on the formation of the Sp specificity towards the nematodes.
  • FIG. 1 Amino acid sequence of the hero resistance gene
  • FIG. 2 Southern analysis with HRl. Genomic DNA from descendants of the L. pennellii mapping population (Tanksley et al., 1992) was digested with EcoRV and separated on a 1% agarose gel. After blotting on Hybond N +, the HR1 probe was hybridized at 65 ° C. Fragments that show a cosegregation with the hero locus are marked with ⁇ ero. Other hybridizing fragments are labeled with the assigned chromosome. C4: chromosome 4, C6: chromosome 6, C3 / C12: chromosome 3 or 12; P: E. pennelli, ⁇ : E. esculentum
  • Figure 3 Genomic organization of the 14 resistance gene-like sequences at the Hero Locus. The 17 cosmid clones covering the entire region are shown. Arrows above the map show the position, relative length and direction of transcription of each open reading frame. Letters identify each individual member of the hero gene family. Cosmide A3-2 and F12-31 complement the susceptible variety Moneymaker. X indicates the approximate position of the recombination events that were used to limit the hero gene.
  • Figure 4 Region of 23.67 kb from the region co-segregating with the hero gene, which contains the complete sequence of the three genes A, B and C.
  • Figure 5 Complementation of the susceptible tomato variety Moneymaker with the cosmids A3 -2 and F 12-31. 10 to 15 plants from an FI progeny of the primary transformants were infected with G. rostochiensis 2 weeks after sowing. The cysts formed were counted after six weeks. Untransformed plants of the Moneymaker variety were infected as a control. Plants with fewer than 8 cysts are clearly resistant. Susceptible plants usually have more than 25 cysts. The presence of the gene and part of the vector was investigated by PCR with specific primers for gene A and by Southern hybridization for the 35S promoter of the T-DNA. R: resistant; s: susceptible; +: gene-specific PCR product or RFLP fragment detected; -: No PCR product or RFLP fragment detected.
  • Figure 6 Structure and amino acid sequence of the hero gene.
  • the amino acid sequences for the kinase-la, kinase-2 and kinase-3 motif of the nucleotide binding site (NBS) are marked.
  • the hydrophobic region and the leucine-rich repeating units (LRR) are also shown.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein <i>Hero</i>-Resistenzgen sowie Gen-Fragmente davon zur Biosynthese von Proteinen, welche Resistenz gegen Nematoden, insbesondere gegen Globodera-Zystennematoden, bewirken, ihre Isolierung und Verwendung zur gentechnischen Transformation suszeptibler Pflanzen, wie z.B. Kartoffel, Tomate und Aubergine. Es wurde gefunden, dass das <i>Hero</i>-Resistenzgen die Proteinsequenz gemäss Abbildung 1 codiert. Die entsprechende Gensenquenz wurde zur gentechnischen Erzeugung von Pflanzen mit Resistenz gegenüber <i>Globodera</i>-Zystennenmatoden verwendet.

Description

-flTero-Resistenzgen gegen Nematoden
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Hero-Resistenzgen sowie Gen-Fragmente davon zur Biosynthese von Proteinen welche Resistenz gegen Nematoden, insbesondere gegen Globodera- Zystennematoden, bewirken, ihre Isolierung und Verwendung zur gentechnischen Transformation suszeptibler Pflanzen, wie z.B. Kartoffel, Tomate und Aubergine. Anwendungsgebiet ist insbesondere die Landwirtschaft.
Nematoden (Fadenwürmer) sind tierische Schädlinge, welche große Probleme in der Landwirtschaf verursachen, da sie nur schwer zu kontrollieren sind und eine chemische Bekämpfung die Verwendung von hoch toxischen Substanzen erfordert. Auf der anderen Seite können Dauerstadien der Nematoden bis zu 10 Jahre im Boden überleben und damit den Anbau suszeptibler (anfälliger) Pflanzen auf befallenen Äckern ohne eine chemische Bekämpfung mit Nematiziden über lange Zeit unmöglich machen.
Die Zystennematoden Globodera rostochiensis und Globodera pallida verursachen große Schäden beim Anbau von Nachtschattengewächsen in der gemäßigten Klimazone (z.B. Mitteleuropa). Von diesen Globodera-Arten werden besonders die Kartoffel (Solarium tuberosum), aber auch die Tomate (Lycopersicon esculentum) und die Aubergine (Solarium melongena), sowie andere Pflanzenarten befallen. Insbesondere beim Kartoffelanbau können signifikante Ernteverluste durch den Befall mit Zystennematoden auftreten.
Für Globodera rostochiensis sind inzwischen fünf Pathotypen (Rol bis Ro5) beschrieben, welche durch entsprechende, in Sorten und Wildmaterial vorkommende Resistenzgene differenziert werden können (Gen für Gen Interaktion, Flor 1956, Adv. Genet. 8: 29-54). Für Globodera pallida sind 3 Pathotypen bekannt (Pal bis Pa3).
Durch genetische Kartierung mit Hilfe von molekularen Markern war es 1995 möglich, das Hero-Resistenzgen auf Chromosom 4 der Tomate zu lokalisieren (Ganal et al. 1995; Mol. Plant Micr. Interact. 6: 886-891). Genetisch eng gekoppelte Marker konnten identifiziert werden. In Fortführung der 1995 publizierten Arbeiten wurde bekannt, daß in der Region Gene mit Homologie zu bekannten Resistenzgenen aus der NBS-LRR-Klasse zu finden waren. Unter anderem zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des Markers HR1 (Ganal et al. 1995) eine signifikante Homologie zur Aminosäuresequenz des Prf-Gens aus der Tomate, welches bei der Interaktion mit Pseudomonas syringae eine Rolle spielt (Salemeron et al., 1996; Cell 86:123-133). Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, das Hero-Resistenzgen auf Chromosom 4 der Tomate präzise zu lokalisieren, molekular zu isolieren und zu sequenzieren, sowie seine Verwendung zur gentechnischen Transformation in suszeptible Pflanzen, wie z.B. Tomate, Kartoffel, Aubergine, um eine Nematoden-Resistenz zu erzeugen.
Der Erfindung liegen die eigenen Erkenntnisse zugrunde, dass das Nematodenresistenzgen Hero aus der Tomate eine vollständige Resistenz gegenüber allen Pathotypen des Zystennematoden Globodera rostochiensis bewirkt und wahrscheinlich auch eine partielle Resistenz gegenüber Globodera pallida. Es besitzt damit ein extrem breites Resistenzspektrum gegenüber Zystennematoden. Eine detaillierte Beschreibung des Hero- Genes erfolgte erstmals 1971 durch Ellis und Maxon-Smith 1971 (Euphytica 20: 93-101).
Die Aufgabe der Erfindung wurde mit Gen A, dessen codierende Region die Sequenz 2 mit 3909 bp (vgl. Sequenzprotokoll) darstellt und das aus einer großen Anzahl von Kandidatengenen aus der Genfamilie der NBS-LRR-Resistenzgenhomologen isoliert werden konnte, gelöst. Es wurde gefunden, daß das Hero-Resistenzgen die Proteinsequenz gemäß Abbildung 1 codiert.
Die Erfindung betrifft das Hero-Resistenzgen mit der Gensequenz A, das die bp 16642 bis 21002 der Abbildung 4 (vgl. auch Sequenz 1 im Sequenzprotokoll) umfasst, wobei die Nukleotide 16666 bis 16759 und 20574 bis 20931 zwei nichtcodierende Introns darstellen. Außerdem betrifft die Erfindung ein Gen mit der Sequenz 2, das 3909 bp umfasst, und die codierende Sequenz des Gens A aufweist. Gegenstand der Erfindung sind auch ein Protein mit der in Abbildung 1 dargestellten Aminosäuresequenz, sowie Derivate der Gene, die für Proteine codieren, bei denen ein Teil der Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz fehlt oder durch andere substitutiert ist oder bei denen Aminosäuren hinzugefügt sind, die jedoch die gleichen Eigenschaften aufweisen. Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Vektoren und Plasmide, welche das Hero-Gen beinhalten.
Die erfinderische Leistung bezüglich der Isolierung des Hero Resistenzgenes liegt besonders darin, aus diesen Resistenzgenanalogen, trotz ihrer großen Ähnlichkeit, das Gen zu isolieren, das die Resistenz gegenüber den einzelnen Pathotypen von Globoderea rostochiensis bewirkt. Aufgrund der bis zu 98 % identischen Nukleinsäuresequenz waren die Gene erst nach Sequenzierung der gesamten Region unterscheidbar. Kreuzungsanalysen und Komplementation anfälliger Pflanzen durch die Transformation mit DNA-Abschnitten, die einzelne oder mehrere Gene der Genfamilie enthielten, führten schließlich zur Identifizierung des Hero-Genes, das für ein Protein der Sequenz der Abbildung 1 codiert. Mit der Erfindung sind unter anderem folgende Anwendungen möglich:
1. Erzeugung von resistenten oder verstärkt resistenten Pflanzen gegenüber den Nematoden Globodera rostochiensis und Globodera pallida in allen Pflanzenarten, die ursprünglich suszeptibel gegenüber diesen Nematoden sind, vorzugsweise Kartoffel, Tomate und Aubergine, durch Transformation mit dem isolierten Gen unter Verwendung des eigenen oder fremder Promotoren.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Zellen und transgene Pflanzen, die mittels Vektoren und Plasmiden transformiert wurden.
2. Gentechnische Veränderung des Genes durch Einsetzen, Hinzufügen oder Entfernen von einzelnen oder mehreren Nukleotiden zur Erzeugung neuer Resistenzspezifitäten gegenüber diesen Nematoden oder zur Erzeugung einer generell verbesserten Resistenz gegenüber allen Rassen dieser und anderer Nematoden.
Die Erfindung ist nachfolgend durch die Ausführungsbeispiele näher erläutert: Allgemeine molekularbiologische Techniken wurden nach dem Stand der Technik durchgeführt. Enzymatische Reaktionen wurden nach den Empfehlungen der Hersteller vorgenommen. Die meisten der verwendeten Techniken sind in den Handbüchern ,Molecular Cloning' und , Genome Analysis' beschrieben (Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989; Green et al. Genome Analysis - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1997).
Ausführungsbeispiele und Beschreibungen
1. Charakteriserung der Genfamilie der NBS-LRR-Resistenzgenhomologen
Zur Charakterisierung der Genfamilie wurden mit Hilfe der HR1 -Sonde Phagen cDNA Bibliotheken der Tomate (hergestellt aus Wurzel-RNA der Sorten Mogeor bzw. VFN8) nach Standardmethoden bei 65°C Hybridisierungstemperatur gesichtet. Die Waschbedingungen der Hybridisierungen waren 0,5 x SSC, 0,1%SDS bei 65°C. Die identfizierten Klone wurden auf ihre Größe untersucht und sequenziert. Spezifische Hybridisierungsproben aus dem 5' und 3 '-Bereich des längsten Klones (Wgt23) wurden neben der HRl-Sonde zur Untersuchung von genomischer DNA verwendet. Genomische Southern Analysen (Abbildung 2) zeigen, daß mit den Hybridisierungssonden (hier HR1) eine ganze Reihe von DNA-Fragmenten unter Standardbedingungen (65°C Hybridisierungstemperatur) detektiert werden (mindestens 8 bis 10). Eine genetische Kartierung dieser Fragmente auf einer Population der Tomate (Tanksley et al, 1992; Genetics 132: 1141-1160) zeigt, daß viele aber nicht alle dieser Fragmente in der Region auf Chromosom 4 der Tomate kartieren (in Abbildung 2 mit Hero markiert), welche das Hero-Gen enthält. Aufgrund der unterschiedlichen Intensitäten der Fragmente ist klar, daß einige der hybridisierenden Fragmente mehr als ein Gen detektieren und damit das Gen nicht auf einfache Weise isoliert werden kann, weil eine größere Genfamilie vorliegt.
2. Isolierung der Gene aus der Ηero-Region auf Chromosom 4 der Tomate
Zur molekularen Isolierung der resistenzgenhomologen Gene auf Chromosom 4 wurde in einem ersten Schritt eine genomische Bibliothek im binären Cosmid p04541 (Jones et al. 1992; Transgenic Research 1, 285-297) hergestellt. DNA aus Blättern der Linie LA1792 (Ηero) wurde nach einer modifizierten CTAB-Methode (Bernatzky und Tanksley, 1986; Genetics 112: 887-898) extrahiert. Die genomische DNA wurde partiell mit Sau3A abgebaut und mittels einer Saccharosegradientenzentrifugation fraktioniert. DNA im Größenbereich zwischen 9 und 23 kb wurde in den Rα ΗI-geschnittenen Vektor ligiert. Nach einer Verpackung der Cosmide mit dem Gigapacklll XL Packaging Extract (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurden die resultierenden Phagen in den Escherichia coli Stamm XLl-Blue MRF'Kan (Stratagene) eingeführt. 136 Bakterienpools mit jeweils 1000-2000 verschiedenen Bakterienklonen wurden erhalten (entspricht etwa 4,4 Genomäquivalenten). Nach DNA- Extraktion aus den einzelnen Pools wurden diese DNA-Pools mittels Primem für die ΗR1- Sequenz und 5' und 3 '-Sequenzen aus den cDNA-Klonen (z.B. Wgt23) gesichtet. Die erhaltenen Cosmidklone wurden nach Standardmethoden durch den Abbau mit Restriktionsenzymen und über Ηybridisierung mit der ΗR1 -Sonde und Fragmenten aus Wgt23 charakterisiert. Femer wurden die Enden der Cosmide sequenziert. Ausgehend von den Endsequenzen der isolierten Cosmide wurden weitere Primer abgeleitet um zusätzliche Cosmide zu isolieren. Wegen der nahezu identischen Sequenzen der von ΗR1 detektierten Genfamilie war es nur unter grossen Schwierigkeiten möglich, die Genfamilie in einem vollständig überlappenden Contig zusammenzusetzen. Die Erzeugung von spezifischen Sonden war nur dadurch möglich, daß alle Cosmide sequenziert wurden und durch Sequenzvergleiche Regionen identifiziert wurden, welche spezifisch für einzelne Cosmide sind. Die Analyse einer DNA-Sequenz von 158 kb zeigte, daß in dem Contig 14 sehr ähnliche Gene lokalisiert sind. Von diesen Genen sind sechs Gene durch Rastermutationen, Insertionen oder Deletionen nicht funktionsfähig. Acht Gene zeigen ein intaktes Leserater und sind damit potentiell funktionale Gene. Eine Darstellung des gesamten Contigs ist in Abbildung 3 dargestellt. 3. Identifizierung von Hero-Kandidaten aus der Genfamilie mit Hilfe hochauflösender genetischer Kartierung
Die große Anzahl von Kandidatengenen für Hero und die bekannten Probleme mit großen und Genduplikationen enthaltenden Cosmiden in Agrobacterium tumefaciens erforderten eine weitere Eingrenzung der Kandidaten für eine Komplementation. Diese erfolgte durch die Analyse einer großen F2-Population aus der Kreuzung Hero (LA1792) x Ailsa Craig. 747 Pflanzen wurden mittels RFLP-Analyse für das Interval HR1/H293 (Ganal et al. 1995) mit diesen zwei Markem untersucht. Für das Interval CT229/HR1 wurden weitere 207 Pflanzen mit den CT229 und HRl -Markem untersucht. Alle rekombinanten Pflanzen wurden geselbstet und in der F3 -Generation (jeweils 10 bis 15 Pflanzen pro Rekombinante) wurden mit den entsprechenden Markem diejenigen Nachkommen identifiziert, welche homozygot für das Rekombinationsereignis waren. Diese Pflanzen wurden wieder geselbstet und die entsprechenden Nachkommen konnten, da sie alle einheitlich homozygot für das Rekombinationsereignis sind, in größerer Anzahl auf ihre Nematodenresistenz getestet werden. Die Resistentests wurden entsprechend den Beschreibungen von Behringer (Bayer. Landw. Jahrbuch 62, SH3, 1985) oder Ganal et al. (Mol. Plant Micr. Interact. 6, 886-891, 1995) durchgeführt. Die Daten aus den Resistenztests mit den homozygot rekombinanten Pflanzen sind zuverlässiger als die normale F3 -Nachkommensanalyse (Ganal et al. 1995) und zeigen, daß im Gegensatz zu den dort publizierten Daten das Hero-Gen zwischen den RFLP- Markern ΗR1 und CT229 liegt. Die genaue Analyse der identifizierten Rekombinationsereignisse mit Hilfe von spezifischen PCR-Markern aus der gesamten Region der oben beschriebenen Genfamilie zeigt, daß das Hero-Resistenzgen mit den PCR-Markern A10E13P1/P2 (5'GGA TGA CTT TTA TCT CAG G3' / 5'GGA TAG GAT AGA AAT CCA TC3'), F1231UP1/UP2 (5'CGT ATA TAT TTT TTC ATC TGC3V5'GAG TAT TTC ACT ATG GTG3') und F51ES25P1/P2(5'AAT TCA AGT CAA GGT GGA G3' / 5'GGA GAA AAT GAT TTG ATA TAA C3') auf eine Region von etwa 60 kb eingegrenzt werden kann. Diese Region enthält nur noch drei funktionale Gene (Gen A, B und C) aus der beschriebenen Genfamilie (Abbildung 3). Eine weitere Analyse der rekombinanten Pflanzen für den Bereich zwischen ΗR1 und CT229 mit allen Pathotypen (Rol bis Ro5) zeigte, daß die Resistenz gegenüber allen Pathotypen kosegregiert und damit sehr wahrscheinlich durch ein einziges Gen kontrolliert wird.
4. Sequenzanalyse der kosegregierenden Region
Abbildung 4 zeigt eine Region von 23,67 kb aus dem mit dem Hero-Gen kosegregierenden Bereich, welche die vollständige Sequenz der drei Gene A, B und C enthält. Die DNA- Sequenz wurde mit Hilfe von Standardmethoden aus den Cosmide A3-2, F12-31 und C6-25 und davon erzeugten Subklonen bestimmt. Die genomischen Sequenzen der einzelnen Gene werden durch folgende Abschnitte definiert:
Codierende Sequenz Gen A Nukleotid 16642 bis 21002 Codierende Sequenz Gen B Nukleotid 7973 bis 12130 Codierende Sequenz Gen C Nukleotid 1690 bis 5446
5. Transformation von suszeptiblen Tomatenlinien mit dem Hero-Gen und Komplementation zur Resistenz
Zur Bestimmung, welches der drei Gene (A, B, C) für die Resistenz gegenüber Globodera rostochiensis verantwortlich ist, wurden drei verschiedene Cosmide, die entsprechende Sequenzabschnitte enthalten, mittels Agrobacterium vermittelter Transformation in die suszeptiblen Tomatensorten Moneymaker und Ailsa Craig eingeführt. Hierzu wurde die Prozedur von Ling et al (Plant Cell Rep. 17: 643-847) verwendet. Die drei verwendeten Cosmide enthalten folgende Gene:
Cosmid A3-2: Nukleotid 9986 bis 23670
Gen A vollständig, Gen B unvollständig, Gen C nicht
Cosmid F12-31: Nukleotid 6640 -23671
Gen A vollständig, Gen B vollständig, Gen C nicht
Cosmid C6-25: Nukleotid 2379-16896
Gen A teilweise, Gen B vollständig, Gen C teilweise
Transformierte Pflanzen (T0) wurden mit Hilfe von «pt-spezifϊschen Primem über PCR bestätigt. Für die Resistenztestungen wurden transformierte Pflanzen geselbstet und das resultierende Saatgut für die Resistenztests verwendet. Die Resistenztestungen mit den Pathotypen Rol, Ro3 und Ro5 wurden wie beschrieben (Ganal et al. 1995) am Scottish Crop Research Institute von Dr. Amar Kumar und Dr. Mark Phillips durchgeführt. Die Ergebnisse der Resistenztests sind in Abbildung 5 dargestellt. Cosmid A3-2 und Cosmid F12-31 sind in der Lage die Resistenz auf die ursprünglich suszeptiblen Linien Moneymaker und Ailsa Craig zu übertragen. Die zwei Cosmide überlappen in einem Bereich von 7 kb, welcher das vollständige Gen A enthält. Damit wird Gen A als das Hero-Resistenzgen identifiziert. 6. Beschreibung der Genstruktur des Hero-Genes:
Die Aminosäuresequenz (1302 Aminosäuren) für das Hero-Resistenzgen (Gen A) ist in Abbildung 6 dargestellt. Das Gen enthält ein Intron in der 5'untranslatierten Region (Nukleotid 15292 bis 16622 sowie zwei Introns innerhalb der kodierenden Sequenz (Nukleotide 16666 bis 16759 bzw. 20574 bis 20931, siehe auch Abbildung 4). Das berechnete Molekulargewicht beträgt 150021 Dalton. Ein Sequenzvergleich mit den publizierten Nematidenresistenzgenen Mi und Gpa2 zeigt eine Identität von 35% zu dem Mi- Gen und 24% zu Gpal. Das Hero-Gen enthält einen typischen P-Loop (GMPGNGK), eine Kinase 2 (KRYLIVLDDV) und Kinase 3a (GΝRVILTSR) Region. Der C-terminale Teil enthält 13 imperfekte Leucin-reiche Repetitionseinheiten (LRR). Untypisch im Vergleich zu anderen Resistenzgenen ist eine sogenannte saure coiled coil-Domäne innerhalb der LRRs (Aminosäuren 1025 bis 1050), welche durch eine mikrosatellitenähnliche Sequenz kodiert wird. Die Länge dieser Mikrosatellitensequenz stellt ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal zwischen den einzelnen Mitgliedern der Genfamilie dar und könnte an der Ausbildung der Spezifität gegenüber den Nematoden beteiligt sein.
Legenden zu den Abbildungen
Abbildung 1: Aminosäuresequenz des Hero-Resistenzgenes
Abbildung 2: Southernanalyse mit HRl. Genomische DNA von Nachkommen der Kar- tierungspopulation L. pennellii (Tanksley et al., 1992) wurde mit EcoRV abgebaut und auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Nach dem Blotting auf Hybond N+ wurde mit der HR1- Sonde bei 65°C hybridisiert. Fragmente, welche eine Kosegregation mit dem Hero-Locus zeigen, sind mit Ηero markiert. Andere hybridisierende Fragmente sind mit dem zugeordneten Chromosom beschriftet. C4: Chromosom 4, C6: Chromosom 6, C3/C12: Chromosom 3 oder 12; P: E. pennelli, Ε: E. esculentum
Abbildung 3: Genomische Organisation der 14 resistenzgenähnlichen Sequenzen am Hero Locus. Die 17 Cosmidklone, welche die gesamte Region abdecken, sind dargestellt. Pfeile überhalb der Karte zeigen die Position, relative Länge und Transkriptionsrichtung jedes offenen Leserasters. Buchstaben kennzeichnen jedes einzelne Mitglied der Hero-Genfamilie. Cosmide A3-2 und F12-31 komplementieren die suszeptible Sorte Moneymaker. X kennzeichnen die ungefähre Position der Rekombinationsereignisse, welche zur Εingrenzung des Hero-Genes verwendet wurden.
Abbildung 4: Region von 23,67 kb aus dem mit dem Hero-Gen kosegregierenden Bereich, welcher die vollständige Sequenz der drei Gene A, B und C enthält.
Abbildung 5: Komplementation der suszeptiblen Tomatensorte Moneymaker mit den Cosmiden A3 -2 und F 12-31. 10 bis 15 Pflanzen einer FI -Nachkommenschaft der primären Transformanten wurden mit G. rostochiensis 2 Wochen nach der Aussaat infiziert. Nach sechs Wochen wurden die gebildeten Zysten gezählt. Untransformierte Pflanzen der Sorte Moneymaker wurden als Kontrolle infiziert. Pflanzen mit weniger als 8 Zysten sind eindeutig resistent. Suszeptible Pflanzen haben in der Regel mehr als 25 Zysten. Die Anwesenheit des Genes und eines Teils des Vektors wurde durch PCR mit spezifischen Primem für das Gen A und durch Southern Ηybridisierung für den 35S Promotor der T-DNS untersucht. R: resistent; s: suszeptibel; +: genspezifisches PCR-Produkt bzw. RFLP-Fragment nachgewiesen; -: kein PCR-Produkt bzw. kein RFLP-Fragment nachgewiesen.
Abbildung 6: Struktur und Aminosäuresequenz des Hero-Genes. Die Aminosäuresequenzen für das Kinase- la, Kinase-2 und Kinase-3 Motiv der Nukleotidbindestelle (NBS) sind markiert. Die hydrophobe Region und die Leucin-reichen Repetitionseinheiten (LRR) sind ebenfalls dargestellt.

Claims

Patentansprüche:
1. DNA-Sequenzen für ein Hero-Gen, welche für Proteine codieren, die Resistenz gegenüber Globodera-Zystennematoden bewirken.
2. Genomische DNA-Sequenz nach Ansprach 1, gekennzeichnet durch die Nukleotide 16642 bis 21002 (einschließlich Introns) der Abbildung 4 (Sequenz 1), sowie resistenzvermittelnde Fragmente und Varianten dieser Sequenz.
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch die Sequenz 2, umfassend 3909 bp, sowie Fragmente oder Derivate davon, die für Proteine mit den gleichen Eigenschaften codieren.
4. Nukleinsäure-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie vollständig komplementär sind.
5. Rekombinante Vektoren, die mindestens eine Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasssen, zur Transformation von Pflanzen, vorzugsweise von Tomaten-, Kartoffel-, und Auberginenpflanzen.
6. Rekombinante Plasmide, die mindestens eine Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasssen, zur Transformation von Pflanzen, vorzugsweise von Tomaten-, Kartoffel-, und Auberginenpflanzen.
7. Verwendung mindestens einer Nukleotoidsequenz oder einer Gensequenz (cDNA) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur gentechnischen Erzeugung von Pflanzen durch Transformation, welche vollständig oder teilweise resistent gegenüber Globodera rostochiensis und/oder Globodera pallida sind.
8. Transgene Pflanzen und Samen, insbesondere Tomaten-, Kartoffel-, und Auberginenpflanzen, enthaltend das Hero-Gen oder resistenzvermittelnde Fragmente und Varianten dieser Sequenz.
9. Verwendung des Hero-Genes gemäß Ansprach 2 mittels gezielter Mutagenese zur gentechnischen Erzeugung neuer Resistenzspezifitäten gegenüber einzelnen oder allen Pathotypen von Globodera rostochiensis und/oder Globodera pallida.
10. Protein mit der Sequenz der Abbildung 1 (Sequenz 3), welches Resistenz gegenüber Globodera-Zystennematoden bewirkt, sowie Fragmente und Derivate davon, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
11. Protein mit der Sequenz 3.
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