CN102337274B - 一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法，该方法是通过基因枪轰击紫花苜蓿叶片，将轰击后的叶片在含有壮观霉素的筛选培养基上筛选，经过三轮筛选，获得紫花苜蓿叶绿体转基因植株。本发明为紫花苜蓿的叶绿体转化提供了载体和方法，实现了绿色荧光蛋白在紫花苜蓿叶绿体中的表达。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法，通过该方法实现了绿色荧光蛋白在紫花苜蓿叶绿体中的表达。
背景技术
随着生物技术的发展，植物转基因技术获得了举世瞩目的成就。许多经过性状改良如抗病虫、抗除草剂、品质优良的转基因作物新品种相继问世并得到推广，给农业发展带来了巨大的推动作用。然而，传统的转基因技术以核基因组转化为主，仍存在一些亟待解决的问题，如外源基因表达量低甚至沉默、多基因共转化难、存在位置效应、具有环境安全的风险等。叶绿体转化技术的出现，为解决以上问题提供了一种有效的途径。
叶绿体是植物细胞的一种重要细胞器，它是植物进行光合作用的场所，还参与氨基酸、核苷酸、脂肪酸和淀粉等许多物质的生物合成过程。叶绿体具有自身的遗传物质，大多数高等植物叶绿体的基因组大小在120-160kb之间，是环状裸露的双链DNA分子，其基因的组织和表达特性与原核生物相似（Plant J, 1998/16 (5) //627～732）。叶绿体转化具有多重优势，第一，表达量高。每个植物细胞内含约有30-100个叶绿体，而每个叶绿体内又有100多个基因组拷贝，因此外源基因插入到叶绿体基因组中，可以大大提高外源基因的拷贝数，从而显著提高蛋白的表达量；第二，可以实现外源基因的定点整合。通过同源重组的方法把外源基因插入基因组的特定位置，从而克服位置效应；第三，实现多基因的一步转化。由于叶绿体基因表达具有原核生物基因表达的特征，可以构建多顺反子载体，同时完成多个基因的转化；第四，对生态环境安全和生物多样性的风险显著降低。因为绝大多数植物属于母性遗传，叶绿体在细胞质中，此方法获得的转基因植物可以避免由花粉引起的基因飘移。
叶绿体遗传转化的研究起步较晚，1988年，Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物——衣藻一个突变体(atpB基因突变体)，使其完全恢复光合作用能力（Science, 1988/240//1534~1538），标志着叶绿体基因工程的诞生。1990年，Svab等实现了高等模式植物烟草叶绿体的稳定转化（PNAS, 1990/87//8526~8530），从而开启了高等植物叶绿体转化的新纪元。到目前为止，除烟草以外，已在拟南芥(Plant Cell Rep, 1998/ 18(1-2)//20~24)、马铃薯(The Plant Journal, 1999/19(2)//209~216)、番茄(Nature Biotechnology. 2001/19//870 ~875)、油菜（Transgenic Research, 2003/12(1) //111~114）、棉花（Plant Molecular Biology, 2004/56//203~216）、甘蓝（Plant Cell Rep，2007/26//1733~1744）、胡萝卜(Plant Physiology, 2004/136//2843~2854)、莴苣（Plant Molecular Biology，2005/58（6）//763~774）、矮牵牛（Transgenic Research，2004/13// 523~530）、大豆（Plant Molecular Biology，2005/58(5)//659~668）、杨树(Transgenic Research 2006/15(5)//637~646)、甜菜（Transgenic Research，2009/18(1)//17~30）、茄子（Transgenic Res，2010/19//113~119）等植物上获得了稳定的叶绿体转基因植株；另外，在单子叶植物水稻上也获得了非同质化的叶绿体转基因植株（Mol Cells，2006/21(3)//401~410）。
豆科植物是人畜主要的蛋白质来源，实现豆科植物的叶绿体转化，对于提高豆科植物的育种进程具有重要的意义。目前，豆科植物的叶绿体转化仅在大豆上有过成功的报道（Plant Molecular Biology，2005/58(5)//659~668）。紫花苜蓿是一种优良的豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，对其叶绿体转化的研究对农牧业生产具有重要的意义。
发明内容
本发明公开了一种转化紫花苜蓿叶绿体的转基因方法，通过该方法获得了表达绿色荧光蛋白的叶绿体转基因紫花苜蓿。
本发明提供一种紫花苜蓿叶绿体基因组部分碱基序列（部分16S-trnI-trnA-部分23S），见SEQ ID NO:1。
本发明公开的紫花苜蓿叶绿体转化质粒载体，其特征在于：该载体组合有叶绿体基因组中扩增16S核糖体RNA基因-异亮氨酸转移RNA基因（16S-trnI）片段，丙氨酸转移RNA基因-23S核糖体RNA基因（trnA-23S）片段，绿色荧光蛋白基因（gfp）、壮观霉素抗性基因（aadA）表达框及多克隆位点片段（gfp-aadA-MCS）。
上述的质粒载体，其特征在于：gfp-aadA-MCS片段位于16S-trnI片段和trnA-23S片段之间，片段的顺序从5'端到3'端依次是：16S-trnI片段、gfp-aadA-MCS片段和trnA-23S片段。
上述的质粒载体，其特征在于：gfp-aadA-MCS片段中，gfp-aadA表达框是多顺反子；其中启动子是烟草叶绿体16S rRNA操纵子的启动子Prrn；gfp基因采用T7噬菌体第10个基因的核糖体结合位点T7g10；aadA基因采用烟草叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基的核糖体结合位点；终止子采用烟草叶绿体rps16基因的终止子Trps16。
上述的质粒载体，其特征在于：gfp-aadA-MCS片段中，多克隆位点MCS的5'端有由烟草烟草叶绿体16S rRNA操纵子的启动子Prrn和烟草酪蛋白水解酶导肽clpPrbcL所构成的融合启动子PrrnPclpPrbcL；5'端有烟草叶绿体psbA基因的终止子TpsbA。
本发明利用上述质粒载体进行转基因获得的紫花苜蓿叶绿体转基因植株的转化体，其特征在于：其宿主为紫花苜蓿，其叶绿体基因组上整合了绿色荧光蛋白基因gfp和壮观霉素抗性基因aadA表达框，转化体具有壮观霉素抗性和绿色荧光蛋白表达。
本发明的紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法，包括如下步骤：
（a）基因枪法轰击叶片：把紫花苜蓿无菌苗的叶子剪下，把小叶剪开，小叶的背面朝上平铺在预培养培养基（MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2,4-D+8g/L琼脂）上过夜，基因枪轰击后的叶片放在黑暗下25℃恢复培养3天；
（b）筛选：把恢复培养后的叶片，横切成两段，背面朝下、分散平放到筛选培养基I（MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2,4-D+500mg/L spe+8g/L琼脂）上，在光下25℃进行筛选，每15-20天更换一次培养基I，待有抗性胚状体或者抗性愈伤组织长出，把抗性胚状体或抗性愈伤组织转移到新的筛选培养基I上继续培养两周，再把抗性胚状体转移到筛选培养基II（MS0+30g/L蔗糖+0.05mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+625mg/L spe+8g/L琼脂）上，继续培养两周，把长大的胚状体转移到筛选培养基III（MS0+30g/L蔗糖625mg/L spe+8g/L琼脂）上培养20-30天，抗性胚状体萌发并生根长成抗性再生植株，此时把抗性植株剪下，插入瓶装的筛选培养基III中生根，至此第一轮筛选结束；第二轮筛选是将第一轮筛选获得的抗性植株的叶子剪下在筛选培养基I上以第一轮筛选的方法进行筛选，直至得到抗性植株；第三轮筛选方法和第二轮相同。
本发明的积极效果在于：公开一种转化紫花苜蓿叶绿体的方法，该方法是通过基因枪轰击紫花苜蓿叶片，将轰击后的叶片在含有壮观霉素的筛选培养基上筛选，经过三轮筛选，获得紫花苜蓿叶绿体转基因植株。本发明为紫花苜蓿的叶绿体转化提供了载体和方法，实现了绿色荧光蛋白在紫花苜蓿叶绿体中的表达。
附图说明：
图1是紫花苜蓿叶绿体转化载体pXLW-Ms01的结构图。
图2是紫花苜蓿的叶绿体转化流程；
A-E:第一轮筛选；F:第二轮筛选的开始。
图3是紫花苜蓿叶绿体转基因植株的聚合酶链式反应（PCR）和分子杂交结果；
A，PCR结果；B, Southern blot结果；M:marker；-:水（空白对照）；+:质粒（阳性对照）；WT:未转化植株（野生型，负对照）；A2,A21,B22,C29:转化植株。
图4是紫外光下紫花苜蓿叶绿体转基因植株叶片绿色荧光蛋白的表达结果；
WT:未转化植株（野生型，负对照）；A2,A21,B22,C29:转化植株。
图5是紫花苜蓿叶绿体转基因植株叶片原生质体绿色荧光蛋白的表达结果；
左（绿色）:转化植株在激光激发的显微镜视野下成像；右（灰色）:转化植株在普通显微镜视野下的成像。
具体实施方式：
通过以下实施例进一步描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或者改变都将落入本发明的权利要求范围内。
实施例1：
一、紫花苜蓿叶绿体转化载体的构建方法。
a. 紫花苜蓿16S-trnI-trnA-23S片段的扩增
设计引物P1（5'-cactctgctgggccgacactgacac -3'）、P2（5'- cctggctgtctctgcactcctacct -3'），以紫花苜蓿总DNA为模板，用高保真酶通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，获得4087bp的16S-trnI-trnA-23S片段（见SEQ ID NO:1）；该片段和用PuvII酶切的pUC19质粒大片段相连接。连接产物交由上海捷瑞生物公司测序，测序引物为P3（5'- gcaactgttgggaagggc -3'）、P4（5'- caatacgcaaaccgcctc -3'），确认序列正确后，命名为pUCMS。
b. 紫花苜蓿叶绿体转化载体pXLW-Ms01的构建
首先，设计引物P5（5'-CAATCGCCCTGGGTGGGTTACACG-3'）和P6(5'-CTTGAT
CCACTTGGCTACATCCGC-3')，从质粒pEASY Bs-Syth（本实验室构建）上用高保真酶进行聚合酶链式反应（PCR），扩增出2774bp的绿色荧光蛋白基因（gfp）和壮观霉素抗性基因（aadA）表达框以及多克隆位点，回收产物，命名为gfp-aadA-MCS片段。然后用内切酶PuvII切开pUCMS质粒并gfp-aadA片段连接。连接产物由上海捷瑞生物公司测序，测序引物为P7（5'-CAATTGGATGGACCGTAG-3'）、P8（5'-CATGAAGGAGTC AAATC-3'）。测序序列正确，命名为pXLW-Ms01（图1）。
二、紫花苜蓿的叶绿体转化和筛选
a.培养基。
本发明所用的培养基列在表1中。
表1 紫花苜蓿叶绿体转化涉及到的培养基
| 培养基名称 | 成分 |
| 预培养培养基 | MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2,4-D+8g/L琼脂粉 |
| 筛选培养基I | MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2,4-D+500mg/L spe+8g/L琼脂 |
| 筛选培养基II | MS0+30g/L蔗糖+0.05mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+625mg/L spe+8g/L琼脂 |
| 筛选培养基III | MS0+30g/L蔗糖625mg/L spe+8g/L琼脂 |
b．基因枪轰击。
把紫花苜蓿无菌苗的叶子剪下，把小叶剪开，小叶的背面朝上平铺在预培养培养基上过夜，然后把叶片集中到培养皿的中央，密集铺成直径3厘米的圆。用10μg/μl的质粒pXLW-Ms01包裹直径为0.6μm的金粉颗粒，制成微粒弹并均匀的铺在承载膜中央。打开基因枪电源，把1100psi的可裂膜、粘有微粒弹的承载膜装到基因枪内固定好，也把紫花苜蓿也放入基因枪中，使叶片与微粒弹的距离为9厘米。关上基因枪闭气门，打开真空泵，在真空度为27厘米水银柱Hg条件下轰击。轰击后的叶片放在黑暗下25℃恢复培养3天。
c．筛选。
把恢复培养后的叶片，横切成两段，背面朝下、分散平放到筛选培养基I上，在光下25℃进行筛选。每15-20天更换一次培养基（筛选培养基I），大约60天左右，有抗性胚状体或者抗性愈伤组织长出。把抗性胚状体或抗性愈伤组织转移到新的筛选培养基I上继续培养，其他外植体可以丢弃。两周后，抗性愈伤组织分化为抗性胚状体，此时把抗性胚状体转移到筛选培养基II上，继续培养。两周后，抗性胚状体大量增殖和长大，把长大的胚状体转移到筛选培养基III上培养。20-30天后，抗性胚状体萌发并生根长成抗性再生植株，此时把抗性植株剪下，插入瓶装的筛选培养基III中，约15-20天后生根。至此第一轮筛选结束。第一轮筛选获得的抗性植株的叶子剪下，小叶横切成两段，背面朝下、分散平铺在筛选培养基I上，每个植株一皿，以第一轮筛选的方法进行筛选，直至得到抗性植株。第三轮筛选方法和第二轮相同（见图2）。
d．抗性植株的分子鉴定。
提取叶绿体DNA。将抗性植株的叶子剪下称重，加入6倍体积的叶绿体分离缓冲液I（50mM Tris，25mM EDTA，1.25 NaCl， 0.25M Vc），研磨后用4层纱布过滤，滤液4℃、800rpm离心2min，迅速将上清转到新的离心管中（弃沉淀），4℃、800rpm离心2min重复离心一次。迅速将上清转到新的离心管中（弃沉淀），2500rpm离心6min，弃上清。沉淀用20ml缓冲液B小心重悬，4℃、2500rpm离心6min，弃上清。沉淀用10ml缓冲液I（50mM Tris，25mM EDTA，1.25 NaCl， 10mM β-巯基乙醇（使用前加入），0.1% BSA）重悬沉淀，4℃、2500rpm离心6min，沉淀即为完整的叶绿体。叶绿体加入裂解液（50mM Tris，25mM EDTA），1/20体积的10% SDS溶液、1/5体积的10%十二烷基肌氨酸钠溶液1/200体积的10mg/ml 蛋白酶K，充分混匀，37℃温浴3h。然后用等体积的酚、氯仿各抽提一次，水相加入2.5倍预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，12000rpm离心15min。沉淀用0.5ml TE缓冲液溶解，加入1/100体积的10mg/ml RNase A溶液，混匀，37℃温浴30min，然后用等体积的酚、氯仿各抽提一次，水相加入2.5倍预冷的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000rpm离心15min即得纯净的叶绿体DNA。沉淀用70%乙醇洗涤一次，室温晾干5min，溶解于50μlTE缓冲液中，-20℃保存。
聚合酶链式反应（PCR）检测：设计引物P9（5'-AAACGGAGCACCTAACA-3'）、P10（5'-GGAGAACTGGGAACGAAG-3'），以50ng叶绿体DNA为模板，检测外源基因的插入情况结果见图3A。
分子杂交检测：设计引物P11（5'-GGGGTGACGGCGGGAT-3'）、P12（5'-GGGT GGAGACGAGGGG-3'），以50ng叶绿体DNA为模板扩增出1.1kb的片段作为杂交探针。取4μg叶绿体DNA用EcoRI酶切， 0.8%琼脂凝胶5V/cm电泳4个小时后转移到尼龙膜上。按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I （Roche, Switzerland）试剂盒进行探针标记和杂交操作，结果见图3B。
e．紫花苜蓿叶绿体转基因植株的叶片绿色荧光蛋白的表达检测。
首先，取叶绿体转基因叶片和非转基因叶片，用365nm的紫外光照射，用数码相机拍摄照片（见图4）。将紫外灯下发绿色荧光的植株的叶片用13%的甘露醇高渗处理1个小时，然后用含有1.0%纤维素酶、0.2 %果胶酶的CPW缓冲液(KH2 PO4 27. 2 mg/L, KNO3, 101.0mg/L, CaCl2·2H2O 1480.0mg/L, MgSO4·7H2O, 246.0mg/L, KI 0.16mg/L, CuSO4·5H2O 0. 025mg/L, pH5.8)，放在在28℃、60rpm的摇床中黑暗处理8个小时，分离原生质体。把原生质体滴在盖玻片上，用激光共聚焦扫描显微镜在480nm波长和1000×放大倍数，以0.38μm/张厚度连续扫描，然后进行图像合成。合成后的图像见图5。
SEQ ID NO:1 部分16S-trnI-trnA-部分23S片段（4087bp）
CACTCTGCTGGGCCGACACTGACACTGAGAGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGAGACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGGCTGTGCGTATCGACCCGTGCAATGCTGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAAAGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATGCCGCGAATCCTCTTGAAAGAGAGGAGTGCCTTCGGGAACGCGGACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTGTTTAGTTGCCAACGTTTAGTTTGGAACCCTGAACAGACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGCCCTGGGCGACACACGTGCTACAATGGACGGGACAAAGGATCGCGACCCCGCGAGGGTGAGCTAACTTCAAAAACCCGTCCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACTATGGGAGCTGGCCATGCCCGAAGTCGTTACCTTAACCGCAAGGAGGGGGATGCCGAAGGCAGGGCTAGTGACTGGAGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACTGGAAGGTGCGACTGGATCACCTCCTTTTCAGGGAGAACTAATACTTTTCTGGGTTGTTTGGTTTTACACTGCCTCACACCTCAATAAACATAAAGAAGCGAAGAGCCATTAACAATCTAAAATTGTTGGATGACTTTTCCTTGTTTAAAATAAAAATGGTGAAGTGACAAGTGGAACGGCACTCATAAGATTATTATCCTAGGTCGGAACAAGTTGATAGGAGCTCCCTTTTTTTGTCCCATCTCGCCCCGTGGGGCGACATGAGACAAAAAAGGGGAAAGAGAGAGATGGGGTTTCTCTCGCTTTTGACATAGTGGGCCCCTACGGGAGGCCCACACAACGGGCTATTAGCTCAGTGGTAGAGCGCGCCCCTGATAATTGCGTCGTTGTGCCTGGACTGTGAGGGCTCTCAGCCACATAGATAGTTCAATGTGCTCATCGGCGCCTGACCCTGAGATGTGGATCATCCAAGGCACATTAGCATGGCGTACTTCTCCTGTTTGAACCGGGGTTTGAAACCAAACTTCTCCTCAGGAGGATAGATGGGGCGATTCAGGTGAGATCCAATGTAGATCCAACTTTCTATTCACTCGTGGGATCCGGGCGGTCCAGGGGGGACCATCATGGCTCCTCTCCTCTCGAGAATTCATATATCCCTTATCAGTATATGGACAGCTATCTCTCGAGCACAGGTTTAGGTTTGGCCTCAATAGAAAAAGAAAAACGGAGCACCTAACAACGTATCTTCACAGACCAAGAACTACGAGATCACCTCTTTCATTCTGGGGTGACGGCGGGATCGTACCATTCTCTTGACTCGAAATGGGAGCAGGTAAGAAAAAGGATCTTAGAGTGTCTCTTAACGCCTTCTTTTTTCTTCTCATCAGAGTTATTGTTATTCCACAAATACTTATCATGGTAAGGAAGAAGGGGAAACAAGCACACTTGGAGAGCGCAGTACAATGGATAGTTGTATGCTGCGTTCGGGAAGGATGAATCGCTCCCGAAAAGGAATCTATTGATTCTCTCCCAATTGGATGGACCGTAGGTGCGATGATTTACTTCACGGGCGAGGTCTCTGGTTCAAGTCCAGGATAGCCCAGCTGCGCCAAGGAAAAGAATAAAAGACGGATTTGACTCCTTCATGCATGCTCCAACTTGGCTCGGGGGGATATAGCTCAGTTGGTAGAGCTCCGCTCTTGCAATTGGGTCGTTGCGATTACGGGTTGGATGTCTAATTGTACAGGCGGTAATGATAGTATCTTGTACCTGAACCGGTGGCTCACTTTTTCTAAGTAATGGGAAAGAGGACCGAAACATGCCACTGAAAGACTCTACTAAGACAAAGATGGGCTGTCAAAAACGTAGAGGAGGTAGGATGGGCGGTTGGTCAGATCTAGTATGGATCGTACATGGACGGTAGTTGGAGTCGGTGGCTCTCCTAGGGTTTCCTCATCTGAGATCCTGGGGAAGAGGATTAAGCTGGCCCTTGCGAACAGCTTGATGCACTATCTCCCTTCAACCCTTTGAGCGAAATGCGGGAAAATAAAAGGAAAGAAAATCCATGGACCGACCCCCTCGTCTCCACCCCGTAGGAACTACGAGATCACCCCAAGGACGCCTTCGGCATCCAGGGGTCGCGGACCGACCATAGAATCCTGTTCAAAAAAAAAGCGGAACGCATTAGTTATCCGCTCTCAGGTTGAACAGTTAAGGGTCGGAGAAGTGCAATTACTCATTCTTAACTTAAAACCCACATTCTTAAGAGCAAAGAGTCGGGCGGAAAAAGGGAAGAGAAGCTCTTCGTTCCCAGTTCTCCTGTAGCTGGATCCTCTGGAACCACTAGAATCCTAAGTTTGAATGGGATTCCAACTCAGAACCTTTTGATATTTTGAGAAGAGTTGCTCTTTGGAGAGCACAGTACGATGAAAGTTGTAAGCTGTGTTCGGAGGGTTATTGTCTATCGTTGGCCTCTATGGTAGAATCCGTTGGGGCCTGAGAGGCGGTGATTTACCCTGTGGCGGATGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTTATCTCCAACTCGTGAATTTAGATAATAGAAAACTATATGATAGCACTCATAGCACTCCATTTTTCCAATTCGGTAGTTTGGTTGTAGCTATGGTATGCTTTATCATTTATGGACGTTGATAAGATCCTTCCATCTAGCAGCACCTTAGGATGGCATAGACTTCAAGTTAAGGGCGAGGTTCAAACGAGGAAAGGCTTATGGTGGATACCTAGGCACCCAGAGACGAGGAAGGGCGTAGTAAGCGACGAAATGCTTCGGGGAGTTGAAAATAAGCATAGATCCGAGGATTCCCGAATAGGTCAACCTTTCGAACTGCTGCTGAATTCACGAGCAGGCAAGAGACAACCTGGCGAACTGAAACATCTTAGTAGCCAGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCCGTAGTAGCGGCGAGCGAAATGGGAACAGCCTAAACCGTGAAAACGGGGTTGTGGGAGAGCAGTACAAGCGTCGTGTTGCTAGGCGAAGCAATCGAATGTTGCACCCTAGATGGTGAAAGTCCAGTAGCCGAAAGCATCACTAGCTTATGCTCTGACCCGAGTAGCATGGGGCACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCAAGGACCACCTTGCAAGGCTAAATACTCCTGGGTGACCGATAGTGAAGTAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCCGTCGGGGAGTGAAATAGAACATGAAACCGTAAGCTCCCAAGCAGTGGGAGGAGCTGGGGCTCTGACCGCGTGCCTGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTCATAGGCAGTGGCTTGGTTAAGGGAAACCACCGGAGCCGTAGCGAAAGCGAGTCTTCATAGGGCTATTGTCACTGCTTATGGACCCGAACCTGGGTGATCTATCCATGACCAGGATGAAGCTTAGGTGAAACTAAGTGGAGGTCCGAACCGACTGATGTTGAAAAATCAGCGGATGAGTTGTGGTTAGCGGTGAAATGCCACTCGAACCCAGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGAAATGCGTTGAGGCGCAGCAGTTGACTGGACATCTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGCGCGGGCCGCGAGAGCGGTACCAAATCGAGGCAAACTCTGAATACTAGATATGACCCCAACGGGTCAAGGTCGGCCAGTGAGACGATGGGGGATAAGCTTCATCGTCGAGAGGGAAACAGCCCAGATCACCAGCTAAGGCCCCTAAATGATCGCTCAGTGATAAAGGAGGTAGGAGTGCAGAGACAGCCAGG
Claims (2)
1.一种紫花苜蓿叶绿体转化质粒载体pXLW-Ms01，如图1所示。
2.一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法，包括如下步骤：
1)基因枪法轰击叶片：把紫花苜蓿无菌苗的叶子剪下，把小叶剪开，小叶的背面朝上平铺在预培养培养基上过夜，然后把叶片集中到培养皿的中央，密集铺成直径3厘米的圆；用10μg/μl的质粒pXLW-Ms01包裹直径为0.6μm的金粉颗粒，制成微粒弹并均匀的铺在承载膜中央；打开基因枪电源，把1100psi的可裂膜、粘有微粒弹的承载膜装到基因枪内固定好，也把紫花苜蓿也放入基因枪中，使叶片与微粒弹的距离为9厘米；关上基因枪闭气门，打开真空泵，在真空度为27厘米水银柱Hg条件下轰击；轰击后的叶片放在黑暗下25℃恢复培养3天；
2)筛选：把恢复培养后的叶片，横切成两段，背面朝下、分散平放到筛选培养基I上，在光下25℃进行筛选，每15-20天更换一次培养基I，待有抗性胚状体或者抗性愈伤组织长出，把抗性胚状体或抗性愈伤组织转移到新的筛选培养基I上继续培养两周，再把抗性胚状体转移到筛选培养基II上，继续培养两周，把长大的胚状体转移到筛选培养基III上培养20-30天，抗性胚状体萌发并生根长成抗性再生植株，此时把抗性植株剪下，插入瓶装的筛选培养基III中生根，至此第一轮筛选结束；第二轮筛选是将第一轮筛选获得的抗性植株的叶子剪下在筛选培养基I上以第一轮筛选的方法进行筛选，直至得到抗性植株；第三轮筛选方法和第二轮相同；
所述的预培养培养基组份为：MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2，4-D+8g/L琼脂；
所述的筛选培养基I组份为：MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2，4-D+500mg/Lspe+8g/L琼脂；
所述的筛选培养基II组份为：MS0+30g/L蔗糖+0.05mg/L6-BA+0.25mg/LNAA+625mg/L spe+8g/L琼脂；
所述的筛选培养基III组份为：MS0+30g/L蔗糖+625mg/L spe+8g/L琼脂。
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