CN103374061A - 一种来源于羊草与抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源于羊草并与盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因Lc3670受高盐诱导，其转基因植物具有较强的抗盐能力，实验显示，经150mM NaCl胁迫后第25天野生型拟南芥植株有73.6％的植株出现叶片逐渐发白死亡，而转Lc3670基因植株只有23.1％左右的植株叶片变白死亡，可见Lc3670基因可作为植物抗盐基因工程的候选基因，用来改良植物的抗盐能力。

Description

一种来源于羊草与抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种源于羊草并与盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

目前，土壤盐渍化是一个世界性的难题，据不完全统计，当前全世界盐渍土壤面积为9.54×10⁸hm²，我国各类盐渍土壤总面积约0.99×10⁸hm²。盐渍化土地面积的不断扩大、程度不断加深，严重制约了农业和畜牧业的发展，因此，利用转基因技术改良作物的耐盐性，提高农作物和各种畜牧草类对盐的适应能力，是当前现代农业与畜牧业技术领域的研究热点，同时也是我国及世界农业与畜牧业亟需解决的重大课题。

植物对盐渍胁迫的抵抗和忍耐能力称为抗盐性，抗盐性是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应结果。植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。多年来，人们对植物响应盐胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料。但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚；虽然有许多植物进行了耐盐基因的转化，但转化植株耐盐性提高有限，离生产应用还有一定距离。同时，由于植物抗盐机制的复杂性，利用传统育种方法提高植物的抗盐性十分困难；转基因方法为植物抗盐育种提供了有效途径，但高效抗盐基因的分离和功能验证成为植物耐盐基因工程的瓶颈因素。

近年，随着高通量测序技术的广泛应用，利用高通量测序技术对特定胁迫处理的植物材料进行全面的差异表达基因分析，为参与胁迫应答特异新基因的发现开拓了新的途径。通过对耐盐新基因的发掘和功能验证，人们对植物耐盐机制的了解将更深入，同时，通过现代基因工程手段将获得更多的耐盐突变体和耐盐转基因植物，并最终培育出能用于生产的耐盐作物和牧草品种，从而推动我国和世界盐碱地及次生盐碱地的开发利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因和应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为Lc3670，来源于羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

序列表中序列1由251个氨基酸残基组成。

编码所述Lc3670蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Lc3670蛋白的基因(命名为Lc3670)；所述Lc3670基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第206至961位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述Lc3670蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且所述Lc3670蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

其中，序列2由1025个核苷酸组成，第206-961位为编码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述Lc3670基因转录的启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pSN1301质粒的多克隆位点处插入所述Lc3670基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为KpnI和SacI。

所述表达盒由能够启动所述Lc3670基因表达的启动子，所述Lc3670基因，以及转录终止序列组成。

所述Lc3670蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围：

a1)调控植物抗盐性；

a2)选育抗盐植物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植株抗盐性具体为提高植物的抗盐性。

所述选育抗盐植物品种的方法，具体可包括将所述Lc3670蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法。

该方法包括将编码所述Lc3670蛋白的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提高。

所述Lc3670蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述Lc3670蛋白的基因(即Lc3670基因)是所述基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第206至961位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且所述Lc3670蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且所述Lc3670蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述Lc3670基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥品种哥伦比亚(CoI-O)。

扩增所述Lc3670基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的Lc3670可以调控植物抗盐胁迫能力，受盐胁迫诱导，可以参与羊草对盐胁迫的响应，提高植物的抗盐，Lc3670及其编码基因对于培育抗盐性提高的羊草及其他植物新品种具有重要实用价性。实验证明，经150mM NaCl胁迫后第25天野生型拟南芥植株有73.6％的植株出现叶片逐渐发白死亡，而转Lc3670基因植株只有23.1％左右的植株叶片变白死亡。可见值，可用于农牧业和生态环境治理及能源植物所需的抗旱新品种的培育与鉴定，具有较高的应用价值。本发明在农业、畜牧业及绿色清洁能源等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为羊草总RNA的电泳图谱。泳道1-泳道3为三个重复，每个泳道中的两个条带从上到下依次为28S RNA和18S RNA。

图2为Lc3670基因的5’RACE PCR扩增产物和3’RACE PCR扩增产物电泳图。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为5’RACE PCR扩增产物；泳道2为3’RACE PCR扩增产物。

图3为Lc3670基因全长cDNA的PCR扩增结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为PCR扩增产物。

图4为Lc3670基因的基因组序列PCR扩增结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为基因组序列扩增产物。

图5为Lc3670基因在盐胁迫(400mM NaCl)条件下的表达量分析。其中，CK表示处理时间为0h。

图6为Lc3670基因在不同组织中的表达量分析。

图7为转入pMDC45空载体的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。

图8为转入重组表达载体pMDC45-Lc3670的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。

图9为重组表达载体pSN1301-Lc3670的KpnI和SacI的双酶切鉴定结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为pSN1301-Lc3670质粒条带；泳道2为pSN1301-Lc3670质粒酶切条带。

图10为重组表达载体pSN1301-Lc3670转化农杆菌的PCR鉴定结果。其中，泳道1-5为重组表达载体pSN1301-Lc3670转化农杆菌的PCR鉴定结果，共五个重复；泳道CK为pSN1301转化农杆菌的PCR鉴定结果；泳道M为DL2000DNA分子量标准。

图11为转基因拟南芥植物基因组PCR检测结果。其中，a为Col-0/pSN1301-Lc3670的PCR检测结果；b为Col-0/pSN1301的PCR检测结果。a中，泳道1-8表示不同的Col-0/pSN1301-Lc3670株系，泳道ck表示转空载的拟南芥植株对照，泳道M为DL2000DNA分子量标准。b中，泳道1-4表示不同的Col-0/pSN1301株系；泳道ck为负对照(野生型拟南芥Col-0)；泳道M为DL2000DNA分子量标准。

图12为T3代转Lc3670基因拟南芥的抗盐性检测结果。其中，A为转基因株系3-3；B为转基因株系3-5。A和B中，平皿的上半部分(黑色线条的上方)为野生型(WT)；平皿的下半部分(黑色线条的下方)为转基因株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、羊草抗盐相关基因Lc3670全长cDNA序列及基因组序列的获得

一、羊草抗盐相关基因Lc3670的5’端序列的克隆

1、植物材料处理及总RNA的提取

以羊草(Leymus chinensis(Trin.)品种吉生一号(吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料，盐胁迫(400Mm NaCl)处理6小时后提取总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、羊草抗盐抗盐相关基因Lc3670的5’端序列的克隆

以步骤1提取的经盐胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的5’RACE试剂盒(产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成5′端cDNA模板。反应体系(10μl)：1μl RNA，1μl 5′-CDS primerA，1μl SMART II A oligo，1μlDTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl反转录酶MMLV，2μl 5×First-StrandBuffer，2μl H₂O(所述5′-CDS primer A、SMART II A oligo、5×First-Strand Buffer等组分均为随试剂盒提供)。反应条件：70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃10min。

根据本实验室454转录组测序结果，筛选出与胁迫相关的基因序列，设计引物，具体的引物序列如下：

Lc1：5′-CTCCAAATCCACCGCCGTCTATGC-3′(序列2的第637-660位的方向互补序列)

以上述合成的5′端cDNA为模板，引物Lc1与引物UPM(Clontech公司：Long(0.4μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，Short(2μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)配对进行PCR扩增。PCR反应体系(50μl)：1μl 50×Advantage 2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water，5μl 10×Advantage 2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，5μl UPM，1μl引物Lc1，2.5μlcDNA模板(所述50×Advantage 2Polymerase Mix、PCR-Grade Water、Advantage 2PCRBuffer等组分是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份)。反应条件为：94℃30s，68℃30s，70℃60s，共35个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2泳道1所示，经PCR扩增获得了长度约为650bp的目的片段。回收并纯化5’RACE产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为660bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3(序列2的前660位)所示。

二、羊草抗盐相关基因Lcl3670的3’端序列的克隆

以步骤一提取的经盐胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的3’RACE试剂盒(产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成其3’端cDNA。反应体系(10μl)：1μl RNA，1μl 5′-CDS primerA，1μl DTT(20mM)，1μl dNTPMix(10mM)，1μl反转录酶MMLV，2μl 5×First-Strand Buffer，3μl H₂0。(所述5′-CDSprimer A、SMART II A oligo、5×First-Strand Buffer等组分随试剂盒提供)反应条件：70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃10min。

根据上述步骤一获得的Lc3670基因5’端cDNA序列(序列3)设计引物：

Lc2：5′-GATGTGCTGTCTGCCGCTGCTCC-3′(序列2的第247-269位)。

以获得的3’端cDNA为模板，引物Lc2与引物UPM(Clontech公司：Long(0.4μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，Short (2μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)配对进行PCR扩增。PCR反应体系(50μl)：1μl 50×Advantage 2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water,5 μl10×Advantage 2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，5μl UPM，1μl引物Lc2，2.5μl cDNA模板(所述50×Advantage 2Polymerase Mix、PCR-Grade Water、Advantage 2PCR Buffer等组分是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份)。反应条件：先94℃30s，68℃30s，70℃60s，共35个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2泳道2所示，经PCR扩增获得了长度约为800bp的目的片段。回收并纯化3’RACE产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为778bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4(序列2的第247-1025位)所示。

三、羊草抗盐相关基因Lc3670全长cDNA序列的获得及PCR检测

利用上述步骤一和步骤二获得的长度为660bp(序列3)和778bp(序列4)片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的Lc3670基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由1025个碱基组成，白5’端第206位-第961位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的蛋白质。序列表中序列1由251个氨基酸残基组成。

根据Lc3670基因全长cDNA序列(序列2)设计如下引物：

Lc3：5′-CCAGAAGGACCCAGGCTTC-3′(序列2的第966-984位的反向互补序列)

以反转录获得的cDNA为模板，引物Lc3与引物NUP：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(Clontech公司)配对进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，经PCR扩增获得了长度约为1000bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列(序列2)在扩增部分完全相同，扩增部分的片段的核苷酸序列如序列2的自5’端第1-984位所示，自5’端第206位-第961位为其编码序列。这表明所克隆的3’RACE片段和5’RACE片段属于同一基因，将该基因命名为Lc3670，将其编码的蛋白命名为Lc3670。

四、羊草抗盐相关基因Lc3670基因组序列的获得

以羊草(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料，盐胁迫处理6小时后利用CTAB法提取其基因组DNA，贮存于-20℃备用。

以上述获得的基因组DNA为模板，根据步骤三获得的Lc3670基因全长cDNA序列(序列2)设计引物Lc4：5′-TGGCTCTCATTTCTCCTCTTTCG-3′(序列2的第32-54位)与引物Lc3：5′-CCAGAAGGACCCAGGCTTC-3′(序列2的第966-984位的反向互补序列)配对进行PCR扩增。PCR反应体系(20μl)：cDNA模板、Lc3引物与Lc4各1μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O 12.25μl。反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，经PCR扩增获得了长度约为1000bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为953bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5(序列2的第32-984位)所示，通过比对与cDNA序列一致，表明所得到为羊草抗盐相关基因Lc3670的基因组序列，分析表明该基因没有内含子序列。

实施例2、Lc3670基因在胁迫条件下的表达模式及组织特异性分析

将正常生长5周的羊草(吉生一号)幼苗进行盐胁迫(400mM NaCl)处理。胁迫处理时间为0、1、3、5、8、12、24小时。分别提取上述处理羊草幼苗的总RNA，分别通过RT-PCR方法分析Lc3670基因在不同胁迫条件下的表达模式。其中扩增Lc3670基因引物序列为5′-TGTGCTGTCTGCCGCTGCTC-3′(序列2的第249-268位)和5′-TCCACCGCCGTCTATGCTG-3′(序列2的第635-653位的反向互补序列)；反应条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。以Actin作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为5′-GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT-3′和5′-CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC-3′；反应条件为94℃4min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，28个循环；72℃10min。

结果如图5所示，Lc3670基因的转录水平明显受盐胁迫诱导，随着盐胁迫时间的延长，Lc3670基因的表达量迅速增加。

以2年生羊草(吉生一号)为实验材料，分别提取根、根茎、叶鞘、茎、芽、叶和幼穗共七种组织的总RNA，利用RT-PCR分析Lc3670基因的组织特异性表达模式。

结果如图6所示，Lc3670基因在羊草的根、根茎、叶鞘、茎、芽、叶和幼穗七种组织中的表达存在差异，其中在根和根茎中表达量最高。

实施例3、Lc3670基因的亚细胞定位

将上述实施例1扩增得到的Lc3670基因经重组LR反应连接到含有GFP的载体pMDC45(Mark Curtis&Ueli Grossniklaus(2003).Plant Physiology 133：462-469)重组位点间，将得到的重组表达载体命名为pMDC45-Lc3670。将重组表达载体pMDC45-Lc3670通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105，采用叶脉注射的方法转入幼嫩的烟草叶片细胞，同时以转入pMDC45空载体的烟草表皮细胞作为对照。转化的烟草在23℃条件下生长2-3d后用激光共聚焦/TIRF显微镜(Leica TCS SP5)下观察并照相。

结果如图7(转入pMDC45空载体的烟草)和图8(转入重组表达载体pMDC45-Lc3670的烟草)所示：转入载体pMDC45的转基因细胞中表达的蛋白分布在整个细胞内；转入Lc3670重组表达载体pMDC45-Lc3670的转基因细胞中表达的蛋白也遍布整个细胞。这一结果表明Lc3670基因在烟草表皮细胞的细胞核，细胞膜及细胞质中均有表达。

实施例4、转Lc3670基因拟南芥的获得及其抗盐性检测

一、重组表达载体pSN1301-Lc3670的构建

以实施例1扩增得到的Lc3670基因(序列2的第206-961位)为模板，以两端分别带有酶切位点KpnI和SacI的上下游引物5’-GGGGTACCATGGCTAGATGTGCCGCT-3’(划线处为KpnI的识别位点)和5’-CGAGCTCTTAGATAGACATGAAAACAC-3’(划线处为SacI的识别位点)进行PCR扩增，得到大小为771bp的目的条带，将该目的条带用限制性内切酶KpnI和SacI进行双酶切。与经同样酶切的植物表达载体pSN1301(Zhou J，etal.Basic helix-loop-helix transcription factor from wild rice(OrbHLH2)improves toleranceto salt-and osmotic stress in Arabidopsis.J Plant Physiol(2009)，doi：10.1016/j.jplph.2009.02.007)的骨架片段相连，获得重组质粒。对所得的重组质粒进行KpnI和SacI的双酶切鉴定，将经鉴定表明含有大小为768bp目的条带(见图9)的重组质粒进行测序，将经测序表明含有序列表中序列2的第206-961位的重组质粒命名为pSN1301-Lc3670。

二、转Lc3670基因拟南芥的获得

将步骤一构建的重组表达载体pSN1301-Lc3670(或pSN1301空载体)通过冻融法(Holsters M，de Waele D，Depicker A.Transfection and transformation of Agrobacteriumtumefaciens.Mol Gen Genet，1978，183：181-187)导入根癌农杆菌EHA105。对转化后的重组农杆菌用由5’-GGGGTACCATGGCTAGATGTGCCGCT-3’和5’-CGAGCTCTTAGATAGACATGAAAACAC-3’组成的引物对进行PCR鉴定，鉴定结果见图10。将经鉴定表明含有Lc3670基因(PCR目的条带大小为771bp)的农杆菌EHA105命名为EHA105/pSN1301-Lc3670；将转入pSN1301空载体的农杆菌EHA105命名为EHA105/pSN1301。

采用农杆菌花序侵染的方法(Bechtold N等，(1993)In plantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants.C.R.Acad.Sci.316：1194-1199)将上述所得的重组农杆菌EHA105/pSN1301-Lc3670(或EHA105/pSN1301)转化拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)。

转化后进行潮霉素抗性筛选，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子(T₁代)，并在含有潮霉素B抗生素的平板上培养。再次通过潮霉素抗性筛选，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pSN1301-Lc3670的拟南芥植株和转入pSN1301空载体的拟南芥植株。

进一步对上述获得的两种转基因拟南芥植株(T₁代)进行PCR鉴定，筛选PCR鉴定阳性株系。分别提取两种转基因拟南芥植株的基因组DNA作为模板，对与转入pSN1301-Lc3670的拟南芥植株的PCR鉴定，以为Lc3670靶基因，以5’-GGGGTACCATGGCTAGATGTGCCGCT-3’和5’-CGAGCTCTTAGATAGACATGAAAACAC-3’为引物，进行PCR扩增；对与转入pSN1301空载体的拟南芥植株的PCR鉴定，以为GUS靶基因，以5’-ACGGCAAAGTGTGGGTCAA-3’和5’-GCGTAAGGGTAATGCGAGG-3’为引物，进行PCR扩增。同时设置野生型拟南芥Col-0作为负对照。结果显示：可以扩增出预计大小的片段(图11)。将经PCR鉴定表明含有Lc3670基因(目的条带大小约为771bp)的转入pSN1301-Lc3670的拟南芥命名为Col-0/pSN1301-Lc3670；同时将转入pSN1301空载体的拟南芥(目的条带大小约为721bp)命名为Col-0/pSN1301。将获得的T₁代转基因拟南芥植株自交授粉，获得T₂代种子，T₂代自交繁殖获得T₃代。

三、T3代转Lc3670基因拟南芥的抗盐性检测

选取6个T3代纯合体株系(见表1)进行抗盐试验。方法如下：将在基本MS培养基上生长10d的转Lc3670基因拟南芥苗Col-0/pSN1301-Lc3670)分为两组，每组12株，其中一组移栽至含150mM NaCl的MS培养基上培养，另一组在不含NaCl的MS培养基上培养，观察其表型，25d后并统计存活率。同时设置未转基因的拟南芥植株(WT)作为空白对照，设置转入pSN1301空载体的T3代Col-0/pSN1301作为空载体对照。设三次重复实验，结果取平均值。

结果显示，前4天转基因植株(转基因株系3-3和转基因株系3-5，图12)和野生型植株(图12)在表型上不存在明显差异，从胁迫处理的第6天开始统计，到第25天野生型拟南芥植株有73.6％的植株出现叶片逐渐发白死亡，而转基因植株只有23.1％左右的植株叶片变白死亡(表1)。这表明转Lc3670基因株系和作为空白对照的WT(野生型)拟南芥及作为空载体对照的CoI-0/pSN1301相比，抗盐能力得到明显提高。在不含NaCl的MS培养基上正常培养的拟南芥植株均生长正常。

表1  T3代转Lc3670基因拟南芥在盐胁迫(150mM NaCl)下的存活率统计

注：粗体的平均值为转Lc3670基因拟南芥植株或野生型拟南芥植株在盐胁迫下的存活率平均值。

Claims (9)

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第206至961位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。

7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物抗盐性；

a2)选育抗盐植物品种。

8.一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提高。

9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

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