CN103374065B - 源于羊草与抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源于羊草并与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白及其编码基因可作为植物抗盐基因工程的候选基因，用来改良植物的抗盐能力：在盐胁迫(200mM NaCl)处理后第21天，转LcMYB7342基因拟南芥苗全部表型正常，而野生型拟南芥苗78.6％出现了萎蔫变黄的盐害症状。LcMYB7342基因可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高实际应用价值，在农业、畜牧业领域具有广阔应用前景。

Description

源于羊草与抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种源于羊草并与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

不良自然环境，如低温、高温、干旱和盐渍等作用于植物会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，从而导致整个植株死亡。盐胁迫破坏植物体内的离子平衡，造成渗透胁迫，进而引起植物体内发生一系列的生理和代谢反应，影响植物的生长发育。今天全世界20％的农田受到高盐胁迫的影响，高盐胁迫使作物产量降低，极大地影响了农业生产。由于植物的耐盐的复杂性，由多基因控制，利用传统育种的方法来提高作物的抗盐能力十分困难。利用基因工程手段改良作物的耐高盐能力，是我国以及世界农业急需解决的重大课题，也是当前生物和现代农业技术领域的研究热点。

近些年来，人们在生理、生化、分子和遗传等层面上对植物耐盐机理做了大量工作。当前的研究认为，要达到离子平衡，植物必须要进行三方面的相互联系的调节。首先，必须防止植物受到毒害；其次，植物在逆境下要重建一个平衡的体内环境；最后，生长必须可以恢复。因此，挖掘与这三方面相关的基因资源，筛选出有显著作用的基因，通过转基因来提高作物的抗盐能力，成为我们工作的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因和应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为LcMYB7342，来源于羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐性相关的由序列1衍生的蛋白质。

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

序列表中序列1由169个氨基酸残基组成。

为了便于LcMYB7342蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)中的LcMYB7342蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的LcMYB7342蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第536-1045位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。

编码所述LcMYB7342蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述LcMYB7342蛋白的基因(命名为LcMYB7342)；所述LcMYB7342基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第536至1045位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述LcMYB7342蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述LcMYB7342蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由1168个核苷酸组成，第536-1045位为编码序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组克隆载体具体为将所述核酸分子(基因)连入pMDTM19-T Simple载体所得的重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述LcMYB7342基因转录的启动子具体为35S启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在p3301-121载体的多克隆位点处插入所述LcMYB7342基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为BamHI和XbaI。

所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoR I双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含GUS基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接，得到重组载体p3301-121。

所述表达盒由能够启动所述LcMYB7342基因表达的启动子，所述LcMYB7342基因，以及转录终止序列组成。

所述LcMYB7342蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围：

a1)调控植物抗盐性；

a2)选育抗盐植物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植株抗盐性具体为提高植物的抗盐性。

所述选育抗盐植物品种的方法，具体可包括将所述LcMYB7342蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法。

该方法包括将编码所述LcMYB7342蛋白的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提高。

所述LcMYB7342蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述LcMYB7342蛋白的基因(即LcMYB7342基因)是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第536至1045位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述LcMYB7342蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述LcMYB7342蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述LcMYB7342基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)。

扩增所述LcMYB7342基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，所述引物对具体为由序列表中序列3所示的单链DNA和由序列表中序列4所示的单链DNA组成的引物对。

其中，序列3由32个核苷酸组成；序列4由30个核苷酸组成。

本发明所提供的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcMYB7342受高盐诱导，可作为植物抗盐基因工程的候选基因：在盐胁迫(200mM NaCl)处理后第21天，转LcMYB7342基因拟南芥苗88.9％表型正常；野生型拟南芥苗78.6％出现了萎蔫变黄的盐害症状，并死亡。这表明LcMYB7342基因可用来改良植物的抗盐能力，对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值，在农业、畜牧业领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为羊草总RNA的电泳图谱。其中，泳道1-泳道2为两个重复，每个泳道中的两个条带从上到下依次为28S RNA和18S RNA；泳道M是DL 2000plus分子量标准。

图2为LcMYB7342基因的5’RACE PCR扩增产物。其中，泳道M为DL2000PlusDNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为5′RACEPCR扩增产物；泳道2为负对照(H₂O为模板扩增结果)。

图3为LcMYB7342基因全长cDNA的PCR扩增结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准；泳道1为PCR扩增产物。

图4为LcMYB7342基因在高盐胁迫(400mM NaCl)下的表达量分析。其中，0h均为未经任何胁迫处理为对照(CK)。

图5为LcMYB7342基因在不同组织中的表达量分析。

图6为重组表达载体p3301-121-LcMYB7342的构建流程图。

图7为重组载体p3301-121的构建流程图。

图8为重组表达载体p3301-121-LcMYB7342转化农杆菌的PCR鉴定结果。其中，泳道1-5为重组表达载体p3301-121-LcMYB7342转化农杆菌挑取不同的克隆进行菌液PCR鉴定结果；泳道M为DL2000DNA分子量标准。

图9为转基因拟南芥植物基因组PCR检测结果。其中，泳道1-7表示不同的Col-0/p3301-121-LcMYB7342株系，泳道CK-表示野生型Col-0；泳道M为DL2000DNA分子量标准。

图10为T3代转LcMYB7342基因拟南芥的抗盐性检测结果。其中，平皿的上半部分(黑色线条的上方)为野生型(WT)；平皿的下半部分(黑色线条的下方)为转基因株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与植物抗盐性相关的基因LcMYB7342的获得及其表达特异性检测

一、与植物抗盐性相关的基因LcMYB7342的获得

1、植物材料处理及总RNA的提取

以羊草(Leymus chinensis(Trin.)品种吉生一号(吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料，用400mM NaCl处理10小时后提取其总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18SRNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、利用454技术对羊草转录组进行测序

首先利用MACS^TMmRNA分离试剂盒(美天旎公司)处理上述步骤1提取的RNA，得到mRNA，然后反转录得到cDNA，将得到的cDNA插入λ-FLC-III载体然后包装，得到1.1×10⁶个噬菌斑。噬菌体经过离体处理得到的质体转化大肠杆菌感受态细胞DH10B(杰美公司)，然后用包装机器(Genetix公司)包装。包装完毕后转移到384微孔板，DNA测序模板用RCA方法，使用TempliPhi DNA扩增试剂盒(通用生物公司)得到。最后测序用Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit，在ABI 3700(应用生物系统公司)测序仪上完成。得到的序列经拼接后，该DNA片段的长度为583bp。

3、与植物抗盐性相关的基因LcMYB7342的5′端序列的克隆

以步骤1提取的经400mM NaCl处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的5′RACE试剂盒(产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系(10μl)：1μL RNA，1μL 5′-CDS primer A，1μL SMART II A oligo，1μL DTT(20mM)，1μL dNTP Mix(10mM)，1μL反转录酶MMLV，2μL 5×First-StrandBuffer，2μL H₂O(所述5′-CDS primer A、SMART II A oligo、5×First-Strand Buffer等组分均为随试剂盒提供)。反应条件：70℃ 2min，冰上2min，42℃ 1.5h，72℃ 7min。

根据步骤2中454测序得到的序列设计引物，具体的引物序列如下：

LcMYB7342R：5′-ACTGAGGATGAAGATGATGAGGG-3′(序列2第692-714位的反向互补序列)。

以上述第一链cDNA为模板，以LcMYB7342R和UPM(Clontech公司，Long(0.4μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，short(2μM)：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)两个引物配对进行PCR扩增；PCR反应体系(10μl)：5′端cDNA模板0.5μL，10×UPM 1μl，引物LcMYB7342R 0.2μl，Master Mix(Clontech公司Advantage 2 Polymerase Mix产品目录号Cat.Nos.639206)8.3μl。反应条件：先94℃ 30s、72℃ 3min，5个循环；然后94℃ 30s、70℃ 30s、72℃3min，5个循环；最后94℃ 30s、68℃ 30s、72℃ 3min，25个循环。同时设置以H₂O代替模板的负对照。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，经PCR扩增获得了长度约为700bp的目的片段。回收并纯化5′RACE产物，将其连接到pMD-18T载体(TaKaRa公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。结果表明，该片段的长度为714bp，其核苷酸序列为序列表中序列2的第1-714位。

4、LcMYB7342基因全长cDNA序列的获得及PCR检测

利用上述步骤2和步骤3获得的长度为583bp和714bp片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的LcMYB7342基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示，序列表中序列2由1168个碱基组成，自5’端第536位-1045位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的蛋白质。序列表中序列1由169个氨基酸残基组成。

根据LcMYB7342基因全长cDNA序列(序列2)设计如下引物：

7342fullf：5′-GAGGGAACAAAGGTCAGCTTGC-3′(序列2的前22位核苷酸)

7342fullr：5′-GAATGCTAGATAGATATAAAT-3′(序列2的第1148-1168位的反向互补序列)

以步骤1提取的经400mM NaCl处理的羊草幼苗的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，以7342fullf和7342fullr作为引物对，进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，经PCR扩增获得了长度约为1100bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列(序列2)在扩增部分完全相同，PCR扩增产物序列全长为1168bp，其核苷酸序列为序列表中序列2。序列2由1168个碱基组成，自5’端第536位-1045位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的蛋白质。序列表中序列1由169个氨基酸残基组成。将序列2所示基因命名为LcMYB7342，将该基因编码的蛋白质命名为LcMYB7342。

二、LcMYB7342基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

将正常生长8周的羊草(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站)幼苗分别进行不同时间(1、3、8、12、24h)的高盐(400mM NaCl)胁迫处理，同时设未经任何胁迫处理为对照(CK)。分别提取各处理的羊草幼苗的总RNA，通过real time RT-PCR方法分析LcMYB7342基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式。其中扩增LcMYB7342基因的引物序列为5′-GATTACTACAGCCCTGAGGCAG-3′(序列2的第953-974位)和5′-GAATGCTAGATAGATATAAAT-3′(序列2的第1148-1168位的反向互补序列)；反应条件：95℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环。以Actin作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为5′-GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT-3′和5′-CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC-3′；反应条件：95℃ 30s；94℃ 5s，60℃30s，40个循环。

结果如图4所示，LcMYB7342基因的转录水平明显受盐胁迫的诱导。

三、LcMYB7342基因的组织特异性表达分析

分别提取步骤一中经400mM NaCl处理的羊草(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站)幼苗的叶鞘、茎、叶、根和根茎五种组织的总RNA。

利用上述LcMYB7342基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析中LcMYB7342引物进行RT-PCR，同时以Actin基因作为内标，分析LcMYB7342基因的组织特异性表达模式。

反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。电泳结果表明LcMYB7342基因在所选的叶鞘、茎、叶、根和根茎五种组织中都有明显的表达，其中在叶和根中表达较强，其它部位表达基本相同。

实施例2、转LcMYB7342基因拟南芥植株的获得及其抗逆性分析

一、转LcMYB7342基因拟南芥植株的获得

1、重组表达载体p3301-121-LcMYB7342的构建

根据上述实施例1扩增得到的LcMYB7342基因设计引物，加入XbaI和BamH I酶切位点，引物序列如下：

引物1：5′-CGTCTAGAATGAAGAACGCCTCATCCTCGAGC-3′(下划线部分为XbaI的识别序列，其后的序列为序列2的第536-559位)(序列表中序列3)

引物2：5′-CGGATCCATAACCAGGGCCAATTCCTTTAC-3′(下划线部分为BamH I位点，其后的序列为序列2的第1020-1042位的反向互补序列)(序列表中序列4)

以人工合成的序列表中序列2所示的LcMYB7342基因为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增，将扩增得到的含BamH I和Xba I酶切位点PCR产物克隆入pMD^TM19-TSimple载体(TaKaRa公司)，命名为pMD19-LcMYB7342。将pMD19-LcMYB7342利用BamH I和Xba I进行双酶切，回收约500bp的LcMYB7342基因片段，同时用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切p3301-121载体(其构建方法见下文)，回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的约500bp的LcMYB7342基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证。将经测序表明在载体p3301-121的BamHI和XbaI酶切位点间插入了序列表中序列2的第536到1045位所示的LcMYB7342基因片段，证明质粒构建正确，该重组质粒含有LcMYB7342完整阅读框，将其命名为p3301-121-LcMYB7342，构建过程如图6所示。

上述p3301-121载体是通过如下方法构建得到的：

(1)将pCAMBIA3301载体(CAMBIA公司)经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11246bp的载体大片段；

(2)将pBI121载体(Clontech公司)(含35S启动子，GUS报告基因，T-nos终止子)也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含GUS基因的2942bp的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体p3301-121(图7)。

2、转LcMYB7342基因拟南芥的获得

将上述步骤1构建好的重组植物表达载体p3301-121-LcMYB7342(或p3301-121空载体)通过冻融法(参考Holsters M，de Waele D，Depicker A.Transfection andtransformation of Agrobacterium tumefaciens.Mol Gen Genet，1978，183：181-187)转入农杆菌EHA105(北京拜尔迪生物技术有限公司)。对转化后的重组农杆菌用由5’-ATGAAGAACGCCTCATCCTCGAGC-3’(序列2的第536-559位)和5’-ATAACCAGGGCCAATTCCTTTAC-3’(序列2的第1020-1042位的反向互补序列)组成的引物对进行PCR鉴定，鉴定结果见图8。将经鉴定表明含有LcMYB7342基因(PCR目的条带大小为507bp)的农杆菌EHA105命名为EHA105/p3301-121-LcMYB7342；将转入p3301-121空载体的农杆菌EHA105命名为EHA105/p3301-121。

采用农杆菌花序侵染的方法(Bechtold N等，(1993)In plantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants.C.R.Acad.Sci.316：1194-1199)将上述所得的重组农杆菌EHA105/p3301-121-LcMYB7342(或EHA105/p3301-121)转化拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)。转化后暗培养2天，进行第二次浸染，然后正常培养到收获种子(T0)。收获的种子在含除草剂抗性的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上进行抗性筛选，收获抗性苗的种子(T1)，收获的种子在含除草剂的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上种植，筛选后代分离比为3∶1的株系，收获其种子(T2)，T₂代自交繁殖获得T3代。

进一步对用T3代的转基因拟南芥苗进行PCR检测，以转基因拟南芥苗的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为35SF和LcMYB7342F2。

35SF：5′-TCTTCAAAGCAAGTGGATTGA-3′(来自p3301-121载体35S序列)

LcMYB7342F2：5′-ATAACCAGGGCCAATTCCTTTAC-3′(序列2的第1020-1042位的反向互补序列)

PCR检测结果如图9所示，不同的转基因株系均扩增得到了长度约为680bp的片段。而用同样的引物对野生型拟南芥Col-0植株进行PCR检测，未得到上述扩增片段。此结果表明，所检测的7个转LcMYB7342基因株系均为阳性。

二、转LcMYB7342基因拟南芥植株的抗逆性分析

选取经上述步骤一验证的T₃代转LcMYB7342基因拟南芥植株的种子，随机分成两组，种于含除草剂培养基(1/2MS+10mg/L草胺磷)上，萌发生长(萌发生长条件为：温度为22-24℃，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为60％-80％)一周，然后将其中一组移栽到含200mM的NaCl的MS培养基上进行盐胁迫实验，另一组在不含NaCl的MS培养基上培养，每皿移栽12棵苗。移栽后放在培养室培养(培养室培养的条件：温度为22-24℃，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为50-60％)。胁迫处理3天后开始观察表型，观察到胁迫处理第21天，并统计存活率。同时设置野生型拟南芥植株(WT)作为对照组。实验设3次重复，结果取3次重复的平均值。

结果如图10和表1所示显示，在胁迫处理第21天进行统计分析，转LcMYB7342基因拟南芥苗88.9％表型正常；野生型拟南芥苗78.6％出现了萎蔫变黄的盐害症状，并死亡(图10)。该实验结果表明转LcMYB7342基因拟南芥苗与野生型拟南芥相比，具有更强的抗盐能力。

表1 T3代转LcMYB7342基因拟南芥在盐胁迫(150mM NaCl)下的存活率统计

注：粗体的平均值为转LcMYB7342基因拟南芥植株或野生型拟南芥植株在盐胁迫下的存活率平均值。

Claims (13)

1.蛋白质，由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)或2)所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第536至1045位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。

9.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达盒，或权利要求6所述的重组菌，或权利要求8所述的重组载体在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物抗盐性；

a2)选育抗盐植物品种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

11.一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提高。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

13.扩增权利要求1所述蛋白质的编码基因全长的引物对。