CN1845996A - 浮萍的叶绿体转化 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于转化浮萍质体的方法和组合物。本发明的组合物和方法可用于增加浮萍表达体系的重组蛋白质的生产能力。本发明的组合物包括转化的浮萍质体和转质体基因组的浮萍细胞和植物以及可用于转化浮萍质体的核酸构建体。本发明还提供用于把1个或者更多个异源性核苷酸序列导入到浮萍质体基因组中的方法。

Description

浮萍的叶绿体转化

技术领域

本发明涉及用于浮萍质体转化的方法和组合物。

背景技术

浮萍(duckweeds)是单子叶科浮萍科(Lemnaceae)的唯一成员。5个属和38个种都是小的、自由浮动的淡水植物，它们的地理分布跨越全球(Landolt(1986)Biosystematic Investigation on theFamily of Duckweeds：The Family of Lemnaceae-A Monograph StudyGeobatanischen Insitut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)。尽管浮萍是已知在形态上最简化的植物，不过多数浮萍种具有大得多的植物的所有组织和器官，包括根、茎、花、种子和叶状体(fronds)。人们已经广泛地研究了浮萍物种，并且有大量的文献详细地记载了它们的生态学、系统分类学、生命周期、代谢、疾病和害虫易感性、它们的繁殖生物学、遗传结构以及细胞生物学(Hillman(1961)Bot.Review27：221；Landolt(1986)Biosystematic Investigation on theFamily of Duckweeds：The Family of Lemnaceae-A Monograph StudyGeobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)。

浮萍的生长习性对微生物培养方法而言是理想的。通过新叶状体的无性出芽植物迅速增殖，在宏观方式上与酵母的无性增殖相似。通过自分生细胞无性出芽实现这种增殖。分生区域小而且位于叶状体腹表面，分生细胞位于两个叶窝(pockets)中，每个在叶状体中脉的各一侧。小的中脉区域也是将每个叶状体与它们的母叶状体相接的位点及根的起源位点和茎的发起位点。组织瓣(tissue flap)保护分生叶窝。叶状体交替地自这些叶窝出芽。倍增时间因物种而不同，短至20到24小时(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67：271；Chang etal.(1977)Bull.Inst。Chem.Acad.Sin.24：19；Datko and Mudd(1970)Plant Physiol.65：16；Venkataraman et al.(1970)Z.Pflanzenphysiol.62：316)。

浮萍的集约培养可造成在每单位时间最高速率的生物质累积(Landolt and Kandeler(1987)The Family of Lemnaceae-AMonographic Study Vol.2：Phytochemistry，Physiology，application，Bibliography，Veroffentlichungen desGeobotanischen Institutes ETH，Stiftung Rubel Zurich)，干重累积范围为湿重的6-15％(Till berg et al.(1979)Physiol.Plant.46：5；Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67：271；Stomp，未公开数据)。据报告在不同条件下生长的多种浮萍物种的蛋白质含量的范围为15-45％干重(Chang et al(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24：19；Chang and Chui(1978)Z.Pflanzenphysiol.89：91；Porath et al.(1979)Aquatic Botany7：272；Appenroth et al.(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177：251)。根据这些值，浮萍每升培养基中的蛋白质产量水平与酵母基因表达系统中的数量级相同。

所以，在浮萍中表达重组蛋白质的方法可用于大量的研究和商业应用。对于植物分子生物学研究，就整体而言，可以如酵母一样在实验室便利地操作的一个分化的植物系统提供了非常快的系统，在该系统中可以分析分离的基因的发育和生理学作用。对于商业生产有价值的多肽，基于浮萍的系统具有很多超过现有的微生物或者细胞培养系统的优点。植物表现出的翻译后加工与哺乳动物细胞相似，这克服了微生物细胞生产具有生物学活性的哺乳动物多肽所涉及的主要问题，而且其他作者显示(Hiatt(1990)Nature 334：469)，植物系统具有组装多亚基蛋白质的能力，通常在微生物系统中缺乏该能力。按比例扩大浮萍生物量至重组蛋白商业生产所需水平比相似的按比例扩大哺乳动物细胞更快而且更经济有效，而且不像其它推荐的植物生产系统，例如：大豆和烟草，浮萍可以在完全被限制和控制的生物质生产容器中生长，使该系统整合到已有的蛋白质生产工业基础设施中容易得多。

已有对转化浮萍的核基因组的方法的介绍，参见例如：美国专利号6040498。可以用含有目的核苷酸序列的表达盒通过包括农杆菌介导的基因转移、粒子轰击或者电穿孔在内的多种方法中的任一方法有效地转化浮萍植物或者浮萍结节培养物。不过，尚未见有关浮萍质体基因组的稳定转化的介绍。浮萍质体的转化将很有优势，因为质体基因组在每个叶绿体中有多个拷贝并且在每个细胞中有多个叶绿体，所以使用质体基因组转化方法能够在每个植物细胞获得大量的整合的转基因。

浮萍系统的特征使之成为开发用于生产重组蛋白质的有效的、基于植物的系统的理想选择。所以，本发明提供用于转化浮萍质体的方法和组合物。

发明概述

本发明提供具有用1个或者更多异源性核苷酸序列转化的质体的浮萍植物以及用于生产这些转质体基因组(transplastomic)的浮萍植物的核酸构建体和方法。还提供转化的浮萍质体和含有这些转化的质体的浮萍细胞。

在某些实施方案中，浮萍植物具有用编码目的多肽的异源性核苷酸序列转化的质体。在其它实施方案中，异源性核苷酸序列编码1个以上的目的多肽。异源性核苷酸序列可含有可用于选择转化的浮萍细胞的标记多肽的编码序列。

浮萍植物的用异源性核苷酸序列转化的质体可以是前质体、造粉体、有色体(chromoplasts)、叶绿体、黄化质体(etioplasts)或者白色体(leucoplasts)。

本发明的核酸构建体具有：同源于浮萍质体基因组序列的第一靶向核苷酸序列；至少一个编码1个或1个以上目的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列异源于浮萍质体基因组；和同源于浮萍质体基因组序列的第二靶向序列。在某些实施方案中，核酸构建体含有可操作地连接于编码目的多肽的核苷酸序列的表达调控序列。

在某些实施方案中，用于叶绿体转化的核酸构建体具有可增加在浮萍中目的多肽的翻译效率的核苷酸序列。核酸构建体还可以含有一个或者更多个可操作地连接于编码目的多肽的序列的转录终止序列。

本发明提供用于把一个或者更多个异源性核苷酸序列导入到浮萍质体基因组中的方法。该方法包括以用于叶绿体转化的核酸构建体轰击浮萍组织的步骤，其中的核酸构建体吸收于微粒，并且在可促进核酸构建体导入到质体基因组中的条件下进行所述轰击。在某些实施方案中，异源性核苷酸序列被导入到浮萍叶绿体基因组中。

本发明还提供了用于获得转质体基因组的浮萍植物的方法。该方法包括：在一定条件下以吸收于微粒的用于叶绿体转化的核酸构建体轰击浮萍组织，以使用于叶绿体转化的核酸构建体被导入到浮萍组织的至少一个质体中的步骤和从浮萍组织再生浮萍植物的步骤。在某些实施方案中，核酸构建体包括赋予浮萍组织选择性表型的选择性标记序列，而且浮萍组织在转化后被保持在选择性培养基中，其中选择性培养基优选可促进具有用选择性标记序列转化的质体的浮萍细胞的生存。

附图说明

图1显示浮萍属(Lemna)叶绿体基因组16S到23S rRNA区域的示意图。详细内容参见实验部分。

图2显示表达载体pBCT01的示意图。详细内容参见实验部分。

图3显示PCR引物71、248、210和234在pBCT01转基因区域中的定位。这些引物用于证实pBCT01转基因整合到浮萍叶绿体中。详细内容参见实验部分。

图4显示表达载体pBCT04的结构示意图。详细内容参见实验部分。

发明详述

质体是在进行光合作用的植物细胞中发现的细胞器，而且其在氨基酸、复合糖、脂肪酸以及色素的生物合成中具有重要作用。有几种类型的分化植物质体，包括造粉体、有色体、叶绿体、黄化质体和白色体。所有的这些质体衍生自未分化的名为前质体的前体质体。叶绿体是最常见的质体，而且是植物细胞的光合作用位点。每个光合作用植物细胞含有多个叶绿体，典型地每个细胞有50到100个。叶绿体具有它们自己的基因组(名为质体基因组的环状DNA分子)。每个叶绿体含有多个质体基因组拷贝，典型地为50～100个拷贝。

植物质体基因组已经成为用于导入外来转基因的靶，因为与转化植物细胞核相比，来自转化的质体基因组(称为转质体基因组(transplastomes))的转基因的表达具有数个优点。具体而言，由于在每个叶绿体中有多个质体基因组拷贝，而且在每个细胞中有多个叶绿体，使用质体基因组转化的方法能在每个植物细胞中获得大量的整合的转基因。与相同的转基因整合到植物细胞核基因组的表达水平相比，这能导致转基因的更高水平的表达。

由于植物质体是用于遗传工程的引人注意的靶点，所以本发明提供用于浮萍质体转化的方法和组合物。本发明的组合物和方法可用于增加浮萍表达系统的重组蛋白质的生产能力。本发明的组合物包括转化的浮萍质体、转质体基因组的浮萍细胞及植物和用于转化浮萍质体的核酸构建体。本发明还提供了用于把1个或者更多个异源性核苷酸序列导入到浮萍质体基因组中的方法。下面对本发明组合物和方法进行详述。

定义：

术语“表达”或者“生产”指的是基因产物的生物合成，包括基因产物的转录、翻译和组装。术语“浮萍(duckweed)”指的是浮萍科成员。目前该科把浮萍分成如下5个属和38个种：浮萍属(Lemna)(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，L.minor，L.miniscula，L.obscura，L.perpusilla，L.tenera，L.trisulca，L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍属(Spirodela)(S.intermedia，S.polyrrhiza)；无根萍属(Wolffia)(Wa.angusta，Wa.arrhiza，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglecta)、Wolfiella属(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda和Wl.neotropica)和Landoltia属(L.punctata)。任何其它的浮萍科的属或种，如果它们存在，则也包括在本发明中。使用Les等(2002)Systematic Botany 27：221-40所述的分类学方法能对浮萍属的种进行分类。

用于此处的术语“浮萍结节(duckweed nodule)”指的是包含浮萍细胞的浮萍组织，其中至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者100％的细胞是分化细胞。用于此处的“分化细胞”是具有至少一个可把它与未分化细胞或者与在其它组织类型中的细胞区别开的表型特征(例如：与众不同的细胞形态或者标记核酸或蛋白质的表达)的细胞。此处所述浮萍结节培养物的分化细胞形成在邻近的细胞壁上融合的互连细胞的覆瓦状平滑表面，结节已开始组织成散布于整个组织的叶状体原基。结节培养物组织的表面具有通过胞间连丝(plasmadesmata)彼此连接的表皮细胞。

在提及核苷酸序列时使用的“可操作地连接”指的是多个核苷酸序列被置于相互具有功能关系的位置。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的、并且如果必需的话符合阅读框地连接2个蛋白质编码区。例如，当表达调控序列位于使它可调节编码目的多肽的核苷酸序列的转录的位置时，表达调控序列可操作地连接于编码目的多肽的核苷酸序列。在另一个例子中，当靶向核苷酸序列位于使它能与在靶基因组序列的靶位点同源地重组的位置，以致该表达盒被转移到靶基因组序列中时，靶向核苷酸序列可操作地连接于表达盒。

此处所用的核苷酸序列是“异源于浮萍质体基因组的”指的是核苷酸序列不是它所整合到的受体质体基因组天然具有的。

A.质体

本发明中将要转化的浮萍质体可以来自任何细胞类型，并且可以处于分化或者未分化状态。可以使用的浮萍质体的例子包括未分化的前质体、造粉体、有色体、叶绿体、黄化质体和白色体。

质体包含它们自己的基因组(称为“质体基因组”)。典型地，单个质体包含多个质体基因组，最典型的为每个质体有50到100个质体基因组。可以用本发明的核酸分子转化的质体基因组称作“受体质体基因组”，而已经用异源性核苷酸序列转化的受体质体基因组称作“转质体基因组的(transplastomic)”。在某些实施方式中，转质体基因组的质体的所有质体基因组基本上相同，即，它们都含有转化核酸分子的编码区域，并且优选含有任何有关的表达调控序列，或者至少足够促进编码序列表达的任何表达调控序列。这种转质体基因组的质体、含有这种质体的细胞和植物被称为“同转质体基因组的(homotransplastomic)”。

在某些实施方案中，转质体基因组的质体是用异源核苷酸序列稳定转化的。当可以在一段时期内检测到异源性核苷酸序列，表明异源性核苷酸序列被质体基因组所保持时，显示稳定转化了浮萍质体。检测重组的方法是本领域技术人员所公知的，包括例如：使用可以检测异源性核苷酸序列的探针的Southern分析，或者通过PCR扩增转基因。

B.质体转化载体

1.表达盒

根据本发明，可以通过用含有包含在表达盒内的编码目的多肽的核苷酸序列的质体转化载体转化获得转化的浮萍质体。该表达盒含有可操作地连接到编码目的多肽的核苷酸序列的表达调控序列。在本发明的某些实施方案中，将要导入到浮萍质体中的核酸分子含有2个或者更多个表达盒，其中每个编码至少一个目的多肽。

表达调控序列可以含有1个或者更多个启动子序列、1个或者更多个增强子序列或者同时含有启动子和增强子序列。表达调控序列可以对于目的核苷酸序列为天然的或者外源的。所说的“天然的”指的是表达调控序列在野生型基因组中可操作地连接于编码目的多肽的核苷酸序列。所说的“外源的”指的是表达调控序列在野生型基因组中不是可操作地连接于编码目的多肽的核苷酸序列。

表达调控序列可以衍生自任何生物，只要它们能促进浮萍质体中的序列的转录。植物质体启动子的例子包括但是不局限于：来自psbA基因、rbcL基因或者atpB rRNA的启动子，以及rRNA启动子诸如：来自烟草的16S rRNA启动子序列。参见Boyton et al.(1988)Nature240：1534-1538；Daniell et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：88-92和Sriramn et al.(1998)Plant physiol.117：1495-1499；在此处引入其全部内容作为参考。示例性的启动子还包括但是不局限于：在Zurawski et al.(1981)Nucleic Acids Res.9：3251-3270；Zurawski et al.(1982)79：7699-7703；Krebbers etal.(1982)Nucleic Acids Res.10：4985-5002.Mullet et al.(1985)Plant Molec.Biol.4：39-54；Hanley-Bowdoin and Chua(1989)，Mol.Gen.Genet.215：217-24；Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；以及Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-17中所述的那些，此处引入其全部内容作为参考。还可以通过重组技术或者通过其它合成手段生成本发明的表达调控序列。参见例如：NCBI登录号，AJ276677和ABA276676，此处引入作为参考。

可以选择表达调控序列以提供想要的调节水平。例如：在某些情况中，使用在应答特定的环境刺激(例如：热休克基因启动子、干旱诱导性基因启动子、病原诱导性基因启动子、创伤诱导性基因启动子和光/暗诱导性基因启动子)或者植物生长调节剂(例如：来自用脱落酸、植物生长素、细胞分裂素和赤霉酸诱导的基因的启动子)时被激活的表达调控序列可能是有利的。例如：用光调节表达的基因的表达调控序列可以用来赋予光调节表达。这类基因的例子包括SSU或者叶绿素A/B结合蛋白基因。参见例如：Shiina et al.(1997)Plantphysiol.115：477-483和Eilenberg et al.(1998)Planta 206：204-14，其全部内容引入此处作为参考。

其它的诱导性启动子也可以用于本发明。参见，例如：美国专利号5925806，其全部内容引入此处作为参考。该专利介绍了用于诱导整合在质体基因组中的转基因的表达的系统。该方法包括用在组成型或者诱导型启动子调控下的编码病毒RNA聚合酶的序列转化植物的细胞核，并且把转基因导入到该植物的质体中，其中转基因可操作地连接于病毒RNA聚合酶特异的启动子上。然后可以通过诱导该植物的细胞核中的病毒RNA聚合酶的表达诱导该质体转基因的表达。

可以通过本领域已知的技术鉴定其它指导浮萍质体中转录的启动子。例如：候选启动子序列可以被插入到与缺少表达调控序列的标记序列相邻的位置，然后可以用该表达盒转化浮萍质体。之后可以用该标记序列的表达水平确定启动子在浮萍质体中的强度。增加核苷酸序列的转录效率的方法在本领域是公知的。这样的方法包括例如：多个启动子串连插入到表达盒中以及添加增强子序列到表达盒中。

表达盒也可以包括转录终止序列。根据本发明，可以使用任何本领域公知的适当的终止序列。终止区域可以是转录起始区天然的、可以是目的核苷酸序列天然具有的，或者可以衍生自另外的来源。示例性的转录终止序列包括psbA终止序列和rps16终止序列。其它适当的终止序列对本领域的技术人员而言是明显的。

表达盒可以含有多于1个的靶向于整合到质体基因组中的编码序列。在某些实施方案中，每个核苷酸序列将被可操作地连接于1个或者更多个表达调控序列和转录终止序列。或者，可以提供多个表达盒。

质体转化载体典型地含有包含编码目的多肽的核苷酸序列的表达盒。目的多肽可以是任意多肽，例如：胰岛素、生长激素、α-干扰素、β-干扰素、β-葡糖脑苷脂酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucoronidase)、成视网膜细胞瘤蛋白、p53蛋白质、制管张素、苗条蛋白(leptin)、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血纤维蛋白溶酶原、单克隆抗体、片段抗原结合(Fab)片段、细胞因子、受体、人疫苗、动物疫苗、植物多肽、肽和血清白蛋白。本发明不局限于任何特定的目的多肽的表达。

在某些实施方案中，浮萍质体基因组是被工程化的，使之可生产多聚体蛋白质(例如：单克隆抗体、血红蛋白、P450氧化酶以及胶原等)。用于在浮萍中生产具有生物活性的多聚体蛋白质的一个示例性方法使用含有编码多肽所有亚基的基因的叶绿体转化载体。参见例如：During et al.(1990)plant Mol.Biol.15：281和van Engelen etal.(1994)Plant Mol.Biol.26：1701。然后使用在本文的其它部分所述的方法将该载体导入到浮萍质体基因组中。该方法造成在克隆的浮萍细胞或者植物系中表达组装多聚体蛋白质所必需的所有多肽。在某些例子中，例如，为了工业化或者化学工艺或者为了诊断、治疗或者接种疫苗的目的，可能希望在转化的浮萍植物或者浮萍结节培养物中生产比多聚体蛋白质的全部亚基少的、或者甚至是单个的蛋白质亚基。

在某些实施方案中，质体转化载体包括含有编码可以用于选择转化的细胞或者组织的选择性标记多肽的核苷酸序列的表达盒。标记多肽包括赋予抗生素抗性的以及赋予除草剂化合物抗性的那些。除草剂抗性基因通常编码修饰的对除草剂不敏感的目的蛋白质或者在除草剂能发挥作用前在植物中降解或者解毒除草剂的酶。参见DeBlock et al.(1987)EMBO J.6：2531；DeBlock et al.(1989)Plantphysiol.91：691；Fromm et al.(1990)BioTechnology 8：833；Gordon-Kamm et al.(1990)Plant Cell 2：603。例如：使用编码突变的靶酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)以及乙酰乳酸合酶(ALS)的基因获得了对甘膦酸酯类(glyphosphate)或者磺酰脲类(sulfonylurea)除草剂的抗性。使用编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase)(一种腈水解酶)或者2，4-二氯苯氧乙酸单加氧酶的细菌基因(二者使各自除草剂脱毒)获得了对草铵膦、溴苯腈(boromoxynil)以及2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性。

为了本发明的目的，标记序列包括但是不局限于编码氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶(参见，例如：Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917)、新霉素磷酸转移酶II(Fraleyet al.(1986)CRC Critical Reviews in Plant Science 4：1)、新霉素磷酸转移酶III、氨腈水合酶(Maier-Greiner et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4250)、天冬酰胺激酶、二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合酶(Perl et al.(1993))BioTechnology11：715)、bar基因(Toki et al.(1992)Plant physiol.100：1503；Meagher et al.(1996)Crop Sci.36：1367)、色氨酸脱羧酶(Goddijnet al.(1993)Plant Mol.Biol.22：907)、新霉素磷酸转移酶(NEO；Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Gen.1：327)、潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG；Shimizu et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074)、二氢叶酸还原酶(DHFR；Kwok et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4552)、膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock et al.(1987)EMBOJ.6：2513)、2，2-二氯丙酸脱卤酶(Buchanan-Wollatron et al.(1989).J.Cell.Biochem.13D：330)、乙酰羟酸合酶(美国专利号4761373，Anderson et al.；Haughn et al.(1988)Mol.Gen.Genet.221：266)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(AroA；Comai etal.(1985)Nature 317：741)、卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(WO 87/04181，Stalker et al.)、乙酰辅酶A羧化酶(Parker etal.(1990)Plant Physiol.92：1220)、二氢蝶酸合酶(sulI；Guerineauet al.(1990)Plant Mol.Biol.15：127)和32kDa光系统II多肽(psbA；Hirschberg et al.(1983)Science 222：1346(1983))的核苷酸序列。

还包括编码对庆大霉素(例如：aacC1，Wohlleben etal.(1989)Mol.Gen.Genet.217：202-208)、氯霉素(Herrera-Estrellaet al.(1983)EMBO J.2：987)、氨甲蝶呤(Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303：209；Meijer et al.(1991)PlantMol.Biol.16：807)、潮霉素(Waldron et al.(1985)PlantMol.Biol.5：103；Zhijian et al.(1995)Plant Science108：219；Meijer et al.(1991)Plant Mol.Bio.16：807)、链霉素(Maliga et al.(1973)Nature 255：401-402；Etzold etal.(1987)FEBS Lett.219：343-346；以及Fromm et al.(1989)PlantMol.Biol.12：499-505)大观霉素(Fromm et al.(1987)EMBO J6：3233-3237)、林可霉素(Cseplo和Maliga(1984)Mol.Gen.Genet.196：407-412；Cseplo et al.(1988)Mol.Gen.Genet.214：295-299、博来霉素(Hille et al.(1986)Plant Mol.Biol.7：171)、磺胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Bio.15：127)、溴苯腈(Stalkeret al.(1988)Science 242：419)、2，4-D(Streber et al.(1989)BioTechnology 7：811)、膦丝菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.6：2513)；大观霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，TransgenicResearch 5：131)的抗性的基因。

bar基因赋予对草铵膦(glufosinate)型除草剂诸如膦丝菌素(PPT)或者双丙氨酰膦等的除草剂抗性。如上所述，其它的可以用于载体构建体的选择性标记包括但是不局限于用于耐受双丙氨酰膦和膦丝菌素的pat、耐受咪唑啉酮类的ALS、耐受潮霉素的HPH或者HYG、耐受草甘膦(Glyphosate)的EPSP合酶、耐受Hc毒素的Hml、耐受二苯醚(DPE)类除草剂诸如乙氧氟草醚(oxyfluorfen)的protophoryinogen氧化酶和它的变体以及本领域技术人员公知的和常规使用的其它选择性试剂。参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506；Chistopherson Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314；Yao et al.(1992)Cell 71：63；Reznikaff(1992)Mol.Microbiol.6：2419；Barkley et al.(1980)The Operon 177-220；Hu etal.(1987)Cell 48：555；Brown et al.(1987)Cell 49：603；Figge etal.(1988)Cell 52：713；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549；Deuschle et al.(1990)Science 248：480；Labow etal.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072；Wyborski et al.(1991)Nuc.AcidsRes.19：4647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10：143；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry27：1094；Gatz et al.(1992)Plant J.2：397；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology 78；Gill et al.(1988)Nature 334：721，美国专利号6282837、6288306以及5767373、PCT申请WO0112825以及美国专利申请20010016956。引入这些公开内容于此作为参考。

另一个用于本发明的标记多肽的例子是甜菜醛脱氢酶(BADH)。该酶催化毒性甜菜醛转化成无毒的甘氨酸甜菜碱(一种渗透压保护剂(osmoprotectant))。参见Daniell H.et al.(2001)CurrentGenetics 39：109-16)。

上述列出选择性标记序列的用意不在于限定。在本发明中可以使用任何选择性标记序列。

本发明提供用于对表达的核苷酸序列的修饰以提高其在浮萍中的表达。一种这样的修饰是使用质体偏好的密码子合成目的核苷酸序列。例如：已显示，在某些情况下，具有腺嘌呤/胸腺嘧啶含量大于50％的转基因在质体中可比具有低含量的腺嘌呤/胸腺嘧啶的转基因更有效地表达。参见，例如：美国专利号5545817，引入此处作为参考。合成具有改变的密码子使用的核苷酸序列的方法是本领域公知的。参见例如：美国专利号5380831和5436391，Perlak et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 15：3324；Iannacome et al.(1997)PlantMol.Biol.34：485和Murray et al.，(1989)NucleicAcids.Res.17：477，引入此处作为参考。还可以想到基因序列的全部或者任意部分可以被优化或者合成。换而言之，也可以使用全部优化或者部分优化的序列。也可以对目的核苷酸序列进行其它修饰以提高其在浮萍中的表达。这些修饰包括但是不局限于去除假的多聚腺苷酸信号、转座子样重复以及其它这类已很好地表征了的可能对基因表达有害的序列的编码序列。如果可能，可以修饰序列以避免预见的mRNA发夹二级结构。

2.靶向核苷酸序列

本发明的质体转化载体包括第一和第二靶向核苷酸序列(targeting nucleotide sequence)，其中每一个均同源于浮萍质体基因组序列。这些靶向核苷酸序列位于表达盒侧翼并且限定将要转移到质体基因组的质体转化载体区域的5’和3’末端。靶向核苷酸序列允许通过同源重组使表达盒插入到受体质体基因组中。

靶向序列同源于受体质体基因组的区域。典型地，位于表达盒侧翼的靶向核苷酸序列与受体质体基因组的被靶向区域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或者100％一致，并且能与受体质体基因组同源性地重组。

可以使用数学运算法则实现两个序列间的序列比较、一致性百分比以及相似性百分比的测定。在本发明中，使用GCG软件包中的GAP程序、采用BLOSUM62记分矩阵(scoring matrix)(参见Henikoff etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)以及40、50、60、70或者80的间隙权重(gap weight)和1、2、3、4、5或者6的长度权重(length weight)测定两个核苷酸序列间的一致性百分比。

第一和第二靶向核苷酸序列可以同源于受体质体基因组的相同的、重叠的、邻接的或者独立的区域。靶向序列可以同源于受体质体基因组的任何区域，例如包括基因、假基因或者基因间序列的区域。靶向序列可以设计成这样：使编码目的多肽的核苷酸序列被整合到质体基因组以致其可操作地连接于1个或者更多浮萍质体基因组天然的表达调控序列。在该实施方案中，天然的表达调控序列可以用于驱动编码目的多肽的核苷酸序列的表达。在另一个实施方案中，靶向核苷酸序列的每个或者二者可以含有可用于驱动编码目的多肽的核苷酸序列的表达的1个或者更多个表达调控序列。

靶向核苷酸序列可以是任意长度，只要其足以允许与受体质体基因组同源重组。靶向核苷酸序列含有在长度上少于100个核苷酸的核苷酸序列在某些情况下可足以允许重组。在另外的实施方案中，更长的靶向核苷酸序列可以提供更有效的同源重组。这样的靶向核苷酸序列可以为长度至少200、300、400、500、600、700、800或者900个核苷酸，或者至少1000个或者更多个核苷酸。

本发明提供浮萍(Lemna minor)叶绿体基因组16S到23 S rRNA区域的序列。该核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在某些实施方案中，靶向核苷酸序列与该序列的至少200、300、400、500、600、700、800或者900个核苷酸，或者至少1000、1500、2000、2500或者3000或者更多个核苷酸同源。不过，本发明的靶向核苷酸序列可以同源于任何浮萍质体基因组序列。另外的非限定性的可以用作靶向序列的基因间区域的例子包括tRNAGlu(trnE)到tRNA Thr(trnT)区域、trnE到tRNATyr(trnY)、trnY到tRNAAsp(trnD)区域、rps8到rps14区域、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基(rbcL)到乙酰辅酶A羧化酶(accD)β亚基的区域、细胞色素b(559)(psbE)大亚基多肽到细胞色素f(petA)区域、tRNAGly(trnG)到tRNAMet(trnM)区域、psbA到tRNAHis(trnH)区域、tRNAVal(trnV)到16srRNA区域、trnV到rps7/rps12区域以及浮萍质体基因组的非必需基因内的区域。

C.转化方法

通过用异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列转化浮萍质体制备本发明的转质体基因组的浮萍细胞以及植物。可以通过随机插入或者定点整合(例如：同源重组)插入异源性核苷酸序列。该异源性核苷酸序列可以被插入到分离的质体中或者被转化到在体内的质体中。转化的质体可以用于在体内或者离体表达异源性核苷酸序列。

可以通过任何适当的转化方法实现质体的转化，例如：通过植物前质体的电穿孔(参见：Taylor和Walbot(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-28)、基于PEG的方法(参见Goldset al Biotechnology 11：95-97、微注射(参见，Neuhas et al.(1987)Theor.Appl.Genet.74：30-36)、或者通过粒子轰击(例如：参见Boynton et al.(1988)Science 240：1534-38；Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：8526-8530；SVab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：913-917；以及美国专利号5451513、5545817、5545818、5576198以及5866421，其全部引入此处作为参考。)

已经在美国专利号6040498中介绍了通过粒子轰击转化浮萍的细胞核，引入此处作为参考。在本发明的实施方案中，冲击转化法(ballistic transformation method)包括步骤：(a)提供浮萍组织作为靶；(b)朝浮萍组织推进载有叶绿体转化载体的微粒(microprojectile)，推进的速度足以穿透在该组织内细胞的壁且在该组织的细胞内沉积核苷酸序列，由此提供转化的组织。在本发明的特定的实施方案中，该方法还包括如下所述的用选择试剂培养转化的组织的步骤。在其它备选的实施方案中，在选择步骤后是由转化的组织再生出转化的浮萍植物的步骤。

可以使用任何冲击细胞转化装置实施本发明。示例性的装置公开于Sanford et al(1988)Particulate Science and Technology 5：27；Klein et al.(1987)Nature 327：70，以及美国专利号4945050、5036006、5100792、5179022、5204253、5371015以及5478744，其全部内容引入此处作为参考。这样的装置通常允许控制在轰击中使用的压力。用于本方法的压力典型地介于大约500psi和大约2500psi，例如：从大约1100psi到大约2200psi。

可通过沉淀使核苷酸序列固定于微载体粒子上。所使用的精确的沉淀参数将根据诸如所采用的粒子加速方法等因素而不同，如本领域公知的。如在EP0270356中所讨论的，可以任选地用包封试剂诸如多聚赖氨酸包被载体粒子以改进在其上固定的核苷酸序列的稳定性。可以将任何微载体用于本发明，包括金和钨。微载体的大小通常介于大约0.6μm和大约1.6μm之间。

将要被轰击的组织可以是任何浮萍细胞或者组织，包括浮萍叶状体、浮萍结节、片断化的浮萍结节(微结节(micronodules))以及部分再生的结节。在美国专利号6040498以及美国专利申请号09/915873和10/158243中介绍了制备浮萍结节、微结节以及部分再生的结节的方法，其全部内容引入此处作为参考。

转质体基因组的浮萍细胞或者结节组织可以被再生成转质体基因组的或者同转质体基因组的植物。在美国专利号6040498和美国专利申请号09/915873以及10/158243中介绍了从转化的浮萍组织再生成浮萍植物的方法，其全部内容引入此处作为参考。本文的其它处也介绍了从结节培养物再生转化的浮萍叶状体的方法。

在本发明中可以使用多种选择操作流程。例如：在某些实施方案中，可以将转化的叶状体或者结节在一部分选择过程中保持在暗处，然后移到光照下。在其它的实施方案中，叶状体或者结节在整个选择过程中保持在光照下。

在某些实施方案中，转化的叶状体或者结节在保持未分化状态的培养基中进行选择，然后将植物移到可诱导叶状体再生的培养基中，而在其它的实施方案中，在可诱导叶状体再生的培养基中进行全部的选择过程。

在某些实施方案中，转化的浮萍质体和转质体基因组的浮萍植物以及细胞是同质体基因组的(homoplastomic)。可以通过用编码选择性标记多肽的核苷酸序列转化浮萍质体、然后在允许表达标记多肽的浮萍细胞生存的选择性培养基中保持转质体基因组的浮萍植物或者细胞来制备同质体基因组细胞和植物。在一个实施方案中，选择性培养基只允许这种浮萍细胞的生长：该浮萍细胞是同质体基因组的或者其具有的质体基本上全部用编码选择性标记多肽的核苷酸序列所转化、或者其对于编码选择性标记多肽的核苷酸序列而言是同质体基因组的。制备同质体基因组的或者其具有的质体基本上全部用编码标记多肽的序列所转化的浮萍植物或者细胞可能需要多轮选择。可以实施Southern分析或者PCR分析以测定转质体基因组浮萍细胞或者植物是否是同质体基因组的。

在某些实施方案中，选择标记多肽所赋予的标记表型允许选择具有已与编码标记多肽的序列连接的第二编码序列的浮萍细胞。该第二编码序列典型地编码目的多肽，并且该选出的浮萍细胞可以用于生产该目的多肽。

实验

提供下述实施例的目的是用于举例说明，不过本发明不局限于此。

浮萍属叶绿体转化载体

构建用于转化浮萍属(Lemna)叶绿体的载体。该载体包括设计成用于与在浮萍属叶绿体基因组的16S到23S rRNA区域中的位点同源重组的序列(参见图1)。用于促进与浮萍属叶绿体基因组同源重组的序列鉴定如下。将来自烟草、玉米、稻、拟南芥属和菠菜的叶绿体基因组的16S到23S rRNA区域比对(align)以确定具有高水平序列一致性的区域。以在比对中鉴定的保守区域为基础，设计PCR引物扩增浮萍属叶绿体基因组的16S到23S区域。这些PCR引物的序列如下所示：

引物167：5′GCTGGTCCGAGAGGATGATC 3′(SEQ ID NO：1)

引物166：5′GTTATAGTTACGGCCGCCGT 3′(SEQ ID NO：2)

使用标准条件对浮萍种(Lemna minor)基因组DNA实施PCR。将得到的5.4kb的PCR产物克隆到pT7blue载体(Novagen，Madison，WI)中以形成质粒pBCT00。然后测定完整的PCR产物的序列并且确认其为浮萍属叶绿体基因组的16S到23S区域。PCR产物序列如SEQ IDNO：3所示。浮萍属基因组的这个区域含有16SrRNA基因、tRNA异亮氨酸基因(trnI)、tRNA丙氨酸基因(trnA)和23SrRNA基因。

该载体设计成将转基因的整合靶向到在trnI和trnA基因间的基因间区域。包含侧翼连接有用于重组到浮萍属叶绿体基因组的同源区域的转基因和选择性标记盒的浮萍属叶绿体转化载体构建如下。根据如上所述而获得的浮萍属基因组序列，设计PCR引物从浮萍属的16S到23S rRNA区域扩增2.5kb片段。这些引物的序列如下所示：

引物207：5′ACAAGGTAGCCGTACTGGAAGGTGCGGCTG 3’(SEQ ID NO：4)

引物203：5′TTCAACTCCCCGAAGCATTTCGTC 3’(SEQ ID NO：5)

使用标准条件实施对浮萍种(Lemna minor)基因组DNA的PCR。扩增PCR产物并且克隆到pT7blue载体(Novagen，Madison，WI)中。

为了制备载体pBCT01，把包含具有RbcL核糖体结合位点(示于SEQ ID NO：7)的烟草16S rRNA启动子(示于SEQ ID NO：6)、氨基糖苷3″-腺苷酰基转移酶(aadA)基因以及烟草的psbA 3′UTR(示于SEQ ID NO：8)的大观霉素/链霉素选择性标记盒(NCBI登记号AF061065)用PstI/NsiI克隆，插入到pBCT00的在浮萍属trnI和trnA间的基因间区域，制备该质粒。质粒pCBT04的结构示意图如图2所示。

为了制备载体pBCT04，把包含具有RbcL核糖体结合位点(示于SEQ ID NO：7)的烟草16S rRNA启动子(示于SEQ ID NO：6)、氨基糖苷3″-腺苷酰基转移酶(aadA)基因以及烟草psbA 3′UTR(示于SEQ ID NO：8)的卡那霉素选择性标记盒用PstI/NsiI克隆，插入到pBCT00的在浮萍属trnI和trnA间的基因间区域，制备该质粒。该卡那霉素选择性标记盒创建如下：通过PCR扩增编码氨基糖苷3′磷酸转移酶(NCBI登记号P00554)，然后连接它到具有RbcL结合位点的烟草16SrRNA启动子的下游以及烟草psbA 3′UTR的上游。该盒克隆到浮萍属TrnI和trnA基因间区域的PstI位点以创建载体pBCT04。质粒pCBT04的结构示意图如图4所示。

浮萍属结节的制备

在这些实施例中，虽然浮萍种(Lemna minor)8627株用于转化，不过可以使用任何浮萍属株。用于转化的浮萍结节培养物制备如下，分离浮萍叶状体，用无菌手术刀切去根，然后腹面朝下放置该叶状体于Murashige and Skong培养基(MS培养基，Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)(pH5.6)上，该培养基添加有5μM2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脱叶灵(thidiazuron)(Sigma P6186)、3％蔗糖、0.4Difco Bacto琼脂(Fisher Scientific)和0.15％ Gelrite(Sigma)。叶状体生长5～6周。此时，出现结节(小的淡黄色的细胞团块)，通常生自腹面的中心部分。从母叶状体分离开该结节组织块(平均直径3～6mm大小)，并在添加有3％蔗糖、0.4％Difco Bacto琼脂、1μM 2，4-二氯苯氧乙酸以及2μM苄基腺嘌呤的MS培养基中培养。

通过粒子轰击进行浮萍属结节的叶绿体转化

使用QIAGEN Maxi-Prep试剂盒(QIAGEN，Valencia，Ca)制备纯化的pBCT01和pBCT04DNA，然后根据生产商的说明书用纯化的DNA包被金微载体(0.6μM，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。在粒子轰击之前，在含有MS培养基(用于pBCT01)或者含有添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脱叶灵、3％蔗糖、0.4 Difco Bacto琼脂和0.15％Gelrite(用于pBCT04)的MS培养基的培养皿的中央放置大约50个浮萍属结节(直径大约0.5～10mm)。按照生产商的操作流程用来自Bio-Rad(PDS-1000/He，Bio-Rad，Hercules，CA)的Bio-Rad PDS-1000/Hebiolistic仪在靶距离为9cm、氦压范围从1100到2200以及真空度28英寸下轰击结节两次。

对于pBCT01，在轰击后，将结节于MS培养基上在暗处温育48小时。然后转移该结节到含有25μg/ml大观霉素二盐酸的MS培养基中，并且在持续光照下生长2周(用于pBCT01)。然后转移该结节到含有25μg/ml大观霉素的0.5×SH培养基中，并且在持续光照下生长。每周一次转移该结节到新鲜的培养基中。在6到8周后结节在0.5×SH培养基上开始生出叶状体组织。

对于pBCT04，在轰击后，在添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脱叶灵、3％蔗糖、0.4 DifcoBacto琼脂和0.15％Gelrite的MS培养基上于暗处温育该结节48小时。然后转移该结节到添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脱叶灵、3％蔗糖、0.4％Difco Bacto琼脂、0.15％Gelrite和50μg/ml卡那霉素的MS培养基中并维持4周，然后转移到添加有5μM 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲脱叶灵、3％蔗糖、0.4％Difco Bacto琼脂、0.15％Gelrite和100μg/ml卡那霉素的MS培养基中再温育4周。然后将结节置于具有100μg/ml卡那霉素的0.5×SH培养基上温育8～12周直到叶状体再生。

通过粒子轰击进行浮萍属叶状体的叶绿体转化

为了转化浮萍属叶状体，在0.5×SH培养基上的5号Whatman纸片的中央放置大约30个浮萍属叶状体，然后如上述对浮萍属结节所述的进行轰击。在轰击后，于暗处在0.5×SH培养基上温育叶状体48小时，然后转移到添加有3％蔗糖、0.4％Difco Bacto琼脂、0.15％Gelrite，1μM 2，4-二氯苯氧乙酸、2μM苄基腺嘌呤以及50μg/ml卡那霉素的Murashige和Skong培养基中。每周一次转移叶状体到新鲜培养基中，进行6到8周，直到生成结节组织。转移结节组织到含有100μg/ml卡那霉素的0.5×SH中，并且每周一次地转移到新鲜培养基中，进行6到10周，直至再生成叶状体。

叶绿体转化体分析

为了对pBCT01转基因区域整合到浮萍属叶绿体基因组中进行检测，对生出叶状体的结节组织实施PCR。取在含有25μg/ml大观霉素的SH培养基上生长8周后的组织用于分析。使用DNeasy DNA抽提试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)从结节组织抽提基因组DNA，然后使用标准条件实施PCR。设计两个引物组来检测在同源重组位点的两侧的整合。引物71和248可检测重组位点的16S侧的整合并且可扩增1796bp的产物，而引物210和234可检测23S侧并生成2610bp的产物。引物定位如图3所示。

引物71：5′AAAACCCGTCCTCAGTTCGGATTGC 3′(SEQ ID NO：9)

引物248：5′CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG 3′(SEQ ID NO：10)

引物210：5′CTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGC 3′(SEQ ID NO：11)

引物234：5′GGTTCGGACCTCCACTTAGT 3′(SEQ ID NO：12)

在全部6个独立的浮萍培养物中都产生了预期的PCR产物，其中这些样品中有2个表现出特别高的水平的转基因整合。对分离自这些培养物之一的PCR产物测序，其显示出与pBCT01转基因序列相同，这证明了在转基因和质体基因组间的同源性重组。

在说明书中提到的所有出版物和专利申请均指明本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请在此通过引用并入本文，就象明确并且单独地指出每个出版物或者专利申请作为参考文献引入一样。

尽管为了清楚地理解本发明，已经在前面通过举例说明和实施例较详细地描述了本发明，但是很明显，在所附的权利要求的范围内可进行某些改变和修饰。

                                 序列表

<110>Biolex，Inc.

     Cox，Kevin M.

     Peele，Charles G.

<120>浮萍的叶绿体转化

<130>40989/279828

<150>US 60/484,166

<151>2003-07-01

<150>US 60/492,179

<151>2003-08-01

<160>12

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物167

<400>1

gctggtccga gaggatgatc                                                20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物166

<400>2

gttatagtta cggccgccgt                                                20

<210>3

<211>5373

<212>DNA

<213>浮萍(Lemna minor)

<220>

<221>misc_feature

<222>3530，4789

<223>n＝A，T，C或G

<400>3

gctggtccga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg   60

aggcagcagt ggggaatttt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaat gccgcgtgga   120

ggtagaaggc ccacgggtcg tgaacttctt ttctcggaga agaagcaatg acggtatctg   180

aggaataagc atcggctaac tctgtgccag cagccgcggt aagacagagg atgcaagcgt   240

tatccggaat gattgggcgt aaagcgtctg taggtggctt ttcaagtccg tcgtcaaatc   300

ccagggctca accctggaca ggcggtggaa actaccaagc tggagtacgg taggggcaga   360

gggaatttcc ggtggagcgg tgaaatgcgt agagatcgga aagaacacca atggcgaaag   420

cactctgctg ggccgacact gacactgaga gacgaaagct aggggagcga atgggattag   480

ataccccagt agtcctagcc gtaaacgatg gatactaggc gctgtgcgta tcgacccgtg   540

cagtgctgta gctaacgcgt taagtatccc gcctggggag tacgttcgca agaatgaaac   600

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaaa  660

gcgaagaacc ttaccagggc ttgacatgcc gcgaatcctc ttgaaagaga ggggtgcctt  720

cgggaacgcg gacacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgccgtaa ggtgttgggt  780

taagtcccgc aacgagcgca accctcgtgt ttagttgcca ccattgtgga accctgaaca  840

gactgccggt gataagccgg aggaaggtga ggatgacgtc aagtcatcat gccccttatg  900

ccctgggcga cacacgtgct acaatggccg ggacaaaggg tcgcgatccc gcgagggtga  960

gctaacccca aaaacccgtc ctcagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc  1020

cggaatcgct agtaatcgcc ggtcagccat acggcggtga attcgttccc gggccttgta  1080

cacaccgccc gtcacactat gggagctggc catgcccgaa gtcgttacct taaccgcaag  1140

gggggggatg ccgaaggcgg ggctagtgac tggagtgaag tcgtaacaag gtagccgtac  1200

tggaaggtgc ggctggatca cctccttttc agggagagct aatgcttgtt gagtattttt  1260

tttggtttga cactgcttca cacccaaaaa gaagcgagct acgtctgagc taagcttgga  1320

tatggaagtc ttctttcgtt tcttgacggt gaaataagac caagctcatg agcttattat  1380

cctaggtcgg aacaagttga taggatcctt ttacgtcccc atgtccctcc cgtgtggaca  1440

catggggacg taaaaaggaa agagagggat ggggtttctc tcgcttttgg catagcaggc  1500

ctcccggtgg gaggcccgca cgacgggcta ttagctcagt ggtagagcgc gcccctgata  1560

attgcgtcgt tgtgcctggg ctgtgagggc tctcagccac atggatagtt caatgtgctc  1620

atcagcgcct gacccggaga tgtggatcat ccaaggcaca ttagcatggc gtactcctcc  1680

tgttcgaatc ggagtttgaa accaaactta tcctcaggag gatagatggg gcgattcagg  1740

tgagatccaa tgtagatcca actttctatt cactcgtggg atccgggcgg tccggggggg  1800

accaacaagg ctcctctctt ctcgagaatc catacatccc ttatcagtgt atggacagct  1860

atctctcgag cacaggttta ggttcggcct caacgggaaa atggagcacc taacaacgca  1920

tcttcacaga ccaagaacta cgagatcacc ccttttattc tggggtgacg gagggatcgt  1980

accattcgag ccttttttca tgcttttcct gaaggtctgg agaaacgtga aattcttttt  2040

atctatctct tgactcgaaa tgggagcagg tttgaaaaag gatcttagag tgtctagggt  2100

tgggccagga gggtttctta acctcttctt ttttcttccc atcggagttt tttcacaaag  2160

acttccatgg taagggggaa gggtggaaca agcaaagcac acttgtagag cgcagtacag  2220

cggagagctg tatgctgcgt tcgggaagga tgaatcgctc ctgaaaaaga atctattgat  2280

tctcccccaa ttgtttggat cgtaggtgcg atgatttact tcacgggcga ggtctctggt  2340

tcaagtccag gatggcccag cggcgccagg gaaaagaata gaagaagcat ctgactcctt  2400

catgcatgct ccacttggct cggggggata cagctcagtt ggtagagctc cgctcttgca  2460

attgggtcgt tgcgattacg ggttggatgt ctaattgtcc aggcggtaat gatagtatct  2520

tgtacctgaa ctggtggctc actttttcta agtaatgggg aagaggaccg aaacatgcca  2580

ctgaaagact ctactgagac aaagatgggc tgtcaagaac gtagaggagg taggatgggc  2640

agttggtcag atctagtatg gatcgtatat ggaccttagt tggagtcggc ggctctccta  2700

gggttccctc atctgggatc cctggggaag aggatcaagt tggcacttgc gaacagcttg  2760

atgcactatc tcccttcaac cctttgcgcg aaatgtgaca aaaggaagga aaatccatgg  2820

accgacccca tcgtctccac cccgtaggaa ctacgagatc accccaggga cgccttcggc  2880

atccaggggt cacggaccga ccatagatcc tgttcaataa gtggaacgca ttagcagtcc  2940

gttctctggt tgggcagtaa gggtcggaga agggcaatca ctcgttctta aaaccagcat  3000

tcttaaaacc caagagtcgg gcagaaaaag ggggagagtt ctccgttcct gattctcctg  3060

tagctggatt ctccggaacc acaagaatcc ttagaatggg attccgactc agcacctttt  3120

gatattttga gaagagttgc tctttggaga gcacagtacg atgaaagttg taagctgtgt  3180

tcggggggga gttattgtct atcgttggcc tctatagtag aatcagtcgg ggaggcccga  3240

gaggcggtgg tttaccctgt ggcggatgtc agcggttcga gtccgcttat ctccagcccg  3300

tgaacttagc cgaaactatg atagcaccca attttgacga ttcggcagtt cgatctatga  3360

tttatcattc atggacgttg ataagatcct tccatttagc agcaccttag gatggcatag  3420

ccttaacatg gcgaggttca aacgaggaaa ggcttacggt ggatacctag gcacccagag  3480

acgaggaagg gcgtagtaag cgacgaaatg cttcggggag ttgaaaatan gcatagatcc  3540

ggagattccc gaataggtta acctttcgaa ctgctgctga atccatgggc aggcaagaga  3600

caacctggcg aactgaaaca tcttagtagc cagaggaaaa gaaagcaaaa gcgattcccg  3660

tagtagcggc gagcgaaatg ggagcagcct aaaccgtgaa aacggggttg tgggagagca  3720

atacaagcgt cgtgctgcta ggcgaagcgg ttgaatactg caccctagat ggcgaaagtc  3780

cagtagccga aagcatcact agcttacgct ctgacccgag tagcatgggg cacgtggaat  3840

cccgtgtgaa tcagcaagga ccaccttgca aggctaaata ctcctgggtg accgatagcg  3900

aagtagtacc gtgagggaaa ggtgaaaaga acccccatcg gggagtgaaa tagaacatga  3960

aaccgtgagc tctcaagcag tgggaggaga atctgatctc tgaccgtgtg cctgttgaag  4020

aatgagccgg cgactcatag gcagtggctt ggttaaggga atccaccgga gccgtagcga  4080

aagcgagtct tcatagggcg attgtcactg cttatggacc cgaacctggg tgatctatcc  4140

atgaccagga tgaagcttgg gtgaaactaa gtggaggtcc gaaccgactg atgttgaaga  4200

atcagcggat gagttgtggt taggggtgaa atgccactcg aacccagagc tagctggttc  4260

tccccgaaat gcgttgaggc gcagcagttg actggacatc taggggtaaa gcactgtttc  4320

ggtgcgggcc gcgagagcgg taccaaatcg aggcaaactc tgaatactag atatgacccc  4380

aaaataacgg aggtcaaggt cggccagtga gacgatgggg gataagcttc atcgtcgaga  4440

gggaaacagc ccagatcacc agctaaggcc cctaaatgac cgctcagtga taaaggaggt  4500

aggagtgcag agacagccag gaggtttgcc tagaagcagc cacccttgaa agagtgcgta  4560

atagctcact gatcgagcgc tcttgcgccg aagatgaacg gggctaagcg atctgccgaa  4620

gctgtgggat gtaaaaatgc atcggtaggg gagcgttccg ccttagatag aagcacccgt  4680

gcaagcaggt gtggacgaag cggaagcgaa aatgtcggct tgagtaacgc aaacattggt  4740

gagaatccaa atgccccgaa aacctaaggg ttcctccgca aggttcgtnc cacggagggt  4800

gagtcagggc ctaagatcag gccgaaaggc gtagtcgatg gacaacaggt gaatattcct  4860

gtactacccc ttgttggtcc cgagggacgg aggaggctag gttagccgaa agatggttat  4920

cggttcaagg acgcaaggtg accctgattt ttcagggtaa gaaggggtag agaaaatgcc  4980

tcgagccaat gtctgagtac caggcgctac ggcgctgaag taacccatgc catactccca  5040

ggaaaagctc gaacgacctt aaacaagagg gtacctgtac ccgaaaccga cacaggtggg  5100

taggtagaga atacctaggg gcgcgagaca actctctcta aggaactcgg caaaatagcc  5160

ccgtaacttc gggagaaggg gtgcctcctc acaaaggggg tcgcagtgac caggcccggg  5220

cgactgttta ccaaaaacac aggtctccgc aaagtcgtaa gaccatgtat gggggctgac  5280

gcctgcccag tgccggaagg tcaaggaagt tggtgacctg atgacagggg agccagcgac  5340

cgaagccccg gtgaacggcg gccgtaacta aac                               5373

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物207

<400>4

acaaggtagc cgtactggaa ggtgcggctg                                     30

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物203

<400>5

ttcaactccc cgaagcattt cgtc                                           24

<210>6

<211>119

<212>DNA

<213>烟草(Nicotiana tabacum)

<400>6

gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg   60

cagggatggc tatatttctg ggagcgaact ccgggcgaat acgaagcgct tggatacag    119

<210>7

<211>16

<212>DNA

<213>烟草

<400>7

ttgtagggag ggattt                                                    16

<210>8

<211>189

<212>DNA

<213>Nicotiana tabacaum

<400>8

gatcctggcc tagtctatag gaggttttga aaagaaagga gcaataatca ttttcttgtt   60

ctatcaagag ggtgctattg ctcctttctt tttttctttt tatttattta ctagtatttt   120

acttacatag acttttttgt ttacattata gaaaaagaag gagaggttat tttcttgcat   180

ttattcatg                                                           189

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物71

<400>9

aaaacccgtc ctcagttcgg attgc                                          25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物248

<400>10

ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg                                          25

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物210

<400>11

ctgtagaagt caccattgtt gtgc                                           24

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物234

<400>12

ggttcggacc tccacttagt                                                20

Claims (49)

1.浮萍植物，其具有用异源于浮萍质体基因组的至少一个核苷酸序列转化的质体，其中，异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列可操作地连接于能在质体中发挥功能的表达调控序列。

2.权利要求1的浮萍植物，其中至少一个异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列编码目的多肽。

3.权利要求2的浮萍植物，其中所述目的多肽选自胰岛素、生长激素、α干扰素、β干扰素、β葡糖脑苷脂酶、β葡糖醛酸糖苷酶(β-glucoronidase)、成视网膜细胞瘤蛋白、p53蛋白、制管张素、苗条蛋白、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血纤维蛋白溶酶原、单克隆抗体、Fab片段、单链抗体、细胞因子、受体、人疫苗、动物疫苗、植物多肽、肽以及血清白蛋白组成的组。

4.权利要求1的浮萍植物，其中所述质体用至少2个异源于浮萍质体基因组的编码目的多肽的核苷酸序列所转化。

5.权利要求1的浮萍植物，其中所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列包括能用于植物细胞的选择的标记多肽的编码序列。

6.权利要求5的浮萍植物，其中所述标记多肽赋予对选自大观霉素和链霉素组成的组的至少一种抗生素的抗性。

7.权利要求1的浮萍植物，其中，用异源于浮萍质体基因组的至少一个核苷酸序列转化的质体选自前质体、造粉体、有色体、叶绿体、黄化质体或白色体组成的组。

8.权利要求9的浮萍植物，其中，用具有至少一个异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列转化的质体是叶绿体。

9.权利要求1的浮萍植物，其中，在质体中具有功能的表达调控序列是植物16S rRNA启动子序列。

10.权利要求9的浮萍植物，其中，在质体中具有功能的表达调控序列是烟草16S rRNA启动子序列。

11.权利要求10的浮萍植物，其中所述烟草16S rRNA启动子序列是SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

12.权利要求1的浮萍植物，其中所述浮萍植物选自紫萍属(Spirodela)、无根萍属(Wolffia)、Wolfiella属以及浮萍属(Lemna)组成的组。

13.权利要求12的浮萍植物，其中所述浮萍植物选自浮萍(Lemnaminor)、Lemna miniscula、Lemna aequinoctialis和Lemna gibba组成的组。

14.一种核酸分子，其包含作为可操作地连接的成分的如下核苷酸序列：

a)同源于浮萍质体基因组序列的第一靶向核苷酸序列；

b)包含至少一个编码目的多肽的核苷酸序列的表达盒的核苷酸序列，其中所述编码目的多肽的核苷酸序列异源于浮萍质体基因组；和

c)同源于浮萍质体基因组序列的第二靶向核苷酸序列。

15.权利要求14的核酸分子，其中所述表达盒另外包含可操作地连接于所述编码目的多肽的核苷酸序列的表达调控序列。

16.权利要求14的核酸分子，其中在质体中具有功能的表达调控序列是烟草16S rRNA启动子序列。

17.权利要求16的浮萍植物，其中所述烟草16S rRNA启动子序列是SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

18.权利要求14的核酸分子，另外包含至少一个在浮萍中具有功能的核糖体结合位点核苷酸序列。

19.权利要求18的核酸分子，其中所述在浮萍中具有功能的核糖体结合位点包含如SEQ ID NO：7所示的烟草rbcL核糖体结合位点核苷酸序列。

20.权利要求14的核酸分子，另外包含转录终止序列。

21.权利要求20的核酸分子，其中所述转录终止序列是SEQ ID NO：8所示的烟草psbA基因3′非翻译区域的核苷酸序列。

22.权利要求14的核酸分子，其中至少一个目的多肽是能被用于选择转化的浮萍细胞的标记多肽。

23.权利要求22的核酸分子，其中标记多肽赋予对选自链霉素和大观霉素的抗生素的抗性。

24.权利要求14的核酸分子，其中所述第一和第二靶向核苷酸序列能够促进在浮萍质体基因组内的同源性重组。

25.权利要求14的核酸分子，其中所述浮萍质体是浮萍叶绿体，且所述浮萍质体基因组是叶绿体基因组。

26.包含权利要求14的核酸分子的浮萍叶绿体。

27.包含权利要求26的叶绿体的浮萍细胞。

28.包含权利要求27的浮萍细胞的浮萍植物。

29.权利要求14的核酸分子，其中选自第一靶向核苷酸序列与第二靶向核苷酸序列的至少一个核苷酸序列同源于SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

30.一种核酸分子，包含作为可操作地连接的成分的下述核苷酸序列：

a)同源于浮萍叶绿体基因组序列的第一靶向核苷酸序列；

b)在浮萍中具有功能的表达调控序列；

c)在浮萍中具有功能的核糖体结合位点核苷酸序列；

d)异源于浮萍叶绿体基因组的核苷酸序列，其中所述异源于浮萍叶绿体基因组的核苷酸序列编码目的多肽；

e)在浮萍中具有功能的转录终止序列；和

f)同源于浮萍叶绿体基因组序列的第二靶向核苷酸序列。

31.权利要求30的核酸分子，其中选自第一靶向核苷酸序列和第二靶向核苷酸序列的至少一个核苷酸序列同源于SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

32.包含权利要求30的核酸分子的浮萍叶绿体。

33.包含权利要求32的叶绿体的浮萍细胞。

34.包含权利要求33的浮萍细胞的浮萍植物。

35.把异源于浮萍质体基因组的至少一个核苷酸序列导入到浮萍质体中的方法，所述方法包括把吸收于微粒的权利要求14的核酸分子在一定条件下轰击浮萍结节，所述条件致使所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列被导入到所述浮萍结节的至少一个质体中。

36.权利要求35的方法，其中所述浮萍质体是浮萍叶绿体。

37.包含至少一个异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列的浮萍质体，其中所述包含至少一个异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列的浮萍质体是通过权利要求35的方法产生的。

38.包含权利要求37的浮萍质体的浮萍细胞。

39.包含权利要求38的浮萍细胞的浮萍植物。

40.用于获得转质体基因组的浮萍植物的方法，所述方法包括步骤：

a)用吸收于微粒的权利要求14的核酸分子在一定条件下轰击浮萍结节，所述条件致使异源于浮萍质体基因组的所述核苷酸序列被导入到所述浮萍结节的至少一个质体中；和

b)从所述浮萍结节再生浮萍植物。

41.根据权利要求40的方法制备的转质体基因组浮萍植物。

42.用于获得含有稳定地转化的质体的浮萍植物的方法，所述方法包括步骤：

a)提供权利要求14的核酸分子，其中所述核酸分子包含赋予浮萍细胞可选择的表型的标记序列；

b)用吸收于微粒的所述核酸分子在一定条件下轰击浮萍结节，所述条件致使所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列被导入到所述浮萍结节的至少一个质体中；

c)在选择培养基中保持浮萍结节，该培养基允许具有可选择的表型的浮萍细胞生存，由此选择出含有标记序列的浮萍细胞；和

d)从所述浮萍结节再生浮萍植物。

43.权利要求42的方法，其中选择性培养基偏好允许基本上全部质体被所述核酸分子转化了的浮萍细胞生存。

44.根据权利要求42的方法制备的转质体基因组浮萍植物。

45.生产目的多肽的方法，所述方法包括：

a)用吸收于微粒的权利要求14的核酸分子在一定条件下轰击浮萍结节，所述条件致使所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列被导入到所述浮萍结节的至少一个质体中；和

b)在一定条件下培养所述浮萍植物，所述条件致使目的多肽从所述核酸分子表达。

46.生产目的多肽的方法，所述方法包括：

a)用吸收于微粒的权利要求14的核酸分子在一定条件下轰击浮萍结节，所述条件致使所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列被导入到所述浮萍结节的至少一个质体中；

b)从所述浮萍结节再生浮萍植物；和

c)在一定条件下培养所述浮萍植物，所述条件致使目的多肽从所述核酸分子表达。

47.一种浮萍细胞，其具有用异源于浮萍质体基因组的至少一个核苷酸序列稳定地转化的质体，其中所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列可操作地连接于能够在质体中发挥功能的表达调控序列。

48.用于生产1个或者更多个目的多肽的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求27的浮萍细胞，其中所述异源于浮萍质体基因组的核苷酸序列编码1个或者更多个目的多肽；和

b)在一定条件下培养所述浮萍细胞，所述条件致使目的多肽被表达。

49.具有从由下述核苷酸序列组成的组选出的核苷酸序列的核酸分子：

a)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

b)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少100个连续的核苷酸；

c)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少200个连续的核苷酸；

d)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少400个连续的核苷酸；

e)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少600个连续的核苷酸；

f)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少800个连续的核苷酸；

g)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的片段的核苷酸序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少1000个连续的核苷酸；

h)与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有至少90％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述与SEQ ID NO：3具有至少99％的序列一致性的核苷酸序列能够与浮萍叶绿体基因组同源重组；和

i)与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列，其中所述与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列一致性的核苷酸序列能够与浮萍叶绿体基因组同源重组。

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