MX2010011452A - Transformacion y modificacion de rasgos por ingenieria en especies de miscanthus. - Google Patents

Abstract

Se proveen métodos y composiciones para la transformación eficiente de Miscanthus. El método incluye la infección por Agrobacterium, particularmente los que comprenden un vector binario. De esta manera, se puede introducir cualquier gen o secuencia de nucleótídos de interés en la planta de Miscanthus. El gen o la secuencia de nucleótidos de interés transformados estarán flanqueados por al menos un borde T-ADN y estarán presentes en el Miscanthus transformado en una cantidad baja de copias. También se proveen células, tejidos, plantas y semillas transformadas de Miscanthus.

Description

. TRANSFORMACIÓN Y MODIFICACIÓN DE RASGOS POR INGENIERÍA EN ESPECIES DE MISCÁNTHUS CAMPO Se describen métodos y composiciones para la transformación de Miscanthus, particularmente métodos para la transformación mediante el uso de Agrobacterium.

ANTECEDENTES Miscanthus es un género de pasto monocotiledóneo C4 del complejo Saccharum que comprende aproximadamente catorce especies. Miscanthus pertenece a la familia Poaceae, tribu andropogoneae, subtribu saccharinae. Miscanthus tiene un número básico de cromosomas de 19, con especies comunes diploides y tetraploides. Las especies comunes son sinensis, sacchariflorus, floridulus, transmorrisonensis, condensatus, e incluyen la forma híbrida Miscanthus ? giganteus, un triploide que resulta del cruzamiento entre el diploide sinensis y el tetraploide sacchariflorus.

Recientemente, Miscanthus ha llamado la atención como posible cultivo de biocombustible debido a su capacidad de rendimiento de grandes cantidades de material lignocelulósico de alta calidad. Sin embargo, casi todas las investigaciones avanzadas y el desarrollo de Miscanthus alimentación de biocombustible se ha focalizado sólo en un genotipo de M. x giganteus. M. x giganteus se caracteriza por rendimientos relativamente elevados y bajo contenido de humedad en la cosecha. M. ? giganteus también demostró elevadas eficiencias de uso de agua y de nitrógeno, así como baja susceptibilidad a plagas y enfermedades. Estos rasgos hacen que Miscanthus sea especialmente prometedor como cultivo de alimentación sostenible de biocombustible.

Casi todos los trabajos de cultivo de M. sinensis previos han tenido por finalidad el desarrollo de variedades ornamentales para jardines. Otras especies de Miscanthus han recibido escasa o ninguna atención por parte de los científicos y horticultores. En consecuencia, cualquier trabajo que de por resultado el mejoramiento genético de Miscanthus para el uso como biocombustible probablemente sería una contribución novedosa. Hasta recientemente, el mejoramiento genético de Miscanthus se ha llevado a cabo mediante métodos tradicionales de cultivo de plantas. Los avances en tecnologías de cultivos de tejido y transformación han dado por resultado la producción de Miscanthus sacchariflorus transgénicos mediante el uso de bombardeo de microproyectiles como sistema de transformación (Yi et al. (2004) High Technol. Lett.). Sin embargo, el uso de bombardeo de partículas como vehículo de transformación tiene sus desventajas. Por ejemplo, en el uso de transformación por bombardeo, muchas copias de la secuencia transferida se integran rutinariamente en el genoma objetivo. Estas copias integradas a menudo se reordenan y mutan. Además, las secuencias integradas a menudo son inestables debido al punto de inserción (Casa et al (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:11212-11216).

En contraste con la transformación por bombardeo de partículas, se ha demostrado que la transformación mediada por Agrobacterium da por resultado mayor proporción de cantidad de eventos transgénicos estables, con baja cantidad de copias (es decir, una o dos) respecto de la transformación por bombardeo (Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:745-750; Zhao et al. (1998) Maize Genet. CoOp Newslett. 72:34-37), ofrece la posibilidad de transferir segmentos de ADN más grandes en las células receptoras (Hamilton et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA ' 93:9975-9979), y es altamente eficiente (Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:745-750; Zhao et al. (1998) Maize Genet. Coop. Newslett. 72:34-37). En consecuencia, es ventajoso desarrollar una planta transgénica mediante el uso de transformación mediada por Agrobacterium. La transferencia de genes mediante cepas de Agrobacterium obtenidas por ingeniería ha pasado a ser rutinaria para la mayoría de las plantas dicotiledóneas.

Sin embargo, la transferencia de genes mediante cepas de Agrobacterium para plantas monocotiledóneas tales como Miscanthus (ver, por ejemplo, Cheng et al. (2004) Plant 40(1 ):3145, y las referencias allí citadas; ver también Shrawat et al (2006) Plant Biotechnol. J. 4:575-603, y las referencias allí citadas) es limitada debido al carácter recalcitrante de las plantas monocotiledóneas con respecto a la interacción con especies de Agrobacterium.

Hasta la fecha, los científicos han propiciado que la transformación mediada por Agrobacterium se aplique a la producción de especies transgénicas de Miscanthus (Juvik et al. (2007) "Miscanthus Breeding and Improvement", en el "4th Annual Open Symposium on Biomass Feedstocks for Energy Production in Illinois", University of Illinois at Urbana-Champaign), e intentaron producir plantas de Miscanthus usando dicho método (miscanthus.uiuc.edu/index.php/researchers/dr-jack-juvik/sma). Sin embargo, a pesar de años de intentos, aún no se ha logrado la producción de una planta transgénica de Miscanthus mediante el uso de Agrobacterium.

En consecuencia, hay una necesidad de un método eficiente para la transformación de Miscanthus en donde se pueda obtener transformación estable de las secuencias deseadas, particularmente mediante el uso de un método de transformación mediado por Agrobacterium.

SÍNTESIS Se describen métodos y composiciones para la transformación eficiente de Miscanthus. El método incluye el uso de bacterias pertenecientes al género Agrobacterium, particularmente las que comprenden un vector binario. De esta manera, se puede introducir cualquier gen de interés, de hecho cualquier secuencia, en la planta de Miscanthus. El gen transferido estará flanqueado por al menos un borde de T-ADN y presentarse en el Miscanthus transformado con baja cantidad de copias.

También se proveen células, tejidos, plantas y semillas transformadas de Miscanthus. Dichas composiciones transformadas se caracterizan por la presencia de uno o más bordes de T-ADN y una baja cantidad de copias del gen transferido. Las composiciones transformadas también abarcan plantas estériles de Miscanthus así como plantas regeneradas, fértiles transgénicas de Miscanthus, semillas transgénicas producidas de ellas, en generaciones T1 y posteriores.

La invención también se refiere a plantas transgénicas de Miscanthus y métodos para su preparación, en donde primero se selecciona un callo embriogénico por su capacidad para crecer hasta ser una planta madura de Miscanthus. Este "ecallo" se pone en contacto con agrobacterias que comprenden un plásmido de interés, las bacterias y los ecallos se cocultivan para producir células transformadas, y estas últimas luego se cultivan hasta obtener una planta transgénica de Miscanthus. La selección del ecallo por .su capacidad regenerativa se puede lograr mediante el uso de características morfológicas específicas o por un análisis de la síntesis de clorofila después de la exposición del ecallo a la luz.

DESCRIPCIÓN DETALLADA I. DEFINICIONES Se usan diversos términos en toda la memoria descriptiva y las declaraciones. A menos que se especifique otra cosa, estos términos se definen tal como se establece a continuación.

"Callo regenerable de manera sustentable" tal como se usa en la presente significa un callo que es suficientemente regenerable después de la inducción para que, una vez transformado, se pueda regenerar a plantas enteras.

"Transformación" tal como se usa en la presente es la alteración genética de una célula que resulta de la captación, la integración estable en el genoma de la célula, y la expresión de material genético extraño (ADN).

"T-ADN" tal como se as en la presente es cualquier secuencia que pueda ser utilizado por el Agrobacterium como secuencias de borde para la iniciación y/o terminación de la transferencia de ADN a las plantas, y todas las secuencias entre dichas secuencias de borde, tales como las secuencias provenientes del Agrobacterium, o secuencias relacionadas provenientes de plantas, definidas por Romens como P-ADN (ver Romens et al. (2005) Plant Physiol. 139: 1338-1349).

"Regenerado" se refiere a la creación de plantas maduras a partir de tejido vegetal, tal como callo embriogénico, o posiblemente a partir de embriones de estadio temprano, y "capacidad regenerativa" se refiere a la capacidad para dar origen a plantas enteras.

"Planta", "planta transformada", y "planta transgénica", se pueden referir cada uno a partes, tejidos o células individuales de una planta. Estos términos también incluyen material vegetal que puede ser regenerado en una planta madura, incluso sin limitaciones protoplastos o tejido de callo.

Una "planta madura" es una planta en la cual ha tenido lugar el desarrollo normal de todos los órganos vegetativos y reproductivos que generalmente se asocian con las especies de dicha planta.

II. DESCRIPCIÓN Se proveen composiciones y métodos para la transformación eficiente de Miscanthus. Las plantas transformadas de Miscanthus se caracterizan por contener ácido nucleico transferido, tal como un gen transferido o genes de interés flanqueados por al menos un borde T-ADN insertado dentro del genoma de las plantas de Miscanthus. Las plantas son normales en su morfología y pueden ser fértiles, según la especie de Miscanthus. Por lo general, las plantas transformadas contienen una única copia del ácido nucleico transferido sin reordenamientos notables. Alternativamente, el ácido nucleico transferido de interés está presente en el Miscanthus transformado en bajas cantidades de copias. Por baja cantidad de copias se entiende que los transformantes incluyen no más de cinco (5) copias del ácido nucleico transferido, de preferencia, no más de tres (3) copias del ácido nucleico transferido, con mayor preferencia, menos de tres (3) copias del ácido nucleico transferido, con aún mayor preferencia, (1) copia del ácido nucleico transferido. El ácido nucleico transferido incluirá al menos una secuencia de borde de T-ADN.

Los métodos descritos en la presente dependen del uso de transferencia génica mediada por Agrobacterium. La transferencia génica mediada por Agrobacterium aprovecha la capacidad natural de Agrobacterium tumefaciens ó Agrobacterium rhizogenes para transferir ADN dentro de los cromosomas de una planta. Agrobacterium es un patógeno vegetal que transfiere un conjunto de genes codificados en una región denominada T-ADN del plásmido Ti (Agrobacterium tumefaciens) o el plásmido Ri (Agrobacterium rhizogenes) en células vegetales en los sitios de lesión. El resultado típico de la transferencia de genes es un crecimiento tumoral denominado agalla de corona, en la cual el T-ADN está integrado en forma estable al interior de un cromosoma del huésped. La capacidad para causar la enfermedad de la agalla de corona se puede eliminar por deleción de los genes en el T-ADN (por ejemplo, T-ADN desarmado) son pérdida de la transferencia e integración de ADN. El ADN que se transfiere se adjunta a las secuencias de borde que definen los puntos finales de un T-ADN integrado.

La transferencia génica mediante cepas de Agrobacterium obtenidas por ingeniería ha pasado a ser rutinaria para la mayoría de las plantas dicotiledóneas y para algunas plantas monocotiledóneas (ver, por ejemplo, Cheng, et al. (2004) Plant: 40(1):3145, y las referencias allí citadas; también ver Shrawat, et al (2006) Plant Biotechnol. J. 4, pp. 575-603, y las referencias allí citadas). Sin embargo, no hay informes hasta la fecha sobre la producción de Miscanthus transformado mediante transformación mediada por Agrobacterium.

La cepa de Agrobacterium utilizada en los métodos descritos en la presente se modifica para contener un gen o genes de interés, o un ácido nucleico que se ha de expresar en las células transformadas. El ácido nucleico que se transfiere es incorporado en la región T y es flanqueado por al menos una secuencia T-ADN de borde. Una variedad de especie de Agrobacterium es conocida particularmente en la técnica para la transformación del dicotiledóneas. Dichas agrobacterias se pueden usar en los métodos descritos en la presente. Ver, por ejemplo, Hooykaas (1989) Plant Mol. Biol. 13:327-336; Smith et al. (1995) Crop Sci. 35:301-309; Chilton (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:31 19-3120; Mollony et al. (1993) Monograph Theor. Appl. Genet., NY 19:148; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:745-750; y Komari et al. (1996) Plant J. 10:165-174; incorporados en la presente por referencia.

En el plásmido Ti/Ri, la región T está diferenciada de la región vir cuyas funciones son responsables de la transferencia y la integración. Se han desarrollado sistemas de vectores binarios en los cuales están presentes los T-ADN manipulados desarmados portadores de ADN extraño y las funciones vir en plásmidos separados. De esta manera, se construye una región T-ADN modificada que comprende ADN extraño (el ácido nucleico que se transfiere) en un plásmido pequeño que se replica en E. coli. Este plásmido puede ser transferido en forma conjugada en un apareamiento triparental o puede ser transferido por medios alternativos tales como por electroporación al interior de A. tumefaciens o rhizogenes que contiene un gen virulencia portador de plásmido compatible. Las funciones vir son provistas en trans para transferir el T-ADN al interior del genoma vegetal. Dichos vectores binarios son útiles para la puesta en práctica de los presentes métodos y en la producción de las composiciones descritas en la presente.

También se pueden usar vectores superbinarios en los presentes métodos y en la producción de las composiciones descritas en la presente. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 5.591.616 y el documento EPA 0604662A1 , incorporado en la presente por referencia. Dicho vector superbinario se ha construido con el contenido de una región de ADN originada de la región de virulencia de un plásmido Ti pTiBo54'2 (Jin et al. (1987J J. Bacteriol. 169:4417-4425) contenido en un Agrobacterium tumefaciens A281 supervirulento que exhibe eficiencia de transformación extremadamente elevada (Hood et al. (1984) Biotechnol. 2:702-709; Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168:1283-1290; Komari et al. (1986) J. Bacteriol. 166:88-94; Jin et al. (1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425; Komari T. (1989) Plant Sci. 60:223-229; ATCC Accession No. 37394).

Tal como será evidente para los expertos en la técnica, ahora que se ha proporcionado un método para la transformación estable de Miscanthus, se puede usar cualquier ácido nucleico de interés en los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, se puede obtener una planta de Miscanthus por ingeniería para expresar genes de enfermedad y de resistencia a insectos, genes para incrementar el rendimiento o la biomasa, genes para mejorar la tolerancia a un rango de estreses abióticos (incluso sin limitaciones, sequía, calor, frío y congelamiento), genes para modular el contenido de lignina, genes para conferir esterilidad masculina y/o femenina, genes antifúngicos, antibacterianos o antivirales, y similares. De modo similar, el método se puede usar para transferir cualquier ácido nucleico para controlar la expresión génica. Por ejemplo, el ácido nucleico que se transfiere puede codificar un oligonucleótido antisentido.

Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes que intervienen en la regulación de la expresión génica, tales como los miembros de la familia de dedos de zinc, la familia AP2, la familia MADS e incluso algunas de las demás familias enumeradas más adelante, las que intervienen en las señales, tales como cinasas y fosfatasas, y las que intervienen en el cuidado interno, tales como las enzimas de las vías anabólicas y catabólicas, y las proteínas de shock de calor. Las categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican importantes rasgos agronómicos, tales como resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a nematodos, resistencia a herbicidas, esterilidad, características del grano, tiempo de floración, rendimiento inherente, capacidad de fotosíntesis, tolerancia a la sequía, eficiencia de uso de agua, eficiencia de uso de nutrientes (por ejemplo, nitrógeno, fósforo), y genes codificadores de propiedades morfológicas, tales como crecimiento de raíces y ramas, extensión de las hojas, crecimiento y desarrollo tricromo, especificación de los estomas, destino de las flores y destino del meristema.

Otras categorías de genes de interés también pueden incluir miembros de las siguientes familias: la familia de factor de transcripción MYB; la familia de proteínas WRKY; la familia de proteínas repetidoras de anquirina; la familia de proteínas de homeobox (HB); las proteínas fijadoras de elemento CAAT; las proteínas fijadoras de promotor de escamosa (SPB); la familia de proteínas NAM; la familia de proteínas HLH/MYC; la familia de proteínas fijadoras de ADN (DBP); la familia bZIP de factores de transcripción; la familia de proteína fijadora de Box P (BPF-1); la familia del grupo de alta movilidad (HMG); la familia de scarecrow (SCR); la familia GF14; la familia policomb (PCO B); la familia ramificada teosinte (TEO); la familia ABI3; la familia EIL; la familia AT-HOOK; la familia S1 FA; la familia bZIPT2; la familia YABBY; la familia PAZ; una familia de distintos factores de transcripción (MISC) que incluyen la familia DPBF y la familia SPF1 ; la familia GARP, la familia TUBBY, la familia shock de calor, la familia ENBP; la familia RING-zinc, la familia PDBP, la familia PCF; la familia SRS (relacionada con SHI); la familia CPP (símil policomb rica en cisteína); la familia ARF (factor de respuesta a auxina); la familia SWI/SNF; la familia ACBF; la familia PCGL (símil CG-1); la familia ARID; la familia Jumonji; la familia bZIP-NIN; la familia E2F; y la familia símil GRF.

Los rasgos de "resultado" comercialmente importante tales como contenido o composición de aceite, almidón y proteínas se pueden alterar genéticamente mediante el uso de los métodos de transformación descritos en la presente. Las modificaciones incluyen contenido reducido o incrementado de celulosa, contenido reducido o incrementado de hemicelulosa, contenido reducido o incrementado de lignina. La composición específica de hemicelulosa también se puede modificar, por ejemplo al modificar el contenido relativo de azúcares C5 tales como xilosa o arabinosa, y al modificar los enlaces de hemicelulosa a ácidos orgánicos tales como ácido ferúlico. Las modificaciones también incluyen las cantidades relativas de siringilo, guaycilo, y otras formas de lignina basadas en la incorporación de sustratos precursores de lignina. Otras modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, niveles crecientes de lisina y azufre y la provisión de aminoácidos esenciales, y también la modificación de almidón.

Los genes de resistencia de insectos pueden codificar resistencia a plagas que pueden causar significativas reducciones del rendimiento. Por ejemplo, los genes provenientes del microorganismo Bacillus thuringiensis codifica proteínas tóxicas que han sido aisladas, caracterizadas y usadas exitosamente para disminuir la infestación por ECB (patente de los Estados Unidos N.° 5.366.892, Foncerrada et al. Gene Encoding a Coleopteran-active Toxin). Otros ejemplos de genes útiles en la resistencia de insectos incluyen los que codifican metabolitos secundarios y toxinas vegetales.

Los rasgos de resistencia a herbicida pueden incluir genes codificadores de la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactatosintasa (ALS), en particular, los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactatosintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), los genes codificadores de resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutaminasintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros de dichos genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica la resistencia a los antibióticos canamicina y Geneticin®, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorsulfurona.

Los rasgos de resistencia a herbicida también pueden incluir genes que confieren resistencia a herbicidas tales como glifosato o sulfonamida. La resistencia a herbicidas de glifosato se puede obtener al usar genes codificadores de las enzimas objeto mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfatosintasa (EPSPS) (ver, por ejemplo, el documento WO 01/66704). La resistencia a sulfonamida se puede obtener mediante el uso de genes bacterianos que codifican una proteína que tiene actividad de dihidropteroatosintasa insensible a sulfonamida (DHPS) (proteínas sul), y expresar la proteína en las mitocondrias vegetales (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 6.121.513).

Los genes de esterilidad también pueden ser codificados en un cásete de expresión y proveen una alternativa del desespigado físico. Los ejemplos de genes usados de dicha manera incluyen genes preferidos de tejidos masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina tales como QM, descrito en la patente de los Estados Unidos N.° 5.583.210. Otros genes incluyen las cinasas y. los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico masculino o femenino. Además, también se expresan en forma útil los genes que codifican factores que modifican el tiempo de floración, o que reprimen la conversión del meristema de una planta desde la identidad vegetativa a la de floración.

Los rasgos comerciales también pueden ser codificados por un gen o por genes con capacidad para modificar por ejemplo, la composición de la pared celular o la unión entre la lignina y otros componentes de la pared celular vegetal, para el incremento de la producción de etanol (u otro biocombustible), o para proveer la expresión de proteínas. Otro uso importante comercial de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos N.° 5.602.321 , emitida el 11 de febrero de 1997. Los genes tales como B-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxiburiratosintasa) y acetoacetil-CoA-reductasa (ver Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).

Las composiciones y los métodos descritos en la presente son particularmente útiles para la producción de plantas transgénicas de Miscanthus que han sido modificas para exhibir rasgos que serían ventajosos para la producción de biocombustible. Por ejemplo, los genes que pueden modular las vías bioquímicas (por ejemplo para mejorar el uso de nutrientes, mejorar la eficiencia del uso de agua y mejorar la eficiencia de la fotosíntesis), la arquitectura vegetal (por ejemplo cantidad de yemas, tamaño del tallo y altura), resistencia a plagas y enfermedades, tolerancia a estreses abióticos (por ejemplo tolerancia a sequía, tolerancia a sales, y tolerancia a ozono), y resistencia a herbicidas podrían se útiles para incrementar los rendimientos de biomasa de las especies de Miscanthus. La expresión génica de marcadores (por ejemplo, genes de resistencia a herbicidas o a antibióticos e informadores) incrementaría la eficiencia para producir mejores variedades de Miscanthus. Además, los genes con capacidad para modificar la calidad de la biomasa producida por Miscanthus podría ser útil para mejorar la eficiencia de la conversión a combustibles tales como etanol. Un la actualidad se están realizando una enorme cantidad de investigaciones para adelantar el uso de biomasa para biocombustible (ver, por ejemplo, el sitio de red de National Renewable Energy Laboratory en World Wide Web: "nrel.gov/biomass"). Los métodos y las composiciones descritas en la presente pueden ser usados para adelantar dichos esfuerzos.

Por conveniencia, el ácido nucleico que se transfiere puede estar contenido en casetes de expresión. El cásete de expresión generalmente incluye una región de iniciación de la transcripción ligada al ácido nucleico o gene de interés. Dicho cásete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del gene o genes de interés para que esté bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras.

La región de iniciación de la transcripción, el promotor, puede ser nativo u homólogo o extraño o heterólogo para el huésped, o puede ser la secuencia natural o una secuencia sintética. Por extraño se entiende que la región de iniciación de la transcripción no se encuentra en el huésped de tipo silvestre en el cual la región de iniciación de la transcripción se introduce. Tal como se usa en la presente, un gen quimérico incluye una secuencia codificadora ligada operativamente a la región de iniciación de la transcripción que es heteróloga respecto de la secuencia codificadora.

El cásete de transcripción incluye en la dirección 5-3' de la transcripción, una región de transcripción y una región de iniciación de la traducción, una secuencia de interés, y una región de terminación de la transcripción y la traducción funcional de las plantas. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés, o puede ser derivada de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopinasintasa y de nopalinasintasa. Ver también, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Alternativamente, el(os) gen(es) de interés se pueden proporcionar en otro cásete de expresión. Guando corresponde, el(os) gen(es) se pueden optimizar la incrementar la expresión en la planta transformada. Cuando se usan genes de mamíferos, levaduras, o bacterias o dicotiledóneas en la invención, se pueden sintetizar mediante el uso de codones de monocotiledóneas o preferidas de Miscanthus para mejorar la expresión. Existen en la técnica métodos para la síntesis de genes vegetales preferidos. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 5.380.831 , 5.436.391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17:477-498, incorporado en la presente por referencia.

Los casetes de expresión también pueden contener secuencias guía 5' en la construcción del cásete de expresión. Dichas secuencias guía pueden actuar para mejorar la traducción. Los guías de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: guías de picornavirus, por ejemplo, guías EMCV (región 5' no codificadora de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); guías de polivirus, por ejemplo, guías de TEV (virus de tabaco) (Allison et al. (1986) Virol. 154:9-20), y proteína fijadora de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y Sarnow (1991) Nature 353:90-94; guía no traducida del mARN de la proteína de cubierta de virus mosaico de alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling y Gehrke (1987) Nature 325:622-625; guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Agallaie et al. (1989) Molecular Bioloqy of RNA. páginas 237-256; y guía de virus de mancha clorótica de maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virol. 81 :382-385). Ver también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. También se pueden usar otros métodos conocidos por mejorar la traducción, por ejemplo, ¡ntrones, y similares.

Los casetes de expresión pueden contener uno o más de una secuencia de gene o ácido nucleico que se transfiere y se expresa en la planta transformada. En consecuencia, cada secuencia de ácido nucleico estará ligada operativamente a las secuencias reguladoras 5' y 3'. Alternativamente, se pueden proveer múltiples casetes de expresión.

En general, se incluye un cásete de expresión que contiene un gen de marcador seleccionare para la selección de células transformadas. Los genes de marcador seleccionable se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes de marcador seleccionable incluyen genes codificadores de resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicinafosfotransferasa II (NPT) e higromicinafosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a un herbicida o para una enzima que degrada o destoxifica el herbicida en la planta antes de poder actuar. (Ver DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol.,.91 :691-704; Fromm et al. (1990) Bio Technology 8:833-839. Por ejemplo, se ha obtenido la resistencia a herbicidas de glifosato o sulfonilurea mediante el uso de genes que codifican las enzimas objeto mutantes EPSPS y ALS. La resistencia a glufosinato de amonio, bromoxinilo y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) se han obtenido mediante el uso de genes bacterianos que codifican fosfinotricinaacetiltransferasa, una nitrilasa, o una 2,4-diclorofenoxiacetatomonooxigenasa, la cual destoxifica los respectivos herbicidas.

Los genes marcadores seleccionares que se utilizan en los métodos descritos en la presente incluyen sin limitaciones los genes codificadores de: neomicinafosfotransferasa II (Fraley et a. (1986) CRC Critical Reviews en Plant Science 4:1-25); cianamidahidratasa (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4250-4264); aspartatocinasa; dihidrodipicolinatosintasa (Perl et al. (1993) Bio Technology 11 :715-718); tri'ptofanodescarboxilasa (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907-912); dihidrodipicolinatosintasa y aspartatocinasa desensibilizada (Perl et al. (1993) Bio/Technology 11 :715-718); el gen bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503-1507 y Meagher et al. (1996) Crop Sci, 36:1367-1374); triptófano descarboxilasa (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912); neomicinafosfotransferasa (NPT) (Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1 :327-331 ; higromicina fosfotransferasa (HPT o HYG) (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074-1087); dihidrofolatorreductasa (DHFR) (Kwok et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. t;S>A:83:4552- 555); fosfinotricina acetiltransferasa (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518); ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); acetohidroxiácido sintasa (Anderson et al U.S. Pat. N.° 4.761.373; Haughn. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221 :266); 5-enolpiruvil-shikimato-fosfatosintasa (aroA) (Comai et al. (1985) Nature 317:741-744); haloarilnitrilasa (Stalker et al. solic. PCT. WO87/04181); acetil-coenzima A carboxilasa (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220-1225); dihidropteroatosintasa (sul I) (Guerineau et a\. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); polipéptido de 32 kD de fotosistema II (psbA) (Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346-1349); etc.

También se incluyen los genes que codifican la resistencia a: cloranfenicol (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol Biol. 16:807-820 (1991); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108; Zhijián et al. (1995) Plant Science 108:219-227 y Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91 ); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); 2,4-D (Streber et al. (1989) BiofTechnology 7:811-816); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518); espectinomicina (Bretagne-Sagnard y Chupeau (1996) Transgenic Res. 5:131-137).

El gen bar confiere resistencia a herbicidas del tipo de herbicidas de glufosinato, tales como fosfinotricina (PPT) o bialados, y similares. Tal como se observó con anterioridad, otros marcadores seleccionares que podrían usarse en las construcciones del vector incluyen, sin limitaciones, el gen pat, también para resistencia de bialafos y fosfinotricina, el gen ALS para resistencia de imidazolinona, el gen HPH o HYG para resistencia de higromicina, el gen EPSP-sintasa para resistencia de glifosato, el gen Hm1 para resistencia contra la toxina He, y otros agentes selectivos usados en forma ritunaria y conocidos por los expertos en la técnica.

Ver en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511 ; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Ce// 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbíol., 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) The Operon. pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) PhD Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 90:1917-1921 ; Labow et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nuc.

Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc: Germán (Alemania) Biol., 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397-404; Bonin (1993) PhD Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 ; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Exp. Pharmacoloav. 78; Gilí et al. (1988) Nature 334:721-724.

Dichas descripciones se incorporan en la presente por referencia.

La lista anterior de genes marcadores seleccionares es sólo ilustrativa, y no pretende ser limitante. Se puede usar cualquier gene marcador seleccionable para poner en práctica los métodos y las composiciones descritos.

Cuando corresponde, los genes marcadores seleccionabas y los demás genes y ácidos nucleicos de interés que se transfieren se pueden sintetizar para la expresión óptima en Miscanthus. Es decir, la secuencia codificadora de los genes se puede modificar para mejorar la expresión en Miscanthus. El ácido nucleico sintético está diseñado para ser expresado en los tejidos y las plantas transformadas con mayor nivel. El uso de genes marcadores seleccionables optimizados puede dar por resultado mayor eficiencia de transformación.

Los métodos para la optimización sintética de genes están disponibles en la técnica. La secuencia de nucleótidos se puede optimizar para la expresión en Miscanthus o alternativamente se puede modificar para la expresión óptima en monocotiledóneas. Los codones vegetales preferidos se pueden determinar a partir de los codones de máxima frecuencia en las proteínas expresadas en Miscanthus, particularmente las proteínas expresadas con nivel elevado en uno o más tejidos de la planta. Se reconoce que se pueden usar los genes que se han optimizado para la expresión en maíz y otras monocotiledóneas en los métodos descritos en la presente. Ver, por ejemplo, los documentos EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; y Murray et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17:477-498. La patente de los Estados Unidos N.° 5.380.831 ; la patente de los Estados Unidos N.° 5.436.391 ; y similares, incorporados en la presente por referencia. También se reconoce que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica se pueden optimizar o sintetizar. Es decir, también se pueden usar secuencias totalmente optimizadas o parcialmente optimizadas.

Es sabido que las modificaciones de secuencias adicionales mejoran la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias codificadoras de señales espurias de poliadenilación, señales de sitio de corte y empalme de exones-intrones, repeticiones símil transposones, y otras de estas secuencias bien caracterizadas que pueden ser deletéreas para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para determinado huésped celular, tal como se calcula por referencia a genes conocidos expresados . en el huésped. Siempre que sea posible, la secuencia" es modificada con el fin de evitar las estructuras secundarias de horquilla de mARN previstas.

Los métodos descritos en la presente son útiles para producir plantas transgénicas de Miscanthus. La especie Miscanthus usada en los Ejemplos descritos en la presente es M. sinesis. Sin embargo, se puede usar cualquier especie de Miscanthus para producir plantas transgénicas de Miscanthus mediante el uso de los métodos descritos en la presente. Otras especies de Miscanthus incluyen, por ejemplo, sacchariflorus, floridulus, transmorrisonensis, condensatus, y la forma híbrida Miscanthus ? giganteus, un triploide que es el resultado de un cruzamiento entre el diploide sinensis y el tetraploide sacchariflorus.

Las plantas y semillas de Miscanthus generalmente están disponibles en los viveros de plantas ornamentales. Los viveros generalmente proveen plantas o rizomas para asegurar el 100 % de supervivencia después del plantado. La semilla de Miscanthus sinensis usada en los Ejemplos se obtuvo de Jelitto Staudensamen GmbH, Am Toggraben 3, 29690, Schwarmstedt, Alemania.

La semilla de Miscanthus proveniente de genotipos y/o especies fértiles no disponibles de viveros se puede obtener al juntar semillas de plantas en su hábitat natural (por ejemplo, Asia), o de jardines botánicos o centros de recolección de germplasma (por ejemplo, Kew Gardens (RU)). Las especies estériles, los rizomas, las plantas o plantas de cultivos de tejido generalmente se pueden obtener de viveros o empresas de biotecnología (por ejemplo, Tinplant, Alemania).

A fin de obtener semillas de una planta fértil de Miscanthus, rizoma o cultivo de tejido, generalmente se necesita una segunda planta para un cruzamiento y la producción exitosa de semillas, dado que Miscanthus es autoincompatible (además de un informe de apomixis en M. floridulus y un informe de autocompatibilidad en M. condensatus). A menudo se pueden obtener algunas semillas por autopolinización de una única planta debido a incompatibilidad incompleta.

Los métodos descritos en la presente son útiles para producir células de plantas transgénicas de Miscanthus. Dichas células incluyen callos embriogénicos (ecallos) que pueden haber sido originados de cualquier tejido de plantas de Miscanthus. De preferencia, el tejido utilizado para iniciar el ecallo es tejido inmaduro tal como embriones inmaduros, inflorescencias inmaduras (tejido de espículas), y la porción basal de las hojas jóvenes. Alternativamente, el ecállo se puede originar de semillas o tejidos de semillas germinadas, anteras u otros tejidos de antera tales como filamentos, microesporas, embriones maduros, y sobre todo de cualquier otro tejido de Miscanthus capaz de formar ecallo.

El ecallo de Miscanthus se puede producir a partir de semillas, a partir de porciones inmaduras de las inflorescencias, de preferencia espículas inmaduras o a partir de espículas inmaduras. La iniciación del callo embriogénico a partir de semillas se realiza como sigue: Las semillas de Miscanthus se esterilizan por cualquier método conocido en la técnica tales como por inmersión de las semillas en 20% de blanqueador con 0,1 % de Tritón X-100 durante 20 minutos, seguido de enjuague con agua estéril. Las semillas esterilizadas luego se plaquean en un medio sólido tal como "medio de inducción y crecimiento de callo embriogénico" (MECG) que contiene todos los elementos necesarios para la inducción y el crecimiento de callo embriogénico de Miscanthus. Las placas de Petri son convenientes para este proceso, mero se puede usar cualquier recipiente. Es necesario proteger el medio con las semillas contra la desecación. Un método conveniente consiste en sellar el recipiente con Sarán Wrap™ o Parafilm®. Las placas se incuban de preferencia en oscuridad continuada a entre 22 °C y 32 °C, de preferencia aproximadamente 29 °C. En estas condiciones, las semillas germinan, y se puede esperar que el ecallo esté presente en la semilla germinada dentro de 2 a 4 semanas. El subcultivo del ecallo generalmente se lleva a cabo aproximadamente 4 a 6 semanas después de plantar las semillas.

La iniciación del ecallo a partir de las espículas inmaduras se realiza como sigue: Las plantas de Miscanthus se cultivan en macetas, de preferencia 2 macetas de galones hasta que producen estructuras de floración. Cuando las espigas están en la etapa de presencia de 5 a 6 hojas totalmente abiertas, se junta el nudo superior y se esteriliza de manera similar a la forma en que se esterilizan las semillas. Luego se aislan las espículas estériles del nudo superior, y se colocan en medio MECG (ver ejemplos de composición de los medios) igual que se hizo con las semillas. Se puede esperar que el callo embriogénico esté presente en las espículas dentro de 2 a 4 semanas. El subcultivo del ecallo se lleva a cabo aproximadamente 4 a 6 semanas después del plaqueado de las espículas inmaduras.

La iniciación de ecallo a partir de las espículas inmaduras cultivadas se lleva a cabo de manera similar a la iniciación de ecallo a partir de espículas inmaduras, excepto en que antes del plaqueado de las espículas en medio MECG, primero se plaquean en "medio basal" (MSMO; ver ejemplos de la composición de los medios) durante 2 a 4 semanas y luego se tratan las espículas inmaduras cultivadas igual que las espículas inmaduras. Este procedimiento tiene la ventaja de que se puede* producir más tejido antes de plaquear en medio MECG, y en consecuencia se puede producir más ecallo a partir de determinada cantidad de espículas inmaduras.

El método descrito en la presente también se puede usar para transformar suspensiones celulares. Dichas suspensiones celulares se pueden formar a partir de cualquier tejido de Miscanthus. De preferencia el tejido utilizado para iniciar suspensiones es ecallo formado tal como se describió con anterioridad.

Una vez obtenido el ecallo, se pueden usar etapas de cultivo opcionales para incrementar la cantidad o la calidad (tales como la regenerabilidad) del ecallo y seleccionar el ecallo regenerable antes de la transformación. La primera etapa de cultivo incluye el cultivo del ecallo o tejido objetivo antes de la etapa de infección en un medio adecuado tal como (MECG) (ver Ejemplo 1). El periodo de cultivo puede durar tanto como sea necesario para producir suficiente ecallo para la transformación, aunque no tan prolongado para que ocurra variación somaclonal no deseada o pérdida de regenerabilidad. Generalmente, este periodo de cultivo dura desde 4 meses hasta aproximadamente 1 año. Para el cultivo de ecallo, el ecallo se puede subcultivar de rutina cada tres a cuatro semanas y de preferencia el ecallo seleccionado se puede transferir a medio fresco para las ulteriores etapas de cultivo. El ecallo generalmente se cultiva en la oscuridad a una temperatura de 22 a 32 grados C, de preferencia aproximadamente 29 grados C.

La pérdida de regenerabilidad en ecallo cultivado es un problema posible que debe ser evitado, a fin de poder regenerar plantas enteras según un protocolo de transformación. Esto se logra mediante la selección transferencia visual de sólo el tipo regenerable de ecallo, mientras que se descarta el ecallo no regenerable en cada etapa de subcultivo. Un medio para la identificación visual del ecallo regenerable consiste en el uso de la morfología del callo. Los tipos de morfología de ecallo de monocotiledónea que han retenido la capacidad de regeneración son -bien conocidos en la técnica, sin embargo, el uso. de estos métodos de selección visual pueden ser inadecuados para mantener la regenerabilidad del ecallo de Miscanthus durante un periodo suficientemente prolongado para permitir la transformación y la regeneración. Alternativamente, en un método preferido, se puede emplear la biosíntesis de clorofila como marcador para la identificación visual del ecallo regenerable. Mediante el uso de este método de selección, el ecallo se puede someter a luz continuada durante un periodo de al menos aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días antes del subcultivo del ecallo. Cuando se subcultiva el ecallo tratado con luz, de preferencia se puede seleccionar el ecallo verde, por ejemplo, para la regenerabilidad, y transferirlo. El ecallo seleccionado opcionalmente se puede someter a ulteriores etapas de selección en condiciones similares que aseguren mejor que el ecallo usado en el proceso de transformación es callo embriogénico regenerable en forma sustentable. Con aún mayor preferencia, el uso de biosíntesis de clorofila como marcador de selección se puede utilizar en combinación con otros medios conocidos de selección, por ejemplo, selección mediante el patrón morfológico del ecallo.

El proceso de transformación mediada por Agrobacterium descrito en la presente se puede dividir en varias etapas. Las etapas básicas incluyen una etapa de infección (etapa 1); una etapa de cocultivo (etapa 2); una etapa de selección (etapa 3); y una etapa de regeneración (etapa 4).

En la etapa de infección, las células que van a ser transformadas se aislan y se exponen a Agrobacterium. Si las células objetivo son ecallo, el ecallo se pone en contacto con una suspensión de Agrobacterium. Tal como se destacó con anterioridad, el Agrobacterium ha sido modificado hasta contener un gen o ácido nucleico de interés. El ácido nucleico se inserta en la región T-ADN del vector. Se proveen técnicas moleculares generales usadas en la presente, por ejemplo, en Sambrook et al. (eds.) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.

La Agrobacterium que contiene el plásmido de interés de preferencia se mantiene en placas maestras de Agrobacterium con solución madre congelada a aproximadamente -80 ° C. Tal como se usa en la presente, el término "Agrobacterium capaz de transferir al menos un gen" se refiere a Agrobacterium que contiene en gen o ácido nucleico de interés, generalmente en un plásmido que es adecuado para mediar los eventos requeridos para transferir el gen a las células que se busca infectar. Las placas maestro se pueden usar para inocular placas de agar a fin de obtener Agrobacterium que luego se resuspende en medios para el uso en el proceso de la infección. Alternativamente, se pueden usar bacterias provenientes de la placa maestro para inocular caldos de cultivo que crecen en fase logarítmica antes de la transformación.

La concentración de Agrobacterium usada en la etapa de infección y la etapa de cocultivo puede afectar la frecuencia de la transformación. De modo similar, concentraciones muy elevadas de Agrobacterium pueden dañar el tejido que se desea transformar y dar por resultado una menor respuesta del ecallo. En consecuencia, la concentración de Agrobacterium útil en los métodos descritos en la présente puede variar según la cepa de Agrobacterium utilizada, el tejido transformado, el genotipo de Miscanthus transformado, y similares. A fin de optimizar el protocolo de transformación para una línea o tejido de Miscanthus particular, el tejido que se desea transformar (ecallo, por ejemplo), se puede incubar con diversas concentraciones de Agrobacterium. De modo similar, se puede evaluar la expresión génica del marcador y la eficiencia de transformación para diversas concentraciones de Agrobacterium. Si bien la concentración de Agrobacterium puede variar, generalmente se utiliza un rango de concentración de aproximadamente 1 * 103 cfu/ml hasta aproximadamente 1 ?1010, de preferencia dentro del rango desde aproximadamente 1 ? 105 cfu/ml hasta aproximadamente 1 x 109 cfu/ml y con aún mayor preferencia desde aproximadamente 1 ? 108 cfu/ml hasta aproximadamente 1 ,0x 109 cfu/ml.

El tejido que se desea transformar generalmente se añade a la suspensión de Agrobacteríum en una fase de contacto líquida que contiene una concentración de Agrobacteríum para optimizar las eficiencias de la transformación. La fase de contacto facilita el máximo contacto de la célula/el tejido que se busca transformar con la suspensión de Agrobacterium. Las células se ponen en contacto con la suspensión de Agrobacterium durante un periodo de aproximadamente 10 minutos en medio MSMO. Otras suspensiones líquidas equivalentes son conocidas en la técnica y se pueden usar. Ver, por ejemplo, Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:745-750; EPA 0672752A1 ; el documento EPA 0687730A1 ; y la patente de los Estados Unidos N.° 5.591.616. Por ejemplo, también se pueden usar los medios que contienen sales N6 en la etapa de la infección. Las sales de Murashige y Skoog (MS; (1962) Physiol. Plant 15:473-497) incluyen aproximadamente 1 .650,0 mg/l de nitrato de amonio, aproximadamente 6,2 mg/l de ácido bórico, aproximadamente 332,2 mg/l de cloruro de calcio anhidro, aproximadamente 0,025 mg/l de cloruro de cobalto-6H20, aproximadamente 0,025 mg/l de sulfato cúprico-5H20, aproximadamente 37,26 mg/l de Na2EDTA, aproximadamente 27,8 mg/l de sulfato ferroso-7H20, aproximadamente 180,7 mg/l de sulfato de magnesio, aproximadamente 16,9 mg/l de sulfato de manganeso H20, aproximadamente 0,25 mg/l de ácido molíbdico (sal de sodio)-2H2O, aproximadamente 0,83 mg/l de yoduro de potasio, aproximadamente 1.900,0 mg/l de nitrato de potasio, aproximadamente 170,0 mg/l de fosfato de potasio monobásico, y aproximadamente 8,6 mg/l de sulfato de zinc-7H20. Además, se pueden utilizar otros medios tales como Linsmaier y Skoog (LS; (1965) Physiologia Plantarum 18:100-127) y los establecidos en los ejemplos. Las macro y microsales en medio MS son idénticas a las macro y microsales en medio LS, pero ambos medios difieren en la composición de algunas de las vitaminas y otros componentes (Skirvin (1981) en: Cloning Aqricultural Plants Via in Vitro Techniques, Conger, ed., CRC Press, Knoxville, Tenn., pp. 51-140).

En la etapa de cocultivp, las células infectadas preparadas tal como se describió con anterioridad se cocultivan con Agrobacterium. Para el ecallo, el cocultivo con la Agrobacterium usualmente tiene lugar en medio sólido. Los ecallos se cocultivan con Agrobacterium durante aproximadamente 2 a 5 días, de preferencia aproximadamente 4 días. Esta etapa de cocultivo de preferencia tiene lugar en la oscuridad desde 20 hasta 26 grados C, con mayor preferencia aproximadamente 25 grados C.

Después de la etapa de cocultivo, las células transformadas se pueden someter a una etapa de reposo; sin embargo, la etapa de reposo es opcional. Cuando no se usa ninguna etapa de reposo, se puede utilizar una etapa extendida de cocultivo para proveer un periodo de cultivo antes de la adición de un agente selectivo.

Para la etapa de reposo, las células transformadas se transfieren a un segundo medio que contiene un antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de Agrobacteríum. Esta etapa de reposo se realiza en ausencia de cualquier presión selectiva, a fin de permitir la iniciación y el crecimiento preferencial del callo proveniente de las células transformadas que contienen el ácido nucleico heterólogo. Se agrega in antibiótico para inhibir el crecimiento de Agrobacteríum. Dichos antibióticos que inhiben el crecimiento de Agrobacteríum son conocidos en la técnica e incluyen cefotaxima, Timentin®, vancomicina, carbenicilina, y similares. Las concentraciones del antibiótico varían según el estándar para cada antibiótico. Por ejemplo, las concentraciones de carbenicilina varían desde aproximadamente 50 mg/l hasta aproximadamente 500 mg/l de carbenicilina en medios sólidos, de preferencia aproximadamente 75 mg/l hasta aproximadamente 250 mg/l, con mayor preferencia aproximadamente 150 hasta 200 mg/l. Los expertos en la técnica de la transformación de monocotiledóneas reconocerán que la concentración de antibióticos se puede optimizar para un protocolo particular de transformación sin indebida experimentación. De preferencia, no se incluyen pasos de reposo.

Después de la etapa de cocultivo, o después de la etapa de reposo, cuando se usa, las células transformadas se exponen a presión selectiva para seleccionar las células que recibieron y que expresan el polipéptido del ácido nucleico heterólogo introducido por el Agrobacterium. Cuando las células son ecallo, el ecallo es transferido a placas con medio sólido que incluye un antibiótico para inhibir el crecimiento del Agrobacterium y un agente de selección. El agente usado para seleccionar los transformantes selecciona el crecimiento preferencial de las células vegetales transformadas dentro de los explantados que contienen al menos una célula vegetal en la cual una inserción de marcado seleccionare ubicada dentro del vector binario fue proporcionado por el Agrobacterium y se integró de manera estable en el genoma de la célula.

Por lo general, se puede usar cualquiera de los medios conocidos en la técnica para el cultivo de Miscanthus en la etapa de selección, tales como los medios que contienen sales N6 o sales MS. Durante la selección, los ecallos cocultivados se cultivan durante aproximadamente tres semanas, y luego los ecallos sobrevivientes o en crecimiento son transferidos a medio de selección fresco durante otras tres semanas. Después de este periodo de seis semanas, las placas de selección se pasan a luz continuada, tal como se describió con anterioridad, y los ecallos que se pusieron verdes son transferidos a "medio de regeneración de callo embriogénico" (MECR) suplementado con 150 mg/L de timentina para la regeneración de las plantas enteras.

Cuando las plantas transgénicas tienen aproximadamente 1 cm de longitud, se aislan individualmente, y se pasan a MECR fresco suplementado con 150 mg/L de timentina para el crecimiento adicional y la formación de raíces. Las plantas transgénicas con raíces se plantan en tierra y se dejan crecer hasta la madurez.

Ahora que se ha demostrado que se puede transformar Miscanthus mediante la utilización de Agrobacterium, se pueden usar alteraciones al método general descrito en la presente para incrementar la eficiencia o para transformar líneas de élite que pueden tener líneas de cruzamiento endogámico capaces de exhibir algunos rasgos recalcitrantes a la transformación. Los factores que afectan la eficiencia de la transformación incluyen los tipos y las etapas de los tejidos infectados, la concentración de A. tumefaciens, la composición de los medios para el cultivo de tejidos, los genes marcadores seleccionables, la longitud de cualquiera de las etapas antes descritas involucradas, los tipos de vectores y las cepas de Agrobacteríum, y el genotipo de Miscanthus. En consecuencia, se pueden variar estos y otros factores a fin de determinar cuál es el protocolo de transformación óptimo para cualquier genotipo particular de Miscanthus. Se reconoce que no todos los genotipos reaccionan igual a las condiciones de transformación y pueden requerir modificaciones ligeramente diferentes del protocolo. Sin embargo, al alterar cada una de las variables, se puede derivar un protocolo óptimo para cualquier genotipo de Miscanthus.

Si bien se puede usar cualquier genotipo de Miscanthus en los métodos de transformación descritos en la presente, los ejemplos de variedades de Miscanthus incluyen sin limitaciones Miscanthus sinesis.

Se pueden utilizar otras modificaciones que incluyen la provisión de una segunda etapa de infección a fin de incrementar la infección por el Agrobacteríum. Además, se pueden usar los vectores y los métodos descritos en la presente en combinación con bombardeo de partículas a fin de producir plantas transformadas de Miscanthus. Se puede usar el bombardeo de partículas para incrementar las lesiones de los tejidos que se desea transformar mediante Agrobacteríum. (Bidney et al. (1990) Plant Mol. Biol. 18:301-313; EP0486233, incorporado en la presente por referencia). Los métodos para bombardeo de partículas son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sanford et al. Patente de los Estados Unidos N.° 4.945.050; McCabe et al. (1988) Biotechnol. 6:923-926). Ver también, Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Datta et al. (1990) Biotechnol. 8:736-740; Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4305-^309; Klein et al. (1988) Biotechnol. 6:559-563 (maize); Klein et al. (1988) Plant Physiol., 91 ;440- 44; Fromm et al. (1990) Biotechnol. 8:833-839; Tomes et al. "Direct DNA transfer into intact plant cells vía microprojectile bombardment", en: Gamborg y Phillips (Eds.) Plant Cell. Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods: Springer-Verlag, Berlín (1995); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London), 31 :763-764; y Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349; todos los cuales se incorporan en la presente por referencia.

Después de lesionar las células mediante bombardeo de proyectiles, las células se inoculan con solución de Agrobacterium. La etapa adicional de infección y de bombardeo de partículas puede ser de utilidad para transformar los genotipos de Miscanthus que son particularmente recalcitrantes a la infección por Agrobacterium.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y de ninguna manera como limitación.

EJEMPLOS Ejemplo I. Generación de Miscanthus transgénico mediante calló embriogénico derivado de semillas A. Producción de callo embriogénico reqenerable. El callo embriogénico proveniente de "semillas puras": semillas de Miscanthus sinensis variedad "semilla pura" (obtenida de Jelitto, Staudensamen, Alemania) se esterilizaron por inmersión en 20% de blanqueador (más 0,1% de Triton-X100®) durante 20 minutos, seguido de cinco enjuagues en agua destilada estéril. Todas las manipulaciones posteriores a la etapa de esterilización se realizaron en forma aséptica en un gabinete de flujo de aire laminar. Las semillas esterilizadas se plaquearon en medio de inducción y crecimiento de callo embriogénico de Miscanthus (MECG) en placas de Petri (100 x 25 mm) y se sellaron con tres capas de envoltura sarán. Las placas se incubaron en oscuridad continuada a 29 °C durante 6 semanas. Se seleccionó callo embriogénico de alta calidad en el microscopio de disección en ese momento.

B. Cultivo de callo embriogénico regenerable. Una vez obtenido el callo embriogénico, se incubó el callo embriogénico en MECG en oscuridad continuada a 29 °C. El ecallo se subcultivó de rutina en MECG fresco aproximadamente cada tres a . cuatro semanas. Las placas que contenían los cultivos de ecallo se incubaron a 29 °C durante 3-7 días en luz blanca continua provista por tubos fluorescentes de luz blanca fría (70 pmol m-2 s-1 ) antes del subcultivó. La exposición a la luz indujo a algunas partes del ecallo a tornarse verdes. El ecallo seleccionado para el subcultivó se seleccionó preferentemente sobre la base del color (se seleccionaron los ecallos verdes) en combinación con el patrón morfológico. Como tal, se usó la biosíntesis de clorofila como marcador de selección para mantener el ecallo regenerable.

C. Infección y cocultivo del callo embriogénico con Agrobacterium tumefaciens. La transformación del ecallo descrito con anterioridad se inició por infección y cocultivo con Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 (pMP90) que contiene el vector binario PBI121. La cepa de Agrobacterium GV3101 es una cepa que contiene resistencia a gentamicina en el plásmido Ti vir y resistencia a canamicina en el plásmido binario. El vector binario PBI121 también porta (3- glucuronidasa (GUS) como gen informador, y el gen de neomicinafosfotransferas II (NPTII) que confiere resistencia a G418 (Geneticin) como marcador seleccionable dentro de T-ADN.

Las agrobacterias anteriores se cultivaron en 50 mi de medio de cultivo de LB líquido de Agrobacteríum (más 100 ppm de canamicina) en un frasco de 250 mi de Erlenmeyer a 250 rpm a 28 °C durante la noche. Se seleccionaron ecallos jóvenes de Miscanthus sinensis "semilla pura" cultivados en MECG hasta un tamaño de aproximadamente tres milímetros de diámetro en un microscopio de disección. La etapa de crecimiento del ecallo usado para el cocultivo tuvo lugar inmediatamente después de la exposición a la luz. La selección se logró mediante el uso de patrones morfológicos del ecállo combinado con biosíntesis de clorofila como marcador de selección para el ecallo regenerable. Las agrobacterias cultivadas durante la noche se diluyeron a DO 0,6 con medio líquido MECG. El ecallo seleccionado se infectó por inmersión en el líquido de Agrobacteríum durante 5-10 minutos en una placa de Petri. El líquido de Agrobacteríum se extrajo mediante una pipeta estéril. Luego se transfirió el ecallo al "medio de cocultivo de Agrobacteríum y callo embriogénico" (MECC) en placas de Petri para el cocultivo. Las placas para cocultivo se incubaron en la oscuridad a 25 °C durante cinco días.

D. Cultivo v selección de callo embriogénico transformado de Miscanthus.

Después de cinco días de cocultivo, los ecallos se transfirieron a "medio de selección de callo embriogénico transgénico" (MECS; MECG más filtro esterilizado de 100 ppm G418 (Geneticin) para la selección del gen NPTII, y 150 ppm dé timentina para eliminar agrobacterias). El cultivo se incubó en oscuridad continua a 29 °C. Después de tres semanas, el ecallo se transfirió a MECS fresco en las mismas condiciones de cultivo. Después de otras tres semanas, el ecallo recién formado se analizó respecto de la presencia de GUS, y el ecallo transformado se tornó azul cuando se expuso a la solución de tinción de GUS en pocas horas.

E. Regeneración de plantas transqénicas enteras a partir de callo embriogénico cocultivado. Después de seis semanas de selección en MECS en oscuridad, las placas se pasaron a luz blanca continua provista por tubos fluorescentes blancos fríos (70 µ???? m-2 s-1) durante 2 semanas. Las plantas verdes que se formaron fueron transferidas a medio MECR suplementado con 150 mg/L de timentina para ulterior crecimiento y formación de raíces. La punta de las hojas de una planta regenerada entera de Miscanthus sinensis fue analizada respecto de la presencia de GUS. La punta de la hoja de la planta transformada de Miscanthus sinensis se tornó azul cuando se expuso a la solución de tinción de GUS en pocas horas. Se plantó una planta entera con raíces de Miscanthus sinensis en una maceta llena de mezcla de suelo autoclavada "sunshine", y la maceta se mantuvo en una sala de crecimiento con control de temperatura y luz control para la aclimatización y el crecimiento.

Ejemplo II. Generación de Miscanthus transgénico mediante el uso de callo embriogénico derivado de inflorescencia inmadura (espícula). Callo embriogénico obtenido de inflorescencia inmadura: Las semillas de Miscanthus sinensis (variedad "Late Hybrid" obtenida de Jelitto, Staudensamen, Alemania) se plantó y se cultivó en suelo. Cuando las espigas habían crecido hasta el punto de la presencia de 5-6 hojas totalmente abiertas, se cosechó el internado superior y se esterilizó con 20% de blanqueador (más 0,1% de Tritón X100). durante cinco minutos, seguido de cinco enjuagues en agua destilada estéril. Las espículas inmaduras se extrajeron del internado superior y se plantaron en medio MECG en placas de Petri (100 X 25 mm) y se sellaron con tres capas de envoltura sarán. Las placas se incubaron en oscuridad continua a 29 °C durante 6 semanas, momento en el cual el callo embriogénico estaba presente en muchos de los explantados. Los callos embriogénicos de alta calidad se seleccionaron visualmente con microscopio de disección en este momento.

La selección de ecallo regenerable, cocultivo con Agrobacterium y la posterior selección de ecallo transformado se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior (partes B a D). Así se obtuvieron los ecallos transformados.

La regeneración del ecallo y la producción de plantas transgénicas de Miscanthus se lograron por el método descrito en el Ejemplo 1 anterior, Parte E. Ejemplo III. Generación de Miscanthus transgénico resistencia a herbicida sulfonamida Las plantas transgénicas de Miscanthus que son resistentes al herbicida sulfonamida se producen mediante el uso de los métodos descritos en la presente. Esto se logra la seleccionar un gen que exhibe actividad de insensibilidad a sulfonamida tales como dihidropteroatosintasa (DHPS) (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 6.121.513, incorporada a la presente por referencia), por selección de un péptido guía mitocondrial adecuado, construcción de una construcción de fusión entre el guía mitocondrial y el gen que confiere resistencia a sulfonamida, y la inserción de la construcción en un vector binario usado en la transformación mediada por Agrobacterium de una planta de Miscanthus.

La producción de ecallo, la selección del ecallo regenerable, y el cocultivo con Agrobacterium se realizan tal como se describió en los Ejemplos I y II anteriores. La selección dé ecallo transformado se logra en medios tales como MECS, con sustitución por un herbicida sulfonamida tal como Asulam en lugar de G418 como agente de selección. La posterior regeneración del ecallo y la producción de plantas transgénicas de Miscanthus se realizan tal como se describió en los Ejemplos I y II anteriores.

Formulaciones para los medios antes descritos Las siguientes formulaciones son para medios líquidos. Si se requiere medio sólido, se pueden agregar 2,5 g/L de Gelrite® antes de la esterilización, por ejemplo, por autoclave.

Medio basal (MSMO) Mezcla de sales MS (1X) Mezcla de vitaminas Gamborg B5 (1X) Maltosa (30 g/L) pH ajustado a 5,7 Medio de cultivo de Agrobacterium (MinA) Bactc-Tryptone® (10 g/L) Extracto de levadura Bacto® (5 g/L) NaCI (10 g/L) Medio de inducción y crecimiento de callo embriogénico (MECG) Medio MSMO al que se agrega: 6-Bencilaminopurina (BA) (1 ,0 mg/L) 2, 4~-D (5,0 o 2,0 mg/L) Medio de regeneración de callo embriogénico (MECR) Medio MSMO al que se agrega: 0,5 mg/L de ácido giberélico (GA3) Medio de cocultivo de Agrobacterium v callo embriogénico (MECO Medio MSMO al que se agrega: 6-Bencilaminopurina (BA) (1 ,0 mg/L) 2, 4-D (5,0 o 2,0 mg/L) Acetosiringona (100 µ?) Medio de selección de callo embriogénico transqénico (MECS) Medio MSMO al que se agrega: 6- Bencilaminopurina (BA) (1 ,0 mg/L) 2, 4-D (5,0 o 2,0 mg/L) Timentina (150 mg/L) G418 (100 mg/L) Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la presente memoria descriptiva se incorporan en la presente por referencia en el mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual estuviéra específicamente e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

La presente invención no está limitada por las formas de realización específicas descritas en la presente. La invención ha sido descrita ahora en su totalidad, y será aparente para los expertos en la técnica que se pueden hacer muchos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las modificaciones que sean aparentes a partir de la descripción anterior se incluyen en el alcance de las reivindicaciones.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transformada de Miscanthus derivada de callos embriogénicos seleccionados por su capacidad para ser cultivada hasta planta madura, caracterizada porque comprende un plásmido de interés que comprende un ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia de borde recombinante de T-ADN incorporada en su genoma.

2. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque el callo embriogénico cultivado es seleccionado mediante el uso de síntesis de clorofila como indicador de la capacidad del callo embriogénico para desarrollarse hasta planta madura.

3. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende menos de 5 copias del ácido nucleico recombinante incorporado en su genoma.

4. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque el ácido nucleico recombinante también comprende polinucleótidos que confieren resistencia a un agente de selección.

5. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque el polinucleótido codifica la enzima neomicina fosfotransferasa II (NPTII).

6. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque el ácido nucleico recombinante comprende un segundo polinucleótido que confiere tolerancia a herbicida.

7. Un tejido transformado de la planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 1. ,

8. Una semilla transformada producida por la planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende el plásmido de interés.

9. Una planta de progenie de Miscanthus derivada de la semilla transformada de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende el plásmido de interés.

10. Una célula de planta transformada derivada de la planta de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Un método para preparar una planta transgénica de Miscanthus transformada con un plásmido de interés que comprende una secuencia de nucleótidos recombinante, caracterizado porque las etapas del método comprenden: (a) seleccionar un callo embriogénico que se puede cultivar hasta una planta madura, en donde el callo embriogénico se deriva de una planta objetivo de Miscanthus, y la selección incluye el análisis de la síntesis de clorofila como indicador de la capacidad del callo embriogénico para desarrollarse hasta planta madura; (b) poner en contacto el callo embriogénico con una Agrobacterium que comprende él plásmido de interés; (c) cocultivar el callo embriogénico con Agrobacterium para producir un callo embriogénico transformado; (d) cultivar el callo embriogénico transformado hasta una planta transgénica de Miscanthus.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque la selección comprende exponer el callo embriogénico a luz continua. durante un periodo de al menos un día.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque la selección comprende exponer el callo embriogénico a luz continuada durante un periodo de al menos dos días.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque la secuencia de nucleótidos recombinante comprende un polinucleótido que confiere resistencia al menos a un agente de selección.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque la planta transgénica de Miscanthus comprende el plásmido de interés y al menos un vector.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque la etapa de selección de la etapa (a) incluye el análisis de la síntesis de clorofila y el examen morfológico como indicador de la capacidad del callo embriogénico para desarrollarse hasta planta madura.

17. Una planta transformada de Miscanthus, caracterizada porque es producida por: (a) preparación del callo embriogénico a partir de una planta objeto de Miscanthus, en donde el callo embriogénico tiene un genoma y es seleccionado por su capacidad para ser cultivado hasta la planta madura; (b) provisión de un Agrobacterium que comprende un plásmido de interés que comprende una secuencia de nucleótidos recombinante, en donde la secuencia de nucleótidos recombinante comprende un polinucleótido de interés; (c) poner en contacto el callo embriogénico con el Agrobacterium; (d) cocultivar el callo embriogénico con el Agrobacteríum durante tiempo suficiente para que un polinucleótido de interés se integre en el genoma del callo embriogénico para formar el callo transgénico de Miscanthus; y (e) cultivar la planta transgénica de Miscanthus a partir del callo embriogénico de la etapa (d), en donde la planta transgénica de Miscanthus comprende al menos una copia de un polinucleótido de interés incorporado en el genoma.

18. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque el callo embriogénico de la etapa (a) es seleccionado mediante el uso de síntesis de clorofila como indicador de la capacidad del callo embriogénico para desarrollarse hasta una planta madura.

19. La planta transformada de Miscanthus de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos recombinante también comprende un segundo polinucleótido que confiere resistencia a un agente de selección, y el segundo polinucleótido se integra en el genoma del callo embriogénico durante la etapa de cocultivo de (d). p.p. MENDEL BIOTECHNOLOGY, INC.