ES2381667T3 - Transformación de plastos - Google Patents

Abstract

Un método para protección de una planta transplastómica que comprende los pasos de: a) Introducir el un plasto de una célula vegetal un vector de transformación de plastos que comprende dos constructos marcadores seleccionables distintos, en donde el primer constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un primer marcador seleccionable que confiere resistencia a un compuesto selectivo no letal, y el segundo constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un segundo marcador seleccionable que confiere tolerancia a un compuesto letal, en donde el primer constructo marcador seleccionable está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y el segundo constructo marcador seleccionable está flanqueado por secuencias de ácido nucleico que son homólogas a secuencias de ácido nucleico diana de plastos no esenciales; b) poner la célula vegetal en un primer medio de cultivo que comprende un compuesto no letal para el plasto al cual confiere resistencia el primer marcador seleccionable, durante 1) un periodo de aproximadamente 2 semanas o 2) hasta que aparecen brotes en un callo formado a partir de la célula vegetal; y c) poner la célula vegetal en un segundo medio de cultivo que comprende un compuesto letal para el plasto al cual confiere resistencia el segundo marcador seleccionable durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la célula vegetal sea homoplásmica para el marcador letal; y d) obtener una planta transplastómica que comprende únicamente el segundo marcador, letal.

Description

Transformación de plastos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la transformación de plastos. La invención proporciona vectores y métodos de transformación para obtener plantas o algas transplastómicas que tienen un plasto transformado que comprenden los pasos de introducción en los plastos de una molécula o vector de ácido nucleico recombinante, y dos fases de selección, utilizando la primera fase de selección un compuesto no letal y utilizando una segunda fase de selección un compuesto letal. Como alternativa, el método de selección dual se conduce simultáneamente, utilizando una concentración menor del compuesto letal.

Antecedentes de la invención

La mejora de variedades de plantas por transformación ha adquirido una importancia creciente para la reproducción moderna de las plantas. Diversas tecnologías de transferencia de genes permiten la incorporación de moléculas de DNA extraño en los genomas de las plantas. La expresión de genes codificados por tales moléculas de DNA extraño (transgenes, genes de interés) puede conferir en potencia nuevas características beneficiosas a la planta como, por ejemplo, calidad o rendimiento mejorados de la cosecha. La expresión de transgenes puede permitir también el uso de las plantas como factorías bioorgánicas.

La mayoría de los sistemas de transferencia de genes, tales como la transformación mediada por Agrobacterium o el bombardeo con partículas recubiertas de DNA, integran de manera estable genes heterólogos en el genoma nuclear de la planta por medio de recombinación no homóloga. La ingeniería de las plantas utilizando estos métodos presenta varios inconvenientes. Estos métodos producen una población de transformantes que varía en el número de copias de su transgén y cuya expresión es a menudo impredecible debido a variaciones de efecto de posición o posible silenciación de genes. La mayoría de las plantas transgénicas producidas por estos métodos contienen en su genoma nuclear secuencias de vectores no deseadas asociadas con el gen de interés. Adicionalmente, la amenaza de contaminación del transgén de plantas salvajes afines por la planta genéticamente modificada es un problema ambiental importante. El riesgo de escape de transgenes de cosechas alteradas genéticamente a sus afines salvajes se origina predominantemente por diseminación del polen.

La transformación de genes de plastos es una alternativa importante para la expresión de genes heterólogos en plantas (revisado por Bogorad, Trends Biotechnol, 18: 257-263, 2000 y Bock, J. Mol. Biol. 312: 425-438, 2001). Aunque los genomas de los plastos son de tamaño relativamente pequeño, 120 a 160 kb, los mismos pueden acomodar fácilmente varias kilobases de DNA extraño en su interior. La inserción de DNA extraño en el genoma del plasto ocurre principalmente por recombinación homóloga, y un transgén puede dirigirse de modo orientado a un locus particular utilizando regiones flanqueantes homólogas adecuadas. Una de las ventajas principales de la transformación de plastos es que es posible obtener una expresión muy alta del transgén. El genoma del plasto (plastoma) es altamente poliploide, por lo que el transgén se expresa a partir de copias múltiples del gen en el plasto. La poliploidía del genoma de los plastos es tal que una célula de hoja madura puede contener más de 10.000 copias del plastoma. Como factor que contribuye también al alto nivel de la expresión del transgén en los plastos se encuentra la ausencia de los efectos de posición y silenciación de genes. Otra ventaja importante es que los plastos de la mayoría de las plantas de cosecha se heredan sólo por vía materna y por consiguiente, el riesgo ecológico de escape de transgenes de plastos por cruzamiento exogámico mediado por el polen se minimiza.

Las técnicas básicas de suministro de DNA para transformación de plastos son la vía de bombardeo con partículas de las hojas o la incorporación de DNA mediada por polietilenglicol en protoplastos. La transformación de plastos por biolística se realizó inicialmente en el alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., Science

240: 1534-1537, 1988) y este método, utilizando selección para loci con acción cis de resistencia a los anti-bióticos (resistencia a espectinomicina/estreptomicina) o complementación de fenotipos mutantes no-fotosintéticos, se extendió a Nicotiana tabacum (Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530,1990), Arabidopsis (Sikdar et al., Plant Cell Reports 18:20-24, 1991), Brassica napus (WO 00/39313), patata (Sidorov et al., The Plant Journal 19(2):209-216, 1999), petunia (WO 00/28014), tomate (Ruf et al., Nature Biotechnology 19: 870-875, 2001), colza de semilla oleaginosa (Hou et al., Transgenic Res. 12: 111-114, 2003) y Lesquerella fendleri (Skarjinskaia et al., Transgenic Res. 12: 115-122, 2003). La transformación en plastos de protoplastos de tabaco y del musgo Physcomitrella patens se ha conseguido utilizando incorporación de DNA mediada por polietilenglicol (PEG) (O'Neill et al., Plant J.

3: 729-738, 1993; Koop et al., Planta 199: 193-201, 1996). Más recientemente, la micro-inyección de DNA directamente en plastos de células marginales mesófilas de plantas intactas de tabaco dio como resultado una expresión transitoria (Knoblauch et al., Nature Biotechnology 17: 906-909, 1999) pero no se ha informado hasta ahora de transformantes estables utilizando esta técnica. Se ha publicado también la transformación estable de cloroplastos por biolística para la Euglenofita Eugena gracilis (Doetsch et al., Curr. Genet. 39: 49-60, 2001) y el alga roja unicelular Porphyridium sp (Lapidot et al., Plant Physiol. 129: 7-12, 2002), el marcador dominante seleccionable utilizado para la última consiste en una forma mutante del gen codificante de acetohidroxiacido-sintasa que confiere tolerancia al herbicida sulfometurón-metilo. Como se ha mencionado anteriormente, la transformación de cloroplastos consiste en la integración de un DNA extraño en una posición precisa en el genoma del plasto por recombinación homóloga. Los vectores de transformación de plastos están constituidos por DNA del plasto clonado, homólogo a la región diana, que flanquea un gen marcador seleccionable que está enlazado a su vez a un gen o varios genes de interés. Después de la transformación, el o los transgenes y el marcador seleccionable se insertan juntos como un bloque de secuencia heteróloga en el locus diana del genoma del plasto por recombinación homóloga entre los vectores secuencia del plasto y el locus diana. Para obtener plantas homoplásmicas transformadas de manera estable, es decir plantas que tengan el DNA extraño insertado en cada copia del plastoma de la célula de la planta, se requieren varias tandas de subcultivo en medios selectivos. Este proceso facilita la segregación de plastos transplastómicos y no transformados y da como resultado la selección de células homoplásmicas con uno o más genes de interés y el marcador seleccionable integrado de manera estable en el plastoma, dado que estos genes están enlazados unos a otros.

La mayoría de las transformaciones estables de plastos demostradas hasta la fecha se han basado en selección utilizando el gen aadA de resistencia a antibióticos (como se ha indicado arriba en las referencias anteriores) o NPTII (Carrer et al., Mol Gen Genet 241: 49-56, 1993), para obtener plantas homoplásmicas. La eficiencia de transformación de la transformación de plastos podría aumentarse sustancialmente por el empleo de un gen aadA quimérico, que confiere resistencia contra Espectinomicina y Estreptomicina (Svab y Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 913-917). Estos marcadores seleccionables confieren un fenotipo de selección específico, la pigmentación verde (US 5.451.513), que permite distinguir visualmente las células transplastómicas pigmentadas en verde de las células que tienen plastos de tipo salvaje que no se pigmentan en las condiciones seleccionadas.

La mayoría de los métodos de transformación de plastos están basados en el uso de un marcador seleccionable que confiere una selección no letal. Estos marcadores seleccionables confieren también un fenotipo de selección específico, la pigmentación verde (Patente U.S. No. 5.451.513) que permite distinguir visualmente las células transplastómicas pigmentadas en verde de las células que tienen plastos de tipo salvaje que no se pigmentan en las condiciones seleccionadas. Por ejemplo, plantas transformadas con el gen bacteriano aadA que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina crecen normalmente en presencia de uno cualquiera de estos antibióticos, mientras que las plantas no transformadas pierden su color. Las plantas transformadas pueden identificarse por tanto fácilmente utilizando clorofila como marcador visual. Existe un número limitado de marcadores seleccionables disponibles para transformación de plastos, y los más fiables, tales como aadA o mutaciones puntuales en los genes 16S rDNA y rps12 de los plastos confieren resistencia a los mismos antibióticos, espectinomicina y/o estreptomicina. Se demostró que marcadores seleccionables que confieren resistencia a otros antibióticos tales como kanamicina son mucho menos eficaces para transformación de plastos.

Han surgido problemas acerca de los genes de resistencia a los antibióticos en cosechas genéticamente modificadas (GM) debido a los riesgos potenciales de transferencia horizontal de genes a microorganismos en el ambiente o a microbios del tubo digestivo. Estos riesgos potenciales pueden plantear problemas aún mayores en el caso de las plantas transplastómicas debido a las características procariotas del genoma de los plastos y al número mucho mayor de copias del transgén por célula. Por esta razón es sumamente deseable obtener plantas transplastómicas sin genes de resistencia a los antibióticos.

Otra alternativa son métodos en los cuales el gen de resistencia a los antibióticos se elimina después de la transformación. Una vez que las plantas son homoplásmicas para el transgén, la presencia del gen marcador seleccionable en el plastoma ya no es necesaria. La eliminación del marcador seleccionable de una planta transplastómica se ha logrado por dos métodos diferentes. El primer método, desarrollado inicialmente para reciclaje del marcador seleccionable de un plastoma transformado de C. reinhardtii (Fischer et al., Mol. Gen. Genet. 251: 373-80, 1996) y se ha extendido recientemente a Nicotiana tabacum (Iamtham y Day, Nat. Biotechnol. 18: 1172-1176, 2000), está basada en el sistema de recombinación homóloga de los plastos para delecionar el gen marcador del genoma del plasto. La recombinación homóloga entre secuencias repetidas directas que flanquean el marcador seleccionable da como resultado la deleción del segmento de DNA. Este método requiere varias tandas de autocruzamiento o retrocruzamiento antes que se obtengan las plantas transgénicas sin el marcador seleccionable. El segundo método utiliza el sistema de recombinación Cre/lox ((Hajdukiewicz et al., The Plant J. 27: 161-170, 2001; Comeille et al., The Plant J. 27: 171-179, 2001) para escindir el segmento de DNA. En este método, la proteína Cre media la escisión de un segmento de DNA localizado entre dos sitios lox en orientación directa repetida. Para eliminar el marcador seleccionable, se introduce el gen Cre en los núcleos de las plantas transplastómicas sea por transformación nuclear o por cruzamiento. Una vez que se retira el gen marcador seleccionable, se elimina el gen Cre por cruzamiento genético. Aunque ha alcanzado éxito, la retirada del marcador seleccionable utilizando uno cualquiera de estos métodos presenta ciertas desventajas. Ambos métodos son procesos laboriosos dado que puedan requerirse tandas de cruzamiento múltiples, y ambos métodos dejan un segmento de DNA heterólogo residual indeseable en el genoma del plasto que no sirve para propósito alguno. Adicionalmente, se observó recombinación inespecífica que causaba deleciones de DNA con el sistema de recombinación Cre/lox (Hajdukiewicz 2001), Así pues, existe necesidad de desarrollar otros métodos para obtener plantas transplastómicas sin la integración estable de un marcador seleccionable de antibióticos en el genoma del plasto.

La aplicación de genes de resistencia a antibióticos como el marcador seleccionable para transformación de plastos se ve limitada también por el requerimiento de la pigmentación verde como el fenotipo de selección. Una selección basada en pigmentación verde precisa llevarse a cabo a la luz, lo que puede no ser la condición de cultivo óptima para algunos cultivos de células de plantas. Adicionalmente, no todos los tipos de tejido exhiben el fenotipo de pigmentación verde en condiciones de cultivo normales, tales como la mayoría de los cultivos de células de cosechas de cereales. Por tanto, es deseable desarrollar una estrategia de selección para transformación de plastos en la cual la selección no sea dependiente de la pigmentación verde.

Ciertos genes no marcadores de resistencia a antibióticos, tales como el gen de la protoporfirinogeno-oxidasa (US 6.084.155), los genes de 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato-sintasa (Daniell et al., Nature Biotech 16: 345-348, 1998; Ye et al., The Plant Journal 25(3): 261-270, 2001), y el gen bar (Lutz et al., Plant Physiology 125: 1585-1590, 2001), pueden expresarse eficazmente en plantas transplastómicas. Muy recientemente, se ha informado también que los genes EPSPS y bar se han utilizado en un método de segregación para obtener plantas transplastómicas resistentes a herbicidas con exclusión de genes antibióticos (Ye et al., Plant Physiology 133: 402-410, 2003).

Otra alternativa consiste en la utilización de la betaína-aldehído-deshidrogenasa de espinaca como el marcador seleccionable que confiere resistencia al compuesto letal betaína-aldehído (Daniell et al., Curr Genet 2001, 39: 109116, 2001). US 2002/0042934 describe un método de selección en dos fases para obtención de plantas transplastómicas por utilización de un marcador no letal y un marcador letal, en el cual los dos marcadores están localizados en plásmidos separados. Este método tiene la desventaja de una eficiencia bastante baja resultante de tasas bajas de co-transformación.

La presente invención proporciona métodos para transformación de plastos en una gran diversidad de especies de plantas y algas. La misma aborda el problema de eliminación del marcador de resistencia a antibióticos que se suministra a los plastos durante la transformación y proporciona métodos de selección para plantas homoplásmicas transplastómicas en los cuales la pigmentación verde del fenotipo seleccionado no es un requisito previo. Breve Descripción de las Figuras

Figura 1: Mapa del vector de transformación de plastos pEBPPOt (SEQ ID NO: 1). Las secuencias de direccionamiento a plastos plDNA 16rDNA y rps12/7 se representan por líneas sombreadas. Los componentes del gen quimérico ppo de A. thaliana son el promotor del gen de plastos del maíz 16S PEP-NEP rRNA fusionado al rbcL RBS de plastos de N. tabacum (SEQ ID NO: 4; PmrrN), el gen ppo de A. thaliana (Atppo) y la 3'UTR rps16 de plastos de N. tabacum (3' rps16). Los componentes del gen quimérico aadA son el promotor psbA de N. tabacum (PpsbA) fusionado a aadA, la secuencia codificante aadA (aadA) y la 3'UTR de psbA de A. thaliana (3'psbA). La resistencia a ampicilina en la secuencia vectora de la cadena principal (amp) está codificada por el gen bla y se indica por una flecha. Están marcados los sitios de restricción para PstI, NdeI, EcoRI, EcoRV, BamHI y ScaI.

Figura 2: Mapa del vector de transformación de plastos pEB8 (SEQ ID NO: 2). Las secuencias de direccionamiento de plastos plDNA 16rDNA y rps12/7 se representan por líneas sombreadas. Los componentes del gen quimérico ppo de A. thaliana son el promotor psbA de N. tabacum (PpsbA), el gen ppo de A. thaliana (Atppo) y la 3'UTR del plasto rps16 de los plastos de N. tabacum (3' rps16). Los componentes del gen quimérico aadA son el promotor de plastos clpP de N. tabacum (PclpP), la secuencia codificante aadA (aadA) y la 3'UTR rps16 de los plastos de N. tabacum (3' rps16). El gen de resistencia a ampicilina en la secuencia vectora de la cadena principal (amp) está codificado por el gen bla y se indica por una flecha. Están marcados los sitios de restricción para: PstI, NdeI, EcoRI, EcoRV, BamHI y ScaI.

Figura 3: Mapa del vector de transformación de plastos pNY2C (SEQ ID NO: 3). Las secuencias de direccionamiento a los plastos 1 (número de acceso NC_001879 posición 96811 a 97844), 2 (posición 95356 a 96811) y 3 (posición 93132 a 95351) para recombinación homóloga están subrayadas. El gen quimérico aadA está insertado dentro del gen esencial ycf2 en la posición 95351 del genoma de plastos del tabaco. El gen ppo quimérico de A. thaliana está insertado en la región intergénica entre los genes de los plastos ndhB y trnL en la posición 96811 del genoma de plastos del tabaco. Los componentes del gen ppo quimérico de A. thaliana son el promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA de plastos de maíz fusionado al RBS rbcL (PmrrN) de plastos de tabaco, el gen ppo de A. thaliana (Atppo) y la 3'UTR de rps16 del plasto rps16 de N. tabacum (3' rps16). Los componentes del gen quimérico aadA son el promotor psbA de N. tabacum (PpsbA) fusionado a aadA, la secuencia codificante de aadA (aadA) y la 3'UTR de psbA de

A. thaliana (3' psbA). Están marcados los sitios de restricción para EcoRI, EcoRV, MluI, NcoI, NdeI, Ngo-MIV, ScaI, SnaBI, SpeI, XbaI y Xhol.

Figura 4: Ilustra un esquema para integración del transgén PPO en un genoma de plasto. Después de la selección inicial con espectinomicina el vector completo se integra en el genoma del plasto por dos eventos de recombinación posibles que ocurren entre los vectores rps12 de cloroplastos (1) o secuencias flanqueantes trnV-rrn16 (2) y el locus direccionado del plasto. Estos eventos de entrecruzamiento simple crean una población mixta de genomas transformados de plastos que tienen el vector insertado en diferente conformación. Subsiguientemente, la selección con butafenacil permite un segundo evento de recombinación entre secuencias repetidas directas que da como resultado la integración estable del gen ppO en el genoma del plasto y la escisión completa de aadA con la secuencia de la cadena principal del vector. En el presente ejemplo se muestra solamente uno de dos posibles eventos de intrarecombinación. La continuación de la selección con butafenacil permite la selección homoplásmica para genomas de plastos que contienen el gen ppO.

Figura 5: Ejemplos de análisis por hibridación Southern para identificar transformantes de plastos homoplásmicos. A) Polimorfismos de longitud de BamHI esperados entre el locus de transformación de tipo salvaje, los plastos PPO transformados y la integración completa del vector después de un evento de recombinación por entrecruzamiento simple entre las secuencias flanqueantes de rps12 (1) o las secuencias flanqueantes de trnV-rrn16 (2). B indica la posición de los sitios de restricción con BamHI. B) Panel superior; hibridación Southern de DNA total de tipo salvaje digerido con BamHI (pista wt) y 10 transformantes (pistas marcadas 1 a 10) e hibridado con una sonda específica

5 para el locus de inserción. La secuencia de los plastos de tipo salvaje se observa en 3,2 kb, las líneas homoplásmicas transformadas con PPO (pistas 1-3, 5-7 y 10) se secuencian en 5,0 kb. La línea heteroplásmica (pistas 4 y 9) contiene a la vez el inserto PPO y secuencias de tipo salvaje. Panel inferior; hibridación Southern de DNA total de tipo salvaje digerido con SpeI (pista wt) y 10 transformantes (pistas marcadas 1 a 10) e hibridadas con la sonda específica del gen aadA. El gen aadA (0,9 kb) se observa únicamente en las líneas heteroplásmicas (pistas 4 y 9).

10 Figura 6: Ilustra un esquema para integración del transgén PPO en el genoma de los plastos. Después de selección inicial con espectinomicina, los marcadores seleccionables integran el genoma del plasto por tres posibles eventos de entrecruzamiento doble que ocurren entre el vector de transformación de los plastos y el locus del plasto direccionado. Creación de una población mixta de genomas transformados de plastos que tienen uno o ambos marcadores seleccionables. Subsiguientemente, la selección con butafenacil permite la selección homoplásmica para

15 genomas de plastos que contienen gen el PPO y escisión completa de aadA del gen esencial.

Figura 7: Mapa del vector de transformación de plastos pEB10. Las secuencias de direccionamiento a los plastos plDNA 16rDNA y rps12/7 se representan por líneas sombreadas. Los componentes del gen quimérico ppo de A. thaliana son las secuencias semejantes al promotor del bacteriófago X2 de Staphylococcus aureus fusionadas a la 20 5'UTR del gen 10 del bacteriófago kvp1 (PX2k10), el gen ppo de A. thaliana (Atppo) y la 3'UTR del plasto rps16 de

N. tabacum (3' rps16). Los componentes del gen quimérico aadA y el promotor del plasto clpP de N. tabacum (PclpP), la secuencia codificante aadA (aadA) y la 3'UTR rps16 de los plastos de N. tabacum (3' rps16). El vector del gen de resistencia a ampicilina (amp) se indica por flechas. Se han marcado los sitios de restricción para PstI, NdeI, EcoRI, EcoRV, BamHI y ScaI.

Descripción del Listado de Secuencias

SEQ ID NO: 1 Vector de transformación de plastos pEBPPOt (Ejemplo 1 VII). SEQ ID NO: 2 Vector de transformación de plastos pEB8 (= pEB8a) (Ejemplo 2). SEQ ID NO: 3 Vector de transformación de plasto pNY2c (Ejemplo 4 II). SEQ ID NO: 4 Secuencia de DNA del promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA de plastos de maíz fusio

nado al sitio de fijación de ribosoma (RBS) del plasto rbcL de N. tabacum. SEQ ID NO: 5 Cebador superior para amplificación del promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA del DNA

de plastos de maíz, comprendiendo el cebador un sitio de restricción EcoRI (Ejemplo 1 I). SEQ ID NO: 6 Cebador inferior que comprende un sitio de restricción BspHI (Ejemplo 1 I). SEQ ID NO: 7 Cebador superior para amplificación del gen ppo de A. thaliana (Ejemplo 1 II). SEQ ID NO: 8 Cebador inferior para amplificación del gen ppo de A. thaliana, comprendiendo el cebador

un sitio de restricción SpeI (Ejemplo 1 II). SEQ ID NO: 9 Cebador de la cadena superior para amplificación del promotor del gen psbA de N. tabacum, comprendiendo el cebador un sitio de restricción EcoRI (Ejemplo 1 III). SEQ ID NO: 10 Cebador de la cadena inferior para amplificación del promotor del gen psbA de N. tabacum, comprendiendo el cebador un sitio de restricción NcoI (Ejemplo 1 III). SEQ ID NO: 11 Cebador superior para amplificación del promotor del gen clpP de A. thaliana, comprendiendo el cebador un sitio de restricción EcoRI (Ejemplo 1 V). SEQ ID NO: 12 Cebador inferior para amplificación del promotor del gen clpP de A. thaliana, comprendiendo el cebador un sitio de restricción BspHI (Ejemplo 1 V).

SEQ ID NO: 13 Cebador superior para amplificación de un nuevo locus diana de DNA de plastos, comprendiendo el cebador un sitio de restricción XhoI (Ejemplo 4 I). SEQ ID NO: 14 Cebador inferior para amplificación de un nuevo locus diana de DNA de plastos, com

prendiendo el cebador un sitio de restricción XbaI (Ejemplo 4 I). SEQ ID NO: 15 Promotor del bacteriófago X2 de Staphylococcus aureus SEQ ID NO: 16 5'UTR del gen 10 del bacteriófago kvp1 de Kluyvera SEQ ID NO: 17 3'UTR del gen 9 del bacteriófago T3 SEQ ID NO: 18 Secuencia de nucleótidos de la secuencia semejante al promotor quimérico del bacterió

fago X2 de Staphylococcus fusionada a la 5'UTR del gen 10 del bacteriófago kvp1. SEQ ID NO: 19 Secuencia de nucleótidos del vector de transformación de plastos pEB10 SEQ ID NO: 20 Cebador de la cadena superior para amplificar el promotor 16S NEP-PEP de maíz (sitio

EcoRI). SEQ ID NO: 21 Cebador de la cadena inferior para amplificar el promotor 16S NEP-PEP de maíz (sitio XbaI). SEQ ID NO: 22 Cebador de la cadena superior para amplificar la 5'UTR del gen del bacteriófago T3 (RTK36). SEQ ID NO: 23 Cebador de la cadena inferior para amplificar la 5'UTR del gen del bacteriófago T3 (RTK39). SEQ ID NO: 24 Cebador de la cadena superior para amplificar 16S NEP-PEP de maíz (sitio SmaI) (RTK38). SEQ ID NO: 25 Cebador de la cadena inferior para amplificar 16S NEP-PEP de maíz (sitio BspHI)

(RTK37). SEQ ID NO: 26 Cadena superior del fragmento EcoRI-XbaI de la secuencia semejante al promotor del bacteriófago X2. SEQ ID NO: 27 Cadena inferior del fragmento EcoRI-XbaI de la secuencia semejante al promotor del

bacteriófago X2. SEQ ID NO: 28 Cebador de la cadena superior para la 5'UTR del gen 10 de kpv1 SEQ ID NO: 29 Cebador de la cadena inferior para la 5'UTR del gen 10 de kpv1

Definiciones

Para claridad, ciertos términos utilizados en la memoria descriptiva se definen y presentan como sigue:

"Asociado con/enlazado operativamente" se refieren a dos secuencias de ácido nucleico que están relacionadas física o funcionalmente. Por ejemplo, se dice que una secuencia de DNA promotora o reguladora está "asociada con" una secuencia de DNA que codifica un RNA o una proteína sin las dos secuencias están enlazadas operativamente, o situadas de tal manera que la secuencia de DNA reguladora afectará al nivel de expresión de la secuencia

10 de DNA codificante o estructural.

Un "constructo quimérico" o "gen quimérico" es una secuencia de ácido nucleico recombinante en la cual una secuencia de ácido nucleico promotora o reguladora está enlazada operativamente a, o asociada con, una secuencia de ácido nucleico que codifica un mRNA o que se expresa como una proteína, de tal modo que la secuencia regula

15 dora de ácido nucleico es capaz de regular la transcripción o expresión de la secuencia de ácido nucleico asociada. La secuencia de ácido nucleico reguladora del constructo quimérico no está enlazada normalmente de modo operativo a la secuencia de ácido nucleico asociada como se encuentra en la naturaleza.

Una "secuencia codificante" es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en RNA tal como mRNA, rRNA,

20 tRNA, snRNA, RNA sentido o RNA antisentido. Preferiblemente, el RNA se traduce luego en un organismo para producir una proteína.

"Casete de expresión", como se utiliza en esta memoria, significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia particular de nucleótidos en una célula hospedadora o compartimiento de una célula 25 hospedadora apropiado(a), que comprende un promotor enlazado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés que está enlazada operativamente a señales de terminación. La misma comprende también típicamente secuencias requeridas para traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos. La región codificante codifica usualmente una proteína de interés, pero puede codificar también un RNA funcional de interés, por ejemplo RNA antisentido o un RNA no traducido, en la dirección sentido o antisentido. La casete de expresión que comprende la 30 secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérica, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. La casete de expresión puede ser también una que existe naturalmente pero se ha obtenido en forma recombinante útil para expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, la casete de expresión es heteróloga con respecto al hospedador, es decir, la secuencia de DNA particular de la casete de expresión no existe naturalmente en la célula hospedadora y tiene que haber sido introducida en la

35 célula hospedadora o un ancestro de la célula hospedadora por un evento de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en la casete de expresión puede hallarse bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción únicamente cuando la célula hospedadora se expone a un cierto estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor puede ser también específico para un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular.

40 Con respecto a la transformación de plastos, la casete de expresión está diseñada de tal manera que el promotor, el terminador y otras secuencias reguladoras son funcionales en los plastos. El término "gen" se utiliza en sentido amplio para hacer referencia a cualquier segmento de DNA asociado con una función biológica. Así, los genes incluyen secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes incluyen tam

45 bién segmentos de DNA no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes pueden obtenerse de una diversidad de fuentes, que incluyen clonación a partir de una fuente de interés o síntesis a partir de información de secuencia conocida o predicha, y pueden incluir secuencias diseñadas que tienen parámetros deseados.

50 Los términos "heterólogo" y "exógeno" cuando se utilizan en esta memoria para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico (v.g., una secuencia de DNA) o un gen, se refieren a una secuencia que se origina a partir de una fuente extraña a la célula hospedadora particular o, si proceden de la misma fuente, está modificada con respecto a su forma original. Así, un gen heterólogo en una célula hospedadora incluye un gen que es endógeno para la célula hospedadora particular, pero que se ha modificado, por ejemplo, por el uso de desordenamiento del DNA. Los

55 términos incluyen también copias múltiples no existentes naturalmente de una secuencia de DNA existente naturalmente. Así, los términos se refieren a un segmento de DNA que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero que se encuentra en una posición en el ácido nucleico de la célula hospedadora en la cual no se encuentra ordinariamente el elemento. Los segmentos exógenos de DNA se expresan para producir polipéptidos exógenos. Una secuencia de ácido nucleico (v.g., DNA) "homóloga" es una secuencia de ácido nucleico (v.g. DNA) asociada

60 naturalmente con una célula hospedadora en la cual se introduce la misma.

"Homoplásmico" se refiere a plastos, células de plantas y plantas que comprenden un solo tipo, uniforme, de copias del plastoma, es decir se refiere a plastos que no comprenden copias de plastomas diferentes o a células de plantas

o plantas que no comprenden poblaciones de plastos mixtas. En el contexto de la presente invención, una molécula de DNA o enzima "aislada" es una molécula de DNA o enzima que, por acción humana, existe aparte de su ambiente natural y por consiguiente no es un producto de la naturaleza. Una molécula de DNA o enzima aislada puede existir en forma purificada o puede existir en un ambiente no natural tal como, por ejemplo, en una célula hospedadora transgénica.

"Enlazado con" se refiere a una primera secuencia de ácido nucleico que está enlazada con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias están dispuestas de tal modo que la primera secuencia de ácido nucleico afecta a la función de la segunda secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente, las dos secuencias forman parte de una sola molécula contigua de ácido nucleico y más preferiblemente son adyacentes. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica una proteína si el promotor regula o media la transcripción de la secuencia codificante en una célula. El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma mono- o bi-catenaria. A no ser que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de ligación similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos existentes naturalmente. A no ser que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular abarca también implícitamente variantes de la misma modificadas de manera conservadora (v.g. sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias así como la secuencia indicada explícitamente. De manera específica, las sustituciones de codones degenerados pueden realizarse por generación de secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más (o todos) los codones seleccionados está sustituida con residuos de base mixta y/o residuos desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Los términos "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" pueden utilizarse intercambiablemente con gen, cDNA, y mRNA codificado por un gen.

"ORF" significa marco de lectura abierto.

"Compuesto letal para los plastos" se refiere a cualquier compuesto que afecta a la viabilidad de un plasto de célula vegetal de tipo salvaje. Los compuestos que afectan a la viabilidad de un plasto de célula vegetal de tipo salvaje incluyen, pero sin carácter limitante, compuestos que degradan rápidamente las membranas de los plastos, inhiben los caminos metabólicos de los plastos (tales como la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, la fotosíntesis, la biosíntesis de clorofila, la asimilación de amonio, etc.), compuestos tóxicos, proteasas, nucleasas, compuestos que alteran el pH de la célula, etc. Preferiblemente, el compuesto letal para los plastos degrada las membranas interna y externa de un plasto de célula vegetal de tipo salvaje. Ejemplos de tales compuestos incluyen cualquier herbicida, que incluye pero sin carácter limitante, glifosato, butafenacil, fosfoinotricina, norfluorazona, atrizina, glufosinato, bromoxinil, y acifluorfeno.

Un experto en la técnica reconocerá que la capacidad de los compuestos letales para los plastos de afectar a la viabilidad de los plastos depende de la concentración del compuesto en el medio, la duración de exposición, y el tipo y/o fuente del tejido vegetal.

"Compuesto no letal para los plastos" se refiere a compuestos que afectan al metabolismo del plasto de la célula vegetal y por consiguiente ralentizan o inhiben el crecimiento del plasto o de la célula como un todo, pero no afectan a la viabilidad del plasto o de la célula vegetal durante la fase inicial.

"Transformación de plastos" se refiere a la transformación genética de una célula vegetal o planta en la cual se suministran secuencias de DNA extraño a los plastos y se integran en el genoma del plasto (plastoma).

Dos ácidos nucleicos están "recombinados" cuando las secuencias de cada uno de los dos ácidos nucleicos se combinan en un ácido nucleico de la progenie. Dos secuencias están "recombinadas directamente" cuando ambos ácidos nucleicos son sustratos para recombinación. Dos secuencias están "recombinadas indirectamente" cuando las secuencias se recombinan utilizando un intermediario tal como un oligonucleótido cruzado. Para recombinación indirecta, no más de una de las secuencias es un sustrato real para la recombinación, y en algunos casos, ninguna de las secuencias es un sustrato para la recombinación.

"Elementos reguladores" se refieren a secuencias implicadas en el control de la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor enlazado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y las señales de terminación. Los mismos abarcan también típicamente secuencias requeridas para traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos.

"Transformación" es un proceso para introducir DNA heterólogo en una célula de planta, tejido de planta, o planta. Debe entenderse que las células de planta, tejido de planta, o plantas transformadas abarcan no sólo el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica del mismo.

"Transformado", "transgénico", y "recombinante" hacen referencia a un organismo hospedador tal como una bacteria

o una planta en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico heteróloga. La molécula de ácido nucleico puede estar integrada de manera estable en el genoma del hospedador, o la molécula de ácido nucleico puede estar presente también como una molécula extracromosómica. Una molécula extracromosómica de este tipo puede ser auto-replicante. Se entenderá que las células, tejidos o plantas transformados(as) abarcan no sólo el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica del mismo. Un hospedador "no transformado", "no transgénico" o "no recombinante" hace referencia a un organismo de tipo salvaje, v.g., una bacteria o una planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga.

"Transplastómico" se refiere a plastos, células de plantas y plantas que comprenden plastomas transformados.

Descripción Detallada de la Invención

Transformación de plastos con integración estable de un marcador letal seleccionable e integración transitoria de un marcador seleccionable no letal

La presente invención proporciona métodos para producir plantas transgénicas que tienen genomas de plastos recombinantes sin la integración estable de un marcador de resistencia a los antibióticos.

Un aspecto de la presente invención proporciona vectores de transformación de plastos útiles para obtener plastos transformados. Los vectores comprenden una secuencia de ácido nucleico marcadora seleccionable quimérica letal que codifica una proteína que proporciona tolerancia a un compuesto letal para la célula y una secuencia de ácido nucleico marcadora seleccionable quimérica no letal que codifica una proteína que proporciona resistencia a un compuesto selectivo no letal para el plasto. En un vector de acuerdo con la invención, la secuencia de ácido nucleico marcadora letal seleccionable está flanqueada por secuencias de direccionamiento del plasto, mientras que la secuencia de ácido nucleico marcadora seleccionable no letal está localizada en la cadena principal del vector fuera de las secuencias de direccionamiento del plasto.

La secuencia de ácido nucleico marcadora seleccionable quimérica letal comprende una secuencia promotora funcional en el plasto, una región reguladora 5' no traducida (5'UTR), una secuencia de DNA que codifica una proteína que confiere tolerancia al compuesto letal para la célula y una región 3' no traducida (3'UTR).

La secuencia de ácido nucleico marcadora seleccionable quimérica no letal comprende una secuencia promotora funcional en el plasto, una 5'UTR reguladora, una secuencia de DNA que codifica un marcador seleccionable no letal que codifica una proteína que confiere resistencia a un compuesto no letal para los plastos, y una 3'UTR.

Otro aspecto de la presente invención proporciona vectores de transformación de plastos útiles para obtener plastos transformados e integrar secuencias de DNA en el genoma del plasto. Tales secuencias de DNA pueden ser, por ejemplo, genes, secuencias o moléculas de ácido nucleico quiméricas, o casetes de expresión para la expresión de un producto génico o productos génicos en los plastos transformados. Estos vectores de transformación de plastos contienen además de las características descritas previamente al menos una secuencia de DNA de este tipo que está enlazada a la secuencia de ácido nucleico marcadora seleccionable quimérica letal en las secuencias de direccionamiento de los plastos. Una secuencia de DNA expresable comprende típicamente una secuencia promotora funcional en el plasto, una 5'UTR reguladora, al menos un segmento de DNA que codifica un producto génico de interés y una 3'UTR. Alternativamente, la secuencia de DNA que codifica uno o varios productos génicos y el marcador seleccionable quimérico letal puede ser expresada por un promotor simple en un gen policistrónico semejante a un operón.

Numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica se utilizan en la producción de los constructos y vectores de la presente invención tales como, pero sin carácter limitante, ligación, digestión con enzimas de restricción, reacción en cadena de polimerasa (PCR), mutagénesis in vitro, adiciones de enlazadores y adaptadores, etc, y se describen por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989). Por tanto, pueden realizarse transiciones, transversiones, inserciones, y deleciones de nucleótidos en moléculas de ácido nucleico que se emplean en las regiones reguladoras, las secuencias de ácido nucleico de interés para expresión en los plastos.

La presente invención proporciona también métodos para transformación de plastos que utilizan un protocolo de selección de dos pasos con compuestos no letales para los plastos y compuestos letales para la célula. Los transformantes iniciales de los plastos se seleccionan en un medio que contiene un compuesto no letal para los plastos. La selección se facilita por la expresión de un gen marcador seleccionable no letal integrado transitoriamente en el genoma del plasto. Una vez que se ha acumulado un número suficiente de plastos transformados por célula, el medio del compuesto no letal se reemplaza por un medio que contiene un compuesto letal para la célula que selecciona los genomas de los plastos que expresan la proteína que confiere tolerancia a este compuesto.

Alternativamente, se seleccionan transformantes iniciales en un medio que contiene a la vez un compuesto no letal para los plastos y un compuesto letal para la célula. Una vez que se ha acumulado un número suficiente de plastos transformados por célula, se continúa la selección en un medio que contiene únicamente el compuesto letal para la célula.

En una realización preferida de la invención, el compuesto no letal para los plastos es un antibiótico y el marcador no letal es un gen de resistencia a antibióticos.

En otra realización preferida, el compuesto letal para la célula es un herbicida, preferentemente un herbicida del grupo de los inhibidores de PPO.

Transformación de plastos con integración estable de ppo e integración transitoria de aadA

En una realización preferida de la presente invención, el gen marcador letal seleccionable es una protoporfirinógenooxidasa (ppo) que confiere tolerancia al compuesto letal para la célula butafenacil, y el gen marcador seleccionable no letal es aminoglicosido-adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia al compuesto no letal para los plastos espectinomicina.

La presente invención proporciona un método para producir una planta transgénica que posee genomas de plastos recombinantes sin integración estable de un marcador seleccionable de antibióticos tal como aadA. Los transformantes iniciales de los plastos se seleccionan en medio que contiene espectinomicina basado en la expresión del gen aadA que está integrado transitoriamente en el genoma del plasto. Una vez que se ha acumulado un número suficiente de plastos transformados por célula, se confiere a la célula tolerancia a butafenacil por la expresión del gen ppo que está integrado de manera estable en el plastoma. La eliminación del gen resistente al antibiótico y la segregación y selección de transformantes homoplásmicos se realiza por cambio de selección con espectinomicina a butafenacil.

Es útil también un método para integrar establemente un transgén o transgenes de interés en el genoma de los plastos por direccionamiento del mismo a una región no esencial del genoma del plasto en donde el marcador seleccionable está insertado de manera inestable en el genoma del plasto por direccionamiento del mismo al genoma del plasto de tal manera que altera un gen esencial del plasto. Este método está basado en el hecho de que la interrupción direccionada de genes esenciales de los plastos es inestable debido a que los genes interrumpidos revierten a su conformación de tipo salvaje cuando se elimina la presión selectiva. Los genomas de los plastos poseen varios genes (tales como ycf1, ycf2 y clpP) que son esenciales para la supervivencia de la célula. Los intentos previos para desactivar tales genes por interrupción direccionada con genes marcadores seleccionables (Shikanai et al., Plant Cell Physiol. 42:264-73, 2001; Drescher et al., Plant J. 22:97-104, 2000; Boudreau et al., Mol. Gen. Genet. 253:649-53, 1997; Huang et al., Mol. Gen. Genet. 244:151-9, 1994) pudieron producir únicamente poblaciones heteroplásmicas de plastos que comprendían a la vez los genes interrumpidos y los de tipo salvaje. La inserción del marcador seleccionable en estos genes es inestable y la eliminación de la presión selectiva da como resultado la pérdida del marcador selectivo y la reversión a poblaciones de plastos homoplásmicas que tienen únicamente copias de tipo salvaje del gen esencial (Drescher et al., Plant J. 22: 97-104, 2000; Fischer et al., Mol. Gen. Genet. 251: 373-80, 1996).

Se describen también vectores de transformación de plastos útiles para la obtención de plastos transformados. El vector de transformación de plastos comprende un segmento de DNA homólogo a un locus del plasto que contiene al menos una parte de una secuencia del gen esencial del plasto y una secuencia adyacente no esencial del plasto, tal como una región intergénica. Los vectores comprenden un gen marcador seleccionable quimérico no letal, que codifica una proteína que proporciona resistencia a un compuesto no letal para los plastos, en donde el gen marcador seleccionable no letal está insertado en la secuencia del gen esencial del plasto. El vector comprende adicionalmente un gen marcador quimérico letal seleccionable, que codifica una proteína que proporciona tolerancia a un compuesto letal para la célula, en donde el gen marcador letal seleccionable está insertado en la secuencia del plasto no esencial de la secuencia. El gen marcador quimérico letal seleccionable comprende una secuencia promotora funcional en el plasto, una 5'UTR reguladora, una secuencia de DNA que codifica una proteína que confiere tolerancia a un compuesto letal para la célula, y una 3'UTR del plasto.

El gen marcador seleccionable quimérico no letal comprende una secuencia promotora funcional en el plasto, una 5'UTR reguladora, una secuencia de DNA que codifica una proteína que confiere resistencia a un compuesto no letal para los plastos, y una 3'UTR. Ambas casetes marcadoras seleccionables letal y no letal están flanqueadas por una secuencia de DNA del plasto para inserción direccionada en el genoma del plasto por recombinación homóloga. La secuencia del DNA del plasto que enlaza los genes a insertar tiene que ser de longitud suficiente para permitir la recombinación de ambos genes enlazados y no enlazados con el genoma del plasto. Preferentemente, tales secuencias de DNA enlazadoras del plasto tienen una longitud de al menos 200 pb.

Otro aspecto de la presente invención proporciona vectores de transformación de plastos útiles para la obtención de plastos transformados y para la expresión de uno o más productos génicos en los plastos transformados. Los vectores de transformación de plastos comprenden además de los segmentos previamente descritos de direccionamiento de los plastos con genes marcadores seleccionables, al menos una secuencia de DNA expresable que está enlazada al gen marcador seleccionable quimérico letal en la secuencia no esencial. La secuencia de DNA expresable comprende una secuencia promotora funcional en el plasto, una 5'UTR reguladora, un segmento de DNA que codifica un producto génico y una 3'UTR plastídica.

Alternativamente, la secuencia de DNA que codifica uno o varios productos génicos y el marcador seleccionable quimérico letal se expresan a partir de un promotor simple en un gen policistrónico semejante a un operón.

La presente invención proporciona también métodos para transformación de plastos que utilizan un protocolo de selección en dos pasos con compuestos no letales para el plasto y letales para la célula. Los transformantes cebadores de los plastos se seleccionan en un medio que contiene un compuesto no letal para los plastos. La selección se facilita por la expresión de un gen marcador seleccionable no letal integrado en el gen esencial del plasto direccionado. Una vez que se ha acumulado un número suficiente de plastos transformados por célula, se reemplaza el medio del compuesto no letal por un medio que contiene un compuesto letal para la célula que selecciona los genomas del plasto que expresan la proteína que confiere tolerancia a este compuesto. Después de varias tandas de subcultivo del tejido en medios selectivos letales, los genomas de los plastos se vuelven homoplásmicos para el gen marcador letal seleccionable o el marcador letal seleccionable con una o más secuencias de DNA expresables, y de tipo salvaje para el gen esencial direccionado.

Alternativamente, se seleccionan transformantes iniciales en un medio que contiene a la vez un compuesto no letal para los plastos y un compuesto letal para la célula. Una vez que se ha acumulado un número suficiente de plastos transformados por célula, se continúa la selección en un medio que contiene únicamente un compuesto letal para la célula.

Transformación de plastos con integración estable de ppo e integración inestable de aadA

En una realización preferida de la presente invención, el gen marcador letal seleccionable es protoporfirinogenooxidasa (ppo) que confiere tolerancia al compuesto letal para la célula butafenacil, y el gen marcador seleccionable no letal es aminoglicosido-adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia al compuesto no letal para el plasto espectinomicina.

Se describe también un método para producir una planta transgénica que tiene genomas de plasto recombinantes sin integración estable de un marcador antibiótico seleccionable tal como aadA. Se seleccionan transformantes iniciales de plastos en medio que contiene espectinomicina basado en la expresión del gen aadA que está integrado de manera inestable en el genoma del plasto, interrumpiendo un gen esencial del plasto. Una vez que se ha acumulado un número suficiente de plastos transformados por célula, se confiere a la célula tolerancia a butafenacil por la expresión del gen ppo que está integrado de manera estable en el plastoma. La reversión del gen esencial del plasto interrumpido al gen de tipo salvaje y la segregación y selección de transformantes homoplásmicos se realizan por cambio de selección con espectinomicina a butafenacil.

Sección II: Métodos para selección de plantas homoplásmicas transplastómicas que expresan el gen ppo en sus plastos

La invención se refiere a métodos para selección de células de plantas homoplásmicas o plantas que comprenden plastos transplastómicos que tienen el gen ppo integrado en su plastoma con la exclusión de cualquier gen de resistencia a antibióticos.

Estos métodos emplean una casete de expresión de plastos ppo, que está flanqueada por una secuencia homóloga al DNA de plastos, una casete de expresión de plastos aadA, que está separada de la secuencia flanqueante de la casete ppo, y una cualquiera de las dos estrategias de selección de fase proporcionadas por la invención, que comprenden utilizar el gen ppo como gen marcador seleccionable durante la fase de segregación de poblaciones de plastos heteroplásmicas y la selección de células vegetales homoplásmicas para obtener plantas transplastómicas que tienen el gen ppo integrado en su plastoma con la exclusión del gen de resistencia a los antibióticos aadA.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a la extensión de métodos de transformación de plastos a material vegetal no pigmentado. La invención proporciona estrategias de selección que comprenden utilizar un gen marcador letal seleccionable para transformación de plastos y un compuesto letal para la célula tal como Fórmula XVII como agente selectivo, en donde la pigmentación verde no es esencial para el fenotipo transplastómico seleccionado. Estas estrategias de selección tienen por consiguiente el potencial de ser aplicadas tanto a tejido verde como a tejido no verde para transformación de plastos.

El gen marcador letal seleccionable ppo y el gen de resistencia a los antibióticos aadA se suministran conjuntamente a las dianas de transformación en los mismos constructos, en donde la casete ppo comprende su propia secuencia flanqueante que es homóloga a un fragmento de DNA plastídico, mientras que la casete aadA está separada de la secuencia flanqueante de la casete ppo. La casete ppo comprende un promotor 5', el gen ppo, y una 3'UTR, diseñada para expresión en el plasto, mientras que la casete aadA comprende un promotor 5', el gen aadA y una 3'UTR, diseñada para expresión en el plasto.

El procedimiento de selección se compone de dos fases. Durante la primera fase de la selección, se seleccionan células que contienen plastos transplastómicos en un medio que comprende el compuesto selectivo no letal espectinomicina o estreptomicina. Alternativamente, el medio de selección utilizado durante la primera fase de selección comprende espectinomicina o estreptomicina en combinación con el herbicida Fórmula XVII como un agente selectivo letal para la célula.

La selección de la primera fase en un medio que contiene el compuesto no letal se lleva a cabo durante un periodo de tiempo en el cual los eventos resistentes no son visualmente detectables todavía. Una persona experta en la técnica conocerá el modo de determinar este periodo de tiempo, basándose v.g., en parámetros de cultivo de tejidos que son específicos para la especie de planta a transformar. La primera fase de selección dura desde aproximadamente 5 días a aproximadamente 8 semanas, de modo más específico durante aproximadamente una semana a aproximadamente 6 semanas. Preferentemente, la primera fase de selección tiene una duración aproximada 2 a 4 semanas.

Alternativamente, la primera fase de selección puede extenderse hasta que los eventos resistentes se hacen visualmente detectables. Dependiendo de la especie de planta a trasformar y del tipo de explante utilizado, los eventos resistentes llegan a hacerse visibles al cabo de aproximadamente una semana hasta aproximadamente 15 semanas, de modo más específico después de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 semanas. Cuando la primera fase de selección se extiende hasta que los eventos resistentes son visualmente detectables, la primera fase de selección tiene como valor típico una duración de aproximadamente 5 semanas.

La segunda fase de selección que sigue a la selección inicial sobre espectinomicina se lleva a cabo en un medio que contiene el agente letal para la célula Fórmula XVII como agente selectivo. El proceso de segregación y selección durante esta fase da como resultado la pérdida rápida del gen de resistencia a antibióticos aadA y el establecimiento de una población homoplásmica de plastos que tiene el gen ppo integrado de manera estable en el plastoma. Las células transplastómicas así obtenidas se regeneran luego en plantas homoplásmicas que expresan gen ppo en sus plastos y que transmiten los plastos transplastómicos a su progenie. Las plantas homoplásmicas que contienen el transplastoma PPO dan como resultado una tolerancia a los herbicidas mucho mayor que las plantas nucleares transformadas con el mismo gen. Adicionalmente, se obtiene una resistencia a los herbicidas mucho mayor con las plantas transplastómicas homoplásmicas que expresan en el ppo en sus plastos que con los transformantes nucleares que expresan ppo en el núcleo.

En la presente invención puede emplearse cualquier método conocido para transformación de plastos en células vegetales disponible que dé como resultado células de plantas que contengan una población de plastos en los cuales se ha introducido un constructo de ácido nucleico recombinante que tiene una secuencia de DNA que codifica una proteína que proporciona tolerancia a un compuesto letal para los plastos o un compuesto no letal para los plastos según los casos. Métodos de transformación de plastos incluyen, pero sin carácter limitante, bombardeo con partículas, y transformación mediada por PEG.

La transformación estable de genomas de plastos de tabaco por bombardeo con partículas ha sido publicada (Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917) y la transformación de plastos mediada por PEG ha sido descrita por Koffer et al. (1998) in Vitro Cell. Biol. Plant, 34: 303-309. Otros métodos para introducir constructos recombinantes en plastos de células vegetales se conocen en la técnica, y se describen por ejemplo en Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530, Sikdar et al. (1998) Plant Cell Reports 18: 20-24, publicación PCT WO 97/2977, y Sidorov et al. (1999) Plant J. 19(2): 209-216. Métodos adicionales para introducir dos constructos en un plasto de célula vegetal se describen por ejemplo en Carrer et al. Biotechnology 13: 791-794 (1995). Los métodos descritos en las referencias anteriores pueden emplearse para obtener células de plantas transformadas con los constructos de transformación de plastos descritos en esta memoria.

La regeneración de plantas enteras a partir de una célula transformada contenida en el tejido utilizado en la transformación implica varias etapas de crecimiento. Típicamente, un tejido, que ha sido escindido de una planta adulta o planta joven germinada, se pone en un medio químicamente definido en condiciones estériles. Por cultivo del explante en tales condiciones controladas durante cierto periodo de tiempo, puede formarse una masa indiferenciada de células, a la que se hace referencia como un callo. Por cultivo de este callo en la serie de condiciones apropiada,

v.g. nutrientes, luz, temperatura, humedad, y proporcionando la combinación y concentración apropiada de reguladores del crecimiento de las plantas, los callos pueden ser inducidos a formar células diferenciadas y regenerar brotes de plantas. Los brotes de plantas, a los que se hace referencia a veces como plántulas, que contienen tejido de meristemo, se transfieren luego a un medio para la inducción de la producción de raíces.

Los medios selectivos utilizados y descritos en esta memoria pueden ser líquidos o sólidos, tales como la adición de un agente solidificante, tal como agar. Un medio selectivo líquido permite una mayor área superficial de contacto del tejido de la planta con el medio selectivo que contiene hormonas particulares, agentes selectivos particulares y otras sustancias necesarias para obtener la regeneración.

Las realizaciones arriba descritas son ilustrativas. Esta descripción de la invención colocará a un experto en la técnica en posesión de muchas variaciones de la invención. La totalidad de dichas variaciones obvias y previsibles deben considerarse abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.

5 EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación del vector de transformación de plastos para integración transitoria de aadA.

I. Amplificación del promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA de plastos de maíz fusionado al sitio de fijación de ribosoma (RBS) de plastos rbcL de N. tabacum

El promotor del gen 16S PRP-NEP rRNA del maíz (genoma de cloroplastos completo de Zea mays, número de acceso X86563, posición 94966 a 95115) se aisló por amplificación PCR a partir de DNA 6N615 de maíz utilizando un cebador de la cadena superior que comprendía un sitio de restricción EcoRI introducido en el extremo 5' de la región

15 promotora del gen 16S rRNA (SEQ ID NO: 5; 5'-GCCAGAATTCACCACGATCGAACGGGAATGGATA-3', el sitio EcoRI está subrayado) y un cebador de la cadena inferior que se extiende hasta el promotor del gen rRNA 16S, muta un ATG aguas abajo del sitio de comienzo de la transcripción por cambio de posición (T a G), fusiona el RBS rbcL del tabaco (genoma de cloroplastos completo de N. tabacum, número de acceso NC_001879, posición 577569 a 57585) como una extensión 5' hasta el extremo 3' de la 5'UTR del gen rRNA 16S e introduce un sitio BspHI en el extremo 5' del RBS (SEQ ID NO: 6; 5'-GCCGTCATGAATCCCTCCCTACAACTGATTCGGAATTGTCTTTCCTTCCAAGGATAACTTGTATCCAG GCGCTTCAG-3', el sitio de restricción BspHI está subrayado). La amplificación PCR se llevó a cabo con el kit de DNA-polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, LaJolla, CA) en un Termociclador Perkin Elmer 480 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 5 min 95ºC, seguido por 5 ciclos

25 de 1 min 95ºC/2 min 49ºC/1 min 72ºC, y después 25 ciclos de 1 min 95ºC, 2 min 55ºC/1 min 72ºC.

La secuencia de DNA del promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA de plastos del maíz fusionada al sitio de fijación de ribosoma (RBS) del plasto rbcL de N. tabacum se proporciona en SEQ ID NO: 4. En la representación de SEQ ID NO: 4 siguiente la secuencia promotora del gen rRNA 16S está subrayada; el nucleótido mutado se indica en negri

II.

Construcción de un promotor rRNA 16S de maíz fusionado al sitio de fijación de ribosoma (RBS) del gen rbcL de

N.

tabacum, el gen ppo de Arabidopsis thaliana y la casete 3'UTR rps16 de plastos de N. tabacum para selección de plastos.

35 Se creó el gen quimérico ppo de A. thaliana por los pasos de clonación siguientes. El plásmido pAT259 que contenía la secuencia codificante ppo de Arabidopsis se creó por ligación de una parte de 450 pb que comprendía EcoRI-SfuI del gen ppo de Arabidopsis que contiene las mutaciones puntuales pAraC-2Met y pAra305 Leu (descrita en US 6.084.155) a un fragmento de 4,1 kb EcoRI-SfuI de pPH141 (descrito también en US 6.084.155). Se añadió un sitio de restricción SpeI en el extremo 3' del gen ppo por amplificación PCR utilizando pAT259 como molde de DNA y el cebador siguiente de la cadena superior (SEQ ID NO: 7; 5'-CCACGCACGCAAGGAGTTGA-3') y el cebador de la cadena inferior (SEQ ID NO: 8; 5'-CGGTACTAGTCTGGGAGATTTAATGTT-3', el sitio de restricción SpeI está subrayado). Se formó el plásmido pAT260 por ligación del vector pLITMUS28 de 2,8 pb digerido con NcoI-SpeI con un fragmento

45 de 1,1 kb NcoI-EcoRI de pAT259 que contenía el extremo 5' de la secuencia codificante de ppo y un fragmento amplificado por PCR de 337 pb EcoRI-SpeI que contenía el extremo 3' del gen ppo.

Se obtuvo el plásmido pAT263 por ligación de un fragmento de 1,5 kb NcoI-SpeI de pAT260 que comprendía la secuencia codificante ppo de Arabidopsis con un fragmento de 2,8 kb EcoRI-SpeI de pAT229 (descrito en WO 00/20612) que comprendía la 3'UTR de plastos de tabaco rps16 integrada en el vector pUC19 (New England Biolabs) y la secuencia promotora de 145 pb EcoRI-NcoI del maíz rRNA 16S PEP-NEP-rbcL (RBS) amplificada por PCR.

III. Amplificación y clonación del promotor psbA de plastos de N. tabacum

55 El promotor del gen psbA del tabaco (genoma de cloroplastos completo de N. tabacum, número de acceso NC_001879, posición 1596 a 1745) se aisló por amplificación PCR de DNA aislado de la variedad cultivada de N. tabacum 'Xanthi' utilizando un cebador de la cadena superior que comprendía un sitio de restricción EcoRI introducido en el extremo 5' de la región promotora del gen psbA (SEQ ID NO: 9; 5'-TTAAGAATTCGAATAGATCTACATA-3', el sitio EcoRI está subrayado) y un cebador de la cadena inferior que comprendía un sitio NcoI introducido en el extremo de la 5'UTR psbA (SEQ ID NO: 10; 5'-CAGCCATGGTAAAATCTTGGTT-3', el sitio de restricción NcoI está subrayado). La amplificación por PCR se realizó con el kit de DNA-polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, LaJolla CA) en un Termociclador 480 Perkin Elmer de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 1 min 94ºC, seguido por 35 ciclos de 1 min 94ºC/1 min 45ºC/1 min 72ºC, y después 10 min a 72ºC. El producto de amplificación de 161 pb predicho se digirió con EcoRI y NcoI y se ligó en los sitios de respectivos de pLITMUS28 (New England Biolabs, Beverly, MA) para formar el plásmido pPB30.

IV. Preparación del gen quimérico que contenía el promotor psbA de N. tabacum fusionado a aadA.

El plásmido pPB37 que comprendía el promotor psbA de tabaco aguas arriba de la secuencia codificante aadA, un gen bacteriano codificante de la enzima aminoglicosido-adeniltransferasa que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina, se obtuvo por ligación del vector pLITMUS28 de 2,8 kb digerido con EcoRI-SpeI con el fragmento promotor de 149 pb EcoRI-NcoI psbA de tabaco de pPB30 y un fragmento de 813 pb BspHI-SpeI de pAT229 que contiene la secuencia codificante aadA.

V. Construcción de un gen quimérico que contiene el promotor clpP de Arabidopsis thaliana fusionado a un gen informador gus y la 3'UTR psbA de plastos de A. thaliana.

El plásmido pAT242 que comprendía un gen quimérico gus se obtuvo por la estrategia de clonación siguiente. El promotor clpP de A. thaliana se amplificó por PCR del plásmido pPH146b (descrito en US 6.362.398) utilizando un cebador de la cadena superior que comprendía un sitio de restricción EcoRI introducido en el extremo 5' de la región promotora del gen clpP (SEQ ID NO: 11; 5'-GCGGAATTCATCATTCAGAAGCCCGTTCGT-3', el sitio EcoRI está subrayado) y un cebador de la cadena inferior que comprendía un sitio BsPHI introducido en el extremo 5' de la 5'UTR clpP (SEQ ID NO: 12; 5'-GCGTCATGAAATGAAAGAAAAAGAGAAT-3', el sitio BspHI está subrayado). La amplificación por PCR del fragmento de 250 pb se realizó con el kit de DNA-polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, LaJolla, CA) en un Termociclador 480 Perkin Elmer de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 1 min 94ºC, seguido por 35 ciclos de 1 min 94ºC/1 min 45ºC/1 min 72ºC, y después 10 min 72ºC. Se creó pAT242 por ligación del fragmento de 238 pb EcoRI-BspHI de la amplificación PCR del promotor clpP de A. thaliana a un fragmento de 2,1 kb NcoI-HindIII de pAT221 que contenía el gen gus enlazado a la 3'UTR psbA de plastos de A. thaliana (descrita en WO 00/20612) y al vector pUC21 de 3,2 kb digerido con HindIII-EcoRI.

VI. Inserción de los genes quiméricos ppo y aadA en un vector de transformación de plastos de tabaco.

Se creó el plásmido pPB2 que tenía los genes quiméricos ppo y gus clonados en orientación opuesta por ligación de un fragmento de 1,8 kb HindIII-EcoRI de pAT263, que se cortó totalmente con HindIII pero cortado sólo parcialmente con EcoRI, que contenía el gen quimérico de maíz rRNA 16S PEP-NEP-rbcL (RBS)::ppo::N. tabacum rps16 3'UTR, un fragmento de 2,3 kb EcoRI-PstI que contenía el gen quimérico A. thaliana clpP promotor::gus::A. thaliana psbA 3'UTR del plásmido pAT242 y el vector de 2,9 kb Bluescript SK+ de 2,9 kb digerido con HindIII-PstI (Stratagene, LaJolla, CA). Se obtuvo el vector de transformación de plastos pPB6 flanqueando los genes quiméricos ppo y gus con la secuencia de cloroplastos de tabaco. Un fragmento de 4,1 kb PstI que comprendía ambos genes quiméricos de pPB2 se ligó al plásmido pAT218 linealizado con PstI (PCT WO 00/20612) que contenía la secuencia de direccionamiento de plastos. Se obtuvo el vector de transformación de plastos pPB97 por reemplazamiento de la secuencia codificante gus pPB6 con el promotor clpP de A. thaliana por la casete N. tabacum psbA promotor::gen aadA del plásmido pPB37. Un fragmento de 962 pb EcoRI-SpeI de un plásmido pPB37 digerido totalmente con EcoRI pero parcialmente con SpeI se ligó a un fragmento de 6,7 kb EcoRI-XbaI de un plásmido pPB6 digerido totalmente con XbaI pero parcialmente con EcoRI.

VII. Creación del vector de transformación de plastos pEBPPOt.

Se creó el vector de transformación de plastos de pEBPPOt (SEQ ID NO: 1) para integración estable del gen ppo de

A. thaliana en el genoma del plasto pero inserción sólo transitoria del gen aadA utilizando la estrategia siguiente. El gen quimérico N. tabacum psbA promotor::aadA::A. thaliana psbA 3'UTR se separó de pPB97 por digestión parcial del plásmido con EcoRI y corte completo del mismo con HindIII. Después de las digestiones de restricción, los extremos de los fragmentos resultantes se hicieron romos con la DNA-polimerasa T4. Se aisló un fragmento de 6,5 kb que comprendía el vector con el gen quimérico ppo, la secuencia de direccionamiento a los plastos y un fragmento de 1,2 kb que contenía el gen quimérico aadA. El fragmento del vector de 6,5 kb se autoligó para producir pEBPPO. Este plásmido se linealizó subsiguientemente con NgomIV, se hizo romo con DNA-polimerasa T4 y se ligó al fragmento 1,2 romo aadA, para producir pEBPPOt. Se obtuvieron plásmidos que tenían el gen quimérico aadA en cualquier orientación, pero se retuvo únicamente el que tenía aadA orientado hacia el gen bla del vector (Figura 1).

Ejemplo 2: Preparación de un vector de transformación de plastos para integración estable de DNA exógeno enlazado al gen quimérico ppo bajo el control del promotor del gen de plastos de maíz 16S Pep-Nep rRNA e integración transitoria de un gen quimérico aadA bajo el control del promotor clpP de N. tabacum.

Se obtuvo el plásmido pPB96 por una ligación de cuatro vías del promotor psbA de plastos de N. tabacum de 149 pb EcoRI-NcoI de pPB30, un fragmento de 1,5 kb NcoI-SpeI de pAT260 que contenía la secuencia codificante ppo de

A. thaliana, un fragmento de 4,0 kb BamHI-SpeI de pPB67b que contenía la 3'UTR rps16 de plastos de N. tabacum ligada a la porción 16S rDNA de N. tabacum de la secuencia de direccionamiento de plastos y el vector pBluescript SK+, y un fragmento de 1,9 kb EcoRI-BamHI de pPB67b que contiene una porción de la secuencia de direccionamiento de plastos rps7/12. Se obtuvo el vector de transformación de plastos pEB8 por ligación de un plásmido pPB96 NgomIV linealizado con extremos romos con un fragmento 1,2 romo que contenía un promotor de plastos clpP de N. tabacum (descrito en US 6.084.155) fusionado al gen aadA y el gen quimérico de la 3'UTR rps16 de plastos de N. tabacum, obteniéndose los plásmidos pEB8a y pEB8b, que difieren sólo en la orientación del gen quimérico aadA en el plásmido. Únicamente se retuvo para transformación de plastos pEB8a (SEQ ID NO: 2, Figura 2) que tenía aadA dirigido hacia el gen bla del vector.

Ejemplo 3: Transformación biolística del genoma de plastos de tabaco con los vectores de transformación de plastos pEBPPOt y pEB8 y selección (véase el Ejemplo 6 para una descripción detallada de los métodos de transformación y selección).

Después de suministro de pEBPPOt (Figura 1, SEQ ID NO: 1) o pEB8 (Figura 2, SEQ ID NO: 2) en el plasto, el vector entero se integra en el genoma del plasto en un primer evento de recombinación. Los transformantes iniciales de plastos se seleccionan por espectinomicina debido a la expresión del gen aadA integrado transitoriamente en el genoma del plasto. Dado que las secuencias de cpDNA que flanquean el gen ppo en el vector proporcionan dos loci de entrecruzamiento diferentes, la recombinación entre el genoma de los plastos y el vector da como resultado una población mixta de genomas transformados que tienen el vector insertado en conformación diferente (A y B). El cambio a selección con butafenacil favorece la inserción estable del gen ppo y la escisión del gen aadA junto con la secuencia de la cadena principal del vector. La pérdida de la secuencia del vector está mediada por un evento de intra-recombinación entre secuencias de DNA de repetición directa que se crearon cuando se insertó el vector en el genoma. Adicionalmente, la segregación de la población de plastos bajo selección con butafenacil da como resultado el enriquecimiento de genomas de plastos transformados con ppo sin el marcador aadA y conducirá finalmente a células homoplásmicas.

El análisis PCR de las muestras de DNA a partir de eventos pEBPPOt y pEB8 seleccionados obtenidos por selección inicial con espectinomicina demostró que ambos, el gen aadA y el gen ppo, están presentes en los transformantes. Subsiguientemente, después de 2 a 3 tandas de subcultivo en medio que contenía butafenacil, el análisis PCR de muestras de DNA de los mismos eventos confirmó la pérdida del gen aadA, mientras que el gen ppo se retenía en los transformantes.

Se utilizó análisis por transferencia Southern para demostrar que el gen ppo podía insertarse en el genoma de los plastos por homoplasmicidad después de selección con butafenacil. El DNA celular total de 10 transformantes pEBPPOt que se sometieron a 3 ó 4 tandas de subcultivo en condiciones selectivas de butafenacil se analizó por hibridación de transferencia Southern. El DNA del tipo salvaje y de los transformantes se digirió con BamHI y se hibridó con una sonda específica de DNA de cloroplastos (cpDNA). Esta sonda se hibridaba con un fragmento de 3,3 kb de DNA de tipo salvaje, mientras que se hibridaba predominantemente con un fragmento de DNA de 5,1 kb en 8 de los transformantes, lo que indicaba que el gen ppo de 1,8 kb se inserta a homoplasmicidad en la mayoría de estos eventos. En las líneas 4 y 9, son detectables ambos fragmentos, lo que indica la existencia de una población heteroplásmica (mixta) de genomas de plastos de tipo salvaje y transformados con ppo. Se observan cuatro poblaciones diferentes de genomas de plastos en estas líneas: un genoma de tipo salvaje (3,3 kb), un genoma transformado con ppo (5,1 kb) y genomas insertados con el vector en dos conformaciones diferentes (inserción de vector A y B, 7,6 y 5,8 kb, respectivamente). La repetición del sondado de la transferencia Southern BamHI con una sonda específica de aadA, confirmó que los transformantes homoplásmicos añaden la pérdida del marcador antibiótico y que el vector se insertaba en conformación diferente (fragmentos BamHI de 7,6 y 5,8 kb) en los genomas de plastos de las líneas heteroplásmicas 4 y 9. Una transferencia Southern de muestras de DNA digeridas con SpeI sondadas con la misma sonda aadA demostró también que sólo las líneas heteroplásmicas 4 y 9 tienen el marcador antibiótico (0,9 kb) mientras que los otros transformantes lo han perdido.

Análisis de hibridación Southern de DNA digerido con BamHI para la identificación de transformantes de plastos pEBPPOt homoplásmicos.

Se utilizó análisis por transferencia Southern para demostrar que el DNA exógeno ligado al gen ppo del vector pEB8 podía insertarse en el genoma del plasto por homoplasmicidad después de selección con butafenacil. El DNA celular total de 2 transformantes pEB8 que se sometieron a 4 tandas de subcultivo en condiciones selectivas con butafenacil se analizó por hibridación de transferencia Southern. El DNA de tipo salvaje y de los transformantes se digirió con BamHI y se hibridó con una sonda específica de DNA de cloroplastos (cpDNA). Esta sonda se hibridó con un fragmento de 3,3 kb de DNA de tipo salvaje, mientras que se hibridaba predominantemente con un fragmento de 6,1 kb de DNA de los transformantes, indicando que la secuencia de 2,8 kb que contenía el DNA exógeno ligado al gen ppo se inserta a homoplasmicidad en estos eventos.

Ejemplo 4: Preparación del vector de transformación de plastos para integración inestable de aadA

I. Clonación de un nuevo locus diana de plastos

Un fragmento de 4,7 kb de DNA de plastos de tabaco (genoma de cloroplastos completo de N. tabacum, número de acceso NC_001879, posición 93132 a 97844 y 144782 a 149494) se aisló por amplificación PCR de DNA aislado de la variedad cultivada de N. tabacum 'Xanthi' utilizando un cebador de la cadena superior que comprendía un sitio de restricción XhoI introducido (SEQ ID NO: 13; 5'-AGTTATCTCGAGTGAGAGAAAGAAGTGAGGAAT-3', el sitio XhoI está subrayado) y un cebador de la cadena inferior que comprendía un sitio XbaI (SEQ ID NO: 14; 5'-TTCTCTAGAAGAAATACGGGG-3', el sitio de restricción XbaI está subrayado). Se realizó la amplificación PCR con el kit de DNA-polimerasa Pfu-Turbo (Stratagene, LaJolla CA) en un Termociclador 480 Perkin Elmer de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 1 ciclo a 95ºC durante 5 min, en el que se añadió enzima 2 min antes del final del ciclo, seguido por 30 ciclos de 1 min 94ºC/1 min 45ºC/4 min 72ºC, y luego 1 ciclo durante 10 min a 72ºC. El producto de amplificación de 4,7 kb predicho se digirió con XhoI y XbaI y se ligó en los sitios respectivos de pLITMUS28 (New England Biolabs, Beverly MA) para el plásmido pEB-NY2.

II. Construcción del nuevo vector de trasformación de plastos

El plásmido pEBNY2 se linealizó con la endonucleasa de restricción PstI. El gen quimérico aadA se eliminó de pPB97 por digestión parcial del plásmido con EcoRI y corte total del mismo con HindIII. Después de las digestiones de restricción, los extremos del plásmido de 7,5 kb pEBNY2 linealizado con PstI y del fragmento de 1,2 kb HindIII-EcoRI que contenía el gen quimérico aadA se hicieron romos con la DNA-polimerasa T4. Subsiguientemente, estos fragmentos se ligaron uno a otro para producir el plásmido pEBNY2+ aadA. Se obtuvieron plásmidos que tenían el gen quimérico aadA en cualquier orientación, pero únicamente se retuvo el que tenía aadA orientado en dirección opuesta del gen ycf2.

El plásmido pEBNY2+ aadA se linealizó con la endonucleasa de restricción NdeI. El gen quimérico ppo se eliminó de pEBPPO cortándolo con la endonucleasa de restricción PstI. Después de las digestiones de restricción, los extremos del plásmido de 8,6 kb pEBNY2+ aadA linealizado con NdeI y el fragmento de 1,8 kb PstI que contenía el gen quimérico ppo se hicieron romos con la DNA-polimerasa T4. Subsiguientemente, estos fragmentos se ligaron uno a otro para producir el plásmido pNY2C (SEQ ID NO: 3, Figura 3). Se obtuvieron plásmidos que tenían el gen ppo quimérico en cualquier orientación, pero únicamente se retuvo el que tenía ppo orientado en la misma dirección que el gen ycf2.

Ejemplo 5: Transformación biolística del genoma de plastos del tabaco con pNY2C y selección (véase el Ejemplo 6 para una descripción detallada del método de transformación y selección).

Después de suministro del DNA vector al plasto, se seleccionan transformantes para resistencia a espectinomicina, que es conferida por el gen aadA integrado en el gen esencial ycf2. Las secuencias de plastos que flanquean ambos genes marcadores seleccionables en el vector de transformación de plastos proporcionan 3 loci de recombinación diferentes y las diferentes combinaciones de eventos de entrecruzamiento doble producirán una población mixta de genomas plastídicos transformados que tienen uno o ambos marcadores seleccionables. El cambio a selección con butafenacil dará como resultado la segregación de la producción genómica de plastos mixta y la selección de plastos homoplásmicos que expresan el gen ppo. La presión selectiva natural favorecerá la copia de tipo salvaje del gen esencial y dará como resultado por tanto la pérdida completa del gen aadA.

El análisis PCR de muestras de DNA de eventos obtenidos por selección inicial con espectinomicina demostró que ambos genes aadA y ppo están presentes en los transformantes. Subsiguientemente, después de 2 a 3 tandas de subcultivo en butafenacil, el análisis PCR de las muestras de DNA de los mismos eventos confirmó la pérdida del gen aadA mientras que se retenía el gen ppo en los transformantes.

Se utilizó análisis de transferencia Southern para demostrar que el gen ppo podía insertarse en el genoma de los plastos y que se obtenían células homoplásmicas por selección con butafenacil. El DNA celular total de 20 transformantes que se sometieron a 3 ó 4 tandas de subcultivo en medio que contenía butafenacil se analizó por hibridación de transferencia Southern. El DNA del tipo salvaje y de los transformantes se digirió con NcoI y se hibridó con una sonda de DNA específica para la secuencia de plastos de tabaco (NC_001879, posiciones 96811 a 97844). Esta sonda, que reconoce normalmente un fragmento de 2,6 kb NcoI en el tipo salvaje, se hibridaba predominantemente con un fragmento de DNA de 4,4 kb en todos los transformantes, lo que indicaba que el gen ppo de 1,8 kb se inserta de manera estable en el plastoma y que se han seleccionado transformantes homoplásmicos en estos eventos.

El análisis de transferencia Southern reveló también que la inserción de aadA en el gen esencial ycf2 después de selección con espectinomicina es inestable. El análisis Southern de muestras de DNA tomadas de dichos 20 transformantes después de selección inicial en medio que contenía espectinomicina que se han descrito anteriormente indicó que el gen quimérico aadA se insertaba en el gen esencial diana de los plastos, pero que las células permanecían en el estado heteroplásmico dado que se retenía una determinada porción de copias de tipo salvaje. Una sonda de DNA de plastos de tabaco (NC_001879, posición 94408 a 95861) específica para el locus aadA de direccionamiento de los plastos se hibridaba tanto al fragmento de tipo salvaje de 1,4 kb como a un fragmento de 2,6 kb que contenía la inserción aadA en todos los transformantes. Después de varias tandas de inserción en butafenacil, la sonda reconocía únicamente el fragmento de DNA de 1,4 kb de tipo salvaje, lo que indicaba que todos los genomas revertían al tipo salvaje y que el gen aadA se perdía cuando se retiraba la presión de selección con espectinomicina. Adicionalmente, no se observó señal de hibridación alguna cuando la transferencia Southern se hibridó con una sonda específica de aadA.

Ejemplo 6: Transformación y selección de plastos

I. Germinación de las semillas

Se esterilizan semillas de tabaco (Nicotiana tabacum) con etanol de 70% durante varios minutos, se lavan 3 a 5 veces con agua estéril, y se extienden luego en placas sobre medio de germinación (Tabla 2, 3). Las placas de germinación se incuban a aproximadamente 25ºC con fotoperiodo de 12-16 horas. El medio de germinación (GM) es como sigue: Macro-sales MS ½ x; Micro-sales MS 1 x; vitaminas GM (100 x) 10 ml/l; Na2EDTA 75 mg/l; FeCl3·6H2O 27 mg/l; sacarosa 10 g/l; Phytagar 8 g/l; y pH ajustado a 5,5.

Las vitaminas GM (100 x) son mezclas como sigue: Inositol 10 g/l; Biotina 5 mg/l; Piridoxina 50 mg/l; Tiamina 50mg/l; Ácido Nicotínico 500 mg/l; Ácido Fólico 50 mg/l; y Glicina 200 mg/l.

II. Preparación de explantes y suministro de DNA

Hojas de plantas jóvenes de tabaco de aproximadamente 2 semanas se colocan con la cara adaxial ("cara superior") hacia arriba en el centro de placas que contienen medio de cultivo de tabaco (Tabla 4). Alternativamente, las vitaminas contenidas en este medio pueden reemplazarse por 100 mg/l de inositol y 1 mf/l de tiamina. El bombardeo con partículas se realiza el mismo día. El medio de cultivo de tabaco es como sigue: sales MS 1 x; vitaminas MS ½ x; vitaminas B5 ½ x; BAP 1 mg/l; NAA 0,1 mg/l; sacarosa 30 g/l; y agar purificado Sigma 6 g/l, con el pH ajustado a 5,8. La preparación DNA-partículas se realiza como sigue: Se esterilizan 60 mg de partículas (wolframio u oro) con 0,5 ml de etanol de 70%, se lavan dos veces con 0,5 ml de agua bidestilada estéril, y se resuspenden luego en 1 ml de glicerol al 50%. A una parte alícuota de 100 1l de la suspensión de partículas, se añaden secuencialmente 101g de DNA, 100 1l de CaCl2 2,5 M, 50 1l de espermidina 0,1 M y se mezcla suavemente después de cada adición. Las partículas recubiertas de DNA se centrifugan brevemente, seguido por un solo lavado con 200 1l de etanol de 70% y otro lavado con 200 1l de etanol 100%. Se resuspenden luego las mismas en 100 1l de etanol 100%. Para cada bombardeo, se utilizan 5 a 10 1l de DNA-partículas.

El bombardeo se lleva a cabo utilizando la pistola de helio PDS 1000 (Bio-Rad, Richmond, CA), siguiendo una modificación del protocolo descrito por el fabricante. Las placas con los explantes diana se colocan en el tercer estante del fondo de la cámara de vacío, se bombardean con discos de rotura a 650 p.s.i. con disparos simples o múltiples por placa.

III. Selección de plantas homoplásmicas transplastómicas que expresan el gen ppo en sus plastos.

a) Selección Inicial

La selección inicial se lleva a cabo con espectinomicina como el agente de selección, o con la combinación de espectinomicina y Fórmula XVII en el caso de selección dual. Se añade espectinomicina a 500 mg/l al medio de cultivo de tabaco en cualquier caso, mientras que se añade Fórmula XVII al medio en concentraciones de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 10 nM, con preferencia aproximadamente 5 nM a aproximadamente 25 nM o, de modo alternativo, aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nM.

Una semana después del bombardeo, se transfieren los explantes a medio de cultivo de tabaco que contiene el o los agentes de selección, con las caras bombardeadas directamente en contacto con el medio de selección. Cuando se incluye Fórmula XVII en el medio de selección, se prefiere cortar los explantes en pequeños trozos, para facilitar una selección más eficiente. Después de aproximadamente 2 a 4 semanas de selección en medio que contiene espectinomicina, los explantes o, si son identificables, los transformantes resistentes, se llevan ulteriormente a la fase siguiente de la selección a fin de obtener plantas homoplásmicas que expresan el gen ppo en sus plastos.

El fenotipo de selección del sistema de selección dual es notablemente diferente del fenotipo obtenido con la selección con espectomicina sola. En el caso de la selección con espectomicina sola, el fenotipo de selección está pigmentado en verde, en cuyo caso los transformantes pigmentados en verde se identifican contra el tejido blanco no transformado. En contraste, en el medio de selección que contiene Fórmula XVII, los transformantes aparecen siempre como callos blancos a amarillentos, sobre un fondo de tejido pardo no transformado.

El fenotipo de selección con el compuesto letal de selección Fórmula XVII es particularmente importante para la selección de aquellos tipos de tejido que no cambiarían a color verde en las condiciones de cultivo utilizadas para la selección. Es más deseable y practicable seleccionar tejido blanco o amarillento contra el tejido pardo, como en el caso con el compuesto letal Fórmula XVII, que selecciona tejido blanco o amarillento contra el tejido blanco.

b) Selección secundaria de eventos homoplásmicos que expresan el gen ppo en el plastoma.

Los explantes bombardeados o los transformantes primarios seleccionados se transfieren a medio de cultivo de tabaco que contiene únicamente Fórmula XVII como el agente de selección en concentraciones que van desde aproximadamente 25 nM a aproximadamente 50 nM o aproximadamente 50 nM a aproximadamente 250 nM para segregación y selección ulterior.

Los tejidos se cortan en pequeñas piezas durante el cultivo y posteriormente cada subcultivo, a fin de asegurar un mejor contacto del tejido con el medio, y por tanto una selección más eficiente. Después de varias tandas de selección, se recogen muestras de los transformantes y se analizan por Transferencia Southern. De 10 transformantes independientes analizados, se confirmó que 8 eran transformantes homoplásmicos que tenían el gen ppo integrado

5 en su plastoma, pero no el gen aadA. Los otros dos eventos eran heteroplásmicos que contenían ambos genes (Tabla 1).

IV. Regeneración de plantas homoplásmicas y expresión del gen ppo en los plastos

10 Se regeneran eventos homoplásmicos ppo para formar brotes en medio de cultivo de tabaco que contiene el agente de selección. La concentración de citoquinina en el medio puede duplicarse para mejorar la regeneración. Los brotes obtenidos se enraízan individualmente en medio de cultivo de tabaco exento de hormonas, con o sin el agente de sección.

15 La homoplasmia de cada planta individual transferida al invernadero se confirmó por transferencia Southern o PCR. Todas las plantas son fértiles y exhiben un fenotipo normal. La expresión del gen ppo en plantas homoplásmicas se evalúa por un ensayo ELISA. Los datos obtenidos se compararon con los de transformantes nucleares de tabaco que expresaban el gen ppo en el núcleo. El ensayo ELISA demostró un aumento significativo de la concentración de proteína PPO en las plantas de plastos transplastómicas comparadas con los transformantes nucleares (Tabla 5).

20 Tabla 1. Cuantificación de la proteína PPO en plantas transplastómicas homoplásmicas y en transformantes nucleares que expresan el gen ppo

Número de evento plastídico

Proteína PPO por proteína total [ng / mg] Número de evento nuclear Proteína PPO por proteína total [ng / mg]

814

127,12 2200 6,0

815

138,43 2203 2,4

816

147,72 2212 0,1

818

143,90 2213 2,6

Ejemplo 7: Transformación de plastos de tomate

25 Se utilizó el genotipo de tomate ZTV840 de la elite Syngenta para transformación de plastos. La esterilización de las semillas, la germinación y el bombardeo de las hojas se realizaron como se ha descrito previamente para la transformación de plastos de tabaco (Ejemplo 6).

30 Dos días después del bombardeo, se transfirieron las hojas de tomate al medio de selección con 500 mg/l de espectinomicina, y se cultivaron bajo luz débil. Una mes más tarde, se cortaron las hojas en pequeñas piezas y se subcultivaron en el mismo medio de selección. Los eventos transplastómicos comenzaron a aparecer después de dos meses de la selección. Se obtuvieron dos eventos con 10 placas bombardeadas con un constructo estable aadA-PPO, y otros dos eventos de 11 placas bombardeadas con el constructo transitorio aadA: PPO estable (pEBPPOt).

35 Cuando comenzaron a aparecer los cuatro eventos, los mismos estaban constituidos por callos blandos muy friables con un ligero matiz de color verde. Estos eventos se transfirieron luego a medio que contenía 50 a 75 nM de Fórmula XVII para la segunda fase de selección. Tres de los cuatro eventos sobrevivieron a la selección con Fórmula XVII y continuaron creciendo en el medio de selección durante más de 6 meses.

40 Ejemplo 8: Nivel alto de tolerancia a los herbicidas obtenido con las plantas transplastómicas homoplásmicas PPO Se obtienen niveles mucho mayores de tolerancia a los herbicidas con las plantas transplastómicas homoplásmicas que expresan ppo en sus plastos que con transformantes nucleares que expresan ppo. Las plantas de tabaco PPO transplastómicas sobrevivían muy bien con el tratamiento de Fórmula XVII hasta la concentración de 2000 nM, el

45 nivel máximo de herbicida testado, mientras que el mismo estudio los transformantes nucleares exhibían sensibilidad cuando se trataron con Fórmula XVII a una concentración superior a 100 nM.

Ejemplo 9: Expresión de transgenes en plastos utilizando el nuevo promotor

50 La siguiente invención proporciona secuencias de ácido nucleico de origen no plastídico útiles para la expresión de genes transgénicos en plastos. Existen sólo un número limitado de elementos reguladores de genes tales como promotores, región 5' no traducida (5'UTR) y región 3' no traducida (3'UTR) disponibles para expresión de transgenes de plastos, y la mayoría de ellos son secuencias plastídicas. Dado que los genomas plastídicos son muy activos en recombinación homóloga, la inserción de secuencias endógenas en el genoma como elemento regulador podría producir reordenamientos genómicos dando como resultado pérdida o desactivación de la función transgénica. Con objeto de evitar una transformación genómica de este tipo, deberían utilizarse como elementos reguladores secuencias extrañas que compartieran poca homología con la secuencia de DNA genómica de los plastos para la expresión de los transgenes plastídicos.

Nuevo promotor

La secuencia semejante al promotor del bacteriófago X2 de Staphylococcus aureus, que se confirmó era capaz de promover la expresión génica en E. coli (Carbonelli et al., FEMS Micro. Letters 177: 75-82, 1999), se testó respecto a su capacidad para promover la expresión génica en plastos de tabaco. La secuencia X2 (SEQ 10) contiene características promotoras de tipo bacteriano tales como la región del hexanucleótido canónico -10 (TATAAT) y la región 35 (TTGCTG) y una secuencia del promotor -16 (TRTG), que se observa también en muchos promotores de cloroplastos PEP. La secuencia X2 (posición 141 a 219 de la secuencia publicada) se enlazó a la secuencia 5' no traducida funcional en plastos y se fusionó a un gen informador en un vector de transformación de plastos de tabaco. SEQ ID NO: 15 Promotor del bacteriófago X2 de Staphylococcus aureus

Nueva región 5' no traducida con secuencia de tipo Shine-Dalgarno

En los plastos de plantas terrestres, las secuencias mRNA 5'UTR son esenciales para la estabilidad del mRNA y el proceso de iniciación de la traducción. Las 5'UTRs de la mayoría de los genes de plastos fuertemente expresados contienen una secuencia del tipo Shine-Dalgarno que es complementaria al extremo 3' de plastos rRNA 16S y se cree que juega un papel predominante en la iniciación de la traducción. Es posible que secuencias extrañas que contengan una secuencia del tipo Shine-Dalgarno puedan funcionar como elemento de traducción de genes de plastos. Se ha demostrado previamente que la secuencia 5'UTR del gen 10 del bacteriófago T7, que contiene un elemento SD, es muy eficiente en promover la traducción en plastos (McBride et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7301-7305; Ye et al., (2001) Plant J. 25:261-270; Kuroda y Maliga (2001) Nucl. Acids Res. 29: 970-975). La secuencia siguiente del gen 10 del bacteriófago de Kluyvera y el gen 9 del bacteriófago T3 se testaron respecto a su capacidad para actuar como secuencias 5'UTR para la expresión de genes de plastos.

SEQ ID NO: 17 5'UTR del gen 9 del bacteriófago T3

La obtención del vector de transformación de plastos que contiene PPO tiene un marcador seleccionable que está bajo el control del promotor del bacteriófago X2

Amplificación de la 5'UTR del gen 10 del bacteriófago kvp1

La 5'UTR del gen 10 de kvp1 se aisló por amplificación PCR a partir de un plásmido que contenía el gen 10 de kvp1 utilizando un cebador de la cadena superior que comprendía un sitio de restricción XbaI introducido en el extremo 5' de la región 5'UTR (5' GTTCTAGAGACATTACGTTCTCCCCTTG 3' (el sitio XbaI está subrayado) SEQ ID NO: 28) y un cebador de la cadena inferior que comprendía un sitio de restricción NcoI introducido que solapaba el codón de iniciación ATG (5' AGATATCCATGGTGAATCTCCTGTTGATT 3' (el sitio de restricción NcoI está subrayado) SEQ ID NO: 29). La amplificación PCR de un fragmento de 119 pb se realizó con el kit de DNA-polimerasa taq (QIAGEN, Valencia CA) en un Termociclador 480 Perkin Elmer de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 5 min 95ºC, seguido por 5 ciclos de 1 min 95ºC/1 min 40ºC/15 s 72ºC, y luego 25 ciclos de 1 min 95ºC/1 min 55ºC/15 s 72ºC.

Se creó el plásmido pEBPKVP-10 por ligación del fragmento XbaI-NcoI de 105 pb del fragmento amplificado 5'UTR del gen 10 de kvp1 con un fragmento XbaI-NcoI de 8,0 kb del vector pEBPaccD. Se creó el plásmido pEBPkvp10-GFP por ligación de un fragmento NcoI/BamHI de 5,2 kb de pEBPKVP10 con un fragmento 1,8 kb de pPB69b, que contenía el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) enlazado a la 3'UTR psbA de los plastos de A. thaliana.

Se amplificó el promotor 16S NEP-PEP de maíz por PCR a partir de pPB98 utilizando un cebador de la cadena superior que comprendía una restricción EcoRI introducida en el extremo 5' de la región promotora del gen rRNA 16S (5' GCCAGAATTCACCACGATCGAACGGGAATGGATA 3' (el sitio EcoRI está subrayado)) (SEQ ID NO: 20) y un cebador de la cadena inferior que comprendía un sitio de restricción XbaI introducido en el extremo 3' de la región promotora del gen rRNA 16S (5' CTCTAGAGATTCGGAATTGTCTTTCCTT 3' (el sitio de restricción XbaI está subrayado) SEQ ID NO: 21). La amplificación PCR de un fragmento de 164 pb se realizó con el kit de DNA-polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, LaJolla CA) en un Termociclador 480 de Perkin Elmer de acuerdo con las recomendaciones

5 del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) como sigue: 5 min 95ºC, seguido por 35 ciclos de 1 min 95ºC/1 min 50ºC/15 s 72ºC.

La secuencia del promotor rRNA 16S amplificado se cortó con XbaI y EcoRI, y el fragmento de 152 pb resultante se ligó a un fragmento XbaI-EcoRI de 6,0 kb del vector de transformación de plastos pB98. El plásmido resultante se cortó subsiguientemente con XbaI y BamHI y un fragmento de 5,1 kb aislado del producto de digestión se ligó con un fragmento XbaI-BamHI de 1,9 kb de pEBPKVP10-GFP, que contenía el gen 10 de kvp1 5'UTR::GFP::A. thaliana psbA 3'UTR quimérico, para dar pEBZM16SKGFP.

Construcción del plásmido RTK7 que tiene

15 La 5'UTR del gen del bacteriófago T3 de 116 pb se amplificó por PCR a partir de un plásmido utilizando un cebador de la cadena superior (RTK36) que comprendía un sitio de restricción NcoI introducido en el extremo 3' de la 5'UTR del gen 9 de T3 (5' GAAGATGCCATGGATTAAATCTCCTAAGTTATTAAAG 3' (el sitio NcoI está subrayado) SEQ ID NO: 22) y un cebador de la cadena inferior (RTK39) que comprendía un sitio SmaI introducido en el extremo 5' de la 5'UTR (5' CGAATCTCTTCCCGGGTAGAGGGAGACCTCATCTTTG 3' (el sitio de restricción SmaI está subrayado) SEQ ID NO: 23). Un fragmento de 328 pb que contenía el promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA de maíz y el promotor del gen psbA de tabaco se amplificó por PCR a partir de pEBT3-9 GFP utilizando un cebador de la cadena superior (RTK38) que comprendía un sitio de restricción SmaI introducido en el extremo 3' del promotor 16S PEP-NEP de maíz (5' CTCCCTCTACCCGGGAAGAGATTCGGAATTGTCTTTCC 3' (el sitio SmaI está subrayado) SEQ

25 ID NO: 24) y un cebador de la cadena inferior (RTK37) que comprendía un sitio BspHI introducido en el extremo 3' de la 5'UTR psbA (5' CGCTTAGTCATGATAAAATCTTGGTTTATTTAATCATC 3' (el sitio de restricción BspHI está subrayado) SEQ ID NO: 25). Los productos PCR se purificaron, se mezclaron en ratio igual en moles con cebadores RTK36 y RTK37 y la mixtura se utilizó para amplificar por PCR un fragmento de 421 pb. Las PCRs se realizaron con el kit de DNA-polimerasa Pfu Turbo (Stratagene, LaJolla CA) en un Termociclador 480 Perkin Elmer de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ).

Para obtener el plásmido RTK7, se creó primeramente el plásmido RTK6 que tenía los genes ppo y gus clonados en orientación opuesta por ligación de un fragmento HindIII-NcoI de 7,5 kb de pEB8a, el vector de transformación con el gen quimérico rps16 ppo::N. tabacum3'UTR, con un fragmento HindIII-NcoI de 2,1 kb que contenía el gen gus::A.

35 thaliana psbA 3'UTR del plásmido pEBPkvp10. Se obtuvo finalmente el plásmido RTK7 por ligación de un RTK6 de 9,6 kb linealizado con NcoI con los promotores 16S y psbA de maíz NcoI-BspHI de 405 pb amplificados por PCR.Únicamente se retuvo el plásmido que tenía el promotor psbA que activaba ppo y el promotor 16S PEP-NEP de maíz que activaba gus.

Construcción de una secuencia semejante al promotor del bacteriófago X2 fusionada al gen quimérico gen 10 de kvp1 5'UTR::GFP::A. thaliana plasto psbA 3'UTR.

Se creó un fragmento EcoRI-XbaI de 85 pb constituido por la secuencia semejante al promotor del bacteriófago X2 por reasociación de un oligonucleótido de la cadena superior (5'

por ligación del fragmento EcoRI-XbaI de 85 pb creado con un fragmento EcoRI-XbaI de 6,8 kb del plásmido pEBZM16SKGFP, que contenía el gen 10 de kvp1 5'UTR::GFP::A. thaliana psbA 3'UTR con el resto del vector de transformación de plastos.

Construcción del vector de transformación de plastos pEB10

55 Se creó el plásmido pEB9 por ligación de un fragmento BgIII-NcoI de 200 pb de pEBX2, que contenía la secuencia semejante al promotor X2 fusionada a la 5'UTR del gen 10 de kvp1, y un fragmento BglII-NcoI de 8,5 kb del vector de transformación de plastos pEB8a.

Secuencia de DNA de la quimera de las secuencias semejantes al promotor del bacteriófago X2 de Staphylococcus aureus fusionada a la 5'UTR del gen 10 del bacteriófago kvp1. La secuencia X2 está subrayada; el codón de iniciación (ATG) está escrito en versalitas. SEQ ID NO: 18).

Se creó el vector pEB10 final de transformación de plastos por ligación de un fragmento BglII-HindIII de 7,8 kb de pEB9 con un fragmento de 2,3 kb de pRTK7, que contenía el gen quimérico pMz16SNEP::T3-9 5'UTR::uidA::3' psbA.

10 Ejemplo 10: Transformación de plastos con pEB10

El gen informador quimérico resultante se introdujo de manera estable en el genoma de plastos de tabaco utilizando el protocolo de selección dual de transformación de plastos descrito en el caso de la Solicitud US 70149. De 6 plastos bombardeados, se encontró un evento que era capaz de crecer en 50 nM de butafenacil después de dos tandas

15 de selección con espectinomicina. Después de tres tandas de selección en butafenacil, el evento se confirmó por análisis Southern, encontrándose que era homoplásmico para inserción en los genomas de cloroplastos de los genes PPO y gus. La actividad de GUS se visualizó por ensayos de GUS estándar.

LISTADO DE SECUENCIAS

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Vector de transformación de plastos pEB8 (= pEB8a)(Ejemplo 2).

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Vector de transformación de plastos pNY2C (Ejemplo 4 II) <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de DNA del promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA de plastos demaíz fusionado al sitio de fijación de ribosoma (RBS) del plasto rbcLde N.tabacum

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador superior para amplificación del promotor del gen 16S PEP-NEP rRNA del DNA de plastos de maíz, comprendiendo el cebador un sitio de restricción EcoRI (Ejemplo 1 I).

<210> 6

<211> 77

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inferior que comprende un sitio de restricción BspHI (Ejemplo 1 I).

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador superior para amplificación del gen ppo de A. thaliana (Ejemplo 1 II).

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inferior para amplificación del gen ppo de A. thaliana, comprendiendo el cebador un sitio de restricción SpeI (Ejemplo 1 II).

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de la cadena superior para amplificación del promotor del gen psbA de N. tabacum, comprendiendo el cebador un sitio de restricción EcoRI (Ejemplo 1 III).

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de la cadena inferior para amplificación del promotor del gen psbA de N. tabacum, comprendiendo el cebador un sitio de restricción NcoI (Ejemplo 1 III).

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador superior para amplificación del promotor del gen clpP de A. thaliana, comprendiendo el cebador un sitio de restricción EcoRI (Ejemplo 1 V).

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inferior para amplificación del promotor del gen clpP de A. thaliana, comprendiendo el cebador un sitio de restricción BspHI (Ejemplo 1 V).

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador superior para amplificación de un nuevo locus diana de DNA de plastos, comprendiendo el cebador un sitio de restricción XhoI (Ejemplo 4 I).

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inferior para amplificación de un nuevo locus diana de DNA de plastos,

comprendiendo el cebador un sitio de restricción XbaI (Ejemplo 4 I).

<213> Bacteriófago X2 de Staphylococcus aureus

<210> 16

<211> 110

<212> DNA

<213> Bacteriófago kvp1 de Kluyvera

<210> 17

<211> 97

<212> DNA

<213> Bacteriófago T3

<210> 18

<211> 194

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Promotor quimérico X2 y gen 10 de kvp1 5; UTP

<220>

<221> Característica diversa

<222> (1) .. (194)

<210> 19

<211> 10011

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Plásmido pEB10

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de la cadena superior

<220>

<221> Característica diversa

<222> (1) .. (34)

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de la cadena inferior de 16S NEP-PEP de maíz

<220>

<221> Característica diversa

<222> (1) .. (28)

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de la cadena superior de la 5'UTR del gen del bacteriófago T3

<220>

<221> Característica diversa

<222> (1) .. (37)

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de la cadena inferior de la 5'UTR del gen del bacteriófago T3

<220>

<221> Característica diversa

<223> Cebador de la cadena superior, 5'UTR del gen 10 de kpv1

<220>

<221> Característica diversa

<222> (1) .. (28)

<210>

29

<211>

29

<212>

DNA

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador de la cadena inferior , 5'UTR del gen 10 de kpv1

<220>

<221>

Característica diversa

<222>

(1) .. (29)

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para protección de una planta transplastómica que comprende los pasos de:

   a) Introducir el un plasto de una célula vegetal un vector de transformación de plastos que comprende dos constructos marcadores seleccionables distintos, en donde el primer constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un primer marcador seleccionable que confiere resistencia a un compuesto selectivo no letal, y el segundo constructo comprende un promotor funcional en un plasto de célula vegetal y una región de terminación de la transcripción funcional en un plasto de célula vegetal enlazada operativamente a un segundo marcador seleccionable que confiere tolerancia a un compuesto letal,

   en donde el primer constructo marcador seleccionable está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y el segundo constructo marcador seleccionable está flanqueado por secuencias de ácido nucleico que son homólogas a secuencias de ácido nucleico diana de plastos no esenciales;

   b) poner la célula vegetal en un primer medio de cultivo que comprende un compuesto no letal para el plasto al cual confiere resistencia el primer marcador seleccionable, durante 1) un periodo de aproximadamente 2 semanas o 2) hasta que aparecen brotes en un callo formado a partir de la célula vegetal; y

   c) poner la célula vegetal en un segundo medio de cultivo que comprende un compuesto letal para el plasto al cual confiere resistencia el segundo marcador seleccionable durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la célula vegetal sea homoplásmica para el marcador letal; y

   d) obtener una planta transplastómica que comprende únicamente el segundo marcador, letal.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en donde el vector de transformación de plastos comprende adicionalmente uno o más constructos de productos génicos de interés expresables en plastos adyacentes al marcador letal.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, en donde el marcador letal y el constructo génico o constructos génicos están organizados como un gen policistrónico semejante a un operón.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, en donde el marcador no letal es un gen de resistencia a antibióticos.

5. 5.

   El método de la reivindicación 4, en donde el gen de resistencia a antibióticos es aadA y el compuesto selectivo no letal es espectinomicina o estreptomicina.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1, en donde el marcador letal es un gen de tolerancia a los herbicidas.

7. 7.

   El método de la reivindicación 6, en donde el gen de tolerancia a los herbicidas es una forma mutada de una protoporfirinógeno-oxidasa y el compuesto selectivo letal es butafenacil o Fórmula XVII.

8. 8.

   El método de la reivindicación 1, en donde dicho vector de transformación de plastos comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 19.

9. 9.

   Un vector de transformación de plastos que comprende un marcador no letal que está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y un marcador letal flanqueado por secuencias que son homólogas a secuencias de DNA de plastos no esenciales.

10. 10.

    El vector de transformación de plastos de la reivindicación 9, que comprende SEQ ID NO: 1 cuando el marcador no letal está presente en la cadena principal del vector.

11. 11.

    Un vector de transformación de plastos que comprende un marcador no letal que está presente en la secuencia de la cadena principal del vector, y un marcador letal adyacente a uno o más constructos de productos génicos de interés expresables en plastos flanqueados por secuencias que son homólogas a secuencias de DNA de plastos no esenciales, en donde el marcador letal y el constructo génico o constructos génicos tienen promotores diferentes funcionales en plastos y se expresan independientemente, o en donde el marcador letal y el constructo génico o constructos génicos están organizados como un gen policistrónico semejante a un operón.

12. 12.

    El vector de transformación de plastos de la reivindicación 11, que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:

13. 19.

    Figura 1

    7,6 Kpb

    Figura 2 Figura 3 Figura 4

    Figura 5

    Inserción de PPO

    Inserción del vector A

    Inserción del

    vector B

    Inserción del vector A Inserción del vector B Inserción de PPO

    Tipo salvaje

    Figura 6

    Locus del plasto direccionado

    Plásmido pNY2C

    Población mixta

    Entrecruzamiento doble 1 y 3

    Entrecruzamiento doble 1 y 2

    Entrecruzamiento doble 2 y 3

    Homoplásmico para PPO y tipo salvaje ycf2

    Selección con espectinomicina

    Selección con butafenacil

    Figura 7

    10011 pb

    rDNA 16S