ES2946040T3 - Regeneración de plantas modificadas genéticamente - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo del fitomejoramiento y en particular a la generación de plantas a partir de células y otros tejidos. Más particularmente, la invención proporciona métodos y medios para mejorar la regeneración de plantas, especialmente a partir de células vegetales transformadas o modificadas genéticamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Regeneración de plantas modificadas genéticamente

La presente invención se refiere al campo del fitomejoramiento y la biotecnología y en particular con la generación de plantas a partir de células y otros tejidos. Más particularmente, la invención proporciona métodos y medios para mejorar la regeneración de plantas, especialmente a partir de células vegetales transformadas o modificadas genéticamente.

En el fitomejoramiento, el procedimiento de manipulación de especies vegetales se ha practicado desde casi el comienzo de la civilización humana para crear genotipos y fenotipos deseados para fines específicos. Con el desarrollo de la ingeniería genética, este campo de la agricultura ha cambiado significativamente durante las últimas décadas. Se ha desarrollado una variedad de métodos para la ingeniería genética de plantas. La elección del método de transformación depende de un número de variables, principalmente de la especie vegetal que se va a transformar, el propósito del experimento y la disponibilidad del equipo necesario. La gran mayoría de las técnicas de transformación de plantas requieren el uso de explantes con altas capacidades de regeneración como material de partida. Además, la edición de genes constituye un nuevo método de biología molecular mediante el cual se pueden introducir en el genoma de una planta modificaciones específicas como inserciones, deleciones o mutaciones puntuales o combinaciones de las mismas. Para ello se requieren instrumentos moleculares específicos que en primer lugar tengan actividad nucleasa, pero sobre todo puedan ser guiados a la secuencia diana que se va a modificar con suficiente especificidad para programar y realizar una mutagénesis específica y dirigida al sitio. En los últimos años en la biotecnología vegetal, la edición específica del genoma se ha convertido en una alternativa al mejoramiento convencional y a las estrategias transgénicas. Sin embargo, las herramientas que están disponibles actualmente, tales como las meganucleasas, las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), las "nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción" (TALEN) o los sistemas CRISPR solamente se usan en biotecnología vegetal de forma limitada debido a las capacidades de regeneración limitadas de materia prima editada de las plantas.

Una amplia variedad de células tiene el potencial de convertirse en embriones, incluidas las células gametofíticas haploides, tales como las células del polen y los sacos embrionarios (véase Forster, B.P, et al. (2007) Trends Plant Sci. 12: 368-375 y Segui-Simarro, J.M. (2010) Bot. Rev. 76: 377-404), así como células somáticas derivadas de las tres capas fundamentales de tejido de la planta (Gaj, M.D. (2004) Plant Growth Regul. 43: 27-47 or Rose, R., et al. (2010) "Developmental biology of somatic embryo genesis" en: Plant Developmental Biology-Biotechnological Perspectives, Pua E-C and Davey MR, Eds. (Berlin Heidel- berg: Springer), pp. 3-26).

La capacidad de regenerarse en plantas a menudo se limita a genotipos particulares en una determinada especie vegetal y se debilita en células vegetales transformadas y modificadas genéticamente y otros tejidos precursores. Incluso si la etapa de transformación y modificación genética de una célula vegetal tiene éxito, esto no significa necesariamente que las plantas deseadas puedan obtenerse realmente a partir de las células modificadas. Se supone que el tratamiento al que se someten las células vegetales y otros tejidos precursores para conseguir una modificación genética afecta al desarrollo y regeneración de las plantas. De este modo, es un objeto de la presente invención mejorar la eficacia de los métodos previamente conocidos para generar plantas transgénicas y modificadas genéticamente y apoyar la regeneración de plantas a partir de células vegetales modificadas y otros precursores de plantas.

En la presente invención, se encontró sorprendentemente que el gen de Arabidopsis GRF5 (factor regulador del crecimiento 5) tiene un efecto en el impulso de la regeneración de plantas que nunca se ha informado para este gen o sus contrapartes de la familia de genes GRF.

En van der Knaap et al. (2000; "A novel gibberellin-induced gene from rice and its potential regulatory role in stem growth", Plant physiology, 122(3), 695-704) los autores han identificado y caracterizado el primer miembro de la familia de genes GRF en el arroz (OsGRFI). Este fue un gen inducido por ácido giberélico en meristemos intercalares. La sobreexpresión en Arabidopsis provocó un crecimiento deficiente del tallo, esterilidad femenina y fertilidad masculina reducida. La aplicación de ácido giberélico no pudo recuperar el defecto de elongación del tallo de las plantas transformadas, lo que sugiere que OsGRFI podría participar en el alargamiento del tallo inducido por GA. En 2003 Kim et al. ("The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis", The Plant Journal, 36(1), 94-104) han caracterizado la familia Arabidopsis GRF y determinaron que los genes se expresan principalmente en tejidos en crecimiento activo. Análisis de mutantes nulos y plantas transgénicas que sobreexpresan AtGRF1 y AtGRF2 indicó que algunos miembros de la familia GRF están implicados en la regulación de la expansión celular durante el crecimiento de hojas y cotiledón. Además, las plantas sobreexpresadoras mostraron un retraso en el tiempo de floración, lo que revela un supuesto papel en la floración. En un estudio para determinar los mecanismos moleculares que coordinan la proliferación celular en hojas en desarrollo, Rodríguez et al. descubrió que el miR396 antagoniza el patrón de expresión de sus dianas, los factores de transcripción de GRF, en Arabidopsis ((2010), "Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396", Development, 137(1), 103-112). De este modo, el equilibrio entre miR396 y el GRF controla el número final de células en las hojas. Adicionalmente, los autores demostraron que GRF dirigido miR396 puede regular el tamaño del meristemo apical del brote.

En 2005, Horiguchi et al. ("The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regúlate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana", The Plant Journal, 43(1), 68-78) caracterizaron por primera vez AtGRF5 y su socio de interacción ANGUSTIFOLIA3 (AN3). Los mutantes con deficiencia genética atgrf5 y an3 desarrollaron hojas angostas debido a la disminución del número de células, mientras que la proliferación celular en los primordios de las hojas se potenció en las líneas de sobreexpresión AtGRF5y AN3. Kuijt et al. ((2014), "Interaction between the GROWTH-REGULATING FACTOR and KNOTTED1-LIKE HOME- OBOX Families of Transcription Factors", Plant physiology, 164(4), 1952-1966) mostraron que los miembros de la familia GRF actúan como jugadores en la red que controlan la expresión de genes KNOTTED1-LIKE HOMEBOX (KNOX) que están implicados en la restricción de la diferenciación celular en el meristemo apical del brote. AtGRF4, AtGRF5 y AtGRF6 son capaces de unirse al promotor de un gen KNOX, reprimiendo su expresión. La sobreexpresión de plántulas de Arabidopsis AtGRF4, AtGRF5, o AtGRF6 muestran aberraciones de desarrollo en el meristemo apical del brote. En un estudio reciente de Vercruyssen et al. ((2015), "Growth regulating factor 5 stimulates Arabidopsis chloroplast division, photosynthesis, and leaf longevity", Plant physiology, pp-114) hojas de Arabidopsis que sobreexpresan GRF5 mostró mayor número de cloroplastos por célula, mayor contenido de clorofila y retraso en la senescencia de las hojas.

En resumen, es bien sabido que el gen de Arabidopsis AtGRF5 y otros genes GRF juegan un papel en la morfogénesis de la hoja y el desarrollo del tallo. Además, se informó que los genes GRF funcionan en la floración, el desarrollo de semillas y raíces, para controlar el crecimiento de la planta en condiciones de estrés y para regular la longevidad de la planta. Sin embargo, durante sus estudios, los inventores de la presente invención encontraron sorprendentemente otra y nueva función de esta familia de genes. GRF5 es capaz de proporcionar un efecto positivo para potenciar la regeneración de las plantas y permitir de este modo una recuperación más eficiente de las plantas transgénicas. La presente invención permite mejorar la regeneración de diversos tejidos o células (por ejemplo, microsporas), puede superar la resistencia a la regeneración de plantas, en particular la dependencia del genotipo, mejorar la recuperación de plantas transgénicas, por ejemplo, mediante la coexpresión de genes de interés y GRF5, y de plantas modificadas genéticamente mediante, por ejemplo, coexpresión transitoria de componentes de edición del genoma y GRF5, así como acortar el tiempo para la producción de líneas transgénicas y la recuperación. De este modo, un primer aspecto del presente documento es el uso del polipéptido de GRF5 para mejorar la capacidad regenerativa de una planta.

Cualquier referencia en lo que sigue a un polipéptido o proteína útil en los métodos de la presente invención se entiende como un polipéptido de GRF5 o proteína de GRF5 como se define en este documento. Cualquier referencia en lo que sigue a un ácido nucleico o polinucleótido útil en los métodos de la invención (excepto la secuencia de nucleótidos de interés que se transforma o la molécula de ácido nucleico que se usa opcionalmente como plantilla de reparación para modificar el genoma de una planta) significa un ácido nucleico ácido o polinucleótido capaz de codificar dicho polipéptido de GRF5 o proteína de GRF5. En una realización, cualquier referencia a un polipéptido/proteína o ácido nucleico/polinucleótido útil en los métodos de la invención debe entenderse como proteínas o ácidos nucleicos útiles en los métodos, construcciones, casetes de expresión, células vegetales, plantas, semillas, partes cosechables y productos de la invención. El ácido nucleico/polinucleótido que incluye el ARNm que se va a introducir en una célula vegetal o planta (y, por lo tanto, útil para realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico/polinucleótido que codifica el tipo de polipéptido/proteína que se describirá ahora, en lo sucesivo también denominado "ácido nucleico de GRF5", "polinucleótido de GRF5", "gen de GRF5" o "ARNm de GRF5" o similares.

Un "polipéptido de GRF5" o "proteína de GRF5" como se define en este documento se refiere a un factor de transcripción (preferiblemente una proteína épsilon GF14, similar a 14-3-3) que comprende un dominio de PFAM, PF08880 (también conocido como dominio q Lq ) y un dominio de PFAM, PF08879 (también conocido como dominio WRC) cuando se analiza con el software Interproscan (www.ebi.ac.uk/interpro), y preferiblemente comprende un dominio de PFAM, PF08880 que encuentra una coincidencia de al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de cobertura en o cerca del extremo N del polipéptido de GRF5 y el dominio de PFAM, PF08879 que encuentra una coincidencia de al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de cobertura C-terminal ubicado en el dominio de PFAM, PF08880 del polipéptido de GRF5, es decir, el tramo de aminoácidos que coincide con PF08879 está ubicado en la dirección de traducción detrás del tramo de aminoácidos que coincide con PF08880. Preferiblemente, al menos una de las coincidencias tiene una cobertura de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %.

En una realización, ambos tramos de aminoácidos coincidentes están ubicados en la mitad N-terminal del polipéptido GRF5, preferiblemente el dominio de PFAM, PF08880 coincidente del tramo de aminoácidos está ubicado en el cuarto N-terminal del polipéptido de GRF5. Preferiblemente, el dominio de PFAM, PF08880 coincide con los residuos de aminoácidos del polipéptido de GRF5 a partir del residuo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 del polipéptido de GRF5, preferiblemente del residuo 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21, y el dominio de PFAM, PF08879 coincide con los residuos de aminoácidos del polipéptido de GRF5 a partir del residuo 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 del polipéptido de GRF5, preferiblemente a partir del residuo 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o 95. Preferiblemente, la distancia entre el residuo de aminoácido inicial del dominio de PFAM, PF08880 de coincidencia con el tramo de aminoácidos y el residuo de aminoácido inicial del dominio de PFAM, PF08880 de coincidencia con el tramo de aminoácidos es de 60 a 82 aminoácidos dentro del polipéptido del GRF5, más preferiblemente de 60 a 75 aminoácidos, más preferiblemente de 61 a 75 aminoácidos, aún más preferiblemente de 62 a 73 aminoácidos dentro del polipéptido de GRF5.

En una realización adicional, el polipéptido de GRF5 como se usa en este documento comprende el motivo indicador:

[DHPLHEHPHGHRHCHRHRHTHDHGHKHKHW HRHCHSAHRKHEDHAHYHHPHDHSHKHYHCHEHKR]-[H]-[M]-[H]-[R]-[G]-[RK]-[N]-[R], en el que es permisible/tolerable que el polipéptido de GRF5 exhibe un número máximo de tres apareamientos erróneos en comparación con el motivo indicador, es decir, pueden aparecer hasta tres apareamientos erróneos en una alineación de secuencia entre el polipéptido de GRF5 respectivo y el motivo indicador, preferiblemente un número máximo de dos apareamientos erróneos en comparación con el motivo indicador, es decir, pueden aparecer hasta dos apareamientos erróneos en un alineamiento de secuencias entre los polipéptidos de GRF5 respectivos y el motivo indicador, más preferiblemente un número máximo de un apareamiento erróneo en comparación con el motivo indicador, es decir, solo puede aparecer un apareamiento erróneo en una alineación de secuencia entre los respectivos polipéptido de GRF5 y el motivo indicador, y más preferiblemente sin apareamiento erróneo en comparación con el motivo indicador. En una realización particularmente preferida, uno de los apareamientos erróneos o el único apareamiento erróneo está ubicado en la posición 2 del motivo indicador y más preferiblemente el apareamiento erróneo es [A] en lugar de [P]. Un apareamiento erróneo significa que el aminoácido en una determinada posición según el motivo indicador se reemplaza por un aminoácido diferente o se suprime o desplaza mediante la inserción de al menos un aminoácido adicional. Las letras del motivo indicador entre corchetes indican el residuo de aminoácido (código de una letra) y el motivo representa el orden de los residuos de aminoácido en dirección desde el extremo N hasta el extremo C tal como está presente en cualquier polipéptido de GRF5 de la presente invención. Si hay dos letras dentro de un corchete, representan alternativas. El motivo se dedujo de una comparación exhaustiva de las secuencias de polipéptidos de GRF5 derivados de 16 especies vegetales diferentes, incluidas plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y permite distinguir los polipéptidos de GRF5 de otros miembros de la familia de proteínas de GRF como GRF1 (consulte la figura 5A). Análisis de motivos de ejemplo mediante alineación/comparación de secuencias para la determinación del número de apareamientos erróneos muestra en la Figura 5B. Preferiblemente, el motivo está ubicado en la mitad N-terminal del polipéptido de GRF5, más preferiblemente el motivo está ubicado en la mitad N-terminal del polipéptido de GRF5 y contiene una subregión del dominio de PFAM, PF08879 que coincide con el tramo de aminoácidos, es decir, el motivo tiene una superposición secuencial con el dominio de PFAM, PF08879 que coincide con el tramo de aminoácidos. Preferiblemente, el motivo indicador consta de cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176. Correspondientemente el polipéptido de GRF5 comprende preferiblemente un motivo contiguo que consta de cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176.

Ejemplos de polipéptido de GRF5 de diversas especies vegetales útiles en los métodos de la presente invención se describen más adelante. En la tabla 1, se indican las ubicaciones del dominio de PFAM, PF08880 y del dominio de PFAM, PF08879, así como la cobertura individual en cualquiera de las secuencias de GRF5 presentadas.

Según un aspecto, la invención proporciona un método de transformación de una célula vegetal que comprende las etapas

(a1) introducir en una célula vegetal

(i) al menos una secuencia de nucleótidos de interés; y

(ii) un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 o un polipéptido de GRF5, en el que (i) y (ii) pueden introducirse en paralelo o secuencialmente en cualquier orden, o

(a2) introducir en una célula vegetal al menos una secuencia de nucleótidos de interés; e inducir en dicha célula vegetal en paralelo o secuencialmente un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5, en el que el polipéptido de GRF5 comprende un dominio de PFAM, PF08880 y un dominio de PfAm , PF08879; y

(b) cultivar la célula vegetal de (a1) o (a2) o una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a1) o (a2) en condiciones en las que en la célula vegetal el polipéptido de GRF5 se expresa a partir del casete de expresión, el polipéptido de GRF5 se traduce a partir de los ARNm introducidos, el(los) polipéptido(s) de GRF5 se potencia(n)/aumenta(n) la expresión del gen endógeno, o el(los) polipéptido(s) de GRF5 está(n) presente(s), preferiblemente en una cantidad potenciada en comparación con la cantidad en una célula vegetal de tipo salvaje o una célula vegetal en la que el casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 o el (los) polipéptido(s) de GRF5 no se ha(n) introducido según la etapa (a1) o en el que no se ha inducido el nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica el polipéptido de GRF5 según la etapa (a2).

Los métodos según la presente invención producen una célula vegetal modificada o transformada que tiene una capacidad de regeneración mejorada debido a la presencia de GRF5 o a la presencia de GRF5 en una cantidad potenciada. Se prefiere, sin embargo, que en la célula vegetal modificada la presencia de GRF5 o la presencia de GRF5 en una cantidad potenciada sea transitoria.

La transformación de una célula vegetal significa la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula vegetal de manera que provoque una integración estable en el genoma de la célula vegetal o una aparición transitoria en la célula vegetal que conduzca a la expresión de la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, de forma constitutiva, temporal o relacionada específicamente con tejido(s) particular(es) o determinada(s) etapa(s) de desarrollo, etcétera. La transformación y regeneración de células de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas es ahora una rutina, y el médico determinará la selección de la técnica de transformación más adecuada. La elección del método variará según el tipo de planta o genotipo que se va a transformar; los expertos en la técnica reconocerán la idoneidad de métodos particulares para tipos o genotipos de plantas dados. Los métodos apropiados pueden incluir, pero no se limitan a: electroporación de protoplastos de plantas; transformación mediada por liposomas; transformación mediada por polietilenglicol (PEG); transformación usando virus; microinyección de células vegetales; bombardeo con microproyectiles de células vegetales; infiltración al vacío; y transformación mediada por Agrobacterium.

La etapa (a1) (i) o (a2) de introducir la al menos una secuencia de nucleótidos de interés se puede realizar usando cualquier método apropiado comúnmente conocido en la técnica. Un número de métodos está disponible para transferir los ácidos nucleicos de interés a las células vegetales. Un método mediado por vector de ejemplo es la transformación mediada por Agrobacterium, como se describe, por ejemplo, por Lindsay & Gallois, 1990, Journal of Experimental Botany, and Kischenko et al., 2005, Cell Biology International for sugar beet, by Ishida et al., 2007, ("Agrobacterium-mediated transformation of maize" Nature protocols, 2(7), 1614-1621) para maíz, o por the PureWheat Technology from Japan Tobacco company para trigo. Otras técnicas apropiadas incluyen el bombardeo de partículas y la electroporación.

La secuencia de nucleótidos de interés según la invención puede ser una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, ARNm, ARNip, miARN, etc. Más particularmente, la secuencia de nucleótidos de interés codifica al menos un rasgo fenotípico. Preferiblemente, el rasgo fenotípico conferido por el ADN o el ARN se puede seleccionar del grupo que consiste en resistencia/tolerancia al estrés biótico, incluida la resistencia/tolerancia a patógenos, en el que el patógeno puede ser un virus, una bacteria, un hongo o un patógeno animal, resistencia/tolerancia al estrés abiótico, incluida la resistencia/tolerancia al frío, la resistencia/tolerancia al estrés por sequía, la resistencia/tolerancia osmótica, la resistencia/tolerancia al estrés por calor, la resistencia/tolerancia al estrés por frío o heladas, la resistencia/tolerancia al estrés oxidativo, la resistencia/tolerancia al estrés por metales pesados, resistencia/tolerancia al encharcamiento o el estrés salino, resistencia/tolerancia al encamado, resistencia/tolerancia a la ruptura, o resistencia/tolerancia frente a uno o más herbicidas como glifosato, glufosinato, 2,4-D, Dicamba, inhibidores de ALS, etcétera. El al menos un rasgo fenotípico de interés también se puede seleccionar del grupo que consiste en la modificación de un rasgo adicional agronómico de interés, incluido el aumento del rendimiento, la modificación del tiempo de floración, la modificación del color de la semilla, la modificación de la composición del endospermo, la modificación del contenido nutricional o la ingeniería metabólica de una ruta de interés.

En el contexto de la presente invención, GRF5 puede introducirse como un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de ^g RF5, como ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 (incluyendo también pre-ARNm o ARNm precursor) o como un polipéptido de GRF5. Las técnicas de ejemplo para introducir una molécula de ácido nucleico se describen anteriormente. Alternativamente, GRF5 puede proporcionarse en la célula vegetal activando la expresión del gen endógeno que codifica el polipéptido de ^g RF5. Esto conduciría a un nivel de expresión potenciado del gen de GRF5 endógeno, es decir, a la presencia o aparición del polipéptido de GRF5 en una cantidad potenciada en la célula vegetal. La activación de la expresión del gen endógeno puede lograrse modificando la actividad o estructura del promotor del gen endógeno que codifica el polipéptido de GRF5. Por ejemplo, los elementos potenciadores pueden introducirse en el promotor por medio de la edición de genes; o ya sea un elemento potenciador que regula el promotor puede reforzarse más o un elemento silenciador que regula el promotor puede debilitarse, por ejemplo, mediante mutagénesis/modificación dirigida; o se pueden introducir modificaciones en el epigenoma relacionadas con potenciadores por medio de herramientas de edición de genes como los sistemas CRISPR (Hilton et al. (2015). Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature biotechnology, 33(5), 510-517); o factores de transcripción sintéticos basados en, por ejemplo, activadores TALE o activadores dCas9 pueden introducirse en la célula donde pueden unirse a sitios de reconocimiento específicos en o cerca del promotor y activar la transcripción del gen de GRF5 (Chen et al. (2013). Activación multiplexada de genes endógenos mediante CRISPR-on, un sistema activador transcripcional guiado por ARN. Cell research, 23(10), 1163); o la cantidad de microARN (miARN) en la célula vegetal que regula la expresión del gen de GRF5 por inhibición después de la transcripcional puede reducirse, por ejemplo, mediante deficiencia genética (mutante nulo) o modificación genética para aumentar la cantidad de polipéptido de GRF5 traducido en la célula vegetal - por ejemplo, Rodríguez et al. 2010 (supra) identificaron en Arabidopsis el microARN miR396 que antagoniza la expresión de GRF5 y representa por lo tanto una diana apropiada para afectar la cantidad de polipéptido de GRF5 en una célula vegetal.

Dependiendo de la especie de planta, así como del tipo de célula, se necesitan diferentes niveles de activación génica o de expresión para tener la cantidad adecuada de polipéptido de GRF5 presente en la célula vegetal en el momento en que tiene lugar la regeneración. Hay diversas técnicas disponibles para un experto en la técnica para medir el nivel de expresión real de un gen endógeno o introducido, por ejemplo, qPCR, RT-PCR, transferencia de Northern o micromatriz. Medición del nivel de expresión del gen de AtGRF5 introducido en una planta Beta vulgaris se muestra en la figura 4. Estos métodos permiten a los expertos en la técnica ajustar el nivel de expresión del gen de GRF5 que produce una capacidad de regeneración mejorada a partir de diversos tejidos o células somáticas y reproductoras (por ejemplo, microsporas). En una realización preferida, en la célula vegetal el nivel de expresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5 aumenta al menos por el factor de 2, el factor de 3 o el factor de 5, preferiblemente por el factor de 10, el factor de 25 o el factor de 50, más preferiblemente por el factor de 100, el factor de 200, o el factor de 500.

Como se describe más arriba, la inducción de un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno en una célula vegetal puede llevarse a cabo mediante la aplicación de uno o más activadores o un precursor de los mismos. Estos se pueden aplicar al medio en el que se cultivan las células vegetales y luego son absorbidos activa o pasivamente por la célula vegetal. Adicionalmente, el uno o más activadores o uno de sus precursores puede introducirse directamente en la célula vegetal mediante microinyección, electroporación o bombardeo biolístico. Además de los activadores de transcripción sintéticos anteriores, se conocen del estado de la técnica un número de activadores adicionales que pueden usarse para aumentar el nivel de expresión de un gen endógeno, en particular el nivel de expresión del gen endógeno de GRF5: En los últimos años, surgieron los campos técnicos de la genética vegetal química y la biología vegetal química donde los sistemas biológicos se tratan con pequeñas moléculas para perturbar específicamente las funciones celulares. Las moléculas pequeñas se usan comercialmente como fármacos, herbicidas y fungicidas en diferentes sistemas, pero en los últimos años se explotan cada vez más también como herramientas para la regulación genética. Por ejemplo, la genética química implica el descubrimiento de efectores de moléculas pequeñas de diversas funciones celulares a través de pantallas de bibliotecas compuestas (Dejonghe & Russinova (2017). Plant Chemical Genetics: From Phenotype-Based Screens to Synthetic Biology. Plant Physiology, pp-01805; Kawasuml, M., & Nghiem, P (2007). Chemical genetics: elucidating biological systems with small-molecule compounds. Journal of Investigative Dermatology, 127(7), 1577-1584). Tales efectores de molécula pequeña apropiadas para la activación de la expresión de un gen diana como GRF5, pueden identificarse mediante pantallas químicas siguiendo diferentes estrategias (Dejonghe & Russinova, 2017). Hay disponibles bibliotecas completas de compuestos que permiten el cribado simple de innumerables moléculas pequeñas y la identificación de efectores que pueden usarse para la activación de la expresión génica de genes como GRF5. Como se mencionó anteriormente, otro enfoque para potenciar el nivel de expresión de un gen endógeno como GRF5 es la aplicación de los llamados activadores de transcripción sintéticos. Por lo general, se diseñan mediante la fusión de un dominio de reconocimiento y al menos un dominio activador. El dominio de reconocimiento se puede derivar de sistemas conocidos como dedos de zinc, efectores TAL o CRISPR; para la activación, la fusión, por ejemplo, de los dominios de activación VP-16 o VP-64 derivados del virus del herpes simple a un dominio de reconocimiento puede causar un aumento en la transcripción. Los dominios de activación más débiles, tales como el AD de NF-^kB humano, se suman a la variedad de opciones para la activación de genes. Adicionalmente, como se muestra en los promotores endógenos, se pueden usar combinaciones de activadores para introducir efectos sinérgicos (Moore et al. (2014). "Transcription activator-like effectors: a toolkit for synthetic biology." ACS synthetic biology, 3(10), 708-716.; US 2002/0046419 A1; Lowder et al. (2017). "Multiplexed transcriptional activation or repression in plants using CRISPR- dCas9-based systems." Plant Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols, 167-184). El activador de transcripción sintético puede administrarse a la célula vegetal o introducirse en la célula vegetal también como precursor, es decir, como molécula de ADN o ARN que codifica tal activador de transcripción artificial o sintético o un dominio del mismo o como una forma inactiva de activador de transcripción que se activa posteriormente en la célula o en un compartimiento específico de la célula. Por último, potenciación de la expresión de los genes de GFR también se pueden lograr mediante la inactivación de los reguladores negativos aguas arriba (es decir, miR396) o mediante la creación de una versión mutante del gen de GFR que es resistente a tales reguladores negativos.

Preferiblemente, el polipéptido de GRF5 de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 o 209, o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 70 % de identidad con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 o 209, preferiblemente al menos el 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 o 209, y preferiblemente comprende un motivo indicador como se describe en este documento, en particular preferiblemente un motivo indicador que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 41 a SeQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176. El polipéptido de GRF5, por ejemplo codificado por un gen endógeno, puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de SEQ ID NO: 2 (Arabidopsis thaliana), SEQ ID NO: 4 (Beta vulgaris), SEQ ID ⁿ O: 6 (Zea Mays), SEQ ID NO: 8 (Triticum aestivum), SEQ ⁱD NO: 10 (Brassica napus), ^s E^q ID NO: 12 (Brassica rapa), SEQ ID ⁿ O: 14 (Brassica oleracea), SEQ ID NO: 16 (Raphanus sativus), SEQ ID NO: 18 (Sorghum bicolor), SEQ ID No : 20 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 22 (Solanum tuberosum), SEQ ID NO: 24 (Hordeum vulgare), SEQ ID NO: 26 (Secale cereale), SEQ ID NO: 28 (Glycine max), SEQ ID NO: 30 (Gossypium hirsutum), SEQ ID n O: 32 (Oryza sativa), SEQ ID NO: 106 (Glycine max), SEQ ID NO: 108 (Brassica napus), SEQ ID NO: 110 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 112 (Zea mays) o S^e Q ID NO: 209 (Zea mays).

Un polinucleótido exógeno (heterólogo) o endógeno que codifica el polipéptido de GRF5 de la invención comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 105, 107, 109, 111, 207, 208 o 210;

(ii) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos 70 %, preferiblemente al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 105, 107, 109, 111, 207, 208 o 210;

(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GRF5 como se define anteriormente o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido codificado por (i) y/o (ii) dentro del alcance de la degeneración del código genético;

(iv) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de (i), (ii) o (iii); o/y

(v) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de (iv) en condiciones estrictas.

El polinucleótido que codifica el polipéptido de GRF5, particularmente el polinucleótido que codifica el polipéptido de g RF5, puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de SEQ ID NO: 1 (Arabidopsis thaliana); SEQ ID NO: 3 (Beta vulgaris), SEQ ID NO: 5 (Zea mays), SEQ ID NO: 7 (Triticum aestivum), SeQ ID NO: 9 (Brassica napus), SEQ ID NO: 11 (Brassica rapa), SEQ ID NO: 13 (Brassica oleracea), SEQ ID NO: 15 (Raphanus sativus), SEQ iD n O: 17 (Sorghum bicolor), SEQ ID NO: 19 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 21 (Solanum tuberosum), SEQ ID NO: 23 (Hordeum vulgare), SEQ ID NO: 25 (Secale cereale), ^s E^q ID NO: 27 (Glycine max), SEQ ID NO: 29 (Gossypium hirsutum), SEQ ID No : 31 (Oryza sativa), SEQ ID NO: 105 (Glycine max), SEQ ID NO: 107 (Brassica napus), ^s E^q ID NO: 109 (Helianthus annuus), SEQ ID N^o : 111 (Zea mays), SEQ ID NO: 207 (sintética), SEQ ID NO: 208 (sintética) o SEQ ID NO: 210 (sintética).

Para los fines de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas de manera óptima que tienen residuos idénticos (x100) dividido por el número de posiciones comparadas. Una brecha, es decir, una posición en una alineación donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera una posición con residuos no idénticos. El alineamiento de las dos secuencias se realiza mediante el algoritmo de Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch 1970). El alineamiento de secuencia asistido por ordenador anterior puede realizarse convenientemente usando un programa de software estándar tal como el programa NEEDLE implementado en The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS), por ejemplo, la versión 6.3.1.2 (Tendencias en Genética 16 (6), 276 (2000)), con su parámetro predeterminado, por ejemplo, para matriz de proteínas = EBLOSUM62, gapopen = 10.0 y gapextend = 0.5.

Los términos "condiciones estrictas" o "hibridación en condiciones estrictas" se refieren a las condiciones en las que las secuencias de nucleótidos con suficiente complementariedad entre sí normalmente permanecen hibridadas. Estas condiciones estrictas son conocidas para los expertos y se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y (1989) 6.3.1-6.3.6. El experto sabe cómo determinar las condiciones de hibridación requeridas sobre la base de, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory, 1989. El término "condiciones de hibridación" a este respecto se refiere no sólo a las condiciones reales que prevalecen durante la aglomeración real de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones que prevalecen durante las etapas de lavado subsiguientes. Los ejemplos de condiciones de hibridación estrictas son condiciones en las que principalmente solo aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen al menos al menos 80 %, preferiblemente al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de la secuencia sufren una hibridación. Las condiciones de hibridación estrictas son, por ejemplo: 4*SSC a 65 °C y múltiples lavados posteriores en 0.1*SSC a 65 °C, durante aproximadamente 1 hora. El término "condiciones de hibridación estrictas", como se usa en este documento, también puede significar: hibridación a 68 °C en fosfato de sodio 0.25 M, pH 7.2, SDS al 7 %, EDTA 1 mM y BSA al 1 % durante 16 horas y, posteriormente, lavar dos veces con 2*SSC y S^d S al 0.1 % a 68 °C. Preferiblemente, la hibridación tiene lugar en condiciones estrictas.

La expresión "vinculado operativamente" significa que dichos elementos del gen quimérico están enlazados entre sí de tal forma que su función está coordinada y permite la expresión de la secuencia codificante, es decir, están enlazados funcionalmente. A modo de ejemplo, un promotor está funcionalmente unido a otra secuencia de nucleótidos cuando es capaz de asegurar la transcripción y, en última instancia, la expresión de dicha otra secuencia de nucleótidos. Dos proteínas que codifican secuencias de nucleótidos se unen funcional u operativamente entre sí si se conectan de tal manera que se pueda formar una proteína de fusión de la primera y la segunda proteína o polipéptido.

Se dice que un gen se expresa cuando conduce a la formación de un producto de expresión. Un producto de expresión indica un producto intermedio o final que surge de la transcripción y, opcionalmente, traducción del ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica dicho producto, por ejemplo, el segundo ácido nucleico descrito en este documento. Durante el procedimiento de transcripción, una secuencia de ADN bajo el control de las regiones reguladoras, particularmente el promotor, se transcribe en una molécula de ARN. Una molécula de ARN puede ya sea formar por sí misma un producto de expresión o ser un producto intermedio cuando es capaz de traducirse en un péptido o proteína. Se dice que un gen codifica una molécula de ARN como producto de expresión cuando el ARN como producto final de la expresión del gen es, por ejemplo, capaz de interaccionar con otro ácido nucleico o proteína. Los ejemplos de productos de expresión de ARN incluyen ARN inhibidor tal como por ejemplo, ARN sentido (cosupresión), ARN antisentido, ribozimas, miARN o ARNip, ARNm, ARNr y ARNt. Se dice que un gen codifica una proteína como producto de expresión cuando el producto final de la expresión del gen es una proteína o un péptido.

Un ácido nucleico (molécula) o nucleótido (secuencia) o polinucleótido, como se usa en este documento, se refiere tanto a ADN como a ARN. El ADN también incluye ADNc y ADN genómico. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, y puede sintetizarse químicamente o producirse por expresión biológica in vitro o incluso in vivo.

Quedará claro que siempre que las secuencias de nucleótidos de las moléculas de ARN se definan por referencia a la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ADN correspondientes, la timina (T) en la secuencia de nucleótidos debe reemplazarse por uracilo (U). Quedará claro en el contexto de la solicitud si se hace referencia a moléculas de ARN o de ADN.

Como se usa en este documento "que comprende" o similar debe interpretarse como que especifica la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. De este modo, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, es decir, estar incrustados en un ácido nucleico o proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN que está funcional o estructuralmente definida puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.

Por medio de GRF5, se puede proporcionar una célula vegetal u otros tejidos precursores de plantas que tengan una capacidad de regeneración mejorada. Esto es particularmente útil para las células vegetales modificadas genéticamente, en particular las células vegetales con un genoma editado.

Según una realización preferida de la invención, la etapa (a1) de introducir la al menos una secuencia de nucleótidos de interés y GRF5 o la etapa (a2) de introducir la al menos una secuencia de nucleótidos de interés e inducir un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica los rendimientos de GRF5 en la transformación transitoria de la célula vegetal. En cuanto a la invención, "transformación transitoria" significa que la secuencia insertada no está (establemente) integrada en el genoma de la célula vegetal. En otra realización, se efectúa una transformación estable, en la que la secuencia de nucleótidos de interés en la etapa (a1) y (a2) del método de transformación divulgada aquí y/o el polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5 en la etapa (a1) del método de modificar el genoma divulgado aquí se inserta en el genoma de la célula vegetal. Según una realización especialmente preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica GRF5 se transforma transitoriamente en la célula mientras que la secuencia de nucleótidos de interés se transforma de forma estable en el genoma de la célula.

La modificación del genoma de la célula vegetal se puede realizar por medio de una enzima inductora de rotura de ADN bicatenario (DSB) que reconoce preferiblemente un sitio predeterminado en el genoma de dicha célula.

De este modo, otra realización de la presente invención es un método de modificación del genoma de una célula vegetal que comprende las etapas

(a1) introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, un ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 (incluidos pre-ARNm) o polipéptido(s) de GRF5;

(a2) inducir en una célula vegetal un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5, en el que el polipéptido de GRF5 comprende un dominio de PFAM, PF08880 y un dominio de p Fa M, PF08879;y

(b) cultivar la célula vegetal de (a1) o (a2) o una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a1) o (a2) en condiciones en las que en la célula vegetal el polipéptido de GRF5 se expresa a partir del casete de expresión, polipéptido de GRF5 se traduce a partir del (los) ARNm introducido(s), el polipéptido de GRF5 se potencia/aumenta se expresa a partir del gen endógeno, o está(n) presente(s) el(los) polipéptido(s) de GRF5, preferiblemente en una cantidad potenciada en comparación con la cantidad en una célula vegetal de tipo salvaje o una célula vegetal en el que el casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, los ARNm que codifican el polipéptido de GRF5 o el polipéptido de GRF5 no se ha introducido según la etapa (a1) o en el que se ha potenciado el nivel de expresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5 no ha sido inducido según la etapa (a2);

(c) modificar el genoma de la célula vegetal de (b) mediante una enzima inductora de rotura de ADN bicatenario (DSB) que reconoce preferiblemente un sitio predeterminado en el genoma de dicha célula, y opcionalmente mediante una molécula de ácido nucleico reparadora,

en el que la modificación de dicho genoma en dicho sitio predeterminado se selecciona de

i. un reemplazo de al menos un nucleótido;

ii. una deleción de al menos un nucleótido;

iii. una inserción de al menos un nucleótido; o

iv. cualquier combinación de i.- iii.; y

en el que la etapa (c) se realiza simultáneamente con la etapa (a1)/(a2) y/o (b), antes de la etapa (a1)/(a2), entre la etapa (a1)/(a2) o (b) o después de la etapa (b).

Como se usa en este documento, una "enzima inductora de ruptura de ADN bicatenario" o "Enzima DSBI" es una enzima capaz de inducir una ruptura de ADN bicatenario en una secuencia de nucleótidos particular, llamada "sitio de reconocimiento". La enzima inductora de rotura de ADN bicatenario (DSB) puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en meganucleasa, nucleasa efectora TAL, nucleasa con dedos de zinc, sistemas CRISPR como CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpfl, CRISPR/CasX, CRISPR/CasY, CRISPR/Csml o CRISPR/MAD7. Las endonucleasas de escisión extrañas son enzimas DSBI que tienen un sitio de reconocimiento preferentemente de aproximadamente 14 a 70 nucleótidos consecutivos y, por lo tanto, tienen una frecuencia de escisión muy baja, incluso en genomas más grandes, tales como la mayoría de los genomas de plantas. Las endonucleasas autodirigidas, también denominadas meganucleasas, constituyen una familia de tales endonucleasas de escisión extrañas. Pueden estar codificadas por intrones, genes independientes o secuencias intermedias, y presentan sorprendentes propiedades estructurales y funcionales que las distinguen de las enzimas de restricción más clásicas, generalmente de los sistemas bacterianos de restricción-modificación de Tipo II. Sus sitios de reconocimiento tienen una asimetría general que contrasta con la simetría de diada característica de la mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Se ha demostrado que varias endonucleasas dirigidas codificadas por intrones o inteínas promueven la búsqueda de sus respectivos elementos genéticos en sitios alélicos sin intrones o sin inteínas. Al hacer una ruptura bicatenaria específica del sitio en los alelos sin intrones o sin inteínas, estas nucleasas crean extremos recombinogénicos, que participan en un procedimiento de conversión de genes que duplica la secuencia codificante y conduce a la inserción de un intrón o una secuencia intermedia al nivel de ADN. En la tabla I del documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) se proporciona una lista de otras meganucleasas de escisión extrañas y sus respectivos sitios de reconocimiento.

Adicionalmente, hay métodos disponibles para diseñar endonucleasas de escisión extrañas personalizadas que reconocen básicamente cualquier secuencia de nucleótidos diana de elección. Brevemente, las enzimas de restricción quiméricas se pueden preparar usando híbridos entre un dominio de dedo de zinc diseñado para reconocer una secuencia de nucleótidos específica y el dominio de escisión de ADN no específico de una enzima de restricción natural, tal como Fokl. Tales métodos se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 03/080809, WO 94/18313 o WO 95/09233 y en Isalan et al. (2001). Un método rápido, de aplicación general, para diseñar dedos de zinc ilustrado al dirigirse al promotor del VIH-1. Nature biotechnology, 19(7), 656; Liu et al. (1997). Design of polydactyl zinc- finger proteins for unique addressing within complex genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(11), 5525-5530).

Otro ejemplo de endonucleasas diseñadas a medida incluye las nucleasas TALE (TALEN), que se basan en efectores similares a activadores de transcripción (TALE) del género bacteriano Xantomonas fusionado al dominio catalítico de una nucleasa (por ejemplo, Fokl o una variante de la misma). La especificidad de unión al ADN de estos TALE se define mediante diresiduos variables repetidos (RVD) de unidades repetidas de 34/35 aminoácidos dispuestas en tándem, de modo que un RVD reconoce específicamente un nucleótido en el ADN diana. Las unidades repetidas pueden ensamblarse para reconocer básicamente cualquier secuencia diana y fusionarse con un dominio catalítico de una nucleasa para crear endonucleasas específicas de secuencia (véase, por ejemplo, Boch et al. (2009). Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 326(5959), 1509-1512; Moscou & Bogdanove (2009). A simple cipher governs ^d N^a recognition by TAL effectors. Science, 326(5959), 1501-1501; y los documentos WO 2010/079430, WO 2011/072246, WO 2011/154393, WO 2011/146121, WO 2012/001527, WO 2012/093833, WO 2012/104729, WO 2012/138927, WO 2012/138939). El documento WO 2012/138927 describe además TALEN y TALE monoméricos (compactos) con diversos dominios catalíticos y combinaciones de los mismos.

Recientemente, se ha descrito un nuevo tipo de sistema de endonucleasa personalizable; el llamado sistema CRISPR/Cas. Un sistema CRISPR en su entorno natural describe un complejo molecular que comprende al menos un ARN no codificante pequeño e individual en combinación con una nucleasa Cas u otra nucleasa CRISPR similar a una nucleasa Cpf1 (Zetsche et al., "Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163, pp. 1-13, October 2015) que puede producir una ruptura de ADN bicatenario específico. En la actualidad, los sistemas CRISPR se clasifican en 2 clases que comprenden cinco tipos de sistemas CRISPR, el sistema de tipo II, por ejemplo, que usa Cas9 como efector y el sistema de tipo V que usa Cpf1 como molécula efectora (Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015). En sistemas CRISPR artificiales, un ARN no codificante sintético y una nucleasa CRISPR y/u opcionalmente una nucleasa CRISPR modificada, modificada para actuar como nickasa o que carece de cualquier función de nucleasa, puede usarse en combinación con al menos un ARN guía sintético o artificial o gARN que combina la función de un crARN y/o un tracrARN (Makarova et al., 2015, supra). La respuesta inmune mediada por CRISPR/Cas en sistemas naturales requiere CR!SPR-ARN (crARN), en los que la maduración de este ARN guía, que controla la activación específica de la nucleasa CRISPR, varía significativamente entre los diversos sistemas CRISPR que se han caracterizado hasta ahora. En primer lugar, el ADN invasor, también conocido como espaciador, se integra entre dos regiones repetidas adyacentes en el extremo proximal del locus CRISPR. Los sistemas CRISPR de tipo II codifican una nucleasa Cas9 como enzima clave para la etapa de interferencia, cuyo sistema contiene un crARN y también un ARN transactivador (tracrARN) como motivo guía. Estos se hibridan y forman regiones de ARN bicatenario (ds) que son reconocidas por RNAseIII y se pueden escindir para formar crARN maduros. Estos, a su vez, se asocian con la molécula Cas para dirigir la nucleasa específicamente a la región de ácido nucleico diana. Las moléculas de gARN recombinantes pueden comprender tanto la región de reconocimiento de ADN variable como también la región de interacción Cas y, de este modo, pueden diseñarse específicamente, de forma independiente del ácido nucleico diana específico y la nucleasa Cas deseada. Como mecanismo de seguridad adicional, los PAM (motivos adyacentes al protoespaciador) deben estar presentes en la región del ácido nucleico diana; estas son secuencias de ADN que siguen directamente del ADN reconocido por el complejo Cas9/ARN. La secuencia PAM para el Cas9 de Streptococcus pyogenes se ha descrito como "NGG" o "NAG" (código estándar de nucleótidos de la IUPAC) (Jinek et al, "A programmable dual-RNA- guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 2012, 337: 816-821). La secuencia PAM para Cas9 de estafilococo aureus es "Nn Gr RT" o "NNGRR(N)". Se conocen otras variantes de sistemas CRISPR/Cas9. De este modo, un Neisseria meningitidis Cas9 se escinde en la secuencia PAM NNNNGATT. Un Streptococcus thermophilus Cas9 se escinde en la secuencia PAM NNAGAAW. Recientemente, se ha descrito un motivo PAM NNNNRYAC adicional para un sistema CRISPR de Campylobacter (WO 2016/021973 A1). Para las nucleasas Cpf1, se ha descrito que el complejo Cpf1-crARN, sin un tracrARN, reconoce y escinde eficientemente el ADN diana precedido por un PAM corto rico en T en contraste con los PAM comúnmente ricos en G reconocidos por los sistemas Cas9 (Zetsche et al., supra). Adicionalmente, mediante el uso de polipéptidos CRISPR modificados, se pueden obtener roturas monocatenarias específicas. El uso combinado de Cas nickasas con diversos gARN recombinantes también puede inducir roturas bicatenarias de ADN altamente específicas por medio de doble corte de ADN. Mediante el uso de dos gARN, además, se puede optimizar la especificidad de la unión del ADN y, de este modo, la escisión del ADN. Mientras tanto, efectores CRISPR adicionales como los efectores CasX y CasY descritos originalmente para bacterias, están disponibles y representan otros efectores adicionales, que pueden usarse con fines de ingeniería genómica (Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes", Nature, 2017, 542, 237-241).

El sitio de escisión de una enzima DSBI se refiere a la ubicación exacta en el ADN donde se induce la rotura del ADN bicatenario. El sitio de escisión puede estar o no comprendido en (superponerse con) el sitio de reconocimiento de la enzima DSBI y, por tanto, se dice que el sitio de escisión de una enzima DSBI está situado en o cerca de su sitio de reconocimiento. El sitio de reconocimiento de una enzima DSBI, también denominado a veces sitio de unión, es la secuencia de nucleótidos que la enzima DSBI reconoce (específicamente) y determina su especificidad de unión. Por ejemplo, un monómero TALEN o ZNF tiene un sitio de reconocimiento que está determinado por sus repeticiones RVD o ZF, respectivamente, mientras que su sitio de escisión está determinado por su dominio de nucleasa (por ejemplo, Fokl) y generalmente se encuentra fuera del sitio de reconocimiento. En el caso de TALEN o ZFN diméricos, el sitio de escisión está ubicado entre los dos sitios de reconocimiento/unión de los respectivos monómeros, esta región de ADN intermedia donde se produce la escisión se denomina región espaciadora.

Una persona experta en la técnica podría elegir una enzima DSBI que reconozca un determinado sitio de reconocimiento e inducir una DSB en un sitio de escisión en o en las proximidades del sitio preseleccionado/predeterminado o diseñar dicha enzima DSBI. Alternativamente, se puede introducir un sitio de reconocimiento de la enzima DSBI en el genoma diana usando cualquier método de transformación convencional o cruzándolo con un organismo que tenga un sitio de reconocimiento de la enzima DSBI en su genoma, y luego se puede introducir cualquier ADN deseado en o cerca del sitio de escisión de esa enzima DSBI.

En un aspecto particularmente preferido de esta realización, se introduce adicionalmente una molécula de ácido nucleico de reparación en la célula vegetal. Como se usa en este documento, un "molécula de ácido nucleico de reparación" es una molécula de ADN o molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria que se usa como plantilla para la modificación del ADN genómico en el sitio preseleccionado en las proximidades o en el sitio de escisión. Como se usa en este documento, "uso como plantilla para la modificación del ADN genómico", significa que la molécula de ácido nucleico de reparación se copia o integra en el sitio preseleccionado mediante recombinación homóloga entre la región o regiones flanqueantes y la región o regiones homólogas correspondientes en el genoma diana que flanquea el sitio preseleccionado, opcionalmente en combinación con el extremo no homólogo-unión (NHEJ) en uno de los dos extremos de la molécula de ácido nucleico de reparación (por ejemplo, en caso de que sólo haya una región flanqueante). La integración por recombinación homóloga permitirá la unión precisa de la molécula de ácido nucleico de reparación al genoma diana hasta el nivel de nucleótido, mientras que NHEJ puede dar lugar a pequeñas inserciones/deleciones en la unión entre la molécula de ácido nucleico de reparación y el ADN genómico.

Como se usa en este documento, "una modificación del genoma", significa que el genoma ha cambiado en al menos un nucleótido. Esto puede ocurrir mediante el reemplazo de al menos un nucleótido y/o una deleción de al menos un nucleótido y/o la inserción de al menos un nucleótido, siempre que resulte en un cambio total de al menos un nucleótido en comparación con la secuencia de nucleótidos del sitio diana genómico preseleccionado antes de la modificación, lo que permite la identificación de la modificación, por ejemplo, mediante técnicas tales como secuenciación o análisis PCR y similares, de las que el experto en la técnica será muy consciente.

Como se usa en este documento "un sitio preseleccionado", "un sitio predeterminado" o "sitio predefinido" indica una secuencia de nucleótidos particular en el genoma (por ejemplo, el genoma nuclear o el genoma del cloroplasto) en la ubicación en la que se desea insertar, reemplazar y/o suprimir uno o más nucleótidos. Esto puede, por ejemplo, ser un locus endógeno o una secuencia de nucleótidos particular en, o ligada a, un transgén o a Dn extraño previamente introducido. El sitio preseleccionado puede ser una posición particular de nucleótido en (después) de la cual se pretende realizar una inserción de uno o más nucleótidos. El sitio preseleccionado también puede comprender una secuencia de uno o más nucleótidos que se van a intercambiar (reemplazar) o suprimir.

Como se usa en el contexto de la presente solicitud, el término "aproximadamente” significa /-10 % del valor indicado, preferiblemente /- 5 % del valor indicado. Por ejemplo, aproximadamente 100 nucleótidos (nt) se entenderá como un valor entre 90 y 110 nt, preferiblemente entre 95 y 105.

Como se usa en este documento, una "región flanqueante", es una región de la molécula de ácido nucleico de reparación que tiene una secuencia de nucleótidos que es homóloga a la secuencia de nucleótidos de la región flanqueante de ADN (es decir, aguas arriba o aguas abajo) del sitio preseleccionado. Quedará claro que la longitud y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones flanqueantes deben elegirse de modo que permitan la recombinación homóloga entre dichas regiones flanqueantes y su región de ADN correspondiente aguas arriba o aguas abajo del sitio preseleccionado. La región o regiones flanqueante(s) de ADN del sitio preseleccionado que tiene homología con la región o regiones de ADN flanqueantes de la molécula de ácido nucleico de reparación también se denominan región o regiones de homología en el ADN genómico.

Para tener suficiente homología para la recombinación, las regiones de ADN flanqueantes de la molécula de ácido nucleico de reparación pueden variar en longitud y deben tener al menos aproximadamente 10 nt, aproximadamente 15 nt, aproximadamente 20 nt, aproximadamente 25 nt, aproximadamente 30 nt, aproximadamente 40 nt o aproximadamente 50 nt de longitud. Sin embargo, la región flanqueante puede ser tan larga como sea prácticamente posible (por ejemplo, hasta aproximadamente 100-150 kb, tal como cromosomas artificiales bacterianos completos (BAC). Preferiblemente, la región flanqueante será de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 2000 nt, por ejemplo, aproximadamente 100 nt, 200 nt, 500 nt o 1000 nt. Además, las regiones que flanquean el ADN de interés no necesitan ser idénticas a las regiones de homología (las regiones de ADN flanqueantes del sitio preseleccionado) y pueden tener entre aproximadamente un 80 % y aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia, preferiblemente de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia con las regiones de ADN flanqueantes del sitio preseleccionado. Cuanto más larga sea la región flanqueante, menos estricto será el requisito de homología. Adicionalmente, para lograr el intercambio de la secuencia de ADN diana en el sitio preseleccionado sin cambiar la secuencia de ADN de las secuencias de ADN adyacentes, las secuencias de ADN flanqueantes deberían ser preferiblemente idénticas a las regiones de ADN aguas arriba y aguas abajo que flanquean el sitio preseleccionado.

Como se usa en este documento, "aguas arriba" indica una ubicación en una molécula de ácido nucleico que está más cerca del extremo 5' de dicha molécula de ácido nucleico. Asimismo, el término "aguas abajo" se refiere a una ubicación en una molécula de ácido nucleico que está más cerca del extremo 3' de dicha molécula de ácido nucleico.

Para evitar dudas, las moléculas de ácido nucleico y sus secuencias se representan por lo general en su dirección 5' a 3' (de izquierda a derecha).

Para apuntar a la modificación de la secuencia en el sitio preseleccionado, las regiones flanqueantes deben elegirse de modo que el extremo 3' de la región flanqueante aguas arriba y/o el extremo 5' de la región flanqueante aguas abajo se alineen con los extremos del sitio predefinido. Como tal, el extremo 3' de la región flanqueante aguas arriba determina el extremo 5' del sitio predefinido, mientras que el extremo 5' de la región flanqueante aguas abajo determina el extremo 3' del sitio predefinido.

Como se usa en este documento, dicho sitio preseleccionado está ubicado fuera o lejos de dicho sitio de escisión (y/o reconocimiento), significa que el sitio en el que se pretende realizar la modificación genómica (el sitio preseleccionado) no comprende el sitio de escisión y/o o sitio de reconocimiento de la enzima DSBI, es decir, el sitio preseleccionado no se solapa con el sitio de escisión (y/o reconocimiento). En este sentido fuera/lejos de, significa de este modo aguas arriba o aguas abajo del sitio de escisión (y/o reconocimiento).

La célula vegetal modificada que ha sido transformada o editada genéticamente según los métodos de la presente invención y posiblemente tiene un genoma modificado puede regenerarse en una planta completa (fértil). Debido a la presencia del GRF5 adicional en la célula vegetal, su capacidad de regeneración mejora significativamente. De este modo, en un aspecto preferido de la invención, la transformación de una célula vegetal o la modificación de un genoma de una célula vegetal, respectivamente, van seguidas de una etapa de regeneración de una planta. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un método de producción de una planta transgénica que comprende

(a) transformar una célula vegetal como se describe anteriormente en este documento y

(b) regenerar a partir de la célula vegetal de (a) o de una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a) una planta que comprende al menos una célula vegetal que comprende la al menos una secuencia de nucleótidos de interés como transgén.

Además, la presente invención también proporciona un método de producción de una planta genéticamente modificada que comprende

(a) modificar el genoma de una célula vegetal como se describe anteriormente en este documento y

(b) regenerar a partir de la célula vegetal de (a) o a partir de una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a) una planta que comprende en al menos una célula la modificación del genoma o la célula vegetal modificada.

Las técnicas de regeneración se basan en la manipulación de determinadas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejidos, ocasionalmente se basan en un biocida y/o marcador herbicida que se puede introducir junto con la(s) secuencia(s) de nucleótidos deseada(s) de interés. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, protoplastos, embriones inmaduros o maduros, tejido embrionario, tejidos meristemáticos, órganos o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467486. Para obtener plantas completas a partir de tejidos transgénicos, tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar en condiciones ambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un procedimiento conocido como cultivo de tejidos. Una vez que se generan plantas completas y producen semillas, comienza la evaluación de la progenie.

Según la presente invención, no solo es posible mejorar la capacidad de regeneración de células vegetales transformadas o modificadas genéticamente, sino también otros tipos de células sensibles con escasas capacidades de regeneración. En particular, la producción de un embrión de planta haploide a partir de precursores como un gametofito masculino inmaduro o una microspora se puede mejorar por medio de GRF5.

De este modo, otro aspecto de la presente invención es un método de producción de un embrión de planta haploide que comprende las etapas

(a1) introducir en un gametofito masculino inmaduro o una microspora un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm(s) que codifica un polipéptido de GRF5 o un polipéptido(s) de GRF5; o

(a2) inducir en un gametofito masculino inmaduro o una microspora un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5,

en el que el polipéptido de GRF5 comprende un dominio de PFAM, PF08880 y un dominio de PFAM, PF08879; y

(b) cultivar el gametofito masculino inmaduro o la microspora de (a) en condiciones en las que en el gametofito masculino inmaduro o la microspora el polipéptido de GRF5 se expresa a partir del casete de expresión, el polipéptido de GRF5 se traduce a partir del ARNm(s) introducido(s), polipéptido de GRF5 se expresa potenciado a partir del gen endógeno, o están presentes el(los) polipéptido(s) de GRF5, preferiblemente en una cantidad potenciada en comparación con la cantidad en una célula vegetal de tipo salvaje o una célula vegetal en la que el casete de expresión comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm(s) que codifica el polipéptido de GRF5 o el polipéptido de GRF5 no se ha introducido según la etapa (a1) o en el que no se ha inducido el nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5 según la etapa (a2); y

(c) seleccionar un embrión de planta haploide derivado del gametofito masculino inmaduro o la microspora de la etapa (b).

La invención también incluye un método de producción de plántulas haploides que comprende exponer material vegetal haploide a un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm codificante de polipéptido de GRF5, o polipéptido(s) de GRF5 para producir embriones haploides y luego convertir (es decir, germinar) los embriones haploides en plántulas. Por lo tanto, la invención incluye un método para hacer plantas haploides que comprende cultivar una plántula producida de acuerdo con el método mencionado anteriormente. La invención también proporciona un método de producción de una planta doble haploide que comprende cultivar material vegetal haploide en presencia de GRF5 durante un período, estimulando o permitiendo una duplicación cromosómica espontánea, y cultivando el material vegetal doble haploide en una plántula, plantón o planta. En determinadas realizaciones, la embriogénesis haploide y la duplicación de cromosomas pueden tener lugar de forma sustancialmente simultánea. En otras realizaciones, puede haber un retraso de tiempo entre la embriogénesis haploide y la duplicación de cromosomas. Si el crecimiento de plántulas, plantas o plantones haploides no implica un evento de duplicación de cromosomas espontáneo, entonces se puede usar un agente de duplicación de cromosomas químico, por ejemplo, colchicina. Muchos procedimientos implican el contacto de células vegetales con colchicina, agentes antimicrotúbulos o herbicidas antimicrotúbulos tales como pronamida, óxido nitroso o cualquier inhibidor mitótico. El resultado son células haploides dobles homocigóticas. Cuando se usa colchicina, la concentración en el medio puede ser generalmente del 0.01 % al 0.2 %. El intervalo de concentración de colchicina puede ser de aproximadamente 400 - 600 mg/L.

Cuando una microspora se expone a polipéptido(s) de GRF5, entonces se puede formar un callo y éste puede sufrir organogénesis para formar un embrión. Por lo tanto, la invención incluye un método de producción de callos de plantas haploides que comprende exponer un gametofito masculino inmaduro o una microspora al polipéptido(s) de GRF5 o introduciendo en este un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica el polipéptido de GRF5, o el (los) polipéptido(s) de GRF5.

La exposición del gametofito masculino inmaduro o la microspora a GRF5 durante la etapa de cultivo se lleva a cabo preferiblemente durante un período de tiempo suficiente para inducir la formación de embriones haploides. El período de tiempo necesario puede depender de la especie de planta de que se trate y todo ello puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Un intervalo preferido de la exposición GRF5 es desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20 horas; más preferiblemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 20 horas.

En determinados aspectos de la invención, se aplica un estrés físico al material vegetal haploide antes de la introducción del casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica el polipéptido de GRF5, o el (los) polipéptido(s) de GRF5. El estrés físico puede ser cualquier temperatura, oscuridad, luz o radiación ionizante, inanición o estrés osmótico, por ejemplo. La luz puede ser luz solar de espectro completo, o una o más frecuencias seleccionadas del espectro visible, infrarrojo o ultravioleta. El estrés puede ser continuo o interrumpido (periódico); regular o aleatorio en el tiempo.

La presente invención es aplicable a cualquier especie vegetal, ya sea monocotiledónea o dicotiledónea. Preferiblemente, las plantas que pueden estar sujetas a los métodos y usos de la presente invención son plantas del género seleccionadas del grupo que consiste en Hordeum, Sorghum, Saccharum, Zea, Setaria, Oryza, Triticum, Secale, Triticale, Malus, Brachypodium, Aegilops, Daucus, Beta, Eucalyptus, Nicotiana, Solanum, Coffea, Vitis, Erythrante, Genlisea, Cucumis, Marus, Arabi- dopsis, Crucihimalaya, Cardamine, Lepidium, Capsella, Olmarabidopsis, Arabis, Brassica, Eruca, Raphanus, Citrus, Jatropha, Populus, Medicago, Cicer, Cajanus, Phaseolus, Glycine, Gossypium, Astragalus, Lotus, Torenia, Allium, o Helianthus. Más preferiblemente, la planta se selecciona del grupo que consiste en Hordeum vulgare, Hordeum bulbusom, Sorghum bicolor, Saccharum officinarium, Zea spp., incluyendo Zea mays, Setaria italica, Oryza minuta, Oryza sativa, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Secale cereale, Triticale, Malus domestica, Brach- ypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Beta spp., including Beta vulgaris, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vin- ifera, Erythrante guttata, Genlisea aurea, Cucumis sativus, Marus notabilis, Arabidopsis arenosa, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine nexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsute, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Raphanus sativus, Brassica juncacea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subsp. sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpa, Medicago truncatula, Cicer yamashitae, Cicer bijugum, Cicer arietinum, Cicer reticulatum, Cicer judaicum, Cajanus cajanifolius, Cajanus scarabaeoides, Phaseolus vulgaris, Glycine max, Gossypium sp., Astragalus sinicus, Lotus japonicas, Torenia fournieri, Allium cepa, Allium fistulosum, Allium sativum, Helianthus annuus, Helianthus tuberosus y/o Allium tuberosum. Particularly preferred are Beta vulgaris, Zea mays, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Secale cereale, Helianthus annuus, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor, Brassica rapa, Brassica napus, Brassica juncácea, Brassica olerácea, Raphanus sativus, Oryza sativa, Glycine max, y/o Gossypium sp.

Las células vegetales apropiadas según la presente invención son especialmente células de un tejido calloso, preferiblemente de un callo friable, de un tejido meristemático, de un tejido reproductivo (por ejemplo, microsporas) o un tejido embrionario así como protoplastos.

Una parte o partes de plantas pueden unirse o separarse de una planta entera intacta. Tales partes de una planta incluyen, pero no se limitan a, órganos, tejidos y células de una planta, y preferiblemente semillas.

El presente documento se refiere además a las plantas que se obtienen o se pueden obtener mediante los métodos descritos anteriormente. De acuerdo con lo anterior, un aspecto del presente documento es una planta transgénica obtenida u obtenible mediante el método anterior de transformar una célula vegetal y regenerar una planta a partir de dicha célula, así como la progenie o partes de la misma, en el que la progenie o la parte comprende la al menos una secuencia de nucleótidos de interés como transgén. Otro aspecto del presente documento es una planta genéticamente modificada obtenida u obtenible mediante el método anterior de modificar el genoma de una célula vegetal y regenerar una planta a partir de dicha célula, así como la progenie o partes de la misma, en el que la progenie o la parte comprende la modificación en el genoma introducido por el método de modificación anterior.

Además, el presente documento describe una célula vegetal o una semilla derivada de la planta transgénica o planta genéticamente modificada anterior. Dicha célula vegetal comprende preferiblemente un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5 integrado de forma transitoria o estable y una enzima inductora de rotura de ADN bicatenario (DSB), que reconoce preferiblemente un sitio predeterminado en el genoma de dicha célula y, opcionalmente, una molécula de ácido nucleico reparadora. El polinucleótido que codifica el polipéptido de GRF5 está preferiblemente unido operativamente a una secuencia reguladora apropiada para que la célula vegetal sea capaz de expresar el polipéptido de GRF5. Una secuencia reguladora significa, por ejemplo, un "promotor" que se refiere a una secuencia de nucleótidos, generalmente aguas arriba (5') de su secuencia de codificación, que controla la expresión de la secuencia de codificación proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y otros factores necesarios para la transcripción adecuada. "Promotor constitutivo" se refiere a promotores que dirigen la expresión génica en casi todos los tejidos y en todo momento. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor CaMV 35S, el promotor CaMV 35S doble (promotor 70S), el promotor de nopalina sintasa (nos), promotor de BdEF1, o promotor de ubiquitina como PcUbi4 o ZmUbi1. "Promotor regulado" se refiere a promotores que dirigen la expresión génica no constitutivamente sino de manera regulada temporal y/o espacialmente e incluyen promotores tanto específicos de tejido como inducibles. Incluye secuencias naturales y sintéticas así como secuencias que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Constantemente se descubren nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales y son bien conocidos para un experto en la técnica. "Promotor específico de tejido" se refiere a promotores regulados que no se expresan en todas las células vegetales, sino solo en uno o más tipos de células en órganos específicos (tales como hojas o semillas), tejidos específicos (tales como embriones o cotiledón) o tipos de células específicas (tales como el parénquima de la hoja o las células de almacenamiento de semillas). Estos también incluyen promotores que están regulados temporalmente (tales como en la embriogénesis temprana o tardía), durante la maduración de la fruta en semillas o frutos en desarrollo, en hojas completamente diferenciadas o al comienzo de la senescencia. "Promotor inducible" se refiere a aquellos promotores regulados que pueden activarse en uno o más tipos de células mediante un estímulo externo (tal como una sustancia química, luz, hormona, estrés o patógeno). Ejemplos de promotores inducibles son promotores inducibles por ecdisona, dexametasona, etanol. Tales promotores son bien conocidos por el estado de la técnica (por ejemplo, Samalova et al. (2005). pOp6/LhGR: un sistema de expresión génica inducible por dexametasona altamente sensible y estrictamente regulado para el tabaco. The Plant Journal, 41(6), 919-935; Gatz & Lenk (1998). Promoters that respond to chemical inducers. Trends in Plant Science, 3(9), 352-358.).

Además, el presente documento describe un embrión de planta haploide obtenido u obtenible mediante el método de la invención.

Otro aspecto del presente documento es una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5 integrado de forma transitoria o estable, y una enzima inductora de rotura de ADN bicatenario (DSB) doble que reconoce preferiblemente un sitio predeterminado en el genoma de dicha célula, y opcionalmente una molécula de ácido nucleico de reparación, en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido de GRF5 puede unirse operativamente a una secuencia reguladora apropiada, de modo que la célula vegetal sea capaz de expresar el polipéptido de GRF5. Tal célula vegetal se puede obtener cuando se lleva a cabo el método de modificación descrito anteriormente para modificar el genoma de una célula vegetal.

Un aspecto adicional del presente documento es el uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5, polipéptido de GRF5 o un activador de la expresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5 en un método de transformación de una célula vegetal, preferiblemente en el método de transformación descrito anteriormente, en un método de modificación del genoma de una célula vegetal, preferiblemente en el método de modificación del genoma descrito anteriormente, en un método para la producción de una planta o un embrión de planta haploide, preferiblemente en el método para la producción de una planta o un embrión de planta haploide como se describe anteriormente, o en un método para la regeneración de una planta, preferiblemente en el método para la regeneración de una planta como se describe arriba.

A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según protocolos estándar como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Cray, jointly published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UK. Otras referencias para técnicas estándar de biología molecular incluyen Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK). Los materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany.

La invención se describirá adicionalmente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos descritos en este documento. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a tales ejemplos.

Figuras

Figura 1: Número total de brotes en desarrollo en cada etapa de selección (S1-S4). Datos obtenidos de 5 experimentos de transformación independientes realizados ya sea con la construcción de control pZFN-tdT-nptll o con pZFN-nptll-GRF5 (compárese con la tabla 3).

Figura 2: Regeneración de brotes al comienzo de la etapa de selección 3 (S3) de 14 callos transformados de forma independiente en un experimento (A) de control y un experimento realizado con pZFN-nptll-GRF5 (B). Las flechas indican brotes en desarrollo. Los experimentos se realizaron siguiendo el método de 2.1.

Figura 3: Regeneración de brotes en callos de remolacha azucarera 10 días después de bombardeados con pZFN-nptll-GRF5 (A) y el plásmido control pABM70S-TurboYFP (B). Los callos se bombardearon conjuntamente con el plásmido pUbi4-tDT para controlar los niveles de expresión transitoria mediante fluorescencia roja. Los experimentos se realizaron siguiendo el método 2.2. Se muestran tres callos bombardeados de forma independiente.

Figura 4: Nivel de expresión de GRF5 en once eventos transgénicos independientes de remolacha azucarera.

Figura 5: A: Comparación de secuencias de las secuencias de polipéptidos GRF5 derivados de 16 especies vegetales diferentes y deducción de un motivo indicador específico de ^g RF5 (SEQ ID NO: 177); las secuencias parciales de las secuencias de los polipéptidos GRF5 que se muestran se exponen en SEQ ID NO: 178 - 206; B: análisis de motivos por alineación/comparación de secuencias en las secuencias de proteínas completas derivadas de 16 especies vegetales diferentes que permiten hasta 10 apareamientos erróneos. Las columnas "inicio" y "parada" indican la posición inicial y final del fragmento de secuencia de los polipéptidos GRF5 correspondientes al motivo indicador; columna "apareamientos erróneos" muestra el número de apareamientos erróneos entre el polipéptido GRF5 respectivo y el motivo indicador; las secuencias parciales de las secuencias de los polipéptidos GRF5 como se muestran se exponen en SEQ ID NO: 178 - 184 y SEQ ID NO: 186 - 206. AtGRF1_AT2G22840.1 (SEQ ID NO: 33); AtGRF2_AT4G37740.1 (SEQ ID NO: 34); AtGRF3_AT2G36400.1 (SEQ ID NO: 35); AtGRF4_AT3G52910.1 (SEQ ID NO: 36); AtGRF6_AT2G06200.1 (SEQ ID NO: 37); AtGRF7_AT5G53660.1 (SEQ ID NO: 38); AtGRF8_AT4G24150.1 (SEQ ID NO: 39); AtGRF9_AT2G45480.1 (SEQ ID NO: 40).

Figura 6: Frecuencia de transformación en remolacha azucarera obtenida con la construcción de control 70S::tdT, una construcción para sobreexpresar AtGRF5 (ADNc - SEQ ID NO: 1; secuencia de aminoácidos - SEQ ID NO: 2), y el ortólogo GRF5 de remolacha azucarera, BvGRF5 (ADN sintético - SEQ ID NO: 207; secuencia de aminoácidos - SEQ ID NO: 4).

Figura 7: Número de brotes transgénicos por callo de remolacha azucarera inoculado obtenido en experimentos de transformación mediante el uso de construcciones para sobreexpresar tdTomato (tDT) (control) y AtGRF5 (ADNc -SEQ ID NO: 1; secuencia de aminoácidos - SEQ ID NO: 2).

Figura 8: Número promedio de brotes transgénicos por callo de remolacha azucarera obtenido de experimentos de transformación con la construcción de control 70S-tDT (control) y la construcción para sobreexpresar AtGRF5 (70S-GRF5). Se usaron dos genotipos recalcitrantes A y B. El nivel de recalcitrancia para regenerar brotes del genotipo A es muy alto, mientras que el genotipo B muestra una recalcitrancia más leve que A.

Figura 9: Experimentos de regeneración de callos de líneas transgénicas que sobreexpresan AtGRF5 en remolacha azucarera. La frecuencia de formación de callos (A) y la frecuencia de regeneración de brotes (B) se puntuaron usando el medio de inducción de callos y el medio de regeneración de brotes descritos en Kischenko et al., 2005 (véase también el ejemplo 1). Se ensayaron un total de 5 eventos independientes que sobreexpresan AtGRF5 (AtGRF5-36, AtGRF5-41, AtGRF5-14, AtGRF5-94, AtGRF5-50). Como control, se usaron brotes de remolacha azucarera no transgénicos (WT1 y WT2) y brotes transgénicos que sobreexpresan la proteína indicadora tDT (evento tDT). El nivel de expresión de AtGRF5 se determinó mediante qRT-PCR en muestras aisladas de los eventos transgénicos de GRF5 usados en el ensayo (C).

Figura 10: Frecuencia de transformación en maíz, ya sea con la construcción de control 70S::tDT, o con construcciones para sobreexpresar AtGRF5 (ADNc - SEQ ID NO: 1; secuencia de aminoácidos - SEQ ID NO: 2), dos ortólogos de maíz GRF5 [ZmGRF5 versión A (ADN sintético - SEQ ID NO: 208; secuencia de aminoácidos - Se Q ID NO: 209) y ZmGRF5 versión B (ADN sintético - SEQ ID NO: 210; secuencia de aminoácidos - SEQ ID NO: 112). La eficiencia de transformación se calculó como el número de eventos transgénicos dividido por el número de embriones inmaduros inoculados.

Figura 11: Desarrollo de brotes y fluorescencia DsRed de brotes en explantes de soja 21 días después de la transformación. Imágenes representativas de explantes del control DsRed, AtGRF5 y GmGRF5 que muestran (A) desarrollo de brotes en el nudo primario y (B) fluorescencia DsRed de brotes. Las imágenes DsRed son una combinación de varias imágenes y se colocan en una posición aproximada con fines de orientación.

Figura 12: La formación de brotes "buenos" continuó aumentando rápidamente de 16 a 22 días después de la selección. El porcentaje de explantes se calificó en dos puntos de tiempo para resaltar la rápida producción de brotes en la selección de explantes transformados con las tres construcciones.

Figura 13: Formación de brotes en explantes de soja transformados con y sin variantes GRF5. Se muestran imágenes tomadas desde la vista superior y lateral de una repetición para los tres tratamientos (construcciones). El crecimiento de los brotes es más pronunciado en los explantes transformados con AtGRF5 (panel central) y GmGRF5 (panel inferior) frente al control DsRed (panel superior).

Figura 14: Un diagrama de caja y bigotes que visualiza el aumento significativo en la regeneración de brotes transgénicos en explantes transformados con ya sea AtGRF5 o GmGRF5 a los 16 y 22 días de la selección.

Figura 15: Desarrollo de brotes y fluorescencia DsRed de brotes en explantes de canola 21 días después de la transformación. Imágenes representativas de explantes del control DsRed, AtGRF5 y BnGRF5 que muestran (A) desarrollo de callos en los segmentos del hipocótilo y (B) fluorescencia DsRed en los explantes.

Figura 16: El porcentaje de explantes que expresan DsRed en cinco experimentos de Brassica napus transformados con el control AtGRF5, BnGRF5 y DsRed se representan en un diagrama de caja y bigotes. El porcentaje de explantes que expresan DsRed es significativamente mayor en AtGRF5 y BnGRF5 en comparación con las construcciones de control, con un aumento de casi 3 veces en la media.

Figura 17: Transformación conjunta de callo de remolacha azucarera con la construcción de control 70S-tDT y 70S-AtGRF5. La inoculación de callos en los experimentos de transformación conjunta se realizó con una mezcla 1:1 de las cepas de Agrobacterium que albergaban cada construcción individualmente.

Ejemplos

1. experimentos de Beta vulgaris

Producción del plásmido binario:

El vector binario pZFN-nptll-GRF5 se produjo siguiendo procedimientos de clonación estándar. Dentro del ADN-T de este vector, el ADNc que codifica GRF5 (At3g13960) se clonó entre el promotor doble CaMV 35S y el terminador de nopalina sintasa (NOS) para garantizar altos niveles de expresión ectópica de la proteína GRF5. El ADN-T también contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptll) que confiere resistencia a una serie de antibióticos aminoglucósidos tales como la kanamicina o la paromomicina y se usó para la selección de células vegetales y tejidos de plantas transgénicas. El promotor NOS y el terminador pAG7 flanquean el gen nptll. El esqueleto del vector binario contiene los orígenes colE1 y pVS1 para la replicación del plásmido en Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens, respectivamente; y el gen aadA que confiere resistencia a la estreptomicina/espectinomicina para la selección de bacterias. El plásmido pZFN-nptll-GRF5 se transformó en la cepa AGL-1 Agrobacterium mediante un procedimiento estándar.

Transformación de brotes micropropagados:

Los brotes de remolacha azucarera fueron transformados por diferentes métodos:

a) Transformación mediada por Agrobacterium en base a Kischenko et al., 2005 Cell Biology International:

1. Como material de partida se usaron brotes micropropagados del genotipo S706. Los brotes se multiplicaron en sales MS suplementadas con 30 g/l de sacarosa y 0.25 mg/l de benciladenina (BAP).

2. Para inducir el callo friable, se incubaron explantes de hojas en sales de MS que incluían 15 g/l de sacarosa y 2 mg/l de BAP a aproximadamente 30 °C, durante varias semanas.

3. Se recolectaron callos friables.

4. Se cultivó Agrobacterium AGL-1 que albergaba el vector pZFN-nptll-GRF5 en un medio apropiado suplementado con los antibióticos apropiados.

5. Los callos se inocularon con suspensión de Agrobacterium. El cocultivo del tejido del callo y el Agrobacterium se realizó en un medio que contenía 440 mg/l de CaCl.2x2H₂O, 170 mg/l de KH₂PO4, 1900 mg/l de KNO₃, 370 mg/l de MgSO₄, 1650 mg/l de NH4NO₃, 2 mg/l de BAP, 40 μg/l de acetosiringona, 20 g/l de sacarosa y 2 g/l de glucosa durante al menos 2 días.

6. Los callos se subcultivaron en sales de MS suplementadas con 30 g/l de sacarosa, 1 mg/l de GA3, 1 mg/l de TDZ y 500 mg/l de timentina y se incubaron en la oscuridad durante c. 1 semana.

7. Para la selección de células transgénicas, los callos se transfirieron al medio de la etapa 6 suplementado con 100 mg/l de paromomicina y se incubaron a la luz durante varias semanas.

8. Se seleccionaron callos transgénicos y se subcultivaron varias veces en el mismo medio y condiciones.

9. Los brotes en regeneración se aislaron y propagaron en sales MS que incluían 30 g/l de sacarosa, 0.25 mg/l de BAP y 100 mg/l de kanamicina.

10 Los brotes verdes se transfirieron a sales MS suplementadas con 30 g/l de sacarosa, 0.1 mg/l de BAP, 250 mg/l de timentina y 200 mg/l de paromomicina para finalizar la fase de selección y se multiplicaron regularmente por varias veces en este medio.

11 Se aislaron explantes de hojas de los brotes verdes en crecimiento para la extracción de ADN y el análisis de PCR, con el fin de confirmar las supuestas líneas transgénicas.

12 Los brotes seleccionados se enraizaron en sales MS suplementadas con 0.5 mg/l de IBA, 100 mg/l de cefotaxima y 10 mg/l de PPT y se transfirieron al invernadero para la producción de semillas.

b) Bombardeo de partículas de callos de remolacha azucarera

1. Los callos friables se produjeron como se describió previamente en el método de 2.1.

2. Se llevó a cabo un tratamiento osmótico durante varias horas.

3. La preparación y el recubrimiento de ADN de las partículas de oro se realizaron mediante procedimientos estándar, como se describe en el manual de instrucciones del PDS-1000/He. Los plásmidos pZFN-nptll-GRF5 y pUbi4-tDT (que contenían un indicador rojo fluorescente) se coprecipitaron con partículas de oro. Como control, las partículas de oro se recubrieron con pUbi4tDT y pABM70STurboYFP (que contenían un indicador fluorescente amarillo).

4. Los callos se bombardearon con una unidad PDS-1000/Hc (Bio-Rad), usando 30 ng de partículas de oro recubiertas con 500 ng de ADN por brote.

5. Para evaluar el efecto de la expresión transitoria de GRF5 en la frecuencia de regeneración de brotes, se incubaron callos bombardeados en sales MS suplementadas con 30 g/l de sacarosa, 1 mg/l de GA3 y 1 mg/l de Thidiazuron en condiciones de luz para c. 2 semanas. El número de brotes se calificó usando un binocular estándar.

Resultados:

El Agrobacterium tumefaciens mediada por la transformación de callos derivados de brotes micropropagados de remolacha azucarera con la construcción pZFN-nptll-GRF5 aumenta significativamente el número de brotes regenerados al final de la etapa de selección (Tabla 2). Como control, se ha usado la construcción pZFN-tdT-nptll (Control) que contiene un indicador fluorescente rojo. Los cinco experimentos independientes muestran un aumento de la frecuencia de transformación promedio de 5,0 % a 33,9 %. Además, el número de eventos transgénicos confirmados por PCR aumentó en promedio de 4,8 eventos a 25,4 eventos por experimento de transformación.

Tabla 2. Frecuencia de transformación de 5 experimentos independientes realizados por el método de transformación de a), ya sea con una construcción de control o con el pZFN-nptll-GRF5. También se muestra el número total de brotes al final de la fase de selección y el número total de eventos transgénicos confirmados por PCR. En promedio, el número de brotes en desarrollo, los eventos transgénicos y la frecuencia de transformación se indican en negrita.

En los experimentos de transformación de callos también se ha determinado la regeneración de brotes para cada etapa de selección individual. La cuantificación de brotes en regeneración en cada etapa de selección muestra que la sobreexpresión de GRF5 en callos de remolacha azucarera acelera la organogénesis de los brotes (Tabla 3, figuras 1 y 2). En otro experimento de transformación de callos se ha determinado la regeneración de brotes para dos genotipos de remolacha azucarera recalcitrantes (Figura 8): La transformación con la construcción pZFN-tdT-nptll (control) da como resultado ningún brote transgénico para el genotipo A y solo un promedio de 0.3 brotes por callo para el genotipo B. Usando la sobreexpresión de AtGRF5 bajo el promotor 70S, el número promedio de brotes transgénicos aumenta desde 0 a 1.67 brotes transgénicos para el genotipo A y desde 0.3 a 4.82 brotes por callo para el genotipo B. Esto demuestra de manera impresionante el potencial de AtGRF5 y abre la posibilidad de trabajar de forma independiente del genotipo con métodos de transformación estándar.

Experimentos adicionales demostraron que el número de eventos transgénicos por callo inoculado podría incrementarse en un factor 9 mediante el uso de una construcción para la sobreexpresión de AtGRF5 en callos de Beta vulgaris (Figura 9). Como control, se ha usado la construcción pZFN-tdT-nptll (Control) que contiene un indicador fluorescente rojo. El gen GRF así como el gen indicador estaban bajo el control del promotor 70S constitutivo (promotor 35S constitutivo doblemente potenciado del virus del mosaico de la coliflor).

El nivel de expresión de GRF5 se ha determinado en once eventos transgénicos independientes de remolacha azucarera elegidos al azar. El análisis de expresión se realizó con cebadores que se unían a la 3'-UTR del terminador NOS. En todos los eventos transgénicos analizados se ha detectado un alto nivel de expresión de GRF5 (véase la figura 4).

Tabla 3. Cuantificación de brotes en regeneración en cada etapa de selección de 5 experimentos independientes de transformación de callos realizados ya sea con pZFN-tdT-nptll (Ctrl) o pZFN-nptll-GRF5 (RB). El número total de brotes en desarrollo en cada etapa se indica en negrita.

En un experimento adicional de regeneración de callos, se analizaron cinco eventos transgénicos diferentes que sobreexpresan AtGRF5 en remolacha azucarera. Como control se usaron por un lado dos líneas de remolacha azucarera no transgénicas (WT1 y WT2) y por otro lado una línea transgénica que sobreexpresa la proteína indicadora tdT. La figura 9A muestra que la frecuencia promedio de formación de callos en las líneas de control y los eventos transgénicos de AtGRF5 fueron casi comparables, quizás ligeramente potenciados en los eventos transgénicos. En la figura 9B se presenta el número promedio de brotes transgénicos. Cuatro de los cinco eventos AtGRF5 muestran un aumento significativo en la formación de brotes en comparación con los dos controles. A partir de la figura 9C se hace evidente que el efecto positivo sobre la formación de brotes está relacionado con el nivel de expresión de AtGRF5 en los eventos transgénicos.

En experimentos de transformación conjunta con la construcción de control, 70S-tDT y 70S-AtGRF5 se han integrado de manera estable en el genoma de las células de callo de la remolacha azucarera. La inoculación de callos en los experimentos de transformación conjunta se realizó con una mezcla 1:1 de las cepas de Agrobacterium que albergaban cada construcción individualmente. La frecuencia promedio de transformación conjunta fue del 31.5 %. Como se muestra en la figura 17, el número de eventos fluorescentes rojos (tDT positivos) es alrededor de 8 veces mayor en la transformación conjunta que en los experimentos de transformación única.

La transformación mediante bombardeo de partículas según el método de 2.2 mostró que incluso la (sobre)expresión transitoria de GRF5 da como resultado un aumento significativo de la frecuencia de transformación. Los callos bombardeados muestran una capacidad de regeneración mejorada. La figura 3 muestra que los callos transformados biolísticamente con la construcción pZFN-nptll-GRF5 exhiben un mayor número de brotes en regeneración en comparación con los callos con la construcción de control.

En experimentos adicionales de transformación de callos, la frecuencia de transformación en la remolacha azucarera también se ha determinado usando la construcción pZFN-nptll-AtGRF5 en comparación con la misma construcción pero expresando el homólogo de GRF de Beta vulgaris (BvGRF5). Como control, se ha usado la construcción pZFN-tdT-nptll (Control) que contiene un indicador fluorescente rojo. Los genes GRF así como el gen indicador estaban bajo el control de un promotor 70S constitutivo. Los experimentos que se muestran en la figura 6 se detuvieron en una fase de selección temprana. Eso explica por qué la eficiencia de transformación de la construcción tDT es 0 %. Para la construcción AtGRF5 se pudo lograr una frecuencia promedio de transformación del 70 % y para la construcción BvGRF5 una frecuencia promedio de transformación del 32.5 %.

2. Experimentos con Oriza sativa

Construcciones usadas en el plásmido binario:

Los vectores binarios se produjeron mediante procedimientos de clonación estándar. Dentro del T-ADN de este vector, el ADNc que codifica GRF5 (At3g13960) se clonó entre un promotor y un terminador apropiados, lo que garantiza suficientes niveles de expresión ectópica de la proteína GRF5 en arroz (= construcciones individuales). El T-ADN también contiene el gen GFP que se usó para la selección de células y tejidos vegetales transgénicos. Adicionalmente, se produjeron vectores binarios que, además del ADNc que codifica GRF5 (At3g13960), incluían el promotor y el terminador apropiados para garantizar niveles de expresión ectópica suficientes de la proteína GRF5 en el arroz y un gen adicional de interés bajo el control de un promotor y un terminador (= construcciones dobles (apiladas)).

Esterilización y siembra de semillas:

Las semillas verdes de tipo salvaje se incubaron en etanol al 70 % y se agitaron durante aproximadamente 1 minuto. Después de eliminar el etanol, las semillas se lavaron una vez con agua mQ estéril. Luego se han agregado 30 ml de solución de hipoclorito de sodio al 6 % y se han agitado las semillas durante 40-60 minutos. Después de retirar la solución de hipoclorito de sodio, las semillas se lavaron de 3 a 5 veces con mQ estéril.

Después de terminar la esterilización (0-3 horas), las semillas se secaron en papel de filtro estéril y se colocaron sobre la superficie del medio de inducción R001. La incubación tuvo lugar bajo luz continua (3000 lux) a 32 °C, durante 6 días.

Transformación y Cocultivo:

Para la preparación de explantes, se seleccionaron embriones hinchados (callos derivados del escutelo) de las semillas de tipo salvaje apropiadas para la transformación y se transfirieron a un medio de infección líquido (R002) que contenía Agrobacterium tumefaciens se transformó con el plásmido incorporándose a las células vegetales durante 1.5 minutos y luego a las placas de cocultivo (R003). Las placas se han incubado durante 3 días a 25 °C en la oscuridad. Selección de tejido resistente

Selección:

Después de 3 días de cocultivo, se extrajeron los callos de las semillas, se lavaron varias veces con agua mQ estéril y una vez con agua mQ estéril que contenía 250 mg/l de cefotaxima y se transfirieron al medio de selección R004. La incubación se realizó bajo luz continua (3000 lux) a 32 °C, durante 2 semanas.

Aislamiento y regeneración de microcallos

Por medio de fórceps estériles, los microcallos se transfirieron a R005 y se incubaron bajo luz continua (3000 lux) a 32 °C, durante 1 semana. En lo sucesivo, la GFP usada como marcador de selección se comprobó en el cuarto oscuro. Los callos sanos positivos para GFP se transfirieron a R006 y luego se incubaron bajo luz continua (3000 lux) a 32 °C, durante 1 semana. Para la regeneración continua, los callos se transfirieron a R007 durante 3 semanas bajo luz continua (3000 lux) a 32 °C. Con fórceps estériles, se extrajeron plántulas sanas y se transfirieron a R008 durante 2 semanas bajo luz continua (3000 lux) a 32 °C antes de llevar las plántulas al invernadero.

Tabla 4. Composición de los medios R001 a R008.

Resultados:

El Agrobacterium tumefaciens mediada por la transformación de callos derivados de embriones inmaduros de arroz con las diferentes construcciones que contienen GRF5 conduce a un aumento significativo de la frecuencia promedio de transformación. Como control o como comparación, se ha usado la eficiencia de transformación observada para 28 otras construcciones seleccionadas al azar sin GRF5 que muestra una eficiencia de transformación promedio del 63 %. Para construcciones 'individuales', la eficiencia de transformación podría incrementarse en promedio desde 63 % a 78 %, para construcciones 'dobles' incluso desde 63 % a 84 % (Tabla 5).

Tabla 5. Frecuencia de transformación de experimentos independientes, ya sea con una única construcción con GRF5 o con GRF5 en una pila con otro gen XY en arroz. En total, 12 genes diferentes en la pila con GRF5 de Arabidopsis thaliana ("GRF5", secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 1, secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2) se han probado, por lo que 3 experimentos se han repetido dos veces (indicado por Rep01 y Rep02). Además, GRF5 de Sorghum bicolor ("GRF5-Sorghum", secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 17, secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18) se probó solo y en una pila. La frecuencia de transformación promedio se indica en negrita.

3. experimentos con zea mays

Construcciones usadas en el plásmido binario:

Los vectores binarios se produjeron mediante procedimientos de clonación estándar. Dentro del T-ADN de estos vectores, a) el ADNc que codifica AtGRF5 (SEQ ID NO: 1), b) el ADN sintético que codifica ZmGRF5 (versión A) (SEQ ID NO: 208), y c) el ADN sintético que codifica ZmGRF5 (versión B) SEQ ID NO: 210) se clonaron entre un promotor apropiado (por ejemplo, el promotor BdEF1) y un terminador, lo que garantiza suficientes niveles de expresión ectópica de las proteínas GRF5 en el maíz. Como control se ha usado una construcción que contiene el gen indicador tDT bajo el control del promotor 70S con el intrón ZmUbi.

Transformación:

La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens se ha llevado a cabo mediante el método estándar de transformación de monocotiledóneas mediante el uso de escutelo de embrión inmaduro (por ejemplo, el documento WO 95/06722).

Resultados:

Como se muestra en la figura 10, la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de embriones inmaduros con una construcción que contiene el GRF derivado de Arabidopsis thaliana conduce a un aumento significativo de la frecuencia de transformación en promedio, desde 8 % a 14 %. Por el contrario, el uso de ambas versiones de ZmGRF5 derivadas de diferentes genotipos Zea mays impulsaron la eficiencia de transformación mucho más fuerte. Para la versión A de ZmGRF5 la eficiencia aumenta desde 8 % a 52 %, y para la versión B de ZmGRF5 desde 8 % a 48 %.

4. Experimentos con Glycine max (soja)

Transformación de soja:

La transformación de Glycine max se realizó usando Agrobacterium rhizogenes para la entrega de T-ADN en las células del meristema axilar del epicótilo ubicadas en el nudo primario de las plántulas de soja del cultivar Jake (según Olhoft P.M., Bernal L.M., Grist L.B., Hill D.S., Mankin S.L., Shen Y., Kalogerakis M., Wiley H., Toren E., Song H.-S., Hillebrand H., and Jones T 2007, A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 43:536-549; US 2014237688, WO 2006024509, WO 2005121345).

Producción de plásmidos binarios:

Se produjeron tres plásmidos binarios siguiendo procedimientos de clonación estándar. El primer plásmido binario fue el plásmido de control usado para los experimentos (referido al control DsRed) y es el vector base usado para los otros vectores. Contiene dentro del T-ADN un gen DsRed que se usó para la puntuación fenotípica de células y tejidos vegetales transgénicos y el gen AtAHAS que se usó para la selección preferencial de células transgénicas. Ambos genes se clonaron con promotores y terminadores apropiados que aseguran una expresión ectópica suficiente para servir a los propósitos mencionados anteriormente. El segundo plásmido binario contiene el vector base con el ADNc que codifica AtGRF5 (SEQ ID NO. 2) clonado entre un promotor y un terminador apropiados que garanticen niveles de expresión ectópica suficientes de la proteína GRF5 en soja. El tercer plásmido binario contiene el vector base con el ADNc que codifica GmGRF5 (SEQ ID NO. 106) clonado entre un promotor y un terminador apropiados que aseguran niveles suficientes de expresión ectópica de la proteína GRF5 en soja.

Esterilización y germinación de semillas:

Se esterilizaron semillas de soja de la variedad cultivada 'Jake' en una cámara con cloro gaseoso producido mediante la adición de 3.5 ml de HCl 12N en 100 ml de lejía. Después de la esterilización, se sembraron aproximadamente 65 semillas en medio de germinación sólido (1X sales B5 y vitaminas, sacarosa al 2 %, agar Noble al 0.8 % (A5431 Sigma-Aldrich®); pH 5.8) en PlantCons™. Las plántulas se germinaron a la luz (150 jt tV 2) a 26 °C, durante 7 días y se usó como material de explante para la transformación.

Preparación de Agrobacterium:

Agrobacterium rhizogenes (WO 2006024509) se transformó con uno de los siguientes vectores que contenían: (1) marcador seleccionable pSU-PER:DsRed y pPcUBI:AHAS como control, o el vector de control más ya sea (2) pPcUbi-AtGRF5 o (3) pPcUBI-GmGRF5. A. rizogenes se cultivó y se volvió a suspender en 50 ml de medio líquido de inoculación (1/10a sales B5 (G768 Phytotech), sacarosa al 3 %, MES 20 mM, iX vitaminas de Gamborg, acetosiringona 200 ^j M, ácido giberélico 1.44 ^j M, cinetina 5.0 ^j M; pH 5.4.) en un tubo Falcon a un OD600 de 1.5. La suspensión de Agrobacterium luego se colocó en una placa petri profunda para recibir los explantes preparados.

Preparación y transformación de explantes:

Se prepararon explantes de plántulas a partir de plántulas de 8 días de edad mediante la eliminación de las raíces y la mayoría del hipocótilo, un cotiledón, el crecimiento del tejido axilar en el nódulo cotiledóneo y el epicótilo sobre el nódulo primario, incluidas todas las hojas preformadas. Después de preparar los explantes, se incubaron aproximadamente 45-50 explantes con la suspensión de Agrobacterium en la placa petri durante 30 minutos. Luego, los explantes se colocaron en cajas de Petri sobre un papel de filtro húmedo que contenía medio de cocultivo (1/10a Sales B5 (G768 Phytotech), sacarosa al 3 %, MES 20 mM, agar noble al 0.5 % (A5431 Sigma-Aldrich®), 1X vitaminas de Gamborg, acetosiringona 200 ^j M, ácido giberélico 1.44 ^j M, cinetina 5.0 ^j M, L-cisteína 4.1 mM, ditiotritol 0.5 mM, tiosulfato de sodio 0.5 mM; pH 5.4), y sellado en un recipiente durante 5 días a temperatura ambiente.

Desarrollo y selección de brotes:

Después de 5 días, los explantes se transfirieron a medio de selección (1X sales B5 y vitaminas (G398 Phytotech), sacarosa al 3 %, MES 3 mM, 6-bencil-aminopurina 1 ^j M, cinetina 5 ^j M, 250 mg/l de Timmentin STK, imazapir 3 ^j M, agar noble al 0.8 % (A5431 Sigma-Aldrich®); pH 5.6) cinco por placa y cultivadas a 26 °C. Los explantes tuvieron un crecimiento significativo en el meristemo axilar del nódulo primario después de 16 días de selección y primero se evaluó el desarrollo de brotes (regeneración). Después de 22 días de selección (el final de la selección), los explantes se retiraron de los medios sólidos y se colocaron en medios de cultivo Oasis® antes de la puntuación de (1) la calidad de la formación de brotes y (2) la fluorescencia DsRed en los brotes que se desarrollan en el nódulo primario.

Diseño experimental y resultados:

Se realizó un experimento entre cuatro investigadores y tres construcciones (Tabla 6). Los meristemos axilares del nódulo primario de soja se transformaron con el control DsRed, AtGRF5 y GmGRF5. En total, se transformaron y calificaron 524 explantes de plántulas después de 16 días de selección (21 días después de la transformación) y 22 días de selección (27 días después de la transformación). Después de 16 días de selección, los brotes crecían rápidamente en el nudo primario y eran una combinación de almohadillas de brotes pequeñas y compactas y brotes más grandes y alargados (Figura 11). La regeneración [(número de explantes con brotes)/explantes totales*100] en el tejido diana, el nódulo primario, estuvo entre 80-100 % para todas las construcciones y se fijó en 16 días en la selección. Entre los días 16 y 22, los brotes de los explantes continuaron creciendo rápidamente. Para ambos puntos de tiempo, los explantes se calificaron subjetivamente por la presencia de crecimiento de brotes alargados y saludables con una morfología ("buena") que predice la formación exitosa de una planta transgénica enraizada (Figura 12). Hubo un aumento en la formación de brotes "buenos" en los explantes transformados con las tres construcciones desde los dos puntos de tiempo, especialmente para los explantes transformados con AtGRF5 y GmGRF5. En las cuatro réplicas, los explantes transformados con cualquier forma de GRF5 tendieron a tener una formación de brotes más avanzada (brotes más grandes, más alargados) en comparación con el control DsRed (Figura 13).

Para obtener una medición temprana de las eficiencias de transformación, los explantes se puntuaron a los 16 y 22 días en la selección de la presencia o ausencia de brotes fluorescentes DsRed en el nudo primario, que se debe a las células transgénicas que expresan la proteína DsRed. La expresión de DsRed fue notablemente más intensa en las construcciones que contenían AtGRF5 o GmGRF5 que el control de DsRed en ambos puntos de tiempo; sin embargo, más aún a los 16 días de la selección (Figura 11). Los explantes que se caracterizaron por tener una morfología de brotes "buena" generalmente tenían brotes que tenían expresión de DsRed (Figura 11). El porcentaje de explantes con brotes que expresan DsRed fue significativamente mayor (a a = 0.05) en los explantes que se transformaron con ya sea AtGRF5 o GmGRF5 en comparación con los explantes transformados con el control DsRed en ambos puntos de tiempo (Tabla 6; Figura 14). De los explantes transformados con la construcción de control DsRed, el 54.5 % mostró brotes que expresaban DsRed en comparación con el 70.2 % y el 74.6 % para AtGRF5 y GmGRF5, respectivamente, después de 22 días de selección (Tabla 6). Los datos indican que 27 días después de la transformación, los explantes de soja transformados con ya sea AtGRF5 o GmGRF5 tienen significativamente más brotes transgénicos que se regeneran en el nudo primario que los explantes no transformados con ninguna de las formas de GRF5.

Tabla 6. La regeneración de los brotes transformados aumentó significativamente en los explantes transformados con ya sea AtGRF5 o GmGRF5 a los 16 y 22 días de la selección. Se muestran la media y el rango en la regeneración y los brotes fluorescentes DsRed. Las construcciones que fueron significativamente diferentes (en a=0.05) se siguen con letras diferentes; 1= [(número de explantes con brotes en el nudo primario/número total {n} de explantes inoculados) * 100]; 2= [(número de explantes con brotes DsRed en el nudo primario/número total {n} de explantes inoculados * 100

5. Experimentos con Brassica napus (Canola)

Transformación de canola:

La transformación de Brassica napus se realizó usando Agrobacterium rhizogenes para la entrega de T-ADN en segmentos de hipocótilo de plántulas de B. napus del genotipo BNS3.

Esterilización y germinación de semillas:

Las semillas se esterilizaron superficialmente colocando 200-300 semillas durante 2 minutos en etanol al 70 % en un tubo Falcon de 50 mL. Después de agitar suavemente durante 2 minutos, se eliminó el etanol y se agregaron de 40 a 50 ml de lejía, Clorox al 30 % con 1 gota de Tween. Las semillas se incubaron durante 10 minutos con mezclado ocasional. Se eliminó el líquido, luego se enjuagaron las semillas con agua estéril tres veces antes de colocar las semillas en medio de germinación (1/2x sales MS/vitaminas, 10 g l-1 de sacarosa, Phyto Agar 7g l-1; pH 5.8) en cajas PlantCon. Las cajas se colocaron en una cámara durante 4 a 5 días en la oscuridad a 23 °C.

Preparación de Agrobacterium:

Agrobacterium rhizogenes se transformó con uno de los siguientes vectores: (1) marcador seleccionable pSU-PER:DsRed y PcUBI:AHAS como control, o el vector de control más ya sea (2) PcUbi-AtGRF5 o (3) PcUBI-BnGRF5 (SEQ ID NO. 108). Agrobacterium rhizogenes se cultivó a OD600 de 1.0 y posteriormente diluido a 0.1 con medio líquido de infección (1x sales MS/vitaminas, 30 gl-1 sacarosa; pH 5.8). La suspensión de Agrobacterium luego se colocó en un plato para recibir explantes de hipocótilo preparados.

Preparación y transformación de explantes:

Se prepararon explantes de hipocótilo a partir de plántulas etioladas de cuatro a cinco días sacándolas de la caja de germinación y colocándolas en papel de filtro estéril humedecido con medio de infección sin Agrobacterium para mantener las plántulas turgentes. Se prepararon segmentos de hipocótilo de 7 a 10 mm de longitud después de eliminar la raíz, el cotiledón y el epicótilo. Después del corte, el explante se sumergió en la suspensión de Agrobacterium, se secó en papel de filtro seco y estéril y finalmente se colocó en papel de filtro encima del medio de cocultivo (1x sales MS/vitaminas, 30 g l-1 de sacarosa, 0.6 g l-1 de MES, 18 g l-1 de manitol, 7 g l-1 de Fito Agar, 1 mg l-1 de 2,4-D, 100 mg l-1 de acetosiringona, 200 mg l-1 de L-cisteína; pH 5.6) en placas. Una vez que se sembraron ~50 explantes, las placas se sellaron con cinta microporosa y se cultivaron a la luz a 23 °C con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad durante 3 días.

Desarrollo de callos e iniciación de brotes:

Después de 3 días, todos los explantes se transfirieron al medio de recuperación (1x sales MS/vitaminas, 30 g l-1 de sacarosa, 0.6 g l-1 de MES, 18 g l-1 de manitol, 7 g l-1 de Fito Agar, 1 mg l-1 de 2,4-D, 300 mg l-1 de timentina; pH 5.6), sellado con cinta de microporos y cultivado a 23 °C, durante 7 días. Los explantes se transfirieron al medio de selección #1 (1x sales MS/vitaminas, 30 g l-1 de sacarosa, 0.5 g l-1 de MES, 7 g l-1 de Fito agar, 3 mg l-1 de BAP, 0.1 mg l-1 de Na A, 0.1 mg l-1 GA3, 2.5 mg l-1 AgNO₃, imazetapir 100 nM, timentina 300 mg l-1; pH 5.8) después de una semana, y se cultivaron durante 14 días a 23 °C bajo un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Después de dos semanas de selección, los explantes se transfirieron a medio 2 de selección (1x sales MS/vitaminas, 30 g l-1 de sacarosa, 0.5 g l-1 MES, 7 g l-1 de Fitoagar, 0.5 mg l-1 de BAP, 0.1 mg l-1 de GA3, 2.5 mg l-1 de AgNO₃, imazetapir 100 nM, 300 mg l-1 de timentina; pH 5.8).

Diseño experimental y resultados:

Se realizaron cinco experimentos a lo largo del tiempo entre 3 investigadores con un mínimo de una réplica por investigador (Tabla Canola-1). En el experimento 1, los hipocótilos de Brassica napus se transformaron con construcciones de control DsRed y BnGRF5 solo para el experimento 1; en los otros experimentos, los explantes se transformaron con construcciones de control DsRed, AtGRF5 y BnGRF5. En total, se inocularon 3,156 explantes y se puntuaron para fluorescencia DsRed después de 16 a 22 días. En este momento, los explantes estaban desarrollando callos con rapidez, especialmente en los extremos cortados del hipocótilo. Los explantes se puntuaron según la presencia o ausencia de fluorescencia DsRed en los explantes, de forma independiente del tamaño, la intensidad y la frecuencia en un único explante. La frecuencia de los sectores que expresan DsRed es un indicador temprano de la eficiencia de transformación para un tratamiento.

La expresión de DsRed fue notablemente más intensa en las construcciones que contenían AtGRF5 o BnGRF5 que en el control DsRed (Figura 15). El porcentaje de explantes con brotes que expresaban DsRed fue significativamente mayor en los explantes que se transformaron con ya sea AtGRF5 o BnGRF5 que en comparación con los explantes transformados con el control DsRed (Tabla 7; Figura 16). De los explantes transformados con la construcción de control DsRed, el 20.1 % mostró brotes que expresaban DsRed en comparación con el 56.6 % y el 58.5 % para AtGRF5 y GmGRF5, respectivamente. Los datos indican que a los 21 días después de la transformación, los explantes B. napus transformados con ya sea AtGRF5 o BnGRF5 tienen casi 3 veces más sectores de callos transgénicos que los explantes no transformados con ninguna de las formas de GRF5 (a = 0.05 estadísticamente significativo). No se detectaron diferencias significativas entre los investigadores y los experimentos entre los tratamientos (construcciones).

Tabla 7. El callo transformado aumentó significativamente en los explantes transformados con AtGRF5 o BnGRF521 días después de la inoculación. Se muestran la media y el intervalo en la regeneración y el callo fluorescente DsRed. Las construcciones que fueron significativamente diferentes (en a=0.05) se siguen con letras diferentes; 1= [(número de explantes con callo DsRed/número total {n} de explantes inoculados) * 100].

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método de transformación de una célula vegetal, que comprende las etapas

(a1) introducir en una célula vegetal en paralelo o secuencialmente

1. al menos una secuencia de nucleótidos de interés; y

ii. un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 o polipéptido(s) de g RF5; o

(a2) introducir en una célula vegetal al menos una secuencia de nucleótidos de interés; e inducir en dicha célula vegetal en paralelo o secuencialmente un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5; y

(b) cultivar la célula vegetal de (a1) o (a2) o una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a1) o (a2) en condiciones en las que en la célula vegetal el polipéptido de GRF5 se expresa a partir del casete de expresión, el polipéptido de GRF5 se traduce a partir del ARNm introducido, el polipéptido de GRF5 se expresa potenciado a partir del gen endógeno, o está(n) presente(s) el(los) polipéptido(s) de Gr F5,

en el que el polipéptido de GRF5 comprende un dominio de PFAM, PF08880 y un dominio de PFAM, PF08879.

2. Un método de modificación del genoma de una célula vegetal, que comprende las etapas

(a1) introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 o polipéptido(s) de GRF5; o

(a2) inducir en una célula vegetal un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5, en el que el polipéptido de GRF5 comprende un dominio de PFAM, PF08880 y un dominio de PFAM, PF08879; y

(b) cultivar la célula vegetal de (a1) o (a2) o una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a1) o (a2) en condiciones en las que en la célula vegetal el polipéptido de GRF5 se expresa a partir del casete de expresión, el polipéptido de GRF5 se traduce a partir del ARNm introducido, el polipéptido de GRF5 se expresa potenciado a partir del gen endógeno, o está(n) presente(s) el(los) polipéptido(s) de GRF5;

(c) modificar el genoma de la célula vegetal de (b) mediante una enzima inductora de rotura de ADN bicatenario (DSB) que reconoce preferiblemente un sitio predeterminado en el genoma de dicha célula, y opcionalmente mediante una molécula reparadora de ácido nucleico,

en el que la modificación de dicho genoma en dicho sitio predeterminado se selecciona de

i. un reemplazo de al menos un nucleótido;

ii. una deleción de al menos un nucleótido;

iii. una inserción de al menos un nucleótido; o

v. cualquier combinación de i. - iii.; y

en el que la etapa (c) se realiza simultáneamente con la etapa (a1)/(a2) y/o (b), antes de la etapa (a1)/(a2), entre la etapa (a1)/(a2) y (b) o después de la etapa (b).

3. Un método de producción de una planta transgénica, que comprende las etapas

(a) transformar una célula vegetal según el método de la reivindicación 1, y

(b) regenerar a partir de la célula vegetal de (a) o a partir de una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a) una planta que comprende al menos una célula que comprende la al menos una secuencia de nucleótidos de interés como transgén.

4. Un método de producción de una planta genéticamente modificada, que comprende las etapas

(a) modificar el genoma de una célula vegetal según el método de la reivindicación 2, y

(b) regenerar a partir de la célula vegetal de (a) o a partir de una célula vegetal derivada de la célula vegetal de (a) una planta que comprende en al menos una célula la modificación del genoma.

5. Un método de producción de un embrión de planta haploide, que comprende las etapas

(a1) introducir en un gametofito masculino inmaduro o una microspora un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 o polipéptido(s) de GRF5; o

(a2) inducir en un gametofito masculino inmaduro o una microspora un nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5;

en el que el polipéptido de GRF5 comprende un dominio de PFAM, PF08880 y un dominio de PFAM, PF08879; y (b) cultivar el gametofito masculino inmaduro o una microspora de (a) en condiciones en las que en el gametofito masculino inmaduro o la microspora el polipéptido de GRF5 se expresa a partir del casete de expresión, el polipéptido de GRF5 se traduce a partir del ARNm introducido, el polipéptido de GRF5 se expresa potenciado a partir del gen endógeno o está(n) presente(s) el(los) polipéptido(s) de GRF5; y

(c) seleccionar el embrión vegetal haploide derivado del gametofito masculino inmaduro o la microspora de la etapa (b).

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio de PFAM, PF08880 encuentra una coincidencia de al menos 90 % de cobertura en o cerca del extremo N del polipéptido de GRF5 y el dominio de PFAM, PF08879 encuentra una coincidencia de al menos 90 % ubicado en el extremo C del dominio de PFAM, PF08880 en el polipéptido de GRF5.

7. El método de la reivindicación 6, en el que ambos tramos de aminoácidos coincidentes están ubicados en la mitad N-terminal del polipéptido de GRF5, preferiblemente el dominio de PFAM, PF08880 coincidente de tramos de aminoácidos está ubicado en el cuarto N-terminal del polipéptido de GRF5.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el polipéptido de GRF5 comprende el motivo [DHPLHEHPHGHRHCHRHRHTHDHGHKHKHW HRHCHSAHRKHEDHAHYHHPHDHSHKHYHCHEHKR]-[H]-[M]-[H]-[R]-[G]-[RK]-[N]-[R] (SEQ ID NO: 177) con un número máximo de tres apareamientos erróneos, en el que preferiblemente el motivo consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176, y/o en el que preferiblemente el motivo contiene una subregión del dominio de PFAM, PF08879 que coincide con el tramo de aminoácidos.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polipéptido de GRF5 comprende

(i) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 o 209; o

(ii) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia que es al menos un 70 % idéntica al aminoácido de (i).

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido de GRF5 comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 105, 107, 109, 111, 207, 208 o 210;

(ii) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de (i);

(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido codificado por (i) o (ii) dentro del alcance de la degeneración del código genético;

(iv) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de (i), (ii) o (iii); o

(v) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de (iv) en condiciones estrictas.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la introducción en una célula vegetal del casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5 da como resultado una integración estable del mismo en el genoma de la célula vegetal, o en el que la introducción en una célula vegetal del casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de GRF5, ARNm que codifica un polipéptido de GRF5 o polipéptido(s) de GRF5 o que induce en una célula vegetal el nivel de expresión potenciado de un gen endógeno que codifica un polipéptido de GRF5 da como resultado una aparición transitoria de polipéptido(s) de GRF5 en la célula vegetal o en una célula de su progenie.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido de GRF5 está en enlace operativo con al menos una secuencia reguladora apropiada para la expresión del polipéptido de GRF5 en una célula vegetal.

13. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula vegetal de la etapa (a1) o (a2) es una célula de un tejido somático, un tejido calloso, un tejido meristemático o un tejido embrionario, o un protoplasto.