CN1212399C - 用于生产口蹄疫疫苗的山莴苣叶绿体转化植物的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产口蹄疫多肽疫苗的山莴苣叶绿体转基因植物获得的方法。该方法包括：口蹄疫多肽疫苗基因序列及其合成方法，如合成的SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示序列，将该序列与绿色荧光蛋白基因串联，得到融合的疫苗基因。该融合疫苗基因连接于莴苣叶绿体psbA基因启动子下游从而构建为叶绿体表达框。同时将该疫苗基因构建到SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列之间，构建成山莴苣叶绿体定点转化载体。用该转化载体转化山莴苣，并获得表达口蹄疫多肽疫苗的山莴苣叶绿体转基因植物。

Description

用于生产口蹄疫疫苗的山莴苣叶绿体 转化植物的获得方法

发明领域

本发明涉及一种生产口蹄疫多肽疫苗的山莴苣叶绿体转基因植物的获得方法。具体的说，该方法包括：合成口蹄疫多肽疫苗基因序列；将该序列与报告基因或具有强免疫源性蛋白的基因串联，使之成为融合疫苗基因；构建用于定点转化的莴苣叶绿体相关DNA序列；用此序列构建含口蹄疫多肽疫苗基因的山莴苣叶绿体定点转化载体；用该转化载体转化山莴苣，获得表达口蹄疫多肽疫苗的山莴苣叶绿体转基因植物。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、烈性传染病，以直接接触方式传染，危害对象是猪、牛、羊等家畜和几十种其它偶蹄类动物，其传染速度极快且易引发大流行，对畜牧业的危害极大，已被国际动物卫生法典列为18种A类疫病之首。由于口蹄疫一旦发生将直接影响一个国家或地区的畜产品的出口贸易和国际声誉，为此一些国家甚至采取将病畜销毁等强制性措施来阻止和防止疫情的扩大。预防口蹄疫是仍是防治口蹄疫的最有效方法，常用方法是注射口蹄疫疫苗。但口蹄疫有较多的血清免疫类型，且各型间的疫苗不能提供交叉保护，所以在预防口蹄疫发生时，多用与当地流行的病毒型相同的口蹄疫疫苗。如何能提供足够数量有效的疫苗，并能有效地进行免疫，是预防口蹄疫的关键。

常用的口蹄疫疫苗是利用BHK(鼠肾细胞系)传代细胞系方法来生产灭活疫苗，这类疫苗免疫效果好，但生产涉及动物细胞培养技术，不但生产投入大、成本高，且动物细胞培养易污染，所以只能在少数设备完备的实验室或生物产品工厂才有能力生产，另外在这种疫苗生产中要大量繁殖病毒，而该病毒又能通过空气传播，所以一旦失控将造成严重后果。为此需要大力开发安全性好的其它类型疫苗。现在研究较多的是合成肽疫苗、基因工程疫苗等。

合成肽是人工合成的具有保护作用的类似于天然抗原决定的小肽，由这种小肽制成的疫苗安全性好，然而合成的费用仍较高；基因工程疫苗则以病毒颗粒中的具有免疫源性亚单位蛋白或多肽的DNA序列作为目的基因，通过原核表达系统表达疫苗组份。由于这种方法生产疫苗不涉及病毒本身，所以的安全性好，不过它同合成肽疫苗一样仍有成本高的缺点，其原因是亚单位蛋白或多肽的免疫源性比普通灭活苗低，故需要大量注射从而增加了应用成本。

为降低基因工程疫苗的使用成本，利用植物作为生物反应器表达和生产疫苗是一个较好的选择，这方法的生产条件要求远比动物细胞培养低，只要有土地就能大规模生产；由于植物的内热源物质少，所以从植物中提取疫苗的纯化成本也很低。值得注意的是第一个利用转基因植物表达的病毒疫苗并使免疫动物全部获得保护的，正是口蹄疫方面的工作。另外，目前正在探索食用疫苗的应用，若这一设想能在口蹄疫疫苗上得以实现不但可能进一步降低疫苗成本，也利于运输和应用，对边远地区的口蹄疫防治工作极为有利。

现有最常用的植物核表达体系表达水平低，如用核基因转化获得转疫苗基因的植物中最高的疫苗蛋白量仅为总蛋白的0.37％，近期发展起来的高等植物叶绿体转化则为这一工作提供了新的途径，利用植物的叶绿体转化可克服向核基因组中转化的很多不足并具有独特的优越性。如：(1)高效表达：由于叶绿体基因组的拷贝数非常大(例如每个成熟叶肉细胞中可达10000个拷贝)，整合在其中的外源基因也有可能以高拷贝数存在，这就必然为外源基因的高效表达提供了条件；(2)原核基因无需修饰改造；(3)安全性好：叶绿体多为母系遗传，从而保证了基因工程的安全性，特别是避免了外源基因向杂草或其他非目的植物的传播。(4)叶绿体基因组小，便于遗传操作，可以实现定点整合，消除了核转化中存在的“位置效应”，并减少对植物的生长发育影响。

由于叶绿体可超量表达外源蛋白，因此，植物的叶绿体有可能成为工业用酶或药用蛋白的“生物反应器”，现有工作表明通过叶绿体表达外源基因，其表达量通常是核表达的100以上，目前工作中最高表达量已达总可溶蛋白的46％，这充分表明利用叶绿体转化技术生产蛋白质药物或疫苗的可行性。本发明所涉及工作即是利用一种饲料植物一山莴苣的叶绿体定点转化和表达技术获得表达口蹄疫疫苗的饲料植物。

发明描述

本发明涉及一种用于生产口蹄疫多肽疫苗的饲料植物山莴苣叶绿体转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)合成口蹄疫多肽疫苗基因序列，使之与报告基因或具有强免疫源性蛋白的基因串联得到融合的疫苗基因，该融合的疫苗基因连接于莴苣叶绿体psbA基因启动子下游从而构建为叶绿体表达框；

(2)构建用于向山莴苣叶绿体中定点转化外源基因的莴苣叶绿体相关DNA序列；

(3)将步骤(2)构建出来的DNA序列与步骤(1)合成的融合的口蹄疫多肽疫苗基因重组，使融合的疫苗基因序列位于莴苣叶绿体相关DNA序列的中间；

(4)将步骤(3)中重组得到的DNA片段插入到克隆载体的多克隆位点上，作为口蹄疫多肽疫苗基因山莴苣叶绿体定点转化载体；和

(5)用得到的转化载体转化山莴苣植物细胞，获得叶绿体表达多肽疫苗的转基因植物。

本发明还涉及一种向山莴苣叶绿体定点转化外源DNA的方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建用于向山莴苣叶绿体定点转化外源基因的莴苣叶绿体相关DNA片段；

(2)将步骤(1)构建出的DNA片段与外源基因重组，使外源基因序列位于莴苣叶绿体相关DNA序列的中间；

(3)将步骤(2)重组得到的DNA片段插入到克隆载体的多克隆位点上，作为外源基因山莴苣叶绿体定点转化载体；和

(4)用步骤(3)得到的转化载体转化山莴苣，使外源基因在山莴苣叶绿体中表达。

具体地讲，本发明所述的编码口蹄疫多肽疫苗基因含有SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示序列，其获得是将口蹄疫病毒蛋白中有免疫源性部分的序列从新设计，使其适合于原核表达，然后进行人工合成。发明中所提供的口蹄疫免疫源性的氨基酸序列，来自国内O型58和86株系病毒口蹄疫VP1蛋白上第140-160和200-213氨基酸序列，这两段序列是公认具有免疫源性的病毒组份，是经过比较优选出来的。同时，其DNA序列是参考大肠杆菌偏爱的密码子重新设计并合成的。大肠杆菌密码子使用偏爱情况的数据可以从因特网相关网站上获得。

本发明中还提供了一种口蹄疫多肽序列的拼接方式，即发明中DNA片段上编码多肽序列的拼接有两种方式，一为O58株系的第140-160氨基酸接上O58株系第200-213氨基酸，再串联上O86株系的第140-160氨基酸和第200-213氨基酸的肽链；另一为O86株系的第140-160氨基酸接上第200-213氨基酸，再串联上O58株系的第140-160氨基酸接和第200-213氨基酸的肽链。

由于上述所述的多肽DNA序列编码蛋白分子量小，不利于积累，所以本发明中还将上述多肽的DNA序列再与其它分子量较大的蛋白串联，本发明中采用与绿色荧光蛋白基因的DNA序列串联，从而构建为具免疫源性的多肽一绿色荧光蛋白的融合蛋白形式的疫苗基因。虽然如此，本发明中与口蹄疫疫苗基因串联的基因也不限于绿色荧光蛋白基因，还可以使用其它形式串联的基因，如口蹄疫病毒VP1蛋白基因序列或其它有同样功能的多肽片段，特别是一些有强免疫源性的蛋白基因，如乙肝核心蛋白基因等。

此外，本发明还涉及一种用于向山莴苣叶绿体中定点转化外源DNA的序列，它具有SEQ ID NO：3所示的序列或其不小于1kb的片段，以及SEQ ID NO：4所示的序列或其不小于1kb的片段，在叶绿体定点转化载体上应含有上述两个定位片段的序列，从而实现山莴苣叶绿体定点转化。定位片段是用基因克隆技术从与山莴苣同科的莴苣叶绿体基因组中克隆出来的两段相邻的DNA片段(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，将其构建在载体中使外源基因序列，即口蹄疫多肽疫苗基因序列位于两个片段的中间，当载体导入叶绿体时，这两DNA片段能以同源重组形式将片段间的序列整合到叶绿体基因组的序列上。在本发明中提供的适合整合位点是山莴苣叶绿体基因组中的trnH基因和psbA基因之间的间隔区，即SEQ ID NO：3的3’端到SEQ ID NO：4(图4)的5’端区域。第一片段有1715个核甘酸，包含rpl2基因、trnH及psbA的5’非翻译区和终止序列；第二个片段共有2355个核甘酸，包含部分psbA基因、trnK和MatK基因的部分序列。以此为定位片段构建的山莴苣叶绿体定点转化载体，可将口蹄疫疫苗基因定点插入到山莴苣叶绿体基因组的trnH基因和psbA基因之间的间隔区，即山莴苣叶绿体基因组中第一片段的3’端至第二片段的5’端之间。这两个片段的获得可利用已知烟草叶绿体DNA序列设计引物，用PCR的方法从山莴苣叶绿体基因组中分离相应的DNA片段。也可以从根据本发明提供的上述序列设计引物进行扩增。

trnH7基因和psbA基因之间的间隔区可以保证这一转化过程不引起原有叶绿体基因组重要序列的丢失，或干扰临近基因的正常功能，整合位点是在叶绿体基因组的非功能区或功能不重要区内。所谓基因组的非功能区是指植物基因组中不具编码蛋白质、调控基因复制、转录、翻译等一切生化反应功能的核苷酸序列，如基因之间的间隔区、假基因序列区、转录间隔区等。而功能不重要区是指植物基因组中的核苷酸序列，它所表达的产物在植物的正常生长发育和生理代谢中不起重要的作用，缺失后不影响植物的正常发育与代谢活动。

本发明所述的山莴苣叶绿体转化载体是在普通克隆载体基础上构建的，其中所述的普通克隆载体可以是现有技术中已知的任何一种克隆载体，例如pBluescript系列或pUC18系列等。

由于用于本发明的山莴苣叶绿体定点转化载体上口蹄疫疫苗基因将在叶绿体中表达，所以基因的上游连接有叶绿体启动功能的叶绿体启动子，构成口蹄疫疫苗基因的叶绿体表达框才能在叶绿体中表达，在本发明所使用的启动子为来自莴苣叶绿体psbA基因的启动子PpsbA，终止子为莴苣psbA基因的终止子TpsbA。虽然如此，其它具有相同作用的叶绿体启动子和终止子也适用于本发明中，如来自烟草的相应叶绿体基因启动子和终止子。上述疫苗基因的叶绿体表达框与一个同样由叶绿体启动子启动表达的筛选标记基因叶绿体表达框一起作为本发明中山莴苣叶绿体的定点转化载体上的外源基因。它们的插入位点为trnH基因和psbA基因之间的间隔区。该载体应用的主要目的是建立口蹄疫疫苗的山莴苣高效的叶绿体表达体系，包括转化方法、获得同质化转化体的步骤，特别是融合基因中GFP基因产物在长波紫外下会激发绿色荧光，为检测和分析疫苗基因的表达十分有利。

在载体构建方面，要具备的筛选标记基因以便于转化个体的筛选。本发明所使用的是抗生素标记基因，即壮观霉素基因。但也可应用其它可用于植物叶绿体转化选择的标记基因，特别是甜菜碱醛脱氢酶基因，即BADH，这时在培养基上加入甜菜碱醛以筛选转化体。

在载体的导入方面，常用的基因枪法、微束激光穿刺法、原生质体融合法均适合于本发明所述的山莴苣叶绿体转化。

在叶绿体转化个体的筛选方面，本发明使用了壮观霉素筛选标记基因，只要在培养基中加入适当浓度的壮观霉素便可得到转化个体。本发明所谓适当的抗生素浓度为15-100mg/L，若采用BADH基因作为转化载体上的筛选标记时，培养基中的甜菜碱醛浓度在5-10mg/L。

本发明提供方法可以将口蹄疫疫苗基因导入山莴苣叶绿体基因组中，并将转化植株用于口蹄疫疫苗的生产，与目前使用的口蹄疫疫苗生产方法相比，它具有如下的优点：整个生产过程通过种植转化山莴苣即可，不涉及到病毒的培养和繁殖，具有极高的安全性；表达效率高，可比植物的核基因转化的表达效率提高至少10倍，甚至高出100倍；使生产成本大大降低。另外山莴苣本身是一种极好的饲料，因此，本发明提供的表达口蹄疫疫苗的山莴苣植株为全新的口服疫苗提供基础，对其预防有重要意义。

附图说明

图1.口蹄疫疫苗基因的莴苣叶绿体定点转化和表达载体构建图。图中SalI和NcoI酶切点间为多肽疫苗融合基因片段，其中GFP为绿色荧光蛋白基因序列，F为合成的多肽疫苗基因片段。

图2.合成的寡核苷酸片段的拼接示意图

实施例1.口蹄疫多肽疫苗基因制备

1.序列设计

口蹄疫多肽疫苗基因序列主要是采用国内病毒株系的序列，并根据将来基因表达的受体对密码子偏爱的情况进行了重新设计。

所采用的口蹄疫多肽疫苗基因序列从国际基因数据库(GeneBank)中获得，主要选取来自中国的O型病毒的O58和O86株系，利用目前公认具有疫苗作用的编码VP1蛋白第140-160氨基酸的20个氨基酸多肽(以下称20肽)和第200-213氨基酸的14个氨基酸多肽(以下称14肽)序列，作为多肽疫苗基因中起免疫源作用的多肽序列。

由于合成的多肽疫苗基因将主要用于原核及原核性的叶绿体中表达，所以在设计时尽可能采用原核性偏爱密码子代替原有的密码子。替换主要是参考大肠杆菌对密码子偏爱情况确定的

为尽可能使用原核性密码子，在确定最终多肽疫苗基因序列时主要根据用作疫苗成分的病毒VP1蛋白上的氨基酸序列，直接采用大肠杆菌偏爱密码子。比如亮氨酸，就直接用大肠杆菌中利用率最高的CTG作为相应的核苷酸序列。

虽然设计好的多肽片段的核苷酸序列不是很长，但仍很难直接合成全长序列，故将其分段合成，上、下链分成几段合成，上链为4段，编码的分别为病毒O58株系VP1蛋上有免疫源性的的20肽、14肽和O86株系的20肽和14肽(说明见前文)，其核苷酸长度为60bp和42bp两种，上链5’端全部磷酸化；下链为了合成的方便，设计了多个链，其中不仅有与上链完全对应片段，而且还有与同株系或不同株系不同上链有互补关系的片段。另外还根据多肽疫苗基因的序列设计了引物，用以扩增合成好的片段，而且在引物上加上了限制性内切酶的识别序列。设计好的多肽基因及引物交由DNA合成公司合成。

其具体序列如下表1所示：

表1.设计的寡核苷酸序列

编号	序列
		A	5’gTg ACC AAA gTg AgA ggC gAT CTg Cag gTg CTg gCg CAg AAAgCg gCA CgC TCT CTg CCg(SEQ ID NO：15)
B	5’AgA CAT AAA Cag AAg ATT gTg gCA CCA ggC AAA CgC CTg CTg(SEQ ID NO：16)
		C	5’gTg AgC AAC gTg AgA ggC gAT CTg CgA gTg CTg gCg CAg AAAgCg gAA AgA gCg CTg CCg(SEQ ID NO：17)
D	5’AgA CAT AAA Cag AAg ATT gTg gCA CCA gCA AAA CAA CTg CTg(SEQ ID NO：18)
		1	5’gAA TTC TAA TAg CTC gAg gTC gAC Aag CTT ACC ATg(SEQ IDNO：19)
2	5’TTT ggT CAC CAT ggT AAg CTT gTC Gac(SEQ ID NO：20)
		3	5’CgC TTT CTg CgC CAg CAC CTg CAg ATC gCC TCT CAC(SEQ IDNO：21)
4	5’Tgg TgC CAC AAT CTT CTg TTT ATg TCT Cgg Cag AgA gCg TgC(SEQ ID NO：22)
		5	5’gTT gCT CAC CAg CAg gCg TTT gCC(SEQ ID NO：23)
6	5’CTC gAg CTA TTA gAA TTC CAg CAg gCg TTT gCC(SEQ IDNO：24)
		7	5’gTT gCT CAC CAT ggT AAg CTT gTC gAC(SEQ ID NO：25)
8	5’Tgg TgC CAC AAT CTT CTg TTT ATg TCT Cgg Cag CgC TCT TTC(SEQ ID NO：26)
		9	5’TTT ggT CAC CAg CAg TTg TTT TgC(SEQ ID NO：27)
10	5’CTC gAg CTA TTA gAA TTC CAg CAg TTg TTT TgC(SEQ IDNO：28)

2.片段拼接

合成的寡核苷酸片段用双蒸水溶解，其中用于合成基因的均稀释到约800ng/μl，用作引物的合成片段溶解并稀释到80ng/nl。然后按图2所示方式进行拼接。

在图2中，片段A和B分别代表O58株系的20肽和14肽的上链，C和D分别代表O86的20肽和14肽的上链寡核苷酸片段，1代表的是一个人工设计的上链寡核苷酸片段，主要是提供酶切序列和作引物用，同样它的5’端磷酸化，2、3、4、5、6、7、8、9、10代表的分别是合成的下链寡核苷酸片段，其中有些链能同时与不同的上链相互补，以便用于拼接不同株系的上链，片段1、6、10还将用作引物来扩增合成链。

按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接操作：

分别将片段A、2、3为一组；片段B、4、5为一组；片段C、D、3、8、10、1为一组，按等摩尔混合。混合好的片段溶液10μl放于已升温到95℃的水浴锅中，断电后自然冷却10小时。

分别将片段C、7、3为一组，片段D、8、9为一组，片段A、B、3、4、6、1为一组按等摩尔混合。混合好的片段溶液10μl于已升温到95℃的水浴锅中，断电后自然冷却10小时。

按O86(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)多肽顺序的基因合成操作同理。

3.片段连接

按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接操作的三组拼接产物各取适量混合，取5μl加入等量的连接缓冲液I(大连宝生生物公司产品)，于16℃连接16小时以上。70℃灭活10分钟后，用TE缓冲液稀释100倍，-20℃保存。

按O86(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接产物处理同上。

连接后的片段实际上是一环形DNA链，即按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段。

第一种情况的合成链，即按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段，由于片段上链寡核苷酸链5’端磷酸化，所以连接成一完整的环形DNA单链。下链在寡核苷片段间仍是缺口，但不影响利用片段1、10作为引物，通过PCR可对其进行的扩增。第二种情况的合成方式相似。

4.合成片段的PCR扩增

利用引物序列对上述连接产物进行PCR扩增，PCR在PE480 PCR仪上进行。

PCR反应体系：10XPCR缓冲液5μl，10mM dNTP 4μl，Pfu DNA聚合酶2U，引物1(80ng/μl)2μl，引物2(80ng/μl)2μl，连接产物1μl，水到总体积50μl，上述成份均加入到0.5mL PCR管，混均后覆盖一层无菌石蜡油(20-30μl)。

其中扩增按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段用片段1、10作为引物，扩增按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段用片段1、6作为引物。

PCR程序为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟，65℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，循环30次。反应结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。其余产物利用酚/氯仿抽提法纯化。纯化片段保存。

实施例2.口蹄疫多肽疫苗融合基因的莴苣叶绿体定点表达和转化载体构建

1.莴苣叶绿体DNA提取

叶用莴苣(Lactuca sativa)，其品种为波士顿及奶油生菜，

采用高离子强度、低pH方法提取油菜叶绿体DNA。

取5g莴苣的幼嫩叶片，加入40ml 4℃预冷的Buffer A(25mM EDTA，1.25M NaCl，0.25M抗坏血酸，pH3.6)，高速匀浆数次，至成糊状。浆液用4层医用纱布滤入4个50ml离心管中。4℃800g离心8min，弃上清，加入(以下均为每管加入的量)30ml预冷的Buffer B(50mMTris.HCl，25mM EDTA，1.25M NaCl，10mMβ-巯基乙醇，pH8.0)  重悬叶绿体。4℃ 800g离心8min，回收叶绿体颗粒，弃上清，加入30ml预冷的Buffer C(150mM NaCl，100mM EDTA，pH8.0)重悬沉淀。4℃1000g离心8min，回收叶绿体，弃上清，加入2ml Buffer D(50mMTris.Cl，25mM EDTA，pH8.0)  重悬沉淀，加入0.5ml 10％ Sarcosyl(Buffer配制)和20μl Proteinase K(10mg/ml)，于45℃轻摇4-6h。用等体积Tris饱和酚抽提数次，再用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次，至界面干净。上清中加1/10体积3mmol/LNaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜。4℃ 12000g离心15min，回收DNA，溶于500μl TE(pH8.0)中，加入5μl 10mg/ml的RNase A，37℃保温1h。用酚、酚/氯仿抽提至界面干净，上清中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h以上。4℃ 15000g离心20min，回收DNA。70％乙醇洗涤DNA，真空抽干，溶于50μl TE(pH8.0)放置于-20℃保存待用。

2.莴苣叶绿体DNA片段分离及克隆

用下列引物进行扩增如下：

P1：ATGCCCTACCTTTGAGTGC(SEQ ID NO：5)

P2：GGAGTCGACTTTCCTCTTATTGTAATTGTATAGG(SEQ ID NO：6)

P3：AGAGTCGACAGAGGGAAAGCCGTGTGC(SEQ ID NO：7)

P4：GTGGATCCTTGGGAAAAGAATATATAAACCTC(SEQ ID NO：8)

PCR反应体系：10XPCR缓冲液5μl，10mM dNTP 4μl，PfμDNA聚合酶2U，引物1(30ng/μL)2μl，引物2(30ng/μL)2μl，莴苣叶绿体DNA10-100ng，加水到总体积50μl，上述成份均加入到0.5mL PCR管，混均后覆盖一层无菌石蜡油(20-30μl)。

PCR程序为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟，50℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，循环30次；延伸10分种。

用引物P1和P2扩增的片段经Hind III和SalI酶切，电泳回收的1kb大小的产物带，并连接于同样酶切的克隆质粒PUC-18中，而利用引物P3和P4扩增的片段经BamHI和PstI酶切后，电泳回收1kb大小的带，连接于同样酶切的克隆质粒pBluescript SK(Promega公司)质粒中，这两个重组质粒经酶切验证后，再进行测序(上海博亚公司)，确认正确后保留，这两个片段的克隆分别定名为pLCT-HF1和pLCT-HF2。

3.莴苣叶绿体基因psbA启动子分离和克隆

利用如下引物进行扩增：

P5：AGAGTCGACAGAGGGAAAGCCGTGTGC(SEQ ID NO：9)

P6：ATTCCATGGTAAAATCTTGGTTTATTTAA(SEQ ID NO：10)

PCR扩增方法同前文，其中延伸时间缩短为1分钟，利用这对引物扩增的片段经Sau3A和NcoI酶切后，电泳回收130bp的片段，这就是psbA基因的启动子片段。多肽疫苗基因片段用EcoRI和NcoI酶切，与电泳回收的启动子片段一同与BamHI和EcoRI酶切的pBluescript SK连接，这样就克隆了莴苣叶绿体基因psbA的启动子，并且其下游就是多肽疫苗基因片段。该克隆质粒定名为pLCT-PpsbA1/F。

4.用于叶绿体表达的口蹄疫多肽融合基因表达框构建

利用下述引物，以pART27(GFP)质粒为模板进行PCR扩增即可获得GFP基因片段。

P7：5′GCTGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT(SEQ ID NO：11)

P8：5’GCGGTCGACTTATTATTTGTATAGTTCAT(SEQ ID NO：12)

扩增体系同莴苣片段。

PCR程序为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，循环20次；延伸10分种。

扩增得到的GFP片段经EcoRI和BamHI酶切后插入到同样酶切的pLCT-PpsbA1/F质粒中，这样获得的质粒上GFP基因在多肽疫苗基因的下游，构建成一个由莴苣叶绿体psbA基因启动子启动表达的多肽疫苗基因-GFP融合基因表达框。质粒定名为pLCT-PsbA1/F-GFP。

5.莴苣叶绿体定点转化和表达载体的构建

将同源重组片段2从质粒pLCT-HF2上用EcoRI和BamHI切下，电泳回收约1kb大小的片段，用T4 DNA接连酶连接同样酶切的pLCT-HF1上，获得质粒pLCTH-A。

用BamHI和SalI将多肽疫苗融合基因的叶绿体表达盒从质粒pLCT-PsbA1/F-GFP上切下，插入到经同样酶切的pLCTH-A上，得到带有多肽疫苗融合基因的叶绿体表达盒的叶绿体转化载体质粒pLCTH-A(F-GFP)。

用BamHI酶切质粒pSZB8，得到一个1.3kb片段，这是筛选标记基因aadA的表达盒(Prrn-aadA-TpsbA)，电泳回收此片段，插入到经同样酶切的pLCTHA(F-GFP)上，得到最终的转化载体(见图1)。

实施例3.叶绿体转化

1.外植体

无菌苗：将山莴苣种子用0.1％升汞消毒15分钟后，播种在MS培养基上待其发芽生长后，取其嫩叶平铺于MS培养基上培养2-3天备用。

消毒叶片：水培山莴苣嫩叶用4％次氯酸钠消毒15分钟后，平铺于MS培养基上培养5天备用。

愈伤组织：无菌苗叶片放于MB2培养基上连续诱导培养30天以上形成的绿色愈伤组织。

2.质粒大量制备

将用于山莴苣叶绿体定点转化的和表达载体pLCM-A/pLCM-C，用100mlLB液体培养基扩增培养过夜后，收集菌体并用碱裂解法提取质粒DNA，提取质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测纯度及浓度。

3.植物培养基

MS：MS基本成分、蔗糖3％、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，pH 5.8。

MB2：MS基本成分+6-BA0.2mg/L+IAA1.0mg/L、蔗糖3％、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，pH 5.8。

MB5：MS基本成分+6-BA 0.5mg/L+IAA 1.0、蔗糖3％、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，pH5.8。

MN：蔗糖3％、无机盐用1/2MS、肌醇0.1g/L、琼脂0.5％，pH5.8。

4.基因枪子弹制备

(1)钨粉悬液的制备

60mg钨粉(Φ0.8UW)放在离心管中加无水乙醇，用超声波粉碎机30秒一次间隔1分钟至温度发烫，静置5分钟，离心10000rpm 5分钟去上清；

加1ml无水乙醇涡旋5分钟，静置1分钟，离心10000rpm5分钟去上清；

加入1ml无菌水涡旋3分钟，离心10000rpm 5分钟去上清(重复3次)；

在沉淀的钨粉中加入50％甘油1ml，震荡成为悬浮液，分装50μl/管，放于4℃保存。

(2)微弹的制备

取1管50μl钨粉加入5μl质粒LBG-A震荡30秒；加20μl亚精胺(0.1M)震荡30秒；加50μl CaCl²(2.5M)涡旋60秒，静置1分钟离心3000rpm 30秒去上清；加入150μl 70％乙醇洗沉淀，离心3000rpm 10秒去上清；加入无水乙醇150μl不破坏沉淀静止1分钟去上清；加入60μl无水乙醇重悬。轰击时每枪取10μl。

5.基因枪转化

利用国产的基因枪进行转化。具体参数为采用70Pa的可裂膜，轰击距离7-9cm。

轰击后外植体放于普通MS培养基上2天，然后移至含有观状霉素培养基上培养，首先用的是MB2培养基，经过约2-4周时间的诱导和筛选培养，当外植体有愈伤组织出现时转入MB5培养基上，继续培养至诱导芽。

长出芽的叶伸至1-2cm时，可切下再次放于MB2培养基上，重新进行诱导和筛选培养以便进行同质化的筛选。也可以放于MN培养基上生根，得到完整的转化植株。

实施例4.转基因山莴苣的检测

1.GFP荧光鉴定

用长波紫外灯照射所(国产的三波长紫外检测仪上的长波即可)得到的绿苗，能发出绿色荧光的为转基因个体。或利用荧光显微镜的兰光激发条件下观察转植株的叶片，有绿色荧光的为转化植株，由于口蹄疫多肽序列是在绿色荧光蛋白的上游，所以可以通过绿色荧光蛋白基因表达情况证实口蹄疫免疫源性多肽的表达。

2.叶绿体转化的同质化PCR方法检测

采用根据转化载体同源片段以外叶绿体DNA的序列设计引物进行扩增，若叶绿体基因组中插入位点插入外源基因，由扩增出增大的片段。

这里应用的引物序列为：

5’TAAAGCCTTCAATGGTACGCAGTC(SEQ ID NO：13)

5’CGACGAAACCTAGAAATCGATCACTG(SEQ ID NO：14)

扩增体系采用适合于长片段扩增的PCR体系。在本实施例中采用的是LA-PCR或Premix^EX(Takara)，或Taq plus(sangon).由于头几轮再生得到的转化植株中叶绿体有大量的未转化的DNA分子，所以用上述引物扩增会检测到明亮的3.7kb大小的片段，即在转化体叶绿体的psbA和trnH之间没有外源DNA片段的插入。另外还将扩增得到一个较弱的约6.1kb大小的片段，这是由于转化的叶绿体基因组中psbA和trnH基因间有一个约2.4kb的外源DNA片段的插入，这种情况表明虽然外源基因已插入到叶绿体基因组中，但仍有大量叶绿体的DNA没有被转化，即仍未达到同质化。经多轮同质化筛选后，若扩增产物中只能检测到约6.1kb大小的片段，即表明所有叶绿体的DNA都插入了外源基因片段。

3.口蹄疫疫苗基因表达产物的检测

阳性抗源制备：将原核表达载体质粒pET28a利用NcoI和SalI酶切，回收切开的质粒片段，将其与NcoI和EcoRI酶切的多肽疫苗基因片段、EcoRI和SalI酶切的GFP基因片段一同进行连接，连接产物转化受体菌BL21的感受态，获得的含多肽疫苗融合基因的载体质粒的转化子，参照相关pET产品说明书将转化子菌体进行诱导培养，收集菌体，分离产物经SDS蛋白电泳检测纯度后为阳性抗源。另外蛋白还可从SDS-PAGE胶上切下，干燥粉碎后注射动物(如兔)获得相应的抗血清。

植物蛋白的提取：取100mg植物材料，加研磨缓冲液(10mM Tris.Cl，0.02 NaN3，0.001％PMSF，pH 8.0)200μl，冰浴中研成匀浆，5000rpm室温下离心10分钟，取上清。

酶联免疫测定：按标准的酶联免疫方法进行测定，其中检测样品为从原核表达分离的阳性蛋白样口，从转化的植物分离的蛋白，并未转化植物分离出的蛋白作为阴性蛋白样品。

取一定量样品加入到反应板中包被，其附性抗源蛋白按梯度加于反应板的孔中。

洗掉多余的抗原。

加入测试抗体-兔抗口蹄疫抗血清(利用阳性蛋白注兔子产生的，或直接用中国兰州兽医所生物所的兔抗口蹄疫血清)。

洗掉多余的抗体。

加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔lgG。

洗去未结合之二抗。

加入NBT/BCIP显色液。

显色

酶标仪测定吸光值(OD值)，根据从植物中分离抗源的有色终产物含量和阳性抗源有色产物梯度即可测量带测抗原的含量。

一般地讲，同质化的转化植物中多肽疫苗融合蛋白可占总可溶蛋白的1％以上。

                               序列表

<110>甘肃亚盛集团中国科学院遗传研究所

<120>用于生产口蹄疫疫苗的山莴苣叶绿体转化植物的获得方法

<130>I2001665

<160>28

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>204

<212>DNA

<213>口蹄疫疫苗

<400>1

gtgaccaaag tgagaggcga tctgcaggtg ctggcgcaga aagcggcacg ctctctgccg     60

agacataaac agaagattgt ggcaccaggc aaacgcctgc tggtgagcaa cgtgagaggc    120

gatctgcgag tgctggcgca gaaagcggaa agagcgctgc cgagacataa acagaagatt    180

gtggcaccag caaaacaact gctg                                           204

<210>2

<211>204

<212>DNA

<213>口蹄疫疫苗

<400>2

gtgagcaacg tgagaggcga tctgcgagtg ctggcgcaga aagcggaaag agcgctgccg     60

agacataaac agaagattgt ggcaccagca aaacaactgc tggtgaccaa agtgagaggc    120

gatctgcagg tgctggcgca gaaagcggca cgctctctgc cgagacataa acagaagatt    180

gtggcaccag gcaaacgcct gctg                                           204

<210>3

<211>1715

<212>DNA

<213>莴苣

<400>3

ggagtcgact ttggtcttat tgtaattgta taggagtttt tgaactaaaa aaggagcaat     60

aatgccctct tgataaaaca agagggaagc tatttctcct ttttttttat ttagtagtat    120

ttgccttaca tagtttcttt agaaataaca aggtcttttg tttggttcga ttagcatgtt    180

ttctctttgt attaatttag aggtttatat attcttttcc caatgtttta tgaagtttga    240

tttacaattg aatttcaatc taaaatagat aaaaatgaaa atttttatta tttatttctt    300

tgatttcaga aataagaaag aaaataagaa agaaataata tgctcttttt ttttctgtta    360

atggaaaaat ctagaaatac tagataatag tagaggggcg gatgtagcca agtggatcaa    420

ggcagtggat tgtgaatcca ccatgcgcgg gttcaattcc cgtcgttcgc ccaaattgaa    480

tttaatttat tttttttaat aaattattcg ctacaaacgg attttttttt agtgaacgtg    540

tcacagcttc ctcctatttt tttgttttgt aaagacgaag aaagaaattc tattttctct    600

cctatttact acggcgacga agaatcaaat tatcactata tttattcctt tttctacttc    660

tttttccaag tgcaggataa ccccaagggg ttgtgggttg ttttctacca attggggccc    720

tcccttcacc acccccatgt ggatggtcta cagggttcat aactactcct cttactacag    780

ggcgcttacc tagccaacgc ttagatccgg ctctacccaa acttttctgg ttcaccccaa    840

cattccccac ttgtccgact gttgctgagc agtttttgga tatcaaacgg acctccccag    900

aaggtaattt taatgtggcc gatttccctt cttttgcaat cagtttcgct acagcacccg    960

ctgctctagc taattgtcca ccctttccaa gtgtgatttc tatgttatgt atggccgtgc   1020

ctaagggcat atcggttgaa gtagattctt cttttttatc aatcaaaacc ccttcccaaa   1080

ctgtacaagc ttcttccaaa gcatacggct ttctggatgt agatggtgat atctatacag   1140

atggatctta tatatatggt ataatgaagt accacatggg tggatatata ggaatcaaaa   1200

tctgccgaat cactcatgtt atgatcttct acatcctagg tcttcccgtt ccatcatctg   1260

gcttatgttc ttcatgtagc attcagaccg gatgactcta ttaaattacg ttgatacttc   1320

cacatattat gggtaacgta ggagacatct ctatttttcc ccccgggaat ctttagaatt   1380

accactgctt agctttcaat tcgcctctga ccatcaaatg aaatgtgaat aatccgtcct   1440

cttctctttg aaagaagggg cgcttccggt tctgtcggtg cttgaaacaa ttttgtcttc   1500

tccatattac tatatctcta gagtcaataa ttttatatga ggaactactg aactcaatca    1560

cttgctgccg ttactcttca gttttctgtt gaggtctatc ctgtagaggt actcaaattg    1620

gatcagtgat cgatttctag gtttcgtcgt aaacctaatt ggttacttcc aattacgtaa    1680

atcaatagtt caaaccgcac tcaaaggtag ggcat                               1715

<210>4

<211>2355

<212>DNA

<213>莴苣

<400>4

gggctatctt tcaagtgtgc ggctaaagcc ttcaatggta cgcagtcaaa tgctagaaaa      60

tgcatttata attgaaaatg ctattaagaa gtttgagact attgttccaa ttatgccttt     120

gattggatca ttggctaaat ctaaattttg taatgcattg gggcatccta ttggtaaggc     180

gatttgggcc gatttctcag attctgatat tattgaccgc tttgggcgta tatacagaaa     240

tctttctcat tatcatagtg gatcttcaaa aaaaaagagt ttgtatcgag taaagtatat     300

acttcgactt tcttgtgcta gaactttagc tcgtaagcat aaaagcactg tacgtgcttt     360

tttgaaaaga ttcggctcgg aattattaga agaattcttt acggaagaag aacaagtttt     420

ttccctgacc tttccaaggg tttcttccat ttcgcgaagg ttatctagaa ggcggatttg     480

gtatttggat attatttgta tcaatgattt ggccaatcat gaatgattcg ttatgaaacc     540

ttgtaaatat aaatttcatc actaaataat ctaataaata atgtaaataa tgaagagcta     600

acaaaaaatt atttctttct attctgaaat gttgatgtag tatgtagtaa ggatgaaatc     660

aactgagtat tcaatctttt cttgtctaat gaaggaactg agttttagat gtatacagag     720

ggaaagccgt gtgcaatgaa aaatgcaagc acggcttggg gagggatttt tacttattta     780

actttaacaa ggaaattatc tactccatcc gactagttcc gggttcgaat cccgggcaac     840

ccattgtcat agtgaaatta aattatatgc atagtgtata gaaatccttt tttttttatt     900

tttgcaaacc gcttttgatt tacaaaaaat tgaactagat ccagatagat attggttgac     960

acgggcatat aagtcatgtt atactgttaa ataacaagcc tttagttttc catttgaaaa    1020

ttcgtgcgct tgggagtccc tgataattaa ataaaccaag attttaccat gactgcaatt    1080

ttagagagac gcgaaagcga aagcctatgg ggtcgcttct gtaactggat aaccagcacc    1140

gaaaaccgtc tttacattgg atggtttggt gttttgatga tccctacctt attgaccgca    1200

acttctgtat ttattatcgc cttcattgct gctcctccag tggatattga tggtattcgt    1260

gaacctgttt ctggatctct actttatgga aacaatatta tttcaggtgc cattattcct    1320

acttctgcag ctataggttt gcatttttac ccaatatggg aagcagcatc cgttgatgaa    1380

tggttataca atggtggtcc ttatgaacta attgttctac acttcttact tggtgtagct    1440

tgttacatgg gtcgtgagtg ggagcttagt ttccgtctgg gtatgcgacc ttggattgct    1500

gttgcatatt cagctcctgt tgcagctgcg actgctgttt tcttgatcta cccaattggt    1560

caaggaagct tttctgatgg tatgcctcta ggaatttctg gtactttcaa cttcatgatt    1620

gtattccagg ctgagcacaa catccttatg cacccatttc acatgctagg cgtagctggt    1680

gtattcggcg gctccctatt tagtgctatg catggttctt tggtaacctc tagtttgatc    1740

agggaaacca cagaaaatga atctgctaat gaaggttaca gattcggtca agaagaagaa    1800

acttataata tcgtagccgc tcatggttat tttggccgat tgatcttcca atatgctagt    1860

ttcaacaact ctcgttcttt acatttcttc ctagctgctt ggcctgtagt aggtatctgg    1920

ttcactgctt taggtatcag cactatggct ttcaacctaa atggtttcaa tttcaaccaa    1980

tcggtagttg atagtcaagg ccgtgtaatt aatacttggg ctgatatcat taaccgtgct    2040

aaccttggta tggaagttat gcatgaacgt aatgctcata atttccctct agacttagct    2100

gctatcgaag ctccatctac aaatggataa gactttggtc ttattgtaat tgtataggag    2160

tttttgaact aaaaaaggag caataatgcc ctcttgataa aacaagaggg aagctatttc    2220

tccttttttt ttatttagta gtatttgcct tacatagttt ctttagaaat aacaaggtct    2280

tttgtttggt tcgattagca tgttttctct ttgtattaat ttagaggttt atatattctt    2340

ttcccaagga tccac                                                     2355

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

atgccctacc tttgagtgc                                               19

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ggagtcgact ttcctcttat tgtaattgta tagg                              34

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

agagtcgaca gagggaaagc cgtgtgc                                      27

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

gtggatcctt gggaaaagaa tatataaacc tc                                32

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

agagtcgaca gagggaaagc cgtgtgc                                      27

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

attccatggt aaaatcttgg tttatttaa                                    29

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

gctgaattca tgagtaaagg agaagaactt                                   30

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

gcggtcgact tattatttgt atagttcat                                    29

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

taaagccttc aatggtacgc agtc                                         24

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

cgacgaaacc tagaaatcga tcactg                                       26

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>15

gtgaccaaag tgagaggcga tctgcaggtg ctggcgcaga aagcggcacg ctctctgccg  60

<210>16

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>16

agacataaac agaagattgt ggcaccaggc aaacgcctgc tg                     42

<210>17

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>17

gtgagcaacg tgagaggcga tctgcgagtg ctggcgcaga aagcggaaag agcgctgccg  60

<210>18

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>18

agacataaac agaagattgt ggcaccagca aaacaactgc tg                     42

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>19

gaattctaat agctcgaggt cgacaagctt accatg                            36

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>20

tttggtcacc atggtaagct tgtcgac                                      27

<210>21

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>21

cgctttctgc gccagcacct gcagatcgcc tctcac                            36

<210>22

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>22

tggtgccaca atcttctgtt tatgtctcgg cagagagcgt gc                     42

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>23

gttgctcacc agcaggcgtt tgcc                                         24

<210>24

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>24

ctcgagctat tagaattcca gcaggcgttt gcc                               33

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>25

gttgctcacc atggtaagct tgtcgac                                      27

<210>26

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>26

tggtgccaca atcttctgtt tatgtctcgg cagcgctctt tc                     42

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>27

tttggtcacc agcagttgtt ttgc                                         24

<210>28

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>28

ctcgagctat tagaattcca gcagttgttt tgc                               33

Claims (5)

1.一种生产O型口蹄疫多肽疫苗的山莴苣叶绿体转基因植物的获得方法，包括以下步骤：

(1)合成O型口蹄疫多肽疫苗基因序列，使之与报告基因或具有强免疫源性蛋白的基因串联得到融合的疫苗基因，该融合的疫苗基因连接于莴苣叶绿体psbA基因启动子下游从而构建为叶绿体表达框；

(2)构建用于向山莴苣叶绿体中定点转化外源基因的莴苣叶绿体相关DNA序列；

(3)将步骤(2)构建出来的DNA序列与步骤(1)合成的融合的O型口蹄疫多肽疫苗基因重组，使融合的疫苗基因序列位于莴苣叶绿体相关DNA序列的中间；

(4)将步骤(3)中重组得到的DNA片段插入到克隆载体的多克隆位点上，作为O型口蹄疫多肽疫苗基因山莴苣叶绿体定点转化载体；和

(5)用得到的转化载体转化山莴苣植物细胞，获得叶绿体表达多肽疫苗的转基因植物。

2.按照权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述的编码O型口蹄疫多肽疫苗的基因具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列。

3.按照权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述的用于向山莴苣叶绿体中定点转化外源基因的DNA序列具有SEQ ID NO：3所示序列或其不小于1kb的片段和SEQ ID NO：4所示序列或其不小于1kb的片段。

4.按照权利要求3的方法，其中步骤(3)中所述融合的疫苗基因位于SEQ ID NO：3和SEQ IN NO：4的中间。

5.按照权利要求1的方法，其中步骤(1)所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因，所述具有强免疫源性蛋白的基因选自O型口蹄疫病毒VP1蛋白基因或乙肝核心蛋白基因。