CN114040976A - 用于产生烟杈减少或消除的烟草植物和产品的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供通过改变不同靶基因的表达来控制烟草中烟杈生长的方法和组合物。

Description

用于产生烟杈减少或消除的烟草植物和产品的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月29日提交的美国临时申请第62/854,139号的优先权。其全文通过引用并入本文。
技术领域
本公开提供用于改进可用于植物中烟杈的减少或消除的核酸和蛋白质的表达的方法和组合物。
序列表的并入
本申请包含以ASCII格式电子提交并且通过引用全部并入本文的序列表。将创建于2020年5月21日的所述ASCII副本命名为P34703WO00_SL.txt，并且大小为380,869字节。
背景技术
烟草是一种表现出特别强的顶端优势的植物物种。来自茎尖分生组织(SAM)的分子信号介导有效抑制腋芽生长的激素信号。在去除SAM(也称为“打顶”)后，发生生理和分子变化，使得能够从腋生分生组织(芽)生长新枝(或“烟杈”)。烟杈生长导致产量和叶片质量的损失。通过人工去除和施用化学品来控制烟杈。通常将马来酰肼和氟甲醛用于打顶的植物以抑制腋芽生长(“分杈(suckering)”)。然而，控制烟杈的劳动力和化学试剂非常昂贵。通过常规育种、突变育种和转基因方法控制烟草中的分杈已成为几十年的主要目标，但是迄今为止，通过这些方法尚未成功抑制或消除分杈。最近的分子工作已经产生了烟杈减少或消除的转基因植物，但是腋芽降解基因的渗漏表达可以导致种子和胚的死亡并且阻止转基因植物的连续世代的产生。因此，开发防止腋芽降解基因在非期望组织和/或器官中表达的方法和组合物将导致化学试剂的使用减少并且将降低与烟草生产相关的成本和劳动力。
发明简述
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，其包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，包括：(a)在至少一个烟草细胞中在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的基因组基因座处诱导突变；(b)选择至少一个包含来自步骤(a)的突变的烟草细胞；和(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码多肽的核酸的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子；(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达；(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
在一个方面，本公开提供包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的核酸可操作地连接的异源启动子。
在一个方面，本公开提供包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈的后代烟草植物。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码多肽的核酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
序列简述
SEQ ID NO:1-44、89-113是118-126是核酸序列。
SEQ ID NO:45-88是114-117是氨基酸序列。
本文提供的SEQ ID NO的其它描述可见于下表1中。
表1.序列的描述
Figure BDA0003446356220000081
Figure BDA0003446356220000091
Figure BDA0003446356220000101
Figure BDA0003446356220000111
附图说明
图1是描绘水处理和马来酰肼处理的烟草植物4小时、24小时和72小时打顶后成对比较之间腋芽中差异表达基因的重叠的文氏图。MH4是指马来酰肼处理后4小时；W4是指水处理后4小时；MH24是指马来酰肼处理后24小时；W24是指水处理后24小时；MH72是指马来酰肼处理后72小时；W72是指水处理后72小时。
图2描绘了打顶后一周来自单个P1_2.4::MYB植物的烟杈的总质量。
图3描绘了打顶后一周来自单个P1_2.4::CDKI植物的烟杈的总质量。
图4描绘了打顶后一周来自包含amiRNA-1构建体的单个植物的烟杈的总质量。
图5描绘了打顶后一周来自包含amiRNA-2构建体的单个植物的烟杈的总质量。
图6描绘了打顶后一周来自包含amiRNA-3构建体的单个植物的烟杈的总质量。
发明详述
除非另有定义，使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还预期由所述术语的复数形式描述的本发明的方面。在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其他技术术语具有其在所使用的技术领域中的普通含义，如由各种特定领域的词典所例示，例如“The American
Figure BDA0003446356220000121
Science Dictionary”(Editors of the American Heritage Dictionaries,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Boston and New York)，“McGraw-Hill Dictionary ofScientific and Technical Terms”(6th edition,2002,McGraw-Hill,New York)或“Oxford Dictionary of Biology”(6th edition,2008,Oxford University Press,Oxford and New York)。
本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物，通过引用以其整体并入本文。
当出现一组备选方案时，特别设想了组成该备选方案组的成员的任何和所有组合。例如，如果项目选自由A、B、C和D组成的组，则本发明人明确地设想了每个单独的替代方案(例如，单独的A、单独的B等)，以及诸如A、B和D；A和C；B和C等的组合。术语“和/或”在两个或多个项目的列表中使用时是指所列项目中的任何一个单独或与任何一个或更多个其他所列项目组合。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B之一或两者-即单独的A、单独的B或A和B的组合。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合，或A、B和C的组合。
当本文提供数值范围时，该范围应理解为包括该范围的边界以及该范围的限定边界之间的任何数值。例如，“1-10”包括在1和10之间的任何数字，以及数字1和数字10。
如本文所用，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在一个方面，当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的经修饰的烟草植物在打顶后包含减少的烟杈或不包含烟杈。
如本文所用，“分杈”是指在叶和茎之间生长的来自腋生分生组织的腋生(或侧枝)芽(“烟杈”)的发育和/或生长。腋芽是胚芽，其包含腋生分生组织、周围的叶组织和周围的茎组织。参见，例如，美国专利申请公开号2016/0281100；和2017/0260535，其通过引用整体并入本文。
如本文所用，“打顶”是指当植物接近成熟时去除茎尖，包括顶端分生组织、花、并且直至几片相邻的叶。打顶烟草植物导致丧失顶端优势。在打顶之前，通过顶端分生组织发出的激素信号使得分杈很大程度上处于休眠状态；打顶去除激素信号，并且可以让烟杈长出(“打顶诱导的分杈”)。如果充分控制分杈，则打顶增加产量、增加每英亩的价值，并产生烟叶的物理和化学性质的理想改良。
如本文所用，“可比的生长条件”是指用于生长两种或更多种植物基因型并在它们之间进行有意义的比较的类似环境条件和/或农艺实践，使得环境条件和农学实践均不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光、温度、水、湿度和营养(例如氮和磷)。农艺实践包括例如播种、剪枝、底切、移栽、打顶和分杈。参见Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford(1999),pp.70-103的Chapters 4B和4C。在本领域中可以理解，“可比的生长条件”不需要相同的生长条件。
如本文所用，“修饰的”是指已经进行诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的植物、种子、植物部分、植物细胞和植物基因组。
在一个方面，本公开提供当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈的经修饰的烟草植物。如本文所用，烟杈数量、烟杈大小和/或烟杈对农艺性能的影响“减少”是指统计学上显著的减少。如本文所用，“统计学上显著的”是指当使用适当的统计显著性的度量(例如，单尾双样本t检验)时，p值小于0.05时。
在一个方面，当在可比条件下生长时，与对照植物相比，本文提供的经修饰的植物或方法需要减少的管理来控制分杈。如本文所用，“管理”是指人工去除烟杈、施用化学品(例如马来酰肼、氟节胺)以抑制或除去烟杈，或两者。在一个方面，当在可比条件下生长时，与对照植物相比，本文提供的经修饰的植物或方法需要的人工烟杈去除频率降低、化学品施用频率降低、化学品施用量降低或其组合。参见例如，其全文通过引用并入本文的Fisher等“Topping,Managing Suckers,and Using Ethephon,”pages 96-117In:2016Flue-CuredTobacco Information,North CarolinState University。
在一个方面，本文提供的经修饰的植物或方法需要减少的马来酰肼施用频率以减少或消除烟杈。在一个方面，本文提供的经修饰的植物或方法需要减少的马来酰肼施用量以减少或消除烟杈。在一个方面，本文提供的经修饰的植物或方法需要降低的氟节胺施用频率以减少或消除烟杈。在一个方面，本文提供的经修饰的植物或方法需要减少的氟节胺施用量以减少或消除烟杈。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的1％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率是对照植物的95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的1％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物或方法需要手动去除烟杈的频率小于对照植物的95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的10％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的20％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的30％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的40％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的50％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的60％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的70％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的80％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的90％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的10％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的10％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的10％-25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的50％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的25％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的25％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的1％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的1％-25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要手动去除烟杈的频率是对照植物的1％-10％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的1％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的1％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率小于对照植物的95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的10％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的20％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的30％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的40％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的50％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的60％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的70％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的80％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的90％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的10％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的10％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的10％-25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的50％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的25％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的25％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的1％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的1％-25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要化学施用以控制烟杈的频率为对照植物的1％-10％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的1％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积为用于控制对照植物烟杈的体积的95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的1％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积小于用于控制对照植物烟杈的体积的95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少10％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少20％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少30％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少40％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少50％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少60％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少70％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少80％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少90％-95％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少10％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少10％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少10％-25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少25％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少25％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少50％-75％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少1％-50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少1％-25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，本文提供的经修饰的植物需要的化学喷雾体积比对照植物少1％-10％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，减少的烟杈包含较少的总烟杈、较小的平均烟杈尺寸或两者。在另一个方面，当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物的烟杈相比，较小的平均烟杈尺寸包括选自减少的平均质量、减少的平均长度、减少的平均直径或其任何组合的量度。在另一方面，较小的平均烟杈尺寸包括烟杈的减小的平均质量。在另一方面，较小的平均烟杈尺寸包括烟杈的减小的平均长度。在更进一步的方面，较小的平均烟杈尺寸包括烟杈的减小的平均直径。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含较少的总烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含较小的平均烟杈尺寸。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含较短的平均烟杈长度。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含较低的平均烟杈质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含较短的平均烟杈直径。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少1个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少2个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少3个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少4个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少5个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少7个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少10个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少15个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少20个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含至少少25个的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少30个的烟杈。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少5％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少10％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少15％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少20％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少25％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少30％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少40％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少50％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少60％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少70％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少80％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少90％的烟杈。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的烟草植物包含少至少95％的烟杈。
在一个方面，使用新鲜烟杈重量来测量平均烟杈质量。在另一方面，使用干烟杈重量来测量平均烟杈质量。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少15％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈质量相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈质量低至少95％。
在一个方面，在其将主烟草茎连接到烟杈茎的远端的烟杈的基部测量平均烟杈长度。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少1厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少2厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少3厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少4厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少5厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少10厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少15厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少20厘米。
在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短0.5厘米-30厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短0.5厘米-25厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短0.5厘米-20厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短0.5厘米-15厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短0.5厘米-10厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短0.5厘米-5厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短1厘米-30厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短1厘米-20厘米。在一个方面，在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短1厘米-10厘米。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少15％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈长度相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈长度短至少95％。
在一个方面，在其与植物的主茎邻接的烟杈的基部测量烟杈直径。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少5％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少10％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少15％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少20％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少25％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少30％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少40％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少50％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少60％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少70％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少80％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少90％。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少95％。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少1毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少2毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少3毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少4毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少5毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少6毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少7毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少8毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少9毫米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少1厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少1.5厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少2厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少3厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少4厘米。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物的平均烟杈直径相比，经修饰的烟草植物的平均烟杈直径短至少5厘米。
预期本文提供的任何核酸分子、蛋白质或多肽与本文提供的任何方法一起使用。预期本文提供的任何核酸分子、蛋白质或多肽与本文提供的任何植物、植物部分、细胞或种子一起使用。预期本文提供的任何核酸分子、蛋白质或多肽与本文提供的任何烟草植物、烟草植物部分、烟草细胞或烟草种子一起使用。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”的使用不旨在将本公开限制为包含脱氧核糖核酸(DNA)的多核苷酸。例如，也预期核糖核酸(RNA)分子。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸均包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。在一个方面，本文提供的核酸分子是DNA分子。在另一方面，本文提供的核酸分子是RNA分子。在一个方面，本文提供的核酸分子是单链的。在另一方面，本文提供的核酸分子是双链的。核酸分子可以编码多肽或小RNA。
可以使用本领域的常规技术分离核酸。例如，可以使用包括但不限于以下的任何方法分离核酸：重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)。一般的PCR技术描述于例如PCRPrimer:Laboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995。重组核酸技术包括，例如限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可以作为单个核酸分子或作为一系列寡核苷酸化学合成。可以通过已知方法，例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析从天然来源(例如生物样品)中纯化多肽。例如，也可以通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。多肽的纯度可以使用任何合适的方法测量，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
在一个方面，本公开提供检测植物细胞中的重组核酸和多肽的方法。非限制性地，也可以使用杂交检测核酸。核酸之间的杂交详细讨论于Sambrook等(1989,MolecularCloning:Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。
在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少80％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少85％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ IDNO:1-44和113的序列至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的序列100％相同的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可以由本文提供的多核苷酸编码。本文提供的蛋白质可以由本文提供的核酸分子编码。蛋白质可包含本文提供的多肽。如本文所用，“蛋白质”是指能够向细胞提供结构或酶活性的氨基酸残基链。
可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法制备对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体附着于固体支持物，如微量滴定板。
可以使用可检测标签进行检测(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽)。术语“标签”旨在涵盖使用直接标签以及间接标签。可检测标签包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少70％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少75％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少85％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少95％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少96％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ IDNO:45-88和114的氨基酸序列至少97％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少98％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少99％相同或相似的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本文提供的内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列100％相同或相似的氨基酸序列的多肽。
如本文所用，关于两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的术语“同一性百分比”或“相同百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口(一个或多个“可比对”区域)上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或氨基酸)，(ii)确定在两个序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质和多肽)的位置数以产生匹配位置数，(iii)将匹配位置数除以比较窗口中总位置数，然后(iv)将该商乘以100％以产生同一性百分比。如果“同一性百分比”是在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算的，那么通过将比对区域上匹配位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，为了本申请的目的，当将两个序列(查询和主题)最佳比对(在它们的比对中允许空位)时，查询序列的“百分比同一性”等于两个序列之间相同位置数除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的总位置数，然后乘以100％。
当参照氨基酸使用序列同一性百分比时，公认不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列的保守取代不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。
为了对序列进行最佳比对以计算它们的同一性百分比，各种成对或多重序列比对算法和程序是本领域已知的，例如可用于比较两个或多个核酸或氨基酸序列之间的序列同一性或相似性的ClustalW或基本局部比对
Figure BDA0003446356220000331
(BLASTTM)等。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两个序列之间的比对和同一性百分比(包括上述同一性百分比范围)可以通过ClustalW算法测定，参见例如Chenna et al.,“Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs,”Nucleic Acids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson et al.,“Clustal W:Improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”Nucleic Acids Research 22:4673-4680(1994)；Larkin MA et al.,“Clustal W and Clustal X version 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)；和Altschul et al."Basic local alignmentsearch tool."J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，其全部内容和公开通过引用并入本文。
本文所用的关于两个核苷酸序列的术语“互补性百分比”或“互补百分比”类似于同一性百分比的概念，但是是指当查询序列和主题序列线性排列并且最佳碱基配对而没有二级折叠结构(如环、茎或发夹)时，与主题序列的核苷酸最佳碱基对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可以在两条DNA链、两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链之间。“互补性百分比”可以通过以下方式计算：(i)在比较窗口上以线性和完全延伸的排列(即，没有折叠或二级结构)最佳碱基配对或杂交两个核苷酸序列，(ii)在比较窗口上确定两个序列之间的碱基对位置数以产生互补的位置数，(iii)将互补的位置数除以比较窗口中总位置数，和(iv)将该商乘以100％以得到两个序列的互补性百分比。两个序列的最佳碱基配对可以基于核苷酸碱基的已知配对，如G-C、A-T和A-U，通过氢结合来确定。如果相对于参考序列计算“互补性百分比”而不指定特定的比较窗口，那么通过将两个线性序列之间的互补的位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，为了本申请的目的，当两个序列(查询和主题)是最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸)时，查询序列的“互补性百分比”等于两个序列之间碱基配对位置数除以查询序列在其长度上的总位置数，然后乘以100％。
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，包括：(a)在至少一个烟草细胞中在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的基因组基因座处诱导突变；(b)选择至少一个包含来自步骤(a)的突变的烟草细胞；和(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在一个方面，该方法还包括(d)使在步骤(c)中再生的经修饰的烟草植物生长。在另一方面，该方法还包括(e)使在步骤(d)中生长的经修饰的烟草植物与第二烟草植物杂交；和(f)从步骤(e)中的杂交获得至少一个种子。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、烟草植物部分、烟草种子、烟草细胞或烟草基因组在编码细胞周期蛋白的内源基因中包含一个或多个突变。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、烟草植物部分、烟草种子、烟草细胞或烟草基因组在编码细胞周期蛋白依赖性激酶的内源基因中包含一个或多个突变。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、烟草植物部分、烟草种子、烟草细胞或烟草基因组在编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的内源基因中包含一个或多个突变。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、烟草植物部分、烟草种子、烟草细胞或烟草基因组在编码MYB的内源基因中包含一个或多个突变。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、烟草植物部分、烟草种子、烟草细胞或烟草基因组在编码WRKY转录因子的内源基因中包含一个或多个突变。
细胞周期蛋白控制细胞通过细胞周期的进展。它们通常在CDK的活化中起作用。细胞周期蛋白的特征在于具有保守的细胞周期蛋白盒结构域。细胞周期蛋白盒结构域通常包含约150个氨基酸，其组织成5个α-螺旋区。细胞周期蛋白盒结构域对于结合其他蛋白质如CDK是重要的。参见，例如，Noble et al.,“The cyclin box fold:protein recognitionin cell-cycle and transcription control,”Trends Biochem.Sci.22:482-487(1997)；和Menges et al.,“Genomic Organization and Evolutionary Conservation of PlantD-Type Cyclins,”Plant Physiology,145:1558-1576(2007)，其通过引用以其整体并入本文。
G1(Gap1期)是真核细胞中细胞周期中间期的第一部分。细胞在G1期合成mRNA和蛋白质，G1期以转变为S期结束。S期(合成期)是细胞周期中间期的第二部分，其中DNA被复制。S期以转变为G2期结束。G2期(Gap2期)典型地涉及细胞快速生长，因为细胞准备过渡到M期(有丝分裂期)。细胞周期蛋白和CDK是在从G1期至S期和从G2期至M期的转变之间以及在G1期、S期、G2期和M期期间的检查点处的重要调节剂。
存在两个主要的细胞周期蛋白组：通过G1/S转变控制细胞周期所需的G1/S细胞周期蛋白，和通过G2/M转变控制细胞周期所需的G2/M细胞周期蛋白。如果所需的细胞周期蛋白或CDK不能正确地起作用，则细胞周期可停滞在G1/S转变或G2/M转变并阻止子细胞的形成。一方面，本文提供的细胞周期蛋白是G1/S细胞周期蛋白。另一方面，本文提供的细胞周期蛋白是G2/M细胞周期蛋白。
一方面，本公开提供编码细胞周期蛋白的多核苷酸。在另一方面，本公开提供细胞周期蛋白。
一方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的细胞周期蛋白相比，突变多核苷酸编码突变的细胞周期蛋白。在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的细胞周期蛋白相比，突变多核苷酸编码截短的细胞周期蛋白。另一方面，本公开提供非天然存在的截短的细胞周期蛋白。在一个方面，本公开提供编码包含提前终止密码子的内源基因的突变mRNA的多核苷酸，其中与缺少提前终止密码子的内源基因的mRNA相比，突变mRNA编码截短的细胞周期蛋白。。
在一个方面，本公开提供在编码细胞周期蛋白盒结构域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码细胞周期蛋白的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏细胞周期蛋白盒结构域的细胞周期蛋白。在另一方面，本公开提供在编码细胞周期蛋白的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的细胞周期蛋白相比，突变多核苷酸编码包含截短的细胞周期蛋白盒结构域的细胞周期蛋白。在一个方面，本公开提供在编码细胞周期蛋白的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码不能结合CDK的细胞周期蛋白。在一个方面，本公开提供在编码细胞周期蛋白的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码与由缺乏所述突变的内源基因编码的细胞周期蛋白相比对至少一种CDK表现出降低的结合亲和力的细胞周期蛋白。
在一个方面，突变的多核苷酸编码细胞周期蛋白的显性负性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码细胞周期蛋白的显性正性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码组成型活性细胞周期蛋白。在另一方面，突变的多核苷酸编码失活的细胞周期蛋白。
在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列至少80％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQID NO:6-32的序列至少85％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ IDNO:6-32的序列至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码细胞周期蛋白的内源基因包含与选自SEQ ID NO:6-32的序列100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少70％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少75％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少80％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQID NO:50-76的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少96％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少97％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少98％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少70％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少75％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少80％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQID NO:50-76的序列至少85％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少90％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少95％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少96％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少97％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少98％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列至少99％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的序列100％相似的氨基酸序列。
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是参与调节细胞周期、调节转录和调节mRNA加工的蛋白激酶家族。CDK被认为属于酶委员会类别2.7.11.22。CDK包含激酶结构域，并且它们与细胞周期蛋白相互作用或结合。CDK磷酸化丝氨酸和苏氨酸上的底物，因此它们也可称为丝氨酸-苏氨酸激酶。CDK与细胞周期蛋白一起是细胞进展通过细胞周期所必需的。参见，例如，Mironov et al.,“Cyclin-Dependent Kinases and Cell Division in Plants─TheNexus,”Plant Cell,11:509-521(1999)，其通过引用以其整体并入本文。
在一个方面，本公开提供编码CDK的多核苷酸。在另一方面，本公开提供CDK。
在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的CDK相比，突变多核苷酸编码突变的CDK。在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的CDK相比，突变多核苷酸编码截短的CDK。在另一方面，本公开提供非天然存在的截短的CDK。在一个方面，本公开提供编码包含提前终止密码子的内源基因的突变mRNA的多核苷酸，其中与缺少所述提前终止密码子的内源基因的mRNA相比，所述突变mRNA编码截短的CDK。
在一个方面，本公开提供在编码激酶结构域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码CDK的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏激酶结构域的CDK。在另一方面，本公开提供在编码CDK的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的CDK相比，突变多核苷酸编码包含截短的激酶结构域的CDK。在一个方面，本公开提供在编码CDK的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码不能结合细胞周期蛋白的CDK。在一个方面，本公开提供突变的多核苷酸，其在编码CDK的内源基因中包含突变，与由缺乏所述突变的内源基因编码的CDK相比，所述CDK对至少一种细胞周期蛋白表现出降低的结合亲和力。
在一个方面，突变的多核苷酸编码CDK的显性负性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码CDK的显性正性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码组成型活性CDK。在另一方面，突变的多核苷酸编码失活的CDK。
在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少80％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少85％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ IDNO:1-4的序列至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDK的内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-4的序列100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少70％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少75％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少80％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少96％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少97％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少98％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少70％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少75％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少80％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少85％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少90％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少95％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少96％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少97％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少98％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列至少99％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的序列100％相似的氨基酸序列。
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)是抑制CDK的蛋白质。CDKI可结合CDK以防止CDK结合细胞周期蛋白，从而负调节真核生物中的细胞周期。在植物中，CDKI被分为两个家族：KIP相关蛋白(KRP)和SIAMESE相关蛋白(SMR)。参见，例如，Kumar and Larkin,“Whydo plants need so many cyclin-dependent kinase inhibitors？,”Plant Signaling&Behavior,12:e1282021(2017)，其全部内容通过引用并入本文。
在一个方面，本公开提供编码CDKI的多核苷酸。在另一方面，本公开提供CDKI。在一个方面，本文提供的CDKI是KRP。在另一方面，本文提供的CDKI是SMR。
在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的CDKI相比，突变多核苷酸编码突变的CDKI。在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏所述突变的内源基因编码的CDKI相比，所述突变多核苷酸编码截短的CDKI。在另一方面，本公开提供非天然存在的截短的CDKI。一方面，本公开提供编码包含提前终止密码子的内源基因的突变mRNA的多核苷酸，其中与缺少所述提前终止密码子的内源基因的mRNA相比，所述突变mRNA编码截短的CDKI。
在一个方面，本公开提供在编码CDKI的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码不能结合CDK的CDKI。在一个方面，本公开提供在编码CDKI的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码与由缺乏所述突变的内源基因编码的CDKI相比对至少一种CDK表现出降低的结合亲和力的CDKI。
在一个方面，突变的多核苷酸编码CDKI的显性负性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码CDKI的显性正性等位基因。在进一步的一方面，突变的多核苷酸编码组成型活性CDKI。在另一方面，突变的多核苷酸编码失活的CDKI。
在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少80％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少85％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码CDKI的内源基因包含与SEQ ID NO:5 100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少70％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少75％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少80％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQID NO:49至少85％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少96％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少97％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少98％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQID NO:49至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少70％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少75％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少80％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQID NO:49至少85％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少90％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少95％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少96％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少97％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49至少98％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQID NO:49至少99％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源性CDKI包含与SEQ ID NO:49100％相似的氨基酸序列。
MYB蛋白(MYB)是转录因子家族的一部分。在植物中，MYB包含保守的MYB DNA结合结构域。MYB DNA结合结构域在螺旋-转角-螺旋结构中含有多达三个不完整的重复序列，每个重复序列约55个氨基酸。这些重复序列被称为R1、R2和R3，并且已表明R2/R3重复序列直接结合DNA的大沟。植物特异性MYB的亚家族含有R2R3型MYB结构域并被称为R2R3型MYB。MYB的其它亚家族包括R1型、3R型和4R型MYB。例如，参见Ambawat et al.,“MYB transcriptionfactor genes as regulators for plant responses:an overview,”Physiol.Mol.Biol.Plants,19:307-321(2013)，其全部内容通过引用并入本文。
在一个方面，本文提供的MYB为R1型MYB。在另一方面，本文提供的MYB为R2R3型MYB。在另一方面，本文提供的MYB为3R型MYB。在另一方面，本文提供的MYB为4R型MYB。
在一个方面，本公开提供编码MYB的多核苷酸。在另一方面，本公开提供MYB。
在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的MYB相比，突变多核苷酸编码突变的MYB。在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏所述突变的内源基因编码的MYB相比，所述突变多核苷酸编码截短的MYB。在另一方面，本公开提供非天然存在的截短的MYB。在一个方面，本公开提供编码包含提前终止密码子的内源基因的突变mRNA的多核苷酸，其中与缺少所述提前终止密码子的内源基因的mRNA相比，所述突变mRNA编码截短的MYB。
在一个方面，本公开提供在编码MYB DNA结合结构域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏MYB DNA结合结构域的MYB。在另一方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的MYB相比，突变多核苷酸编码包含截短的MYB DNA结合结构域的MYB。
在一个方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码不能结合DNA的MYB。在一个方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码与由缺乏所述突变的内源基因编码的MYB相比表现出降低的对DNA的结合亲和力的MYB。
在另一个方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏所述突变的内源基因编码的MYB相比，所述突变多核苷酸编码包含截短R2R3型MYB结构域的MYB。在另一方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏所述突变的内源基因编码的MYB相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的R1型MYB结构域的MYB。在另一方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的MYB相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的3R型MYB结构域的MYB。在另一方面，本公开提供在编码MYB的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的MYB相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的4R型MYB结构域的MYB。
在一个方面，突变的多核苷酸编码MYB的显性负性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码MYB的显性正性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码组成型活性MYB。另一方面，突变的多核苷酸编码失活的MYB。
在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少80％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少85％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码MYB的内源基因包含与选自SEQ ID NO:33-44的序列100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少70％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少75％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少80％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少96％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少97％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少98％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少70％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少75％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少80％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少90％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少95％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少96％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少97％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少98％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列至少99％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的序列100％相似的氨基酸序列。
WRKY转录因子是植物中已知的转录调节因子的最大家族之一。WRKY转录因子是包含“WRKY结构域”的蛋白质。WRKY结构域包含约60-70个氨基酸，并且参与DNA结合。WRKY结构域含有高度保守的“WRKY核心结构域”，其具有氨基酸基序WRKYGQK(SEQ ID NO:110)。WRKY结构域的保守核心可以变化，并且氨基酸基序WRKYGKK(SEQ ID NO:111)是通常观察到的“WRKY核心变体结构域”。WRKY结构域包含由5条反效平行β链组成的球状形状，并且在第二β链上发现保守核心。第三β链还含有高度保守的氨基酸基序PRSYY(SEQ ID NO:112)。在许多WRKY转录因子中，“PRSYY基序”(SEQ ID NO:112)的PR和SYY氨基酸由不同的外显子编码；插入内含子的位置在WRKY转录因子中是高度保守的。WRKY结构域还含有“锌指区域”，其包含氨基酸基序CX4-5CX22-23HXH(SEQ ID NO:115)或CX7CX23HXC(SEQ ID NO:116)，其中X可以是任何氨基酸，C是半胱氨酸，且H是组氨酸。WRKY结构域还含有“DWK盐桥”基序，其中WRKY核心(SEQ ID NO:117)的保守色氨酸(W)与W上游4个氨基酸的天冬氨酸(D)和W下游29个氨基酸的赖氨酸(K)形成三联体。据信DWK盐桥对于稳定WRKY结构域是重要的。例如，参见Rushton et al.,“WRKY transcription factors,”Trends in Plant Science,15:247-258(2010)，其通过引用以其整体并入本文。
在一个方面，本公开提供编码WRKY转录因子的多核苷酸。在另一方面，本公开提供WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供包含非天然存在的突变的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码WRKY转录因子。在一个方面，本公开提供编码截短的WRKY转录因子的多核苷酸。在另一方面，本公开提供非天然存在的截短的WRKY转录因子。在一个方面，本公开提供编码包含提前终止密码子的mRNA的多核苷酸，其中所述mRNA编码截短的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，突变多核苷酸编码突变的WRKY转录因子。在一个方面，本公开提供在内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏所述突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码截短的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供非天然存在的截短的WRKY转录因子。在一个方面，本公开提供编码包含提前终止密码子的内源基因的突变mRNA的多核苷酸，其中与缺少所述提前终止密码子的内源基因的mRNA相比，所述突变mRNA编码截短的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码WRKY结构域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏WRKY结构域的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的WRKY结构域的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码WRKY核心结构域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏WRKY核心结构域的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的WRKY核心结构域的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码WRKY核心变体结构域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏WRKY核心变体结构域的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的WRKY核心变体结构域的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码PRSYY基序(SEQ ID NO:112)的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺少PRSYY基序(SEQ ID NO:112)的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的PRSYY基序(SEQ ID NO:112)的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码锌指区域的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏锌指区域的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的锌指区域的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码DWK盐桥基序的序列中包含非天然存在的突变的多核苷酸。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码缺乏DWK盐桥基序的WRKY转录因子。在另一方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中与由缺乏所述突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比，所述突变多核苷酸编码包含截短的DWK盐桥基序的WRKY转录因子。
在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码不能结合DNA的WRKY转录因子。在一个方面，本公开提供在编码WRKY转录因子的内源基因中包含突变的突变多核苷酸，其中所述突变多核苷酸编码与由缺乏所述突变的内源基因编码的WRKY转录因子相比对DNA表现出降低的结合亲和力的WRKY转录因子。
在一个方面，突变的多核苷酸编码WRKY转录因子的显性负性等位基因。在另一方面，突变的多核苷酸编码WRKY转录因子的显性正性等位基因。在进一步的一方面，突变的多核苷酸编码组成型活性WRKY转录因子。在另一方面，突变的多核苷酸编码失活的WRKY转录因子。
在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少80％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少85％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQID NO:113至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，编码WRKY转录因子的内源基因包含与SEQ ID NO:113 100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少70％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少75％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少80％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少85％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少96％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少97％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQID NO:114至少98％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少70％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少75％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少80％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少85％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少90％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少95％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少96％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少97％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQID NO:114至少98％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少99％相似的氨基酸序列。在一个方面，内源WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114100％相似的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、烟草植物部分、烟草种子、烟草细胞或烟草基因组包含一个或多个突变。如本文所用，“突变”是指与内源参考DNA序列相比，DNA的非天然发生的改变。应当理解，当鉴定突变时，内源参考DNA序列应当来自相同的烟草品种。例如，如果包含突变的经修饰的烟草植物来自TN90品种，则内源参考序列必须是内源TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如K326)的同源序列。类似地，如果包含突变的经修饰的烟草细胞是TN90细胞，则内源参考序列必须是内源TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如K326)的烟草细胞的同源序列。
在一个方面，本文提供的突变产生突变基因座的显性等位基因。显性等位基因是掩蔽相同基因座处的第二等位基因的贡献的等位基因。显性等位基因可以是“显性负性等位基因”或“显性正性等位基因”。显性负性等位基因或反效等位基因是与正常等位基因功能相反的等位基因。显性负性等位基因典型地功能不正常并且直接抑制野生型蛋白质的活性(例如，通过二聚化)或抑制野生型蛋白质的正常功能所需的第二蛋白质的活性(例如，激活剂或途径的下游组分)。例如，显性负性等位基因在杂合或纯合状态中去除或降低等位基因的正常功能。显性正性等位基因可以增加正常的基因功能(例如，超等位基因)或为基因提供新的功能(例如，新等位基因)。当等位基因杂合个体中连锁表型的外显率低于等位基因纯合个体中观察到的外显率时，出现半显性等位基因。
在一个方面，本文提供的突变产生突变基因座的显性负性等位基因。在另一方面，本文提供的突变产生突变基因座的显性正性等位基因。
如本文所用，“诱导”突变是指通过人为干预在多核苷酸序列中产生突变。在烟草中诱导突变的许多合适方法是本领域已知的。这些方法的非限制性实例包括使用化学诱变剂、使用辐射和使用核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用选自化学诱变剂、辐射、转座子、土壤杆菌和核酸酶的试剂。
在一个方面，诱导突变包括使用化学诱变剂。在一个方面，化学诱变剂包括甲磺酸乙酯(EMS)。
在另一方面，诱导突变包括使用辐射。在一个方面，辐射包括γ射线，X射线或电离辐射。在另一方面，辐射包括使用快中子。
在一个方面，诱导突变包括使用转座子。另一方面，诱导突变包括使用农杆菌。
在另一方面，诱导突变包括使用核酸酶。在一个方面，核酸酶选自下组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶、CRISPR/CasX核酸酶、CRISPR/CasY核酸酶以及Csm1核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/Cas9核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/Cpf1核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/CasX核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/CasY核酸酶。一方面，诱导突变包括使用Csm1核酸酶。
本领域已知几种类型的突变。一方面，突变包括插入。“插入”是指与内源参考多核苷酸或氨基酸序列相比，分别向给定多核苷酸或氨基酸序列添加一个或多个核苷酸或氨基酸。在另一方面，突变包括缺失。“缺失”是指与内源参考多核苷酸或氨基酸序列相比，分别去除给定多核苷酸或氨基酸序列的一个或多个核苷酸或氨基酸。在另一方面，突变包括取代。“取代”是指与内源参考多核苷酸或氨基酸序列相比，将一个或多个核苷酸或氨基酸分别替换为给定的多核苷酸或氨基酸序列。在另一方面，突变包括倒位。“倒位”是指多核苷酸或氨基酸序列的片段端对端反向。在一个方面，本文提供的突变包括选自插入、缺失、取代和倒位的突变。
当突变的信使RNA(mRNA)被翻译成蛋白质或多肽时，基因编码区中的突变(例如外显子突变)可产生截短的蛋白质或多肽。一方面，本公开提供导致蛋白质或多肽截短的突变。如本文所用，“截短的”蛋白质或多肽与内源对照蛋白质或多肽相比包含少至少一个的氨基酸。例如，如果内源蛋白A包含100个氨基酸，蛋白A的截短形式可包含1-99个氨基酸。
不受任何科学理论的限制，引起蛋白质或多肽截短的一种方式是通过在内源基因的mRNA转录物中引入提前终止密码子。在一个方面，本公开提供导致内源基因的mRNA转录物中提前终止密码子的突变。如本文所用，“终止密码子”是指mRNA转录物中发出蛋白质翻译终止信号的核苷酸三联体。“提前终止密码子”是指在内源mRNA转录物中比正常终止密码子位置更早(例如，在5'侧)定位的终止密码子。不受限制，本领域已知几种终止密码子，包括“UAG”、“UAA”、“UGA”、“TAG”、“TAA”和“TGA”。
在一个方面，本文提供的突变包括无效突变。如本文所用，“无效突变”是指赋予由包含突变的基因编码的蛋白质完全丧失功能的突变，或者赋予由基因组基因座编码的小RNA完全丧失功能的突变。无效突变可导致mRNA转录产物的缺乏、小RNA转录产物的缺乏，蛋白质功能的缺乏或其组合。
本文提供的突变可以位于内源基因的任何部分。在一个方面，本文提供的突变位于内源基因的外显子内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的内含子内。在进一步的方面，本文提供的突变位于内源基因的5'-非翻译区内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的3'-非翻译区内。在又一方面，本文提供的突变位于内源基因的启动子内。
诱变烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNase保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的下一代测序技术(例如Illumina,PacBio,Ion Torrent,454)酶测定，以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其它技术(诸如原位杂交、酶染色和免疫染色)也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于实施所有参考技术的方法是已知的。
在一个方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平降低。在另一方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平增加。在进一步的方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。在进一步的方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。
在一个方面，与缺乏突变的基因组基因座相比，基因组基因座中的突变导致表达水平降低。在另一方面，与缺乏突变的基因组基因座相比，基因组基因座中的突变导致表达水平增加。在进一步的方面，与由缺乏突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽相比，基因组基因座中的突变导致由具有突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。在进一步的方面，与由缺乏突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽相比，基因组基因座中的突变导致由具有突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。
在本领域中，常规地研究基因表达水平。作为非限制性实例，可以使用定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、RNA测序或Northern印迹测量基因表达。在一个方面，使用qRT-PCR测量基因表达。另一方面，使用Northern印迹测定基因表达。在另一方面，使用RNA测序测量基因表达。
在本领域中，还常规地研究蛋白活性水平。例如，可以使用磷酸化测定来测量CDK活性。
如本文所用，术语“异源”是指两种或更多种DNA分子或序列(例如启动子)和相关的可转录DNA序列、编码序列或基因的组合，当这样的组合是人造的并且在自然界中通常不存在时。
在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少1％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少5％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少10％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少15％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少20％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少25％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少50％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少75％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少90％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低至少95％。
在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低1％-99％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低1％-90％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低1％-75％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低1％-50％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低1％-25％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低1％-10％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低75％-99％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低50％-99％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低25％-99％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低10％-99％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低50％-75％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低25％-75％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平降低10％-50％。
在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少1％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少5％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少10％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少15％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少20％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少25％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少50％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少75％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少90％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少95％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少100％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少150％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少200％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少250％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少300％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少400％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少500％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少750％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加至少1000％。
在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-1000％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-750％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-500％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-400％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-300％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-200％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-100％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-75％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-50％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-25％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-10％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加100％-1000％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加100％-750％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加100％-500％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加100％-250％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加750％-1000％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加500％-1000％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加250％-1000％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加1％-100％。在一个方面，与缺乏突变的内源基因的表达水平相比，包含突变的内源基因的表达水平增加50％-100％。
本文所用的术语“内源基因”或“天然基因”是指来源于烟草基因组的基因。“内源基因”是之前未通过人作用修饰的基因。一方面，内源基因是核基因。另一方面，内源基因是线粒体基因。在另一方面，内源基因是叶绿体基因。
如本文所用，“基因”是指可产生功能单位(例如但不限于例如蛋白质或小RNA分子)的多核苷酸。基因可包含启动子、增强子序列、前导序列、转录起始位点、转录终止位点、聚腺苷酸化位点、一个或多个外显子、一个或多个内含子、5’-非翻译区(UTR)、3’-UTR或其任何组合。“基因序列”可包含编码启动子、增强子序列、前导序列、转录起始位点、转录终止位点、聚腺苷酸化位点、一个或多个外显子、一个或多个内含子、5’-UTR，3’-UTR或其任何组合的多核苷酸序列。一方面，基因编码小RNA分子或其前体。另一方面，基因编码蛋白质或多肽。
如本文所用，“基因组基因座”是指染色体上的固定位置。在一个方面，基因组基因座包含编码基因的多核苷酸。在一个方面，基因组基因座包含编码内源基因的多核苷酸。另一方面，基因组基因座包含编码转基因的多核苷酸。在一个方面，基因组基因座可以从DNA转录为RNA。在一个方面，基因组基因座编码信使RNA。另一方面，基因组基因座编码小RNA分子。
如本领域通常理解的，术语“启动子”是指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并辅助或促进相关的可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可以合成产生自、改变自或衍生自已知或天然存在的启动子序列或其它启动子序列。启动子还可以包括含有两种或多种异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本申请的启动子可包括组成上与本文已知或提供的其它启动子序列相似但不相同的启动子序列的变体。
在植物的所有或大部分组织中驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段驱动表达的启动子称为“发育型”启动子。相对于生物体的其它组织，在生物体的某些组织中驱动增强的表达的启动子称为“组织优选的”启动子。因此，“组织优选的”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优选的表达，但在植物的其它组织中具有较低的表达水平。作为非限制性实例，“腋芽优选的启动子”在腋芽组织中引起相对较高或优选的表达，但在植物的其它部分(例如根、叶、茎)中可具有较低的表达水平。在生物体的特定组织中表达而在其它组织中很少表达或不表达的启动子称为“组织特异性”启动子。作为非限制性实例，“腋芽特异性启动子”驱动在腋芽组织中的表达，而在其它植物组织类型中很少表达或检测不到表达。“诱导型”启动子是响应环境刺激(如热、冷、干旱、光)或其它刺激(如创伤或化学应用)而启动转录的启动子。
在一个方面，本文提供的启动子是腋芽特异性启动子。在另一方面，本文提供的启动子是腋芽优选的启动子。在一个方面，本文提供的启动子是组成型启动子。在另一方面，本文提供的启动子是诱导型启动子。在进一步的方面，本文提供的启动子是发育型启动子。
在一个方面，本公开提供异源启动子。在另一方面，本公开提供与异源多核苷酸可操作地连接的启动子。在另一方面，本公开提供与异源启动子可操作地连接的多核苷酸序列。
在一个方面，异源启动子包含腋芽特异性启动子。另一方面，异源启动子包括腋芽优选的启动子。在一个方面，异源启动子包含组成型启动子。在一个方面，异源启动子包括诱导型启动子。在一个方面，异源启动子包含发育型启动子。
如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能连接。例如，目标多核苷酸与调控序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。在一个方面，本文提供的启动子与异源核酸分子可操作地连接。
在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少91％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少92％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少93％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ IDNO:89-109的多核苷酸至少94％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQID NO:89-109的多核苷酸至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽优选的启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少90％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少95％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQID NO:89-109的多核苷酸至少96％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少97％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少98％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸至少99％相同的多核苷酸序列。在一个方面，腋芽特异性启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸100％相同的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物，其包含与异源启动子可操作地连接的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
在另一方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，包括：(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码多肽的核酸的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子；(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在一个方面，该方法还包括(d)使在步骤(c)中再生的经修饰的烟草植物生长。在另一方面，该方法还包括(e)使在步骤(d)中生长的经修饰的烟草植物与第二烟草植物杂交；和(f)从步骤(e)中的杂交获得至少一个种子。
在一个方面，本公开提供包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的核酸可操作地连接的异源启动子。在一个方面，该方法还包括从所述烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物包含所述重组DNA构建体。
在一个方面，本公开提供包含本文提供的多核苷酸的重组DNA构建体。如本文所用，术语“重组DNA构建体”是指通过遗传重组的实验室方法(如分子克隆)形成的构建体。在一个方面，重组DNA构建体是合成产生的。另一方面，重组DNA构建体包含与异源多核苷酸序列可操作连接的启动子。在一个方面，重组DNA构建体包含编码氨基酸序列的多核苷酸序列。另一方面，重组DNA构建体包含编码小RNA或其前体的多核苷酸序列。在一个方面，重组DNA构建体包含质粒。另一方面，重组DNA构建体包含载体。
如本文所用，术语“载体”或“质粒”可互换使用，是指与染色体DNA物理分离的环状双链DNA分子。在一个方面，本文使用的质粒或载体能够在体内复制。如本文所用，“转化载体”是能够转化植物细胞的质粒。在一个方面，本文提供的质粒是细菌质粒。在另一个方面，本文提供的质粒是土壤杆菌Ti质粒或源自土壤杆菌Ti质粒。
在一个方面，本文提供的载体包含启动子。在一个方面，本文提供的载体包含腋芽特异性启动子。在一个方面，本文提供的载体包含腋芽优选的启动子。在另一方面，本文提供的载体包含小RNA。另一方面，本文提供的载体包含小RNA前体。在一个方面，本文提供的载体包含人工miRNA。在另一方面，本文提供的载体包含人工miRNA前体。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少80％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少85％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少90％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少95％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ IDNO:1-44和89-113的序列至少96％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少97％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少98％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列至少99％相同的序列，或其片段。另一方面，本文提供的载体包含与选自SEQ ID NO:1-44和89-113的序列100％相同的序列，或其片段。
如本文所用，核酸序列或氨基酸序列的“片段”包含连续的序列区段，其包含参考序列总长度的1％-99.99％。例如，如果核酸序列包含1000个核苷酸，则核酸序列的片段可包含参考序列的10-999个连续核苷酸之间的任何数目。本公开明确提供SEQ ID NO:1-114中每一个的片段，其中引用了SEQ ID NO:1-114。
将重组DNA构建体导入植物细胞的许多方法是本领域已知的，其可根据本申请的方法使用以产生转基因植物细胞和植物。根据本发明的方法，可以使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，如农杆菌介导的或根瘤菌介导的转化和微粒轰击介导的转化。本领域已知多种方法通过细菌介导的转化或微粒轰击用转化载体转化外植体，然后培养这些外植体以再生或发育转基因植物。植物转化的其它方法，如微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声处理、碳化硅纤维搅拌、聚乙二醇(PEG)介导的转化等，也是本领域已知的。取决于所用的方法和外植体，通过这些转化方法产生的转基因植物对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。
转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员熟知的。例如，美国专利号5,550,318；5,538,880 6,160,208；6,399,861；和6,153,812发现了通过用包被有重组DNA的颗粒进行微粒轰击(例如，基因枪转化)来转化植物细胞的具体说明；以及美国专利号5,159,135；5,824,877；5,591,616；6,384,301；5,750,871；5,463,174；和5,188,958描述了农杆菌介导的转化，其均通过引用以其整体并入本文。转化植物的其它方法可见于例如Compendium of Transgenic Crop Plants(2009)Blackwell Publishing。本领域技术人员已知的任何合适的方法可用于用本文提供的任何核酸分子转化烟草细胞。
在一个方面，向烟草细胞提供核酸分子的方法包括农杆菌介导的转化。另一方面，向细胞提供核酸分子的方法包括PEG介导的转化。另一方面，向细胞提供核酸分子的方法包括基因枪转化。另一方面，向细胞提供核酸分子的方法包括脂质体介导的转染(脂质转染)。另一方面，向细胞提供核酸分子的方法包括慢病毒转染。
脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386,4,946,787；和4,897,355中，并且脂质转染试剂是市售的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括WO91/17424和WO91/16024的那些。可以向细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)进行递送。
预期可以再生可育的烟草植物的任何烟草细胞是用于实践本公开的有用的受体细胞。在一个方面，将重组DNA构建体引入烟草细胞。在一个方面，将重组DNA构建体引入烟草原生质体细胞。另一方面，将重组DNA构建体引入烟草愈伤组织细胞。在一个方面，将重组DNA构建体引入烟草细胞，所述烟草细胞选自种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、芽细胞、干细胞、花细胞、花序细胞、茎细胞、梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、丝细胞、卵巢细胞、胚珠细胞、果皮细胞和韧皮细胞。
愈伤组织可以源自各种组织来源，包括但不限于未成熟胚或胚的部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖为愈伤组织的那些细胞可用作转化的受体细胞。用于制备本公开的转基因植物的实际转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化、以及随后的可育转基因植物的再生)公开于，例如，美国专利6,194,636和6,232,526和美国专利申请公开2004/0216189，其全部通过引用并入本文。
在一个方面，本公开提供包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在另一方面，本公开提供包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
在进一步的方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，包括：(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码多肽的核酸的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子；(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在一个方面，该方法还包括(d)使在步骤(c)中再生的经修饰的烟草植物生长。在另一方面，该方法还包括(e)使在步骤(d)中生长的经修饰的烟草植物与第二烟草植物杂交；和(f)从步骤(e)中的杂交获得至少一个种子。
在另一个方面，本公开提供包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。在一个方面，该方法还包括从所述烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物包含所述重组DNA构建体。
如本文所用，术语“小RNA分子”是指任何非编码RNA分子。除了提供小RNA分子之外，本公开还为每个小RNA分子提供小RNA前体分子。
在一个方面，小RNA分子包含18个核苷酸至30个核苷酸的长度。在另一方面，小RNA分子包含18个核苷酸至24个核苷酸的长度。在另一方面，小RNA分子包含18个核苷酸至22个核苷酸的长度。
另一方面，小RNA分子的长度为18个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为19个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为20个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为21个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为22个核苷酸。另一方面，小RNA分子长度为23个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为24个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为25个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为26个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为27个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为28个核苷酸。
另一方面，小RNA分子的长度为至少18个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少19个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少20个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少21个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少22个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少23个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少24个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少25个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少26个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少27个核苷酸。另一方面，小RNA分子的长度为至少28个核苷酸。
在一个方面，小RNA分子包含18个核苷酸至30个核苷酸。另一方面，小RNA分子包含18个核苷酸至24个核苷酸。另一方面，小RNA分子包含18个核苷酸至21个核苷酸。另一方面，小RNA分子包含21个核苷酸至24个核苷酸。在另一方面，小RNA分子包含21个核苷酸至30个核苷酸。
在一个方面，本文提供的小RNA分子是microRNA(miRNA)。在一个方面，本文提供的小RNA分子是人工miRNA。在另一方面，本文提供的小RNA分子是小干扰RNA(siRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是异色siRNA(hc-siRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是Piwi-相互作用RNA(piRNA)。在一个方面，本文提供的小RNA分子是双链RNA(dsRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是发夹双链RNA(hp-dsRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是反式作用siRNA(ta-siRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是Cas9-指导RNA(gRNA)。在另一方面，本文提供的小RNA分子是Cpf1-gRNA。在另一方面，本文提供的小RNA分子是CasX-gRNA。在另一方面，本文提供的小RNA分子是Csm1-gRNA。
一方面，小RNA分子选自dsRNA、siRNA、ta-siRNA和miRNA。另一方面，小RNA分子选自miRNA、siRNA、hc-siRNA、piRNA、dsRNA、hp-dsRNA、ta-siRNA、nat-siRNA、Cas9-gRNA、Cpf1-gRNA、CasX-gRNA和Csm1-gRNA。
在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少90％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少91％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少92％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少93％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少94％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少95％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少96％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少97％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少98％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有至少99％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的小RNA分子包含与内源mRNA具有100％同一性或互补性的多核苷酸序列。
在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少85％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少90％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少91％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少92％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少93％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少94％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少95％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少96％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少97％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少98％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少99％同一性或互补性的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有100％同一性或互补性的多核苷酸序列。
在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少16个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ IDNO:1-44和113的多核苷酸序列的至少17个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少19个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少20个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少21个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少22个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少23个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少24个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少25个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少26个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少27个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少28个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少29个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。在一个方面，小RNA分子包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列的至少30个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供能够降低编码细胞周期蛋白的多核苷酸的表达的小RNA。在一个方面，本公开提供能够降低编码细胞周期蛋白的多核苷酸的翻译的小RNA。在一个方面，本公开提供能够降低编码CDK的多核苷酸的表达的小RNA。在一个方面，本公开提供能够减少编码CDK的多核苷酸的翻译的小RNA。在一个方面，本公开提供能够降低编码CDKI的多核苷酸的表达的小RNA。在一个方面，本公开提供能够降低编码CDKI的多核苷酸的翻译的小RNA。一方面，本公开提供能够降低编码MYB的多核苷酸的表达的小RNA。一方面，本公开提供能够降低编码MYB的多核苷酸的翻译的小RNA。一方面，本公开提供能够降低编码WRKY转录因子的多核苷酸的表达的小RNA。在一个方面，本公开提供能够降低编码WRKY转录因子的多核苷酸的翻译的小RNA。
MicroRNA(miRNA)为非蛋白质编码RNA，通常具有约19至约25个核苷酸(通常在植物中约20-24个核苷酸)，其引导靶转录物反式切割，负调节参与各种调节和发育途径的基因的表达。在一些情况下，miRNA用于引导siRNA初级转录物的同相加工。
许多microRNA基因(MIR基因)被鉴定，并在数据库中公开获得(“miRBase”，可于microrna(dot)sanger(dot)ac(dot)uk/sequences在线获得；还参见Griffiths-Jones etal.(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。已报道MIR基因存在于基因间区域，分离的和基因组中的簇中，但也可完全或部分位于其它基因(编码蛋白和非编码蛋白)的内含子内。至少在一些情况中，MIR基因的转录可以在MIR基因自身启动子的促进控制下。称为“pri-miRNA”的初级转录物可以相当大(几千碱基)并且可以是多顺反子的，其含有一个或多个pre-miRNA(含有被加工成成熟miRNA的茎-环排列的折回结构)以及mRNA的通常的5’“帽”和多腺苷酸化尾部。
miRNA(无论天然存在的序列或人工序列)的转基因表达可用于调节miRNA靶基因的表达。在转基因表达的转录物中包含miRNA识别位点也可用于调节转录物的表达。已经在mRNA的所有区域中验证了miRNA的识别位点，包括5’非翻译区、编码区和3’非翻译区，表明miRNA靶位点相对于编码序列的位置可能不一定影响抑制。
因为miRNA是真核生物中的重要调节元件，因此miRNA的转基因抑制可用于操纵生物途径和反应。miRNA、它们的前体、它们的识别位点和它们的启动子的各种用途在通过引用并入本文的美国专利申请公开2006/0200878A1中有详细描述。这些用途的非限制性实例包括：(1)表达天然miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(2)表达人工miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(3)表达具有miRNA识别位点的转基因，其中当表达成熟miRNA时转基因被抑制；(4)表达由miRNA启动子驱动的转基因。
如Zeng等(2002)Mol.Cell,9:1327-1333所证明，对于miRNA前体的miRNA茎区中的核苷酸，设计人工miRNA序列可以像替换与预期靶标互补的序列一样简单。用于确定天然miRNA序列中的核苷酸变化以制备工程化miRNA前体的一般方法的一个非限制性实例包括以下步骤：(a)选择靶基因特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如，通过使用序列比对工具如烟草cDNA和基因组DNA数据库的BLAST(参见例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)，以鉴定靶转录物直系同源物和与无关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶标序列的无意沉默；(b)分析不需要的序列的靶基因(例如，与来自非靶标物种的序列匹配)，并对每个潜在的19-聚体片段的以下进行评分：GC含量、Reynolds得分(参见Reynolds等(2004)NatureBiotechnol.,22:326-330)和由自由能的负差异表征的功能不对称性(“.DELTA..DELTA.G”或“ΔΔG”)(参见Khvorova等(2003)Cell,114:209-216)。优选选择具有所有或大多数以下特征的19-聚体：(1)Reynolds得分>4，(2)GC含量为约40％至约60％，(3)负的ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏连续4个或更多个相同的核苷酸；(6)位于靶基因3'末端附近；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。据报道，siRNA中每个第三个核苷酸的位置对影响RNAi效力特别重要，可在rna.chem.tu-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm公开获得算法“siExplorer”(参见Katoh and Suzuki(2007)Nucleic Acids Res.,10.1093/nar/gkl1120)；(c)确定所选19聚体的反向互补序列用于制备修饰的成熟miRNA。第20位的其他核苷酸优选与选择的靶序列匹配，并且优选选择第21位的核苷酸不配对以防止沉默在靶转录物上扩散，或选择与靶序列配对以促进沉默在靶序列上扩散；和(d)将人工miRNA转入植物。
在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少18个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少19个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ IDNO:1-44和113的核酸序列的至少20个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少21个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少22个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少23个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少24个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列的至少25个连续核苷酸互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQID NO:1-44和113的核酸序列的至少26个连续核苷酸互补。
在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少75％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少80％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少85％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少90％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少91％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少92％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少93％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少94％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少95％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少96％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少97％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ ID NO:1-44和113的核酸序列至少98％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ IDNO:1-44和113的核酸序列至少99％互补。在一个方面，本文提供的人工miRNA与选自SEQ IDNO:1-44和113的核酸序列100％互补。
在一个方面，本文提供的人工miRNA减少或消除靶基因的RNA转录或蛋白质翻译。
在一个方面，人工miRNA或其前体可操作地连接至腋芽特异性启动子。在另一方面，人工miRNA或其前体可操作地连接至腋芽优选的启动子。在另一方面，人工miRNA或其前体可操作地连接至包含选自SEQ ID NO1:89-109的序列及其片段的启动子。
烟草在本领域中已知为来自茄科的植物。如本文所用，烟草植物可来自烟草属的任何植物，包括但不限于红花烟草(Nicotiana tabacum)、抱茎烟草(Nicotianaamplexicaulis)PI 271989；本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)PI 555478；毕基劳式烟草(Nicotiana bigelovii)PI 555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)；高烟草(Nicotiana excelsior)PI224063；粘烟草(Nicotiana glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana goodspeedii)PI 241012；哥西氏烟草(Nicotiana gossei)PI 230953；西烟草(Nicotiana hesperis)PI 271991；奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)PI 555527；滨海烟草(Nicotiana maritima)PI 555535；特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)PI555536；裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)PI 555540；圆锥烟草(Nicotiana paniculata)PI 555545；蓝茉莉叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)PI555548；残波烟草(Nicotianarepanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana rustica)；Nicotiana suaveolens PI 230960；林烟草(Nicotiana sylvestris)PI 555569；绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)PI 266379；绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)PI555572。在一个方面，本文所述的烟草植物是红花烟草植物。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物、种子、细胞、杂交种、品种或品系基本上衍生自以下或在以下的遗传背景中：BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、
Figure BDA0003446356220000751
GL 26H、GL338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA119、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY 907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、雄性不育KY 14x L8、Narrow Leaf Madole、MS KY171、Narrow Leaf Madole(phph)、MS Narrow Leaf Madole、MSTND950、PD 7302LC、PD 7305LC、PD 7309LC、PD 7312LC、PD 7318LC、PD 7319LC、MSTKS2002、TKF 2002、TKF 6400、TKF 4028、TKF 4024、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、NC100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、‘Perique’、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、a TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、VA 359，或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。
在一个方面，经修饰的烟草植物选自BU 64植物、CC 101植物、CC 200植物、CC 13植物、CC 27植物、CC 33植物、CC 35植物、CC 37植物、CC 65植物、CC 67植物、CC 301植物、CC 400植物、CC 500植物、CC 600植物、CC 700植物、CC 800植物、CC 900植物、CC 1063植物、Coker 176植物、Coker 319植物、Coker 371Gold植物、Coker 48植物、CU 263植物、DF911植物、Galpao植物、GL 26H植物、GL 338植物、GL 350植物、GL 395植物、GL 600植物、GL 737植物、GL 939植物、GL 973植物、GF 157植物、GF 318植物、RJR 901植物、HB 04P植物、K 149植物、K 326植物、K 346植物、K 358植物、K394植物、K 399植物、K 730植物、NC196植物、NC 37NF植物、NC 471植物、NC 55植物、NC 92植物、NC2326植物、NC 95植物、NC925植物、PVH 1118植物、PVH 1452植物、PVH 2110植物、PVH 2254植物、PVH 2275植物、VA116植物、VA 119植物、KDH 959植物、KT 200植物、KT204LC植物、KY 10植物、KY 14植物、KY160植物、KY 17植物、KY 171植物、KY 907植物、KY 907LC植物、KTY14 x L8 LC植物、LittleCrittenden植物、McNair 373植物、McNair 944植物、雄性不育KY 14x L8植物、NarrowLeaf Madole植物、MS KY171植物、Narrow Leaf Madole(phph)植物、MS Narrow LeafMadole植物、MS TND950植物、PD 7302LC植物、PD 7305LC植物、PD 7309LC植物、PD 7312LC植物、PD 7318LC植物、PD 7319LC植物、MSTKS 2002植物、TKF 2002植物、TKF 6400植物、TKF4028植物、TKF 4024植物、KT206LC植物、KT209LC植物、KT210LC植物、KT212LC植物、NC 100植物、NC 102植物、NC 2000植物、NC 291植物、NC 297植物、NC 299植物、NC 3植物、NC 4植物、NC 5植物、NC 6植物、NC7植物、NC 606植物、NC 71植物、NC 72植物、NC 810植物、NC BH129植物、NC 2002植物、Neal Smith Madole植物、OXFORD 207植物、‘Perique’植物、PVH03植物、PVH09植物、PVH19植物、PVH50植物、PVH51植物、R 610植物、R 630植物、R 7-11植物、R7-12植物、RG 17植物、RG 81植物、RG H51植物、RGH 4植物、RGH 51植物、RS 1410植物、Speight 168植物、Speight 172植物、Speight 179植物、Speight 210植物、Speight 220植物、Speight 225植物、Speight 227植物、Speight 234植物、Speight G-28植物、SpeightG-70植物、Speight H-6植物、Speight H20植物、Speight NF3植物、TI 1406植物、TI 1269植物、TN 86植物、TN86LC植物、TN 90植物、TN90LC植物、TN 97植物、TN97LC植物、TN D94植物、TN D950植物、TR(Tom Rosson)Madole植物、VA 309植物和VA 359植物。
在另一方面，经修饰的烟草细胞选自BU 64细胞、CC 101细胞、CC 200细胞、CC 13细胞、CC 27细胞、CC 33细胞、CC 35细胞、CC 37细胞、CC 65细胞、CC 67细胞、CC 301细胞、CC 400细胞、CC 500cell、CC 600细胞、CC 700细胞、CC 800细胞、CC 900细胞、CC 1063细胞、Coker 176细胞、Coker 319细胞、Coker 371Gold细胞、Coker 48细胞、CU 263细胞、DF911细胞、Galpao细胞、GL 26H细胞、GL 338细胞、GL 350细胞、GL 395细胞、GL 600细胞、GL 737细胞、GL 939细胞、GL 973细胞、GF 157细胞、GF 318细胞、RJR 901细胞、HB 04P细胞、K 149细胞、K 326细胞、K 346细胞、K 358细胞、K394细胞、K 399细胞、K 730细胞、NC196细胞、NC 37NF细胞、NC 471细胞、NC 55细胞、NC 92细胞、NC2326细胞、NC 95细胞、NC925细胞、PVH 1118细胞、PVH 1452细胞、PVH 2110细胞、PVH 2254细胞、PVH 2275细胞、VA116细胞、VA 119细胞、KDH 959细胞、KT 200细胞、KT204LC细胞、KY 10细胞、KY 14细胞、KY160细胞、KY 17细胞、KY 171细胞、KY 907细胞、KY 907LC细胞、KTY14 x L8 LC细胞、LittleCrittenden细胞、McNair 373细胞、McNair 944细胞、雄性不育KY 14x L8细胞、NarrowLeaf Madole细胞、MS KY171细胞、Narrow Leaf Madole(phph)细胞、MS Narrow LeafMadole细胞、MS TND950 cell、a PD 7302LC细胞、PD 7305LC细胞、PD 7309LC细胞、PD7312LC细胞、PD 7318LC细胞、PD 7319LC细胞、MSTKS 2002细胞、TKF 2002细胞、TKF 6400细胞、TKF 4028细胞、TKF 4024细胞、KT206LC细胞、KT209LC细胞、KT210LC cell、a KT212LCcell、an NC 100细胞、NC 102细胞、NC 2000细胞、NC 291细胞、NC 297细胞、NC 299细胞、NC3细胞、NC 4细胞、NC 5细胞、NC 6细胞、NC7细胞、NC 606细胞、NC 71细胞、NC 72细胞、NC810细胞、NC BH 129细胞、NC 2002细胞、Neal Smith Madole细胞、OXFORD 207细胞、‘Perique’细胞、PVH03细胞、PVH09细胞、PVH19细胞、PVH50细胞、PVH51细胞、R 610细胞、R630细胞、R 7-11细胞、R 7-12细胞、RG 17细胞、RG 81细胞、RG H51细胞、RGH 4细胞、RGH 51细胞、RS 1410细胞、Speight 168细胞、Speight 172细胞、Speight 179细胞、Speight 210细胞、Speight 220细胞、Speight 225细胞、Speight 227细胞、Speight 234细胞、SpeightG-28细胞、Speight G-70细胞、Speight H-6细胞、Speight H20细胞、Speight NF3细胞、TI1406细胞、TI 1269细胞、TN 86细胞、TN86LC细胞、TN 90细胞、TN90LC细胞、TN 97细胞、TN97LC细胞、TN D94细胞、TN D950细胞、TR(Tom Rosson)Madole细胞、VA 309细胞和VA 359细胞。
在另一方面，经修饰的烟草种子选自BU 64种子、CC 101种子、CC 200种子、CC 13种子、CC 27种子、CC 33种子、CC 35种子、CC 37种子、CC 65种子、CC 67种子、CC 301种子、CC 400种子、CC 500seed、CC 600种子、CC 700种子、CC 800种子、CC 900种子、CC 1063种子、Coker 176种子、Coker 319种子、Coker 371Gold种子、Coker 48种子、CU 263种子、DF911种子、Galpao种子、GL 26H种子、GL 338种子、GL 350种子、GL 395种子、GL 600种子、GL 737种子、GL 939种子、GL 973种子、GF 157种子、GF 318种子、RJR 901种子、HB 04P种子、K 149种子、K 326种子、K 346种子、K 358种子、K394种子、K 399种子、K 730种子、NC196种子、NC 37NF种子、NC 471种子、NC 55种子、NC 92种子、NC2326种子、NC 95种子、NC925种子、PVH 1118种子、PVH 1452种子、PVH 2110种子、PVH 2254种子、PVH 2275种子、VA116种子、VA 119种子、KDH 959种子、KT 200种子、KT204LC种子、KY 10种子、KY 14种子、KY160种子、KY 17种子、KY 171种子、KY 907种子、KY 907LC种子、KTY14 x L8 LC种子、LittleCrittenden种子、McNair 373种子、McNair 944种子、雄性不育KY 14x L8种子、NarrowLeaf Madole种子、MS KY171种子、Narrow Leaf Madole(phph)种子、MS Narrow LeafMadole种子、MS TND950 seed、a PD 7302LC种子、PD 7305LC种子、PD 7309LC种子、PD7312LC种子、PD 7318LC种子、PD 7319LC种子、MSTKS 2002种子、TKF 2002种子、TKF 6400种子、TKF 4028种子、TKF 4024种子、KT206LC种子、KT209LC种子、KT210LC seed、a KT212LCseed、an NC 100种子、NC 102种子、NC 2000种子、NC 291种子、NC 297种子、NC 299种子、NC3种子、NC 4种子、NC 5种子、NC 6种子、NC7种子、NC 606种子、NC 71种子、NC 72种子、NC810种子、NC BH 129种子、NC 2002种子、Neal Smith Madole种子、OXFORD 207种子、‘Perique’种子、PVH03种子、PVH09种子、PVH19种子、PVH50种子、PVH51种子、R 610种子、R630种子、R 7-11种子、R 7-12种子、RG 17种子、RG 81种子、RG H51种子、RGH 4种子、RGH 51种子、RS 1410种子、Speight 168种子、Speight 172种子、Speight 179种子、Speight 210种子、Speight 220种子、Speight 225种子、Speight 227种子、Speight 234种子、SpeightG-28种子、Speight G-70种子、Speight H-6种子、Speight H20种子、Speight NF3种子、TI1406种子、TI 1269种子、TN 86种子、TN86LC种子、TN 90种子、TN90LC种子、TN 97种子、TN97LC种子、TN D94种子、TN D950种子、TR(Tom Rosson)Madole种子、VA 309种子和VA 359种子。
如本文所用，“烟草植物”是指整个烟草植物。衍生自烟草植物的烟草细胞或烟草组织培养物可包含任何烟草植物部分或烟草植物器官(例如叶、茎、根等)、烟草植物组织、烟草种子、烟草植物细胞和/或其后代。子代植物可以来自任何子代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。烟草植物细胞是烟草植物的生物细胞，取自烟草植物或通过培养取自烟草植物的细胞而衍生。如本文所用，“幼苗”是指等于或小于萌发后14天的烟草植物。
在一个方面，本文提供的植物组分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、果荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、嫩芽、细胞和原生质体。在进一步的方面，本公开提供不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一方面，本公开还提供是繁殖材料并介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。在另一方面，本发明提供不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。在另一方面，本公开提供体细胞植物细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
所提供的烟草细胞、烟草组织和烟草器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、嫩芽、茎、果荚、花、花序、叶柄、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部和维管组织。另一方面，本公开提供烟草植物叶绿体。在进一步的方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、毛状体细胞、根毛或贮藏根。
在一个方面，本公开提供烟草原生质体细胞。在另一方面，本公开提供烟草愈伤组织细胞。在另一方面，本发明提供烟草种子细胞。在另一方面，本公开提供烟草果实细胞。在另一方面，本公开提供烟叶细胞。在另一方面，本公开提供烟草子叶细胞。在另一方面，本公开提供烟草下胚轴细胞。在另一方面，本公开提供烟草分生组织细胞。在另一方面，本公开提供烟草胚细胞。在另一方面，本公开提供烟草根细胞。在另一个方面，本发明提供烟草茎细胞。在另一方面，本公开提供烟草干细胞。在另一方面，本公开提供烟草花细胞。在另一方面，本公开提供烟草花序细胞。在另一方面，本发明提供烟草茎细胞。在另一个方面，本公开提供烟草花梗细胞。在另一方面，本公开提供烟草花柱细胞。在另一方面，本公开提供烟草柱头细胞。在另一方面，本发明提供烟草花托细胞。在另一方面，本发明提供烟草花瓣细胞。在另一方面，本发明提供烟草萼片细胞。在另一个方面，本公开提供烟草花粉细胞。在另一方面，本发明提供烟草花药细胞。在另一方面，本公开提供烟草花丝细胞。在另一方面，本公开提供烟草子房细胞。在另一方面，本公开提供烟草胚珠细胞。在另一方面，本公开提供烟草果皮细胞。在另一方面，本公开提供烟草韧皮部细胞。
本公开提供经修饰的烟草植物、经修饰的烟草植物部分、经修饰的烟草种子和经修饰的烟草细胞及其制备方法。在一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物的烟叶。在另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物的烟草种子。在另一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物的烟草茎。在另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物的烟草植物部分。在另一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物的烟草细胞。在另一个方面，本公开提供经修饰的烟草植物的干燥烟叶。在又一方面，本公开提供经修饰的烟草植物的熟化烟叶。在另一个方面，本公开提供了经修饰的烟草植物的发酵烟叶。
在另一方面，本公开提供了从经修饰的烟草植物提取的生物碱。在另一方面，本公开提供了从经修饰的烟草植物提取的烟碱。在另一方面，本公开提供了从经修饰的烟草植物提取的新烟草碱。在另一方面，本公开提供了从经修饰的烟草植物提取的假木贼碱。在另一方面，本公开提供了从经修饰的烟草植物提取的降烟碱。
在一个方面，经修饰的烟草植物、植物部分、种子、细胞或基因组是顺化的。如本文所用，“顺化”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。本文提供的转基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。在另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物不包含非烟草遗传物质或序列。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加的叶产量质量。一方面，叶产量选自鲜叶产量质量、干叶产量质量和熟化叶产量质量。
在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少0.5％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少0.5％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少0.5％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少0.5％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少1％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少1％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少1％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少1％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少2％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少2％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少2％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少2％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少3％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少3％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少3％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少3％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少4％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少4％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少4％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少4％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少5％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少5％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少5％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少5％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少250％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少250％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少250％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少250％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少25％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少25％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少25％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少25％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少50％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少50％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少50％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少50％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少75％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少75％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少75％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少75％的熟化叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少100％的叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少100％的鲜叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少100％的干叶产量质量。在一个方面，当在可比的条件下生长时，与对照烟草植物相比，经修饰的植物包含增加至少100％的熟化叶产量质量。
“熟化”是一种陈化过程，其减少水分并导致叶绿素的破坏，使烟叶呈现金黄色，淀粉也转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。在一个方面，本文提供的烟草植物或植物组分可以使用常规方法熟化，例如烤制熟化、仓房熟化(barn-cured)、明火烤制熟化、晾制熟化或晒制熟化。对于各种类型的熟化方法的描述，参见例如(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化烟草通常在水分含量为10％至约25％的压缩条件下在木桶(例如大桶)或纸板箱中陈化数年(例如2至5年)。参见美国专利号4,516,590和5,372,149。然后，可以进一步加工熟化和陈化的烟草。进一步加工包括在引入或不引入各种温度的蒸汽、巴氏杀菌和发酵的情况下在真空下调制烟草。
在一个方面，本文提供的熟化烟叶选自晾制熟化烟叶、明火烤制熟化烟叶、晒制熟化烟叶和烤制熟化烟叶。在另一方面，本文提供的熟化烟草材料选自晾制熟化烟草材料、明火烤制熟化烟草材料、晒制熟化烟草材料和烤制烟草材料。在一个方面，熟化的烟叶来自选自以下的烟草品种：烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、深色品种、东方品种和土耳其品种。在另一方面，熟化烟草材料来自选自以下的烟草品种：烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、深色品种、东方品种和土耳其品种。
典型地，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公开号2005/0178398；和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。可以进一步加工熟化的、陈化的和发酵的烟草(例如切割、切碎、膨化或混合)。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577和4,987,907。在一个方面，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化、晒制熟化、晾制熟化或明火烤制熟化。
在一个方面，本文提供的烟草植物、种子、植物部分、植物细胞和植物基因组来自选自以下的烟草类型：烤制熟化烟草、晒制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草和深色明火烤制熟化烟草。在另一个方面，本文提供的烟草植物、种子、植物部分、植物细胞和植物基因组来自选自以下的烟草类型：白肋烟草、马里兰烟草、金黄色烟草、弗吉尼亚烟草、东方烟草、土耳其烟草和
Figure BDA0003446356220000861
烟草。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物是选自下组的烟草品种：烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、
Figure BDA0003446356220000862
品种、深色品种、东方品种和土耳其品种。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物选自烤制熟化品种烟草植物、金黄色品种烟草植物、白肋品种烟草植物、弗吉尼亚品种烟草植物、马里兰品种烟草植物、
Figure BDA0003446356220000863
品种烟草植物、深色品种烟草植物、东方品种烟草植物和土耳其品种烟草植物。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草细胞选自烤制熟化品种烟草细胞、金黄色品种烟草细胞、白肋品种烟草细胞、弗吉尼亚品种烟草细胞、马里兰品种烟草细胞、
Figure BDA0003446356220000864
品种烟草细胞、深色品种烟草细胞、东方品种烟草细胞和土耳其品种烟草细胞。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物部分选自烤制熟化品种烟草植物部分、金黄色品种烟草植物部分、白肋品种烟草植物部分、弗吉尼亚品种烟草植物部分、马里兰品种烟草植物部分、
Figure BDA0003446356220000865
品种烟草植物部分、深色品种烟草植物部分、东方品种烟草植物部分和土耳其品种烟草植物部分。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草种子选自烤制熟化品种烟草种子、金黄色品种烟草种子、白肋品种烟草种子、弗吉尼亚品种烟草种子、马里兰品种烟草种子、
Figure BDA0003446356220000866
品种烟草种子、深色品种烟草种子、东方品种烟草种子和土耳其品种烟草种子。
如本文所用，通过杂交来自不同品种或物种的两种植物产生“杂交种”，使得子代包含来自每个亲本的遗传物质。熟练的技术人员认识到也可以生成更高阶的杂交种。例如，可以通过将品种C与品种D杂交以产生C x D杂交种来制备第一杂交种，并且可以通过将品种E与品种F杂交以产生E x F杂交种来制备第二杂交种。可以进一步杂交第一和第二杂交种以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的高阶杂交种(C x D)x(E x F)。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物是杂交烟草植物。在另一方面，本文提供的经修饰的烟草种子是杂交烟草种子。
如本文所用，术语“杂交”是指两种植物的有意交配。一方面，杂交包括第一烟草植物被第二烟草植物授粉和/或受精。被杂交的两种烟草植物可以是远亲、近亲或相同的。在一个方面，被杂交的两种烟草植物都是经修饰的烟草植物。一方面，被杂交的两种烟草植物是相同的烟草品种。在一个方面，被杂交的两种烟草植物是两种不同的烟草品种。在一个方面，被杂交的两种烟草植物之一是雄性不育的。在一个方面，被杂交的两种烟草植物之一是雌性不育的。在一个方面，被杂交的两种烟草植物中的至少一种是杂交烟草植物。在一个方面，被杂交的两种烟草植物中的至少一种是经修饰的烟草植物。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
在另一方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码多肽的核酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
在一个方面，本公开提供用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
在一个方面，本文提供的烟草品种是雄性不育。在另一个方面，本文提供的烟草品种是细胞质雄性不育(CMS)。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物是雄性不育。在另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物是细胞质雄性不育。雄性不育的烟草植物可以通过本领域已知的任何方法产生。产生雄性不育烟草的方法描述于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.CropSpecies.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp。
在另一个方面，本文提供的烟草品种是雌性不育。作为非限制性的实例，可以通过突变STIG1基因来制备雌性不育植物。参见例如Goldman等1994,EMBO Journal 13:2976-2984。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物是雌性不育。
烤制熟化烟草(也称为弗吉尼亚烟或金黄色烟)占世界烟草产量的约40％。因为在熟化期间其达到金黄色至深橘色，烤制熟化烟草也常常称为“金黄色烟”。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高，油含量低。主要的烤制熟化烟草种植国家有阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的烤制熟化烟草品种：CC 13、CC 27、CC 33、CC35、CC 37、CC65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC 102、NC 196、NC291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT 220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。在另一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的烤制熟化烟草品种：Coker 48、Coker 176、Coker 371-Gold、Coker 319、Coker 347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC37NF、NC 55、NC 60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、McNair373、McNair 944、Ox 207、Ox 414NF、Reams 126、Reams 713、Reams 744、RG 8、RG 11、RG13、RG 17、RG 22、RG 81、RG H4、RG H51、Speight H-20、Speight G-28、Speight G-58、Speight G-70、Speight G-108、Speight G-l11、Speight G-l17、Speight 168、Speight179、Speight NF-3、Va 116、Va 182，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。参见WO2004/041006A1。在另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自K326、K346和NC196的烤制熟化品种。
晾制熟化烟草包括“白肋”、“马里兰”和“深色”烟草。与晾制熟化烟草相关的共同因素是，熟化主要没有人工的热源和湿度。白肋烟的颜色是浅棕色至深棕色，油含量高、且糖含量低。白肋烟典型地在仓房里晾制熟化。主要的白肋烟种植国家有阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。
马里兰烟极度蓬松，具有良好的燃烧性能、低烟碱和中性的香气。主要的马里兰烟种植国家包括美国和意大利。
在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的白肋烟草品种：Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC2000、Tn 86、Tn 90、Tn 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、HB4488PLC、PD 7319LC、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。在另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的白肋烟草品种：TN90、KT209、KT206、KT212和HB4488。在另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的马里兰烟草品种：Md10、Md40、Md201、Md609、Md872和Md341。
深色晾制熟化烟草与其他类型的主要区别在于熟化过程，其赋予深色晾制熟化烟草中褐色至深棕色的颜色和独特的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产嚼烟和鼻烟。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的深色晾制熟化烟草品种：Sumatra、Jatim、Dominic Cubano、Besuki、One sucker、Green River、弗吉尼亚晒制熟化和Paragu Passado。
深色明火烤制熟化烟草通常用封闭的熟化室底板上的低燃烧木火熟化。深色明火烤制熟化烟草典型地用于制造管烟、卷烟、嚼烟、鼻烟和烈性雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要种植区域是美国的田纳西、肯塔基和弗吉尼亚。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的深色明火烤制熟化烟草品种：Narrow Leaf Madole、ImprovedMadole、Tom Rosson Madole、Newton's VH Madole、Little Crittenden、Green Wood、Little Wood、Small Stalk Black Mammoth、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF485、TN D94、TN D950、V309和V359。
东方烟草也称为希腊香气和土耳其烟草，因为它们典型地种植在东地中海区域，例如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马里亚。东方烟草品种的小的植物尺寸、小的叶尺寸和独特的香味特性是它们适应在其中它们发育的贫瘠土壤和胁迫气候条件的结果。在一个方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自以下的东方烟草品种：Izmir、Katerini、Samsun、Basma、Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova、Sinop、Izmit、Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。
本文提供的烟草植物、植物部分和烟草材料可用于任何烟草产品。如本文所用，“烟草产品”定义为意欲用于人类使用或消费的由烟草制备或衍生的任何产品。在一个方面，本文提供的烟草产品包含来自本文提供的烟草植物的熟化组分。在另一个方面，本文提供的烟草产品包含来自本文提供的烟草植物的熟化烟叶。在一个方面，本公开提供包含来自本文提供的任何烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在另一方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在另一方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在另一方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在另一方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在另一方面，本公开提供包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
在一个方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。在另一方面，本公开提供包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
可以从本文提供的任何烟草植物或植物部分提取或分离生物碱化合物。在一个方面，本文提供的烟草产品包含从经修饰的烟草植物或其部分提取的生物碱。在另一方面，本文提供的烟草产品包含从烟草植物或烟草植物部分提取的烟碱。在另一方面，本文提供的烟草产品包含从烟草植物或烟草植物部分提取的新烟草碱。在另一方面，本文提供的烟草产品包含从烟草植物或烟草植物部分提取的假木贼碱。在一个方面，本文提供的烟草产品包含从烟草植物或植物部分提取的降烟碱。在一个方面，本文提供的烟草产品包含从经修饰的烟草植物提取的生物碱，其中所述生物碱选自烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱。
从本文提供的烟草植物或烟草植物部分提取的生物碱化合物可用于生产适用于不可燃产品的组合物。示例性的不可燃产品包括电子卷烟(“e-卷烟”)、电子吸烟产品、e-蒸汽产品、雾化蒸汽产品和加热的烟草产品。在一个方面，本文提供的不可燃产品包含从本文提供的烟草植物或烟草植物部分提取的生物碱。在一个方面，本文提供的不可燃产品包含从本文提供的烟草植物或烟草植物部分提取的烟碱。在一个方面，本文提供的不可燃产品包含从本文提供的烟草植物或烟草植物部分提取的假木贼碱。在一个方面，本文提供的不可燃产品包含从本文提供的烟草植物或烟草植物部分提取的新烟草碱。在一个方面，本文提供的不可燃产品包含从本文提供的烟草植物或烟草植物部分提取的降烟碱。
在一个方面，本文提供的不可燃产品是e-卷烟。在另一方面，本文提供的不可燃产品是电子吸烟产品。在另一方面，本文提供的不可燃产品是雾化蒸汽产品。在另一方面，本文提供的不可燃产品是加热的烟草产品。在另一方面，本文提供的不可燃产品是e-蒸汽产品。
本文提供的烟草产品包括但不限于卷烟产品(例如卷烟、比迪烟、丁香烟)、雪茄产品(例如雪茄、雪茄包皮烟和小雪茄)、烟斗烟产品、衍生自烟草的产品、来自烟草的烟碱产品、无烟烟草产品(例如湿鼻烟、干鼻烟、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟、鼻烟)、膜、可嚼的(例如口香糖)、含片、溶解条、标签、片剂、成形部分、凝胶、消费品单元、不溶性基质、中空形状、再造烟草、膨化烟草等。参见例如美国专利公开号US 2006/0191548。
如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草产品。卷烟“棒”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)固定在滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷入卷烟纸的其他香料)，(3)外壳，(4)调味料，和(5)(混入烟草和替代品并卷入卷烟的)所有其他添加剂。
在一个方面，本公开提供了衍生的烟碱和从本文提供的经修饰的烟草植物产生用于产品的烟碱的方法。
在一个方面，本文提供的方法包括使用来自本文提供的经修饰的烟草植物的熟化烟叶制备烟草产品。
如本文所用，“再造烟草”是指加工成片状并切成条状以模拟烟草的由烟草粉末和其他烟草废料制成的一部分烟草填料。除了节省成本之外，再造烟草由于通过使用氨和糖之间的反应加工风味发展有助于香烟味道的贡献而非常重要。在一个方面，本文提供的烟草产品包含衍生自经修饰的烟草植物的再造烟草。
如本文所用，“膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀进行处理，使得烟草“膨化”，导致密度降低和填充能力增加。它减少了卷烟中使用的烟草的重量。
衍生自本公开的植物的烟草产品还包括卷烟和其他吸烟产品，特别是那些包括过滤元件的吸烟产品，其中可吸烟材料棒包括烟草混合物中的熟化烟草。在一个方面，本公开的烟草产品选自卷烟、丁香烟、比迪烟、雪茄、小雪茄、不通风香烟、通风过滤嘴香烟、烟斗烟、鼻烟(snuff)、鼻烟(snus)、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟产品。在另一个方面，本公开的烟草产品选自口香糖、片剂、锭剂和溶解条。
在一个方面，本文提供的烟草产品包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料。在另一方面，本文提供的烟草产品包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟叶材料。在另一方面，本文提供的烟草产品包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草茎材料。
在另一个方面，本公开的烟草产品是无烟烟草产品。无烟烟草产品不燃烧，包括但不限于嚼烟、潮湿无烟烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其典型地包装在大袋状包装中并用于塞子或捻。潮湿无烟烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，以松散的形式或以小袋的形式提供，并且典型地包装在圆形罐中并用作夹(pinch)在或放置在成人烟草消费者的脸颊和牙龈之间的小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是放在嘴里或用于鼻腔的精细研磨的烟草。在进一步的方面，本公开的烟草产品选自散叶嚼烟、塞嚼烟(plugchewing tobacco)、湿鼻烟和鼻烟(nasal snuff)。
本公开还提供一种制造烟草产品的方法，所述烟草产品包含来自本文提供的烟草植物的烟草材料。在一个方面，本文提供的方法包括调制由本文提供的烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其水分含量从约12.5％至约13.5％增加至约21％，混合经调制的烟草材料以产生所需的混合物。在一个方面，本文提供的制备烟草产品的方法进一步包含将所述混合物进行加料(casing)或调味。通常，在加料工序中，在混合物中加入加料或调味的材料，通过平衡化学组成来提高它们的质量并开发某些期望的风味特征。加料工艺的进一步细节可见于L.Davis和M.Nielsen主编的Tobacco Production,Chemistry andTechnology,Blackwell Science,1999。
本公开提供来自经修饰的烟草植物或其部分的烟草材料。从本公开的烟草植物、细胞、品系、品种或杂交种获得的烟草材料可用于制备烟草产品。在一个方面，烟草材料包括叶材料。在一个方面，烟草材料包括茎材料。在一个方面，烟草材料包括新鲜烟草材料。在另一方面，烟草原料包括干烟草材料。在进一步的方面，烟草材料包括熟化烟草材料。在又一方面，烟草原料包括发酵烟草材料。在一个方面，本文提供的烟草材料可用于本文提供的任何烟草产品。在一个方面，本文提供的熟化烟草材料包含晾制熟化烟草材料。在另一方面，本文提供的熟化烟草材料包含明火烤制熟化烟草材料。在另一方面，本文提供的熟化烟草材料包含晒制熟化烟草材料。在另一方面，本文提供的熟化烟草材料包含烤制熟化烟草材料。在另一方面，本文提供的熟化烟草材料选自晾制熟化烟草材料、明火烤制熟化烟草材料、晒制熟化烟草材料和烤制熟化烟草材料。
本文提供的烟草材料也可以使用包括但不限于热处理(例如烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨化和/或熟化的方法进行加工。可以使用这些技术加工发酵和非发酵烟草。合适的加工烟草的实例包括深色晾制熟化的、深色明火烤制熟化的、白肋烟、烤制熟化的和雪茄填料或包装纸，以及来自整个叶片干燥操作的产品。在一个方面，烟草纤维包括基于鲜重高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398中所述，可通过加热、出汗和/或巴氏杀菌步骤来调制烟草。
本文提供的烟草材料可以进行发酵。典型地，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10至20％。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373和5,372,149。除了改变叶片的香气外，发酵还可以改变叶片的颜色和质地。同样在发酵过程中，可以产生演化气体，可以吸收氧气，可以改变pH值，可以改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry andTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。在加入口腔用产品之前，可以进一步加工(例如切割、膨化、混合、研磨或粉碎)熟化或熟化并发酵的烟草。在某些情况下，烟草是长切发酵的熟化湿烟草，在与共聚物和任选的食用香料和其他添加剂混合之前，其烘箱挥发物含量为48-50重量％。
在一个方面，本文提供的烟草材料可以加工成所需的尺寸。在某些方面，烟草纤维可以加工成平均纤维尺寸小于200微米。在一个方面，烟草纤维为75至125微米。在另一个方面，将烟草纤维加工成具有75微米或更小的尺寸。在一个方面，烟草纤维包括长切烟草，其可被切割或切碎成宽度为约10切/英寸(cut/inch)直至约110切/英寸，长度为约0.1英寸至约1英寸。双切烟草纤维可具有一定范围的颗粒尺寸，使得约70％的双切烟草纤维落在-20目至80目的筛目尺寸之间。
本文提供的烟草材料可以加工成总烘箱挥发物含量为约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％至约25重量％；约20重量％至约30重量％；约30重量％至约50重量％；约45重量％至约65重量％或约50重量％至约60重量％。本领域技术人员将理解，“潮湿”烟草典型地是指烘箱挥发物含量为约40重量％至约60重量％(例如约45重量％至约55重量％，或约50％重量)的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”通过计算在预热的强制通风烘箱中于110℃干燥样品3.25小时后样品的失重百分比来确定。口腔用产品的总烘箱挥发物含量可与用于制备口腔用产品的烟草纤维的烘箱挥发物含量不同。本文描述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。
预期了以下示例性的非限制性实施方案：
1.经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
2.经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
3.经修饰的烟草植物，其包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
4.经修饰的烟草植物，其包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
5.包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
6.包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
7.实施方案1或2的经修饰的烟草植物，其中所述突变包含选自插入、缺失、取代和倒位的突变。
8.实施方案1、2或7任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变包含无效突变。
9.实施方案1、2、7或8任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变导致所述内源基因的mRNA转录物中的提前终止密码子。
10.实施方案1、2或7-9任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变导致所述多肽的截短。
11.实施方案1、2或7-10任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变位于所述内源基因的外显子内。
12.实施方案1、2或7-10任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变位于所述内源基因的内含子内。
13.实施方案1、2或7任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变位于所述内源基因的5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR内。
14.实施方案1、2或7任一项的经修饰的烟草植物，其中所述突变位于所述内源基因的启动子内。
15.实施方案1、2或7-14任一项的经修饰的烟草植物，其中所述内源基因包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列。
16.实施方案1、2或7-15任一项的经修饰的烟草植物，其中所述内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的多肽。
17.实施方案1、2或7-16任一项的经修饰的烟草植物，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述内源基因的表达水平降低。
18.实施方案1、2或7-16任一项的经修饰的烟草植物，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述内源基因的表达水平增加。
19.实施方案1、2或7-16任一项的经修饰的烟草植物，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述多肽的活性水平降低。
20.实施方案1、2或7-16任一项的经修饰的烟草植物，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述多肽的活性水平增加。
21.实施方案3-6任一项的经修饰的烟草植物，其中所述异源启动子包含腋生分生组织特异性启动子。
22.实施方案3-6任一项的经修饰的烟草植物，其中所述异源启动子包含腋生分生组织优选的启动子。
23.实施方案3-6任一项的经修饰的烟草植物，其中所述异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列。
24.实施方案3-6任一项的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子选自双链RNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA和microRNA。
25.实施方案5或6的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子包含18个核苷酸至30个核苷酸。
26.实施方案5或6的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子包含与所述内源mRNA具有至少90％同一性或互补性的多核苷酸序列。
27.实施方案5或6的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子包含18个核苷酸至30个核苷酸。
28.实施方案5或6的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子包含与选自SEQ IDNO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少90％同一性或互补性的多核苷酸序列。
29.实施方案5或6的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子包含与选自SEQ IDNO:1-44和113的多核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同或互补的多核苷酸序列。
30.实施方案1-29任一项的经修饰的烟草植物，其中所述多肽是细胞周期蛋白。
31.实施方案1-29任一项的经修饰的烟草植物，其中所述多肽是CDK。
32.实施方案1-29任一项的经修饰的烟草植物，其中所述多肽是CDK抑制剂。
33.实施方案1-29任一项的经修饰的烟草植物，其中所述多肽是MYB。
34.实施方案1-29任一项的经修饰的烟草植物，其中所述多肽是WRKY转录因子。
35.实施方案30的经修饰的烟草植物，其中所述细胞周期蛋白由与SEQ ID NO:6-32至少80％相同的多核苷酸序列编码。
36.实施方案30的经修饰的烟草植物，其中所述细胞周期蛋白包含与选自SEQ IDNO:50-76的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
37.实施方案31的经修饰的烟草植物，其中所述CDK由与SEQ ID NO:1-4至少80％相同的多核苷酸序列编码。
38.实施方案31的经修饰的烟草植物，其中所述CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
39.实施方案32的经修饰的烟草植物，其中所述CDK抑制剂由与SEQ ID NO:5至少80％相同的多核苷酸序列编码。
40.实施方案32的经修饰的烟草植物，其中所述CDK抑制剂包含与选自SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
41.实施方案33的经修饰的烟草植物，其中所述MYB由与SEQ ID NO:33-44至少80％相同的多核苷酸序列编码。
42.实施方案33的经修饰的烟草植物，其中所述MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
43.实施方案34的经修饰的烟草植物，其中所述WRKY转录因子由与SEQ ID NO:113至少80％相同的多核苷酸序列编码。
44.实施方案34的经修饰的烟草植物，其中所述WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少80％相同或相似的氨基酸序列。
45.实施方案1-44任一项的经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物是选自烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、深色品种、
Figure BDA0003446356220001021
品种、东方品种和土耳其品种的烟草品种。
46.实施方案1-45任一项的经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物选自BU 64植物、CC 101植物、CC 200植物、CC 13植物、CC 27植物、CC 33植物、CC 35植物、CC 37植物、CC 65植物、CC 67植物、CC 301植物、CC 400植物、CC 500植物、CC 600植物、CC 700植物、CC 800植物、CC 900植物、CC 1063植物、Coker 176植物、Coker 319植物、Coker371Gold植物、Coker 48植物、CU 263植物、DF911植物、Galpao植物、GL 26H植物、GL 338植物、GL 350植物、GL 395植物、GL 600植物、GL 737植物、GL 939植物、GL 973植物、GF 157植物、GF 318植物、RJR 901植物、HB 04P植物、K 149植物、K 326植物、K 346植物、K 358植物、K394植物、K 399植物、K 730植物、NC 196植物、NC 37NF植物、NC 471植物、NC 55植物、NC92植物、NC2326植物、NC 95植物、NC 925植物、PVH 1118植物、PVH 1452植物、PVH 2110植物、PVH 2254植物、PVH 2275植物、VA 116植物、VA 119植物、KDH 959植物、KT 200植物、KT204LC植物、KY 10植物、KY 14植物、KY 160植物、KY 17植物、KY 171植物、KY 907植物、KY907LC植物、KTY14x L8 LC植物、Little Crittenden植物、McNair 373植物、McNair 944植物、雄性不育KY 14x L8植物、Narrow Leaf Madole植物、MS KY171植物、Narrow LeafMadole(phph)植物、MS Narrow Leaf Madole植物、MS TND950植物、PD 7302LC植物、PD7305LC植物、PD 7309LC植物、PD 7312LC植物、PD 7318LC植物、PD 7319LC植物、MSTKS2002植物、TKF 2002植物、TKF 6400植物、TKF 4028植物、TKF 4024植物、KT206LC植物、KT209LC植物、KT210LC植物、KT212LC植物、NC 100植物、NC 102植物、NC 2000植物、NC 291植物、NC297植物、NC 299植物、NC 3植物、NC 4植物、NC 5植物、NC 6植物、NC7植物、NC 606植物、NC71植物、NC 72植物、NC 810植物、NC BH 129植物、NC 2002植物、Neal Smith Madole植物、OXFORD 207植物、‘Perique’植物、PVH03植物、PVH09植物、PVH19植物、PVH50植物、PVH51植物、R 610植物、R 630植物、R 7-11植物、R 7-12植物、RG 17植物、RG 81植物、RG H51植物、RGH 4植物、RGH 51植物、RS 1410植物、Speight 168植物、Speight 172植物、Speight 179植物、Speight 210植物、Speight 220植物、Speight 225植物、Speight 227植物、Speight234植物、Speight G-28植物、Speight G-70植物、Speight H-6植物、Speight H20植物、Speight NF3植物、TI 1406植物、TI 1269植物、TN 86植物、TN86LC植物、TN 90植物、TN90LC植物、TN 97植物、TN97LC植物、TN D94植物、TN D950植物、TR(Tom Rosson)Madole植物、VA309植物和VA 359植物。
47.实施方案1-46任一项的经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物是杂交种。
48.实施方案1-47任一项的经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物是雄性不育或细胞质雄性不育。
49.实施方案1-47任一项的经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物是雌性不育。
50.实施方案1、3或[0009]任一项的经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物的烟杈相比，所述减小的烟杈包含较少的总烟杈、较小的平均烟杈尺寸或两者。
51.实施方案50的经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物的烟杈相比，所述较小平均烟杈尺寸包括选自以下的量度：减少的平均质量、减少的平均长度、减少的平均直径或其任何组合。
52.实施方案1-51任一项的经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物相比，所述经修饰的植物具有增加的叶产量质量。
53.实施方案52的经修饰的烟草植物，其中所述增加的叶产量质量包含至少0.5％的增加。
54.实施方案1-53任一项的经修饰的烟草植物的烟叶。
55.实施方案1-53任一项的经修饰的烟草植物的烟草种子。
56.实施方案54的烟叶，其中所述烟叶是熟化烟叶。
57.实施方案56的烟叶，其中所述熟化烟叶选自晾制熟化烟叶、明火烤制熟化烟叶、晒制熟化烟叶和烤制熟化烟叶。
58.烟草产品，其包含从实施方案1-53任一项的经修饰的烟草植物或其部分提取的生物碱。
59.实施方案58的烟草产品，其中所述生物碱选自烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱。
60.实施方案58或59的烟草产品，其中所述烟草产品选自卷烟、丁香烟、比迪烟、雪茄、小雪茄、不通风香烟、通风过滤嘴香烟、烟斗烟、鼻烟(snuff)、鼻烟(snus)、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟产品。
61.实施方案58或59的烟草产品，其中所述烟草产品选自口香糖、片剂、锭剂和溶解条。
62.实施方案58或59的烟草产品，其中所述烟草产品是不可燃产品。
63.实施方案62的烟草产品，其中所述不可燃产品选自电子卷烟、电子吸烟产品、雾化蒸气产品和加热的烟草产品。
64.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
65.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
66.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
67.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
68.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
69.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
70.实施方案64-69任一项的烟草产品，其中所述烟草产品选自卷烟、丁香烟、比迪烟、雪茄、小雪茄、不通风香烟、通风过滤嘴香烟、烟斗烟、鼻烟(snuff)、鼻烟(snus)、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟产品。
71.实施方案64-69任一项的烟草产品，其中所述熟化烟草材料来自选自以下的烟草品种：烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、深色品种、东方品种和土耳其品种。
72.实施方案64-69任一项的烟草产品，其中所述熟化烟草材料选自晾制熟化烟草材料、明火烤制熟化烟草材料、晒制熟化烟草材料和烤制熟化烟草材料。
73.实施方案64-69任一项的烟草产品，其中所述熟化烟草材料包含熟化烟叶材料。
74.实施方案64-69任一项的烟草产品，其中所述熟化烟草材料包含熟化烟草茎材料。
75.产生经修饰的烟草植物的方法，包括：
(a)在至少一个烟草细胞中在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的基因组基因座处诱导突变；
(b)选择至少一个包含来自步骤(a)的突变的烟草细胞；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
76.产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码多肽的核酸的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子；
(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
77.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达；
(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
78.如实施方案75的方法，其中所述诱导包括使用选自由以下的试剂：化学诱变剂、辐射、转座子、土壤杆菌和核酸酶。
79.如实施方案78的方法，其中所述核酸酶选自下组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶、CRISPR/CasX核酸酶、CRISPR/CasY核酸酶、Csm1核酸酶或其任何组合。
80.如实施方案78的方法，其中所述化学诱变剂包括甲磺酸乙酯。
81.实施方案78的方法，其中所述辐射包括γ射线、X射线或电离辐射。
82.实施方案77的方法，其中所述小RNA分子选自双链RNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA和microRNA。
83.实施方案77或82的方法，其中所述小RNA分子包含至少18个核苷酸。
84.实施方案77、82或83中任一项所述的方法，其中所述小RNA分子包含与所述内源mRNA至少90％同一性或互补性。
85.实施方案77、82或84中任一项所述的方法，其中所述小RNA分子包含18个核苷酸至30个核苷酸。
86.实施方案77或82-85任一项所述的方法，其中所述小RNA分子包含与选自SEQID NO:1-44和113的多核苷酸序列至少90％同一性或互补性。
87.实施方案77或82-86任一项所述的方法，其中所述内源mRNA包含与选自SEQ IDNO:1-44和113的多核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同或互补的序列。
88.实施方案75-87任一项所述的方法，其中所述至少一种烟草细胞是烟草原生质体细胞。
89.实施方案75-87任一项所述的方法，其中所述至少一种烟草细胞是烟草愈伤组织细胞。
90.实施方案75-87任一项的方法，其中所述至少一种烟草细胞选自种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、芽细胞、干细胞、花细胞、花序细胞、茎细胞、梗细胞、花柱细胞、柱头细胞，花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、丝细胞、卵巢细胞、胚珠细胞、果皮细胞和韧皮细胞。
91.实施方案75-77任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(d)使步骤(c)中再生的所述经修饰的烟草植物生长。
92.实施方案91的方法，其中所述方法进一步包括：
(e)将步骤(d)中生长的所述经修饰的烟草植物与第二烟草植物杂交；和
(f)从步骤(e)中的所述杂交获得至少一颗种子。
93.实施方案76或77的方法，其中所述异源启动子包含腋生分生组织特异性启动子。
94.实施方案93的经修饰的烟草植物，其中所述异源启动子包含与选自SEQ IDNO:89-109的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列。
95.实施方案75的方法，其中所述基因组基因座包含与选自SEQ ID NO:1-44和113的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列。
96.实施方案75的方法，其中所述基因组基因座编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的多肽。
97.实施方案75的方法，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述基因组基因座的表达降低。
98.实施方案75的方法，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述基因组基因座的表达增加。
99.实施方案75所述的方法，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述多肽的活性降低。
100.实施方案75所述的方法，其中与所述对照烟草植物相比，所述突变导致所述多肽的活性增加。
101.实施方案75-100任一项所述的方法，其中所述多肽是细胞周期蛋白。
102.实施方案75-100任一项所述的方法，其中所述多肽是CDK。
103.实施方案75-100任一项所述的方法，其中所述多肽是CDK抑制剂。
104.实施方案75-100任一项所述的方法，其中所述多肽是MYB。
105.实施方案75-100任一项所述的方法，其中所述多肽是WRKY转录因子。
106.实施方案101所述的方法，其中所述的细胞周期蛋白由与SEQ ID NO:6-32至少80％相同的多核苷酸序列编码。
107.实施方案101的方法，其中所述细胞周期蛋白包含与选自SEQ ID NO:50-76的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
108.实施方案102的方法，其中所述CDK由与SEQ ID NO:1-4至少80％相同的多核苷酸序列编码。
109.实施方案102的方法，其中所述CDK包含与选自SEQ ID NO:45-48的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
110.实施方案103的方法，其中所述CDK抑制剂由与SEQ ID NO:5至少80％相同的多核苷酸序列编码。
111.实施方案103的方法，其中所述CDK抑制剂包含与选自SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
112.实施方案104的方法，其中所述MYB由与SEQ ID NO:33-44至少80％相同的多核苷酸序列编码。
113.实施方案104的方法，其中所述MYB包含与选自SEQ ID NO:77-88的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列。
114.实施方案105的方法，其中所述WRKY转录因子由与SEQ ID NO:113至少80％相同的多核苷酸序列编码。
115.实施方案105的方法，其中所述WRKY转录因子包含与SEQ ID NO:114至少80％相同或相似的氨基酸序列。
116.实施方案75-115任一项的方法，其中所述经修饰的烟草植物是选自以下的烟草品种：烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、深色品种、东方品种和土耳其品种。
117.实施方案75-115任一项的方法，其中所述经修饰的烟草植物选自BU 64植物、CC 101植物、CC 200植物、CC 13植物、CC 27植物、CC 33植物、CC 35植物、CC 37植物、CC 65植物、CC 67植物、CC 301植物、CC 400植物、CC 500植物、CC 600植物、CC 700植物、CC 800植物、CC 900植物、CC 1063植物、Coker 176植物、Coker 319植物、Coker 371Gold植物、Coker 48植物、CU 263植物、DF911植物、Galpao植物、GL 26H植物、GL 338植物、GL 350植物、GL 395植物、GL 600植物、GL 737植物、GL 939植物、GL 973植物、GF 157植物、GF 318植物、RJR 901植物、HB 04P植物、K 149植物、K 326植物、K 346植物、K 358植物、K394植物、K399植物、K 730植物、NC 196植物、NC 37NF植物、NC 471植物、NC 55植物、NC 92植物、NC2326植物、NC 95植物、NC 925植物、PVH 1118植物、PVH 1452植物、PVH 2110植物、PVH2254植物、PVH 2275植物、VA 116植物、VA 119植物、KDH 959植物、KT 200植物、KT204LC植物、KY 10植物、KY 14植物、KY 160植物、KY 17植物、KY 171植物、KY 907植物、KY 907LC植物、KTY14 x L8 LC植物、Little Crittenden植物、McNair 373植物、McNair 944植物、雄性不育KY 14x L8植物、Narrow Leaf Madole植物、MS KY171植物、Narrow Leaf Madole(phph)植物、MS Narrow Leaf Madole植物、MS TND950植物、PD 7302LC植物、PD 7305LC植物、PD 7309LC植物、PD 7312LC植物、PD 7318LC植物、PD 7319LC植物、MSTKS 2002植物、TKF2002植物、TKF 6400植物、TKF 4028植物、TKF 4024植物、KT206LC植物、KT209LC植物、KT210LC植物、KT212LC植物、NC 100植物、NC 102植物、NC 2000植物、NC 291植物、NC 297植物、NC 299植物、NC 3植物、NC 4植物、NC 5植物、NC 6植物、NC7植物、NC 606植物、NC 71植物、NC 72植物、NC 810植物、NC BH 129植物、NC 2002植物、Neal Smith Madole植物、OXFORD 207植物、‘Perique’植物、PVH03植物、PVH09植物、PVH19植物、PVH50植物、PVH51植物、R 610植物、R 630植物、R 7-11植物、R 7-12植物、RG 17植物、RG 81植物、RG H51植物、RGH 4植物、RGH 51植物、RS 1410植物、Speight 168植物、Speight 172植物、Speight 179植物、Speight 210植物、Speight 220植物、Speight 225植物、Speight 227植物、Speight234植物、Speight G-28植物、Speight G-70植物、Speight H-6植物、Speight H20植物、Speight NF3植物、TI 1406植物、TI 1269植物、TN 86植物、TN86LC植物、TN 90植物、TN90LC植物、TN 97植物、TN97LC植物、TN D94植物、TN D950植物、TR(Tom Rosson)Madole植物、VA309植物和VA 359植物。
118.实施方案75-117任一项的方法，其中所述经修饰的烟草植物是杂交种。
119.实施方案75-118任一项的方法，其中所述经修饰的烟草植物是雄性不育或细胞质雄性不育。
120.实施方案75-118任一项所述的方法，其中所述经修饰的烟草植物是雌性不育。
121.实施方案75-120任一项所述的方法，其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物的烟杈相比，所述减小的烟杈包含较少的总烟杈、较小的平均烟杈尺寸或两者。
122.实施方案121的方法，其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物的烟杈相比，所述较小的烟杈包含减少的平均质量、减少的平均长度、减少的平均直径或其任何组合。
123.实施方案75-122中任一个的方法，其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物相比，所述经修饰的植物具有增加的叶产量质量。
124.实施方案123的方法，其中所述增加的叶产量质量包含至少0.5％的增加。
125.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
126.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
127.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
128.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
129.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
130.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
131.实施方案125-130任一项的方法，其中所述烟草产品选自卷烟、丁香烟、比迪烟、雪茄、小雪茄、不通风香烟、通风过滤嘴香烟、烟斗烟、鼻烟(snuff)、鼻烟(snus)、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟产品、口香糖、片剂、锭剂和溶解条。
132.实施方案125-131任一项的方法，其中所述熟化烟草材料来自选自以下的烟草品种：烤制熟化品种、金黄色品种、白肋品种、弗吉尼亚品种、马里兰品种、深色品种、东方品种和土耳其品种。
133.实施方案125-132中任一项的方法，其中所述熟化烟草材料选自晾制熟化烟草材料、明火烤制熟化烟草材料、晒制熟化烟草材料和烤制熟化烟草材料。
134.实施方案125-133任一项的方法，其中所述熟化烟草材料包括熟化烟叶材料。
135.实施方案125-133任一项的方法，其中所述熟化烟草材料包含熟化烟草茎材料。
136.包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的核酸可操作地连接的异源启动子。
137.包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
138.实施方案136或137的方法，其中所述方法进一步包括从所述烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中所述经修饰的烟草植物包含所述重组DNA构建体。
139.实施方案138的方法，其中当在可比条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
140.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和
(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
141.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码多肽的核酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和
(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
142.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和
(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
现在已经总体描述了本公开，通过参考以下实施例将更容易理解本公开，除非另有说明，所述实施例以说明性方式提供并且不旨在限制本公开。
具体实施方式
实施例1.鉴定差异表达基因
使210株TN90烟草植物生长至layby阶段(8-10个完全膨胀的叶片)。在此阶段，从30株植物收集腋芽以形成三个复制品，每个复制品含有来自10株植物的合并的腋芽。将其余180株植物打顶。按照制造商的剂量说明(Arysta LifeScience Royal
Figure BDA0003446356220001162
XTRA)，用水喷雾90株植物，并且用马来酰肼(MH)喷雾90株植物。喷雾后4小时、喷雾后24小时和喷雾后72小时收集水处理(对照)和MH处理植物的腋芽。参见表2。从每个集合中提取RNA并使用Hiseq(Illumina)测序。
表2.实验组
Figure BDA0003446356220001161
Figure BDA0003446356220001171
使用CLC基因组工作台(版本11.0.1；QIAGEN)使用默认参数将RNA序列映射到专有烟草参考基因组。使用CLC基因组工作台中的表达浏览器工具，通过将每个样品中给定基因的映射读长的原始计数与总共98,751个基因进行聚集，产生包括所有样品的读长计数矩阵。使用R package edgeR(版本3.0.8)对读长计数矩阵进行差异基因表达分析。参见Robinson et al.“edgeR:a Bioconductor package for differential expressionanalysis of digital gene expression data,”Bioinformatics,26:139-140(2010)。
将不表达或普遍低表达的基因从读长计数矩阵中滤出，以提高差异基因表达检测的灵敏度。在至少三个RNA测序文库中仅保留具有>1的每百万读长的读长计数的基因。这些过滤器产生包含39,980个表达基因的经过滤的读长计数矩阵。
使用M(TMM)值方法的微调手段将经过滤的读长计数矩阵标准化为文库之间的组成偏差。参见，例如，Robinson and Oshlack,“A scaling normalization method fordifferential expression analysis of RNA-seq data,”Genome Biology,11:R25(2010)。在三个成对比较之间检测差异表达的基因：打顶后4小时、24小时和72小时的对照样品分别与打顶后4小时、24小时和72小时的MH处理的样品比较。p值为≤0.05和log2倍数变化绝对值为≥1或≤1的基因被认为是差异表达的。总体上，在对照和MH处理的样品之间有超过6300个基因差异表达。来自差异表达基因的基因表达值(每百万映射读长的每千碱基转录物的读长(RPKM))用于进行下游分析并鉴定候选基因。
仅在打顶后4小时的成对比较中鉴定了709个差异表达的基因。仅在打顶后24小时的成对比较中鉴定了396个差异表达的基因。仅在打顶后72小时的成对比较中鉴定了3538个差异表达的基因。在打顶后4小时和24小时的成对比较中鉴定了100个差异表达的基因。在4小时和72小时的成对比较中鉴定了431个差异表达的基因。在24小时和72小时的成对比较中鉴定了646个差异表达的基因。在所有三个成对比较中鉴定了513个差异表达的基因。图1提供了描述不同比较之间差异表达基因的重叠的Venn图。
预期在细胞增殖中起作用的差异表达的基因(例如，细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、MYB、WRKY转录因子)被鉴定为候选基因。
实施例2.经修饰的烟草植物的转化和再生
表达载体用作产生包含重组DNA构建体的多种转化载体的骨架(参见实施例5-6)。表达载体含有腋生分生组织优选的启动子(例如，SEQ ID NO:89-109)、NOS终止子和包含卡那霉素选择标志物(NPTII)的盒，该盒与肌动蛋白2启动子和NOS终止子可操作地连接。通过农杆菌转化将含有目标转基因的核酸载体导入烟草叶盘。例如，参见Mayo et al.,2006,Nat Protoc.1:1105-11and Horsch et al.,1985,Science 227:1229-1231。
将Narrow Leaf Madole(NLM)烟草植物在MagentaTM GA-7盒中生长，并将叶盘切下并置于陪替氏平皿中。通过在50mL离心管中以3500RPM离心20mL细胞悬液10分钟来收集包含转化载体的根癌农杆菌细胞。除去上清液，将根癌农杆菌细胞沉淀重悬于40mL液体重悬培养基中。用#15剃刀刀片将烟叶(避开中肋)切成8个0.6cm圆盘，并颠倒放置在陪替氏平皿中。将具有B5维生素液体重悬培养基的Murashige&Skoog薄层添加到陪替氏平皿中，并用细针将叶圆盘均匀地戳破。将约25mL根癌农杆菌悬液添加到陪替氏平皿中，并将叶盘在悬液中温育10分钟。
将叶盘转移至共培养陪替氏平皿(1/2MS培养基)，并将圆盘颠倒放置以与覆盖在共培养TOM培养基(具有20g/L蔗糖；1mg/L吲哚-3-乙酸；和2.5mg/L6-苄氨基嘌呤(BAP)的MS培养基)上的滤纸接触。将陪替氏平皿用石蜡膜密封，然后在24摄氏度下在暗光(60-80mE/ms)中以18小时开、6小时关的光周期温育三天。温育后，将叶盘转移到再生/选择TOM K培养基陪替氏平皿(TOM培养基加300mg/L卡那霉素)。将叶盘在24摄氏度下在暗光下以18小时开、6小时关的光周期每两周一次继代培养到新鲜的TOMK培养基中，直到枝条变得可切除。用镊子取出来自叶的枝条并插入含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基中。将枝条置于含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基上，在24摄氏度温育18小时，在高强度光照(6080mE/ms)下进行6小时关闭光周期以诱导生根。
实施例3.表型筛选
当含有枝条和根的实施例2中再生的小植株生长足够大时(例如，达到MagentaTMGA-7盒高度的约一半)，将它们转移到土壤中。将建立的幼苗转移到温室中用于进一步分析和结籽。通过使经修饰的植物(T0、T1、T2或更晚代)和对照植物生长到layby阶段来进行分杈表型的评估。对照植物是未转化的NLM植物或用空p45-2-7载体转化的NLM植物。人工打顶已经到达layby阶段的植物(除去茎尖分生组织和周围组织)，并且在打顶后的特定时间点评价腋芽生长。通常在打顶时(即0小时)、打顶后24小时(即1天)、打顶后7-8天(即一周)和/或打顶后14-15天(即两周)进行观察。观察包括定性地检查是否存在腋芽生长和总体植物外观。观察还包括在打顶后的特定时间点定量测量所有腋芽的鲜重和/或在打顶后的特定时间点测量所有腋芽长出的长度。
实施例4.通过诱导突变发育经修饰的烟草植物
通过特异性编辑SEQ ID NO:1-44和113在CDK、CDK抑制剂、细胞周期蛋白、MYB和WRKY基因中产生突变。使用聚乙二醇(PEG)用编码CRISPR蛋白的质粒或CRISPR蛋白和靶向所需位置处的单个基因的特异性指导RNA(gRNA)转染烟草原生质体。
然后，将转染的原生质体固定在1％琼脂糖珠中并进行组织培养。当愈伤组织生长至约1毫米直径时，将它们铺板在TOM2板上。使用片段分析筛选愈伤组织的靶位置处的突变(例如插入或缺失(indel)。选择与野生型对照相比显示大小改变的候选物用于进一步培养，并通过片段分析再次测试随后的枝条以证实突变的存在。
如实施例2所述，使包含靶向突变的经修饰的烟草植物(T0代)和缺乏突变的对照烟草植物生长至layby阶段。然后，打顶植物以除去茎尖分生组织，并如实施例3所述对经修饰和对照烟草植物进行表型评价。
实施例5.通过靶向表达发育经修饰的烟草植物
当与腋芽优选的启动子(例如SEQ ID NO:83-109)可操作地连接时，包含SEQ IDNO:1-44和113的基因在腋芽组织中的靶向过表达可用于减少或消除烟草中的烟杈生长。
如实施例2所述构建由包含SEQ ID NO:89或93的启动子驱动的包含SEQ ID NO:5、33或36的6个单独的转化载体。
如实施例2所述使包含转化载体和对照烟草植物之一的经修饰的烟草植物(T0代)生长至layby阶段。然后，打顶植物以除去茎尖分生组织，并如实施例3所述对经修饰和对照烟草植物进行表型评价。
如实施例2所述构建包含驱动SEQ ID NO:36(P1_2.4::MYB)的表达的SEQ ID NO:109和驱动SEQ ID NO:5(P1_2.4::CDKI)的表达的SEQ ID NO:109的额外转化载体并转化入烟草。使所得的经修饰的烟草植物生长并如实施例3所述进行表型筛选。图2描绘了打顶后一周来自单个P1_2.4::MYB植物的烟杈的总质量。图3描绘了打顶后一周来自单个P1_2.4::CDKI植物的烟杈的总质量。
实施例6.通过小RNA分子发育经修饰的烟草植物
包含SEQ ID NO:1-44和113的基因在腋芽组织中的靶向抑制可用于减少或消除烟草中的烟杈生长。通过修饰Nt-miR6147 pre-miRNA并将经修饰的pre-miRNA插入实施例2所述的转化载体中，产生包含驱动经设计以减少SEQ ID NO:1-44或113的转录或翻译的人工miRNA的表达的腋芽优选的启动子(例如，SEQ ID NO:89-109)的转化载体。
构建额外转化载体以产生能够抑制CDK在腋芽中表达的人工miRNA。每个人工miRNA构建体能够抑制两个CDK基因。参见表3。
表3.人工miRNA载体
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如实施例3所述，使包含转化载体的经修饰的烟草植物(T0代)和对照烟草植物生长至layby阶段。然后，打顶植物以除去茎尖分生组织，并如实施例4所述对经修饰和对照烟草植物进行表型评价。图4、5和6描绘了打顶后一周来自分别包含amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3的单个植物的烟杈的总质量。
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Claims (35)

1.经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的所述内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
2.经修饰的烟草植物，其在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的所述内源基因中。
3.经修饰的烟草植物，其包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
4.经修饰的烟草植物，其包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
5.包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
6.包含重组DNA构建体的经修饰的烟草植物，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
7.根据权利要求1或2所述的经修饰的烟草植物，其中所述内源基因包含与选自SEQ IDNO:1-44和113的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列。
8.根据权利要求1或2所述的经修饰的烟草植物，其中所述内源基因编码包含与选自SEQ ID NO:45-88和114的氨基酸序列至少80％相同或相似的氨基酸序列的多肽。
9.根据权利要求3-6任一项所述的经修饰的烟草植物，其中所述异源启动子包含与选自SEQ ID NO:89-109的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列。
10.根据权利要求5或6所述的经修饰的烟草植物，其中所述小RNA分子包含与选自SEQID NO:1-44和113的多核苷酸序列具有至少90％同一性或互补性的多核苷酸序列。
11.根据权利要求1-6任一项所述的经修饰的烟草植物的烟叶。
12.根据权利要求1-6任一项所述的经修饰的烟草植物的烟草种子。
13.根据权利要求54所述的烟叶，其中所述烟叶是熟化烟叶。
14.烟草产品，其包含从权利要求1-6任一项所述的经修饰的烟草植物或其部分提取的生物碱。
15.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
16.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中。
17.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
18.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
19.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
20.包含来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料的烟草产品，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
21.产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)在至少一个烟草细胞中在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的基因组基因座处诱导突变；
(b)选择至少一个包含所述来自步骤(a)的突变的烟草细胞；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
22.产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码多肽的核酸的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子；
(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
23.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将重组DNA构建体引入至少一个烟草细胞，其中所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达；
(b)选择至少一个包含所述重组DNA构建体的烟草细胞；和
(c)从步骤(b)中选择的所述至少一个烟草细胞再生经修饰的烟草植物，其中当在可比的生长条件下生长时，与缺乏所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
24.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的所述内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
25.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
26.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
27.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含可操作地连接至异源启动子的编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的多核苷酸序列。
28.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈。
29.包括使用来自经修饰的烟草植物的熟化烟草材料制备烟草产品的方法，所述经修饰的烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
30.包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的核酸可操作地连接的异源启动子。
31.包括用重组DNA构建体转化烟草细胞的方法，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达。
32.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的至少一种烟草植物在编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源基因中包含突变，其中所述突变不存在于相同品种的对照烟草植物的内源基因中，并且其中当在可比的生长条件下生长时，与所述对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和
(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
33.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的所述至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码多肽的核酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和
(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
34.用于产生经修饰的烟草植物的方法，其包括：
(a)将第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中所述第一烟草品种的所述至少一种烟草植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码至少一种小RNA分子的核酸可操作地连接的异源启动子，所述小RNA分子能够降低编码选自细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、CDK抑制剂、MYB和WRKY转录因子的多肽的内源mRNA的表达，其中当在可比的生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，所述至少一种烟草植物在打顶后不包含烟杈或包含减少的烟杈；和
(b)选择与在可比的生长条件下相同杂交生长的对照烟草植物相比，在打顶后表现出无烟杈或减少的烟杈的后代烟草植物。
35.根据权利要求3所述的经修饰的烟草植物，其中所述多核苷酸序列包含与选自SEQID NO:1-44和113的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列。
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